WO2018021012A1 - 抗体断片の製造方法 - Google Patents

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WO2018021012A1
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antibody fragment
protein
region
separation matrix
affinity separation
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大 村田
吉田　慎一
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株式会社カネカ
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    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
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    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
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    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Definitions

  • the present invention relates to a method capable of producing an antibody fragment containing a CH1 region and not containing an Fc region with higher purity.
  • Protein A affinity separation matrix used to adsorb and purify antibody drugs from animal cell cultures at a high purity at a time.
  • Monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell.
  • Most antibody drugs currently on the market are immunoglobulin G (IgG) subclass in terms of molecular structure. Therefore, an SpA affinity separation matrix using SpA that specifically binds to the Fc region of IgG as a ligand is used in the initial purification step in the antibody drug manufacturing process.
  • IgG immunoglobulin G
  • Non-patent Document 3 antibody drugs composed of antibody fragments having a molecular structure obtained by fragmenting immunoglobulin have been actively developed, and clinical development of various antibody fragment drugs is progressing.
  • antibody fragments antibody fragments that do not contain the Fc region cannot be purified using the SpA affinity separation matrix. Therefore, there is a high industrial need for an affinity separation matrix capable of adsorbing antibody fragments that do not contain the Fc region of IgG from the viewpoint of platformization of antibody drug purification processes.
  • Non-patent Document 4 A plurality of proteins that bind to other than the Fc region of IgG are already known (Non-patent Document 4).
  • CaptoL TM KappaSelect with a camel antibody as a ligand
  • Lambda FabSelect, etc. are known as an affinity separation matrix with a protein L (hereinafter sometimes abbreviated as “SpL”) that binds to the Fab region of IgG as a ligand.
  • SpL protein L
  • protein G a protein called protein G (hereinafter, protein G may be abbreviated as “SpG”) discovered from Streptococcus sp. Of Group G has a property of binding to IgG.
  • SpG affinity separation matrix product immobilized with SpG as a ligand product name “Protein G Sepharose 4 Fast Flow”, manufactured by GE Healthcare, Patent Document 1). It is known that SpG binds strongly to the Fc region of IgG, but binds to the Fab region even though it is weak (Non-patent Documents 4 and 5).
  • F (ab ′) 2 generated by cleaving IgG with a protease is purified with an SpG affinity separation matrix using this property (Patent Document 2).
  • affinity separation matrix containing SpA As described above, for IgG, purification using an affinity separation matrix containing SpA has been generalized, and studies on ligands, elution conditions, and the like are in progress. On the other hand, for antibody fragments, there are a plurality of affinity separation matrices that can be applied to purification, but it is difficult to say that there are problems with each of them and that sufficient studies have been made.
  • a method for producing an antibody fragment a method for purifying a target antibody fragment by cleaving IgG with a protease to fragment IgG as described above.
  • this method it is necessary to purify the target antibody fragment from a mixture of Fab fragment and Fc fragment, a mixture of F (ab ′) 2 fragment and further cleaved Fc fragment, and the efficiency is poor. Therefore, a method for selectively producing a target antibody fragment using genetic engineering techniques has been studied.
  • an antibody-derived misfolded body or an overexpressed unnecessary antibody-derived component may be generated simultaneously (Non-patent Documents 6 and 7).
  • Fab fragments can be produced efficiently by selectively producing Fab fragments and using an affinity separation matrix having SpL as a protein that binds to a light chain as a ligand.
  • an affinity separation matrix having SpL as a protein that binds to a light chain as a ligand when the present inventors produce Fab fragments by genetic engineering techniques, light chain monomers and dimers are produced as impurities, and SpL also adsorbs these impurities, so impurities are mixed into the target Fab fragment. I found out experimentally.
  • impurities having properties similar to those of the target antibody fragment are generated, which makes it difficult to purify the target antibody fragment.
  • the present invention has an object to provide a method capable of separating impurities that are similar in physical properties to the target antibody fragment and difficult to separate, and can efficiently produce the target antibody fragment with high purity.
  • SpG shows a selective affinity for an antibody fragment that contains the CH1 region and does not contain the Fc region, while an impurity comprising a part of the target antibody fragment such as a light chain monomer or dimer. It was found that the affinity for is low. Therefore, when purifying an antibody fragment that contains a CH1 region and does not contain an Fc region from a sample that does not contain an Fc fragment, the use of an affinity separation matrix with SpG as a ligand effectively eliminates impurities that were difficult in the past.
  • the present invention has been completed by finding that the antibody fragments can be separated and can be recovered with higher purity. Hereinafter, the present invention will be described.
  • a method for producing an antibody fragment comprising: The antibody fragment comprises a CH1 region and no Fc region; Producing a liquid sample containing the antibody fragment and not containing the Fc fragment; Contacting the antibody fragment with an affinity separation matrix by contacting the liquid sample with an affinity separation matrix in which protein G, a domain thereof, or a variant thereof is immobilized on an insoluble carrier as a ligand; Washing the affinity separation matrix to remove impurities; and Separating the antibody fragment from the affinity separation matrix.
  • the antibody fragment includes a light chain
  • the impurity is at least one selected from the group consisting of a light chain monomer, a light chain dimer, and an antibody aggregate.
  • the method in any one of.
  • the target antibody fragment in a method for selectively producing a target antibody fragment using a more efficient genetic engineering technique or the like than the method of fragmenting an antibody and further purifying the target antibody fragment,
  • the target antibody fragment can be purified with higher purity by removing impurities such as misfolded substances having similar physical properties to those of the antibody. Therefore, according to the method of the present invention, impurities having physical properties similar to those of the target antibody fragment are not introduced into the subsequent purification step, so that the burden of studying conditions in the subsequent purification can be reduced and the purification process can be easily constructed. become.
  • FIG. 1 is a chromatogram obtained by purifying a CH1 region-containing Fab fragment in a culture supernatant of a yeast transformant using a protein G mutant carrier in which a protein G domain mutant into which a mutation has been introduced is immobilized.
  • FIG. 2 is a chromatogram when a CH1 region-containing Fab fragment in the culture supernatant of a yeast transformant is purified using a commercially available protein G affinity separation matrix on which wild-type protein G is immobilized.
  • FIG. 3 is a chromatogram when a CH1 region-containing Fab fragment in a culture supernatant of a yeast transformant is purified using a commercially available protein L affinity separation matrix on which protein L is immobilized.
  • FIG. 1 is a chromatogram obtained by purifying a CH1 region-containing Fab fragment in a culture supernatant of a yeast transformant using a protein G mutant carrier in which a protein G domain mutant into which a mutation has been introduced is immobilized.
  • FIG. 4 shows the results of SDS-PAGE under the reducing and non-reducing conditions of the fractions in FIGS.
  • FIG. 5 is an enlarged view of the vicinity of 45 to 66 kDa of the SDS-PAGE gel under the non-reducing conditions of FIG.
  • FIG. 6 shows the results of SDS-PAGE under the reducing and non-reducing conditions of each fraction in FIG.
  • the method of the present invention is a method for efficiently purifying an antibody fragment containing a CH1 region and not containing an Fc region with high purity using an affinity separation matrix on which protein G, its domain, or a variant thereof is immobilized. .
  • the method of the present invention will be described step by step.
  • Step 1 Production Step of Crude Antibody Fragment Sample
  • a liquid sample containing an antibody fragment containing a CH1 region and not containing an Fc region and containing no Fc fragment is prepared.
  • the method for producing the liquid sample is not particularly limited as long as the target antibody fragment can be selectively produced and impurities containing the Fc region are not by-produced.
  • it can be produced by genetic engineering techniques.
  • the genetic engineering technique refers to obtaining a transformant by introducing a gene encoding a target antibody fragment into a cell, culturing the transformant, and selectively producing the target antibody fragment. It shall be said.
  • the liquid sample may be prepared in a cell-free protein synthesis system using a gene encoding the target antibody fragment.
  • Immunoglobulin (Ig) is a glycoprotein produced by B cells of lymphocytes and has a function of recognizing and binding molecules such as specific proteins.
  • An immunoglobulin has a function of specifically binding to a specific molecule called an antigen and a function of detoxifying or removing an antigen-containing factor in cooperation with other biomolecules or cells.
  • Immunoglobulin is generally called “antibody”, which is a name that focuses on such a function.
  • All immunoglobulins basically have the same molecular structure, and have a “Y” -shaped four-chain structure as a basic structure.
  • the four-chain structure is composed of two polypeptide chains each called a light chain and a heavy chain.
  • Immunoglobulin G is a monomeric immunoglobulin and is composed of two ⁇ chains and two light chains, and has two antigen-binding sites.
  • the place corresponding to the vertical bar of the lower half of the “Y” of immunoglobulin is called the Fc region, and the “V” of the upper half is called the Fab region.
  • the Fc region has an effector function that induces a reaction after the antibody binds to the antigen, and the Fab region has a function of binding to the antigen.
  • the heavy chain Fab region and the Fc region are connected by a hinge part, and the proteolytic enzyme papain contained in papaya decomposes this hinge part and cleaves it into two Fab regions and one Fc region.
  • the portion near the tip of the “Y” in the Fab region is called a variable region (V region) because various changes in the amino acid sequence are seen so that it can bind to various antigens.
  • the variable region of the light chain is called the VL region, and the variable region of the heavy chain is called the VH region.
  • the Fab region and the Fc region other than the V region are regions with relatively little change, and are called constant regions (C regions).
  • the constant region of the light chain is referred to as the CL region, and the constant region of the heavy chain is referred to as the CH region.
  • the CH region is further divided into three, CH1 to CH3.
  • the heavy chain Fab region consists of a VH region and a CH1 region
  • the heavy chain Fc region consists of a CH2 region and a CH3 region.
  • the hinge part is located between the CH1 region and the CH2 region.
  • Non-patent Document 5 the binding of protein G to the Fab region is the binding of IgG to the CH1 region (CH1 ⁇ ) and CL region. From the knowledge, it has been found that in purifying a target antibody fragment containing the CH1 region with protein G, impurities containing the CL region but not the CH1 region can be removed.
  • a liquid sample containing an antibody fragment containing the CH1 region and not containing the Fc region and containing no Fc fragment is prepared.
  • the antibody fragments include, for example, Fab fragments fragmented only in the Fab region of immunoglobulin G, F (ab ′) 2 fragments, Fab 2 fragments, Fab 3 fragments, etc. It may be a complex in which a recombinant protein is fused to a fragment, and is not particularly limited as long as it contains a CH1 region and does not contain an Fc region.
  • the gene encoding the target antibody fragment may be prepared by a conventional method.
  • a gene encoding the target antibody fragment may be chemically synthesized and amplified by PCR.
  • a gene containing the gene encoding the target antibody fragment is used as a template, and the gene encoding the target antibody fragment is It can also be obtained by PCR using amplifiable primers. Since the antibody fragment to be produced by the method of the present invention contains a CH1 region and does not contain an Fc region, a gene encoding the Fc region is not used. Note that the “Fc region” in the present invention includes a part of the FC region such as the CH2 region and the CH3 region.
  • the vector for inserting the gene is not particularly limited as long as it can replicate autonomously in the host, and plasmid DNA or phage DNA can be used as the vector.
  • the vector preferably contains a promoter that can function in the host.
  • fungi such as yeast
  • bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis
  • animal cells such as Chinese hamster ovary (CHO) cells, BHK cells, COS cells, and human-derived cells
  • insect cells and the like can be used.
  • the host into which the gene has been introduced is cultured to produce the gene. After culturing, the host cells are removed by filtration or centrifugation to obtain a liquid sample containing the target antibody fragment. In this step, since the gene encoding the Fc region is not used, the liquid sample does not contain an Fc fragment.
  • the pH of the liquid sample is preferably in the vicinity of neutrality of about 6 or more and 8 or less.
  • the solvent of the liquid sample may be water alone, or may contain a water-miscible organic solvent such as C 1-4 alcohol as long as water is the main component, and the pH is 6 or more.
  • a buffer solution of about 8 or less may be used.
  • Step 2 Adsorption Step
  • the liquid sample is contacted with an affinity separation matrix in which protein G, a domain thereof, or a variant thereof is immobilized as an ligand on an insoluble carrier, whereby the antibody fragment is affinitized. Adsorb to a separation matrix.
  • the affinity separation matrix used in this step is a protein G, its domain, or a variant thereof immobilized on an insoluble carrier as a ligand.
  • protein G, its domain, or a variant thereof may be collectively referred to as “protein G ligand”.
  • Protein G is a protein derived from the cell wall of group G streptococcus (Streptococcus sp.). SpG has the ability to bind to most mammalian IgGs, and is known to bind strongly to the Fc region of IgG and weakly bind to the Fab region of IgG, particularly the CH1 region and CL region.
  • the functional domain showing SpG IgG binding is called ⁇ domain (SpG- ⁇ ).
  • ⁇ domain The functional domain showing SpG IgG binding
  • B domain The functional domain showing SpG IgG binding
  • C domain The functional domain showing SpG IgG binding
  • Fahnestock et al. J. Biol. Chem., 1987, 28, 13388-, Fig. 5
  • Fahnestock et al. Fahnestock et al.
  • J. Bacteriol., 1986167, 870- The details of the amino acid sequence of SpG- ⁇ vary depending on the bacterial species and bacterial strain from which it is derived.
  • amino acid sequences of the ⁇ domains of SpG are highly homologous to each other, and these are collectively referred to as a protein G- ⁇ domain (SpG- ⁇ ).
  • a “domain” is a protein structural unit, such as a protein unit composed of several tens to hundreds of amino acid sequences and sufficient to express some physicochemical or biochemical function.
  • a “variant” of a protein or peptide refers to a protein or peptide in which at least one substitution, addition and / or deletion has been introduced at the amino acid level with respect to the sequence of a wild-type protein or peptide.
  • a “mutant” refers to one that maintains or improves at least the affinity for the CH1 region compared to native SpG or its domain.
  • Protein G is a protein containing two or three IgG binding domains arranged in tandem.
  • Protein G ligands used as ligands in the affinity separation matrix of the present invention also include, in one embodiment, two or more IgG-binding domains of wild-type and / or mutant SpG that are monomeric or single domain, Preferably, it may be a multimer of multiple domains linked 3 or more, more preferably 4 or more, and still more preferably 5 or more.
  • the upper limit of the number of domains to be linked is 10 or less, preferably 8 or less, more preferably 6 or less.
  • These multimers may be single wild type and / or homopolymers such as homodimers and homotrimers that are linked to the IgG binding domain of the mutant SpG, or multiple types of wild type and / or Alternatively, it may be a heteropolymer such as a heterodimer or a heterotrimer which is a conjugate of IgG binding domains of mutant SpG.
  • one or several amino acids may be added to these multidomain multimers. As a site to be added, the N-terminal and C-terminal are preferable. In one embodiment, Cys may be added to the C-terminus of the two-domain type of the IgG binding domain of wild-type and / or mutant SpG.
  • binding constant for the CH1 region As a variant of SpG or a domain thereof, one having a binding constant for the CH1 region of 10 6 M ⁇ 1 or more is preferable.
  • the binding constant of the protein G ligand, which is the ligand of the affinity separation matrix according to the present invention, to the CH1 region is, for example, a Biacore system (GE Healthcare) using the surface plasmon resonance principle or an Octet system using biolayer interferometry ( However, the present invention is not limited to this.
  • a binding parameter for evaluating affinity for the CH1 region for example, a binding constant (K A ) or a dissociation constant (K D ) can be used (“Real-time analysis experiment method of biological substance interaction” by Nagata et al.).
  • Examples of the material for evaluating the binding constant of the protein G ligand to the CH1 region include CH1 region peptides prepared by genetic engineering techniques. However, in this method, the CH1 region may not have a correct structure. Therefore, as another method, binding constants for two types of Fabs having different antigen recognition sites can be considered as pseudo binding constants for the CH1 region. For example, Fab fragments obtained by fragmenting and separating and purifying two types of IgG having known amino acid sequences and different antigen recognition sites but high CH1 region homology with enzymes are used. If the binding constants for these two types of Fab fragments are similar, the obtained binding constant can be considered as a pseudo binding constant for the CH1 region.
  • the upper limit of the binding constant for the CH1 region is not particularly limited, and it can be said that the higher the binding constant, the stronger the antibody fragment containing the target molecule CH1 region and not the Fc region, which is preferable.
  • the binding constant is excessively high, a low pH solution is required for dissociation of the adsorbed target fragment antibody, and the target fragment antibody may be damaged. Therefore, the coupling constant is preferably 10 11 M ⁇ 1 or less, for example.
  • the order of parameters may vary greatly depending on the experimental conditions, the analysis method, and / or the type of the original antibody fragment.
  • One criterion in this case is that when a peptide having wild-type protein G is evaluated under the same experimental conditions and analysis method, the binding constant is larger. Wild type protein G is readily available as a commercially available research reagent (for example, Life Technologies).
  • mutant SpG domains include those having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the mutant SpG domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 has particularly high affinity for the Fab fragment, and the antibody fragment containing the CH1 region and not containing the Fc region can be purified more efficiently.
  • the method for linking monomeric proteins used as ligands for the affinity separation matrix of the present invention includes a method of linking with one or a plurality of amino acid residues, but is not limited to these methods.
  • the number of amino acid residues to be linked is not particularly limited, but is preferably 20 residues or less, and more preferably 15 residues or less.
  • a sequence linking between ⁇ 1 and ⁇ 2 or between ⁇ 2 and ⁇ 3 of wild-type SpG is used. From another viewpoint, those that do not destabilize the three-dimensional structure of the monomeric protein are preferable.
  • the ligand of the affinity separation matrix of the present invention includes wild-type and / or mutant SpG IgG-binding domains, or peptide multimers in which two or more of the domains are linked.
  • One component includes a fusion peptide characterized by being fused with another peptide having a different function.
  • fusion peptides include, but are not limited to, peptides fused with albumin or GST (glutathione S-transferase).
  • a nucleic acid such as a DNA aptamer, a drug such as an antibiotic, and a polymer such as PEG (polyethylene glycol) are fused
  • the present invention can be used for the affinity separation matrix obtained in the present invention. Included in the invention.
  • the protein G ligand used in the present invention can be prepared by a conventional method. That is, DNA encoding the amino acid sequence of a desired protein G ligand or a fragment thereof is chemically synthesized, and DNA encoding the protein G ligand is amplified by PCR and incorporated into a vector such as a plasmid. What is necessary is just to culture
  • the affinity separation matrix used in the present invention is obtained by immobilizing the above protein G ligand on an insoluble carrier.
  • the “insoluble carrier” used in the present invention is insoluble in an aqueous solvent that is a solvent of a liquid sample containing an antibody fragment that contains a CH1 region and does not contain an Fc region. Those that can be used for purification of the antibody fragment that specifically binds.
  • the insoluble carrier used in the present invention include inorganic carriers such as glass beads and silica gel; synthetic polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene; crystalline cellulose, crosslinked cellulose, crosslinked agarose, and crosslinked.
  • Examples thereof include organic carriers composed of polysaccharides such as dextran; and organic-organic and organic-inorganic composite carriers obtained by combining these.
  • Commercially available products include porous cellulose gel GCL2000, Sephacryl S-1000 covalently cross-linked allyldextran and methylenebisacrylamide, Toyopearl acrylate carrier, Sepharose CL4B agarose cross carrier, and Examples thereof include Cellufine, which is a cellulosic crosslinking carrier.
  • the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers.
  • the insoluble carrier used in the present invention preferably has a large surface area in view of the purpose and method of use of the affinity separation matrix, and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size.
  • the form of the carrier can be any of beads, monoliths, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.
  • a conventional method may be used as a method for immobilizing the protein G ligand, which is a ligand, on an insoluble carrier.
  • the reactive groups present on the surface of the insoluble carrier are used for immobilization.
  • reactive groups such as amino groups, hydroxyl groups, and carboxy groups exist on the surface of general insoluble carriers, and these are activated, substituted with other reactive groups, or reacted with them.
  • a linker group having a functional group may be introduced. For example, epichlorohydrin, diglycidyl ether, 1,4-bis (2,3-epoxypropoxy) butane etc.
  • the linker group is not particularly limited.
  • An ester group (—C ( ⁇ O) —O— or —O—C ( ⁇ O) —), an amide group (—C ( ⁇ O) —NH— or —NH—C ( ⁇ O) —), Sulfoxide group (—S ( ⁇ O) —), sulfonyl group (—S ( ⁇ O) 2 —), sulfonylamide group (—NH—S ( ⁇ O) 2 — and —S ( ⁇ O) 2 —NH— ), And a group in which
  • a spacer molecule composed of a plurality of atoms may be introduced between the ligand and the carrier, or the ligand may be directly immobilized on the carrier.
  • the protein G ligand according to the present invention may be chemically modified for immobilization.
  • the antibody fragment is selectively adsorbed to the protein G ligand in the affinity separation matrix by bringing the liquid sample into contact with the affinity separation matrix.
  • the specific embodiment is not particularly limited, and the liquid sample and the affinity separation matrix may only be mixed.
  • the affinity separation matrix according to the present invention is packed in a column and affinity is used.
  • the liquid sample is passed through the affinity column, and the antibody fragment is selectively adsorbed on the protein G ligand.
  • the conditions for this step may be appropriately adjusted within a range in which the antibody fragment contained in the liquid sample is sufficiently adsorbed to the affinity separation matrix.
  • the pH in this step may be adjusted to 6 or more and 8 or less.
  • Step 3 Affinity Separation Matrix Washing Step
  • the affinity separation matrix on which the antibody fragments are adsorbed and held in the step 2 is washed to remove impurities other than the antibody fragments.
  • impurities such as light chain monomers are once adsorbed, it can be removed in this step.
  • a washing solution that does not interfere with the interaction between the antibody fragment and the protein G ligand is used.
  • water or a buffer having a pH of 5 or more and 8 or less can be used as the cleaning solution.
  • the amount of cleaning liquid used is based on column volume (CV).
  • the column volume is based on the amount of affinity separation matrix packed in the column. For example, in a column packed with 1 mL-gel affinity separation matrix, the amount of 1 CV used is 1 mL.
  • the volume of the affinity separation matrix as a reference is the volume of the affinity separation matrix in a gel state that is in a suspended state and tapped or allowed to stand until the volume does not decrease.
  • the amount of the cleaning solution used may be appropriately adjusted within a range in which impurities can be sufficiently removed from the affinity separation matrix, but is preferably 3 CV or more, more preferably 4 CV or more, and even more preferably 5 CV or more. As the amount of the cleaning solution used increases, the impurity removal efficiency increases and the purity of the antibody fragment in the next step tends to increase, but the recovery rate may decrease. However, when using an affinity separation matrix that uses a SpG or SpG domain mutant having a high binding ability to the CH1 region as a ligand, a high recovery rate can be achieved even if the amount of the washing solution used is large. Whether or not the impurities have been sufficiently removed can be easily determined by monitoring the elution profile when using a chromatography system, for example.
  • Impurities include impurities derived from antibodies in addition to proteins and DNA derived from the host of cultured cells.
  • components derived from overexpressed antibodies such as light chain monomers, light chain dimers, and antibody aggregates, and components generated by misfolding can be mentioned.
  • Antibody-derived impurities are generally difficult to separate because they have similar physical properties to the target antibody fragment, but according to the method of the present invention, it can be efficiently separated and removed. These impurities can be confirmed by SDS-PAGE, HPLC or the like, but the method is not limited thereto.
  • Step 4 Separating antibody fragments
  • the antibody fragments are separated from the affinity separation matrix on which the antibody fragments are adsorbed using an eluate.
  • the purified antibody fragment is obtained.
  • an acidic aqueous solution can be used as an eluent for eluting the antibody fragment.
  • the acidic aqueous solution for example, an aqueous solution of acetic acid, citric acid, and glycine can be used.
  • the pH of the aqueous solution is lowered, the antibody fragment can be efficiently eluted, and the amount of the eluate can be reduced.
  • the pH of the aqueous solution is increased, it is possible to reduce damage to the antibody fragment due to acid.
  • the pH of the eluate is preferably 2.5 or more and 4.0 or less. If the said pH is 2.5 or more, the chemical change of the said antibody fragment, etc. can be suppressed more reliably.
  • the antibody fragment when the pH is 4.0 or less, the antibody fragment can be more reliably eluted.
  • the pH is preferably 2.8 or more, more preferably 3.0 or more, more preferably 3.8 or less, and even more preferably 3.5 or less.
  • the purity of the obtained antibody fragment can be confirmed by SDS-PAGE or HPLC, but the method is not limited thereto.
  • Step 5 Post-treatment step In step 4 above, an aqueous solution of the antibody fragment is obtained.
  • the antibody fragment may be further purified by salting out, chromatography, recrystallization or the like, or may be dried by freeze drying, spray drying, thin film drying or the like.
  • Step 6 Regeneration Step of Affinity Separation Matrix
  • the affinity separation matrix from which the fragments have been separated in step 4 above is regenerated by washing with a regeneration solution.
  • this step does not necessarily have to be performed after the above step 4, and may be performed once every 3 times, once every 5 times, or once every 10 times. That is, in the state where the performance of the affinity separation matrix such as the binding capacity is maintained, this step is not necessarily performed, and the frequency and conditions of execution vary depending on the liquid sample containing the antibody fragment to be purified.
  • the “regeneration solution” used for regeneration of the affinity separation matrix is an aqueous solution that can achieve the purpose such as washing and sterilization.
  • 1M acetic acid solution pH 2.0
  • 20 mM phosphoric acid-1% SDS solution pH 7.0
  • 6M guanidine-hydrochloric acid solution pH 7.0
  • 70% ethanol 0.1M hydrochloric acid
  • An 8M urea solution pH 10.5
  • a 0.1 M glycine-sodium hydroxide solution can be used as the regeneration solution, but are not limited thereto.
  • the time during which the affinity separation matrix after the above step 4 is treated with the regeneration solution is not particularly limited because the damage received by the protein G ligand varies depending on the type of the regeneration solution and the temperature during the treatment, and may be adjusted as appropriate.
  • 0.1 M hydrochloric acid pH 1.0
  • 1 hour is preferable and 2 hours is more preferable.
  • 8M urea pH 10.5
  • the affinity separation matrix regenerated through this step can be used again in the above steps 1 to 3.
  • Example 1 (1) Preparation of Fab Fragment Containing Supernatant Based on Public Sequence Information of Fully Humanized Anti-TNF- ⁇ Antibody Sequence (adalimumab) as an Antibody Fragment Containing a Heavy Chain Constant Region (CH1 Region) and No Fc Region
  • the designed Fab fragment was selected.
  • the Fab gene was obtained by designing and chemically synthesizing a gene encoding the Fd chain amino acid sequence (CH1 region and VH region: SEQ ID NO: 3) and the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the anti-TNF- ⁇ antibody.
  • a template was prepared by PCR. Using the obtained gene, the Fab fragment was produced in methanol-utilizing yeast.
  • the binding constant of the Fab region binding peptide to anti-EGFR antibody-Fab and anti-TNF ⁇ antibody-Fab was 10 6 M ⁇ 1 or more.
  • the immobilization was performed in the same manner as the epoxy immobilization method described in WO2016 / 031902.
  • Each carrier was packed in a commercially available column (“Tricorn 5/50” GE Healthcare) in an amount of 1 mL-gel and connected to a chromatography system AKTAavant25 (GE Healthcare). Specifically, the following operations were performed. First, an equilibration buffer solution (20 mM Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4) for 5 CV (column volume) was passed through the column to equilibrate the support. Next, 100 mL of a sample obtained by diluting the Fab fragment-containing supernatant prepared in (1) above with the equilibration buffer was loaded onto the column.
  • FIGS. 1 to 3 show chromatographic charts when a protein G variant carrier, a commercially available protein G carrier, and a commercially available protein L carrier are used. In FIGS. 1 to 3, each fraction is represented by 1 to 3.
  • FIG. 4 shows the results of SDS-PAGE when a protein G mutant carrier and commercially available protein G are used
  • FIG. 5 shows an enlarged photograph under non-reducing treatment conditions
  • FIG. 6 shows the results of SDS-PAGE when commercially available protein L is used.
  • the protein L carrier Since the protein L carrier has the ability to adsorb to the ⁇ -type light chain, this band is found to be a component derived from the light chain, and is considered to be a light chain monomer from the viewpoint of molecular weight.
  • the light chain monomer band positions differ between reducing conditions and non-reducing conditions, but cysteine is present in the light chain amino acid sequence, so the structures differ between reducing conditions and non-reducing conditions. This is probably due to the difference in band positions.
  • FIG. 5 when FIG. 5 is enlarged in the vicinity of 45 to 66 kDa under non-reducing conditions in FIG. 4, two bands exist between 45 kDa and 66 kDa in the culture supernatant before purification.
  • the lower molecular weight band is considered to be a light chain dimer.
  • the light chain monomer and the light chain dimer were mixed in the eluted fraction when the protein L carrier was used, and could not be separated from the Fab fragment.
  • the light chain monomer band is present in the pre-purification culture supernatant and the sample-loaded fraction. However, it could not be confirmed in the washing fraction and the elution fraction.
  • light chain dimer bands were confirmed in both the sample-loaded fractions of the protein G mutant carrier and the commercially available protein G carrier, but not in the washed fraction and the eluted fraction. From these results, by using protein G carrier, it is possible to remove misfolded bodies such as light chain monomer and light chain dimer and unnecessary components in the culture supernatant and to purify Fab fragments with high purity. It turned out to be.
  • Fab bands are present in both the sample-loaded fraction and the washed fraction, which is different from the case where a protein G mutant carrier is used. That is, although the commercially available protein G carrier can remove the light chain monomer and the light chain dimer, it indicates that the Fab fragment is leaked during sample loading and washing. On the other hand, when a protein G mutant carrier is used, Fab fragments are not contained in the washing solution. Thus, it can be seen that the carrier using the protein G variant having a high binding constant to the Fab fragment as a ligand has improved Fab fragment retention performance. As a result, it is possible to obtain a high-purity Fab fragment with a high recovery rate by the purification step using the present carrier.

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Abstract

本発明は、目的とする抗体断片と物性が類似した、分離が困難な不純物を分離することができ、目的抗体断片を効率的かつ高純度で製造することができる方法を提供することを目的とする。本発明に係る抗体断片の製造方法は、上記抗体断片がＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まないものであり、上記抗体断片を含み且つＦｃ断片を含まない液体試料を作製する工程、上記液体試料を、プロテインＧ、そのドメイン、またはそれらの変異体がリガンドとして不溶性担体に固定化されているアフィニティ分離マトリックスに接触させることにより、上記抗体断片をアフィニティ分離マトリックスに吸着させる工程、上記アフィニティ分離マトリックスを洗浄し、不純物を除去する工程、および、上記アフィニティ分離マトリックスから上記抗体断片を分離する工程を含むことを特徴とする。

Description

抗体断片の製造方法
　本発明は、ＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まない抗体断片をより高い純度で製造することができる方法に関するものである。
　タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で吸着して精製するために利用されるプロテインＡアフィニティ分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。
　抗体医薬品として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術などを用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。そこで、抗体医薬製造工程における初期精製工程には、ＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するＳｐＡをリガンドとした、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスが利用されている。
　一方で、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する抗体断片からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、様々な抗体断片医薬の臨床開発が進んでいる（非特許文献３）。抗体断片の中でも、Ｆｃ領域を含まない抗体断片は、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用した精製ができない。従って、抗体医薬精製プロセスのプラットフォーム化の観点から、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない抗体断片を吸着可能なアフィニティ分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。
　ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するタンパク質はすでに複数知られている（非特許文献４）。例えば、ＩｇＧのＦａｂ領域に結合するプロテインＬ（以下、「ＳｐＬ」と略記する場合がある）をリガンドとしたアフィニティ分離マトリックスとして、ＣａｐｔｏＬTM、ラクダ抗体をリガンドとするＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ、およびＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔなどが知られている。しかし、これらはκ型軽鎖またはλ型軽鎖のいずれか一方しか認識しない。
　そのほか、グループＧの連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ.）より見出されたプロテインＧと呼ばれるタンパク質（以下、プロテインＧを「ＳｐＧ」と略記する場合がある）は、ＩｇＧに結合する性質を有し、このＳｐＧをリガンドとして固定化したＳｐＧアフィニティ分離マトリックス製品もある（製品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ」ＧＥヘルスケア社製，特許文献１）。ＳｐＧはＩｇＧのＦｃ領域に強く結合するが、Ｆａｂ領域にも弱いながらも結合することが分かっている（非特許文献４，５）。この性質を利用して、ＩｇＧをプロテアーゼで切断することで生じたＦ（ａｂ’）2をＳｐＧアフィニティ分離マトリックスで精製した例もある（特許文献２）。
特表昭６３－５０３０３２号公報 特開平４－４９３００号公報
Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁 Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁 Nelson A．N．ら，Nat．Biotechnol．，2009，27巻，331-337頁 Bouvet P．J．，Int．J．Immunopharmac．，1994，16巻，419-424頁 Derrick J．P．，Nature，1992，359巻，752-754頁 Andre F.ら，frontiers in IMMUNOLOGY，2013，217巻，1-20頁 小林和男ら，生物工学，2008，86巻，390-392頁
　上述したように、ＩｇＧについては、ＳｐＡを含むアフィニティ分離マトリックスを用いた精製が一般化されており、リガンドや溶出条件などの検討が進んでいる。一方、抗体断片については、精製に適用できるアフィニティ分離マトリックスが複数存在するものの、それぞれに課題があり十分な検討が為されているとは言い難い。
　例えば、抗体断片の製造方法として、先述のようにＩｇＧをプロテアーゼによって切断してＩｇＧを断片化し、目的の抗体断片を精製する方法が知られている。ところがこの方法では、Ｆａｂ断片とＦｃ断片との混合物や、Ｆ（ａｂ’）2断片とさらに切断されたＦｃ断片との混合物などから目的の抗体断片を精製する必要があり、効率が悪い。そこで、遺伝子工学的技術などを用いて、目的の抗体断片を選択的に製造する方法が検討されている。しかしこの方法でも、目的とする抗体断片以外に、抗体由来のミスフォールド体や過剰に発現した不要な抗体由来の成分などが同時に生成する場合がある（非特許文献６，７）。
　上記の後者の方法により、例えばＦａｂ断片を選択的に製造し、さらに軽鎖に結合するタンパク質であるＳｐＬをリガンドとするアフィニティ分離マトリックスを用いれば、Ｆａｂ断片を効率的に製造できると考えられる。ところが本発明者らは、遺伝子工学的技術でＦａｂ断片を作製すると、軽鎖のモノマーやダイマーなどが不純物として生成し、ＳｐＬはこれら不純物も吸着してしまうため、目的のＦａｂ断片に不純物が混入してしまうことを実験的に見出した。このように、遺伝子工学的技術などを用いた場合には、目的の抗体断片に物性が類似する不純物が生成し、目的の抗体断片の精製が難しいという問題があった。
　そこで本発明は、目的とする抗体断片と物性が類似した、分離が困難な不純物を分離することができ、目的抗体断片を効率的かつ高純度で製造することができる方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ＳｐＧが、ＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まない抗体断片に対する選択的な親和性を示す一方で、軽鎖のモノマーやダイマーなど、目的の抗体断片の一部を構成要素とする不純物に対する親和性が低いことを見出した。よって、Ｆｃ断片を含まない試料から、ＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まない抗体断片を精製するに当たり、ＳｐＧをリガンドとしたアフィニティ分離マトリックスを用いれば、従来は困難であった不純物を効率的に分離することができ、目的とする抗体断片をより高い純度で回収できることを見出して、本発明を完成した。
　以下、本発明を示す。
　［１］　抗体断片を製造する方法であって、
　上記抗体断片がＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まないものであり、
　上記抗体断片を含み且つＦｃ断片を含まない液体試料を作製する工程、
　上記液体試料を、プロテインＧ、そのドメイン、またはそれらの変異体がリガンドとして不溶性担体に固定化されているアフィニティ分離マトリックスに接触させることにより、上記抗体断片をアフィニティ分離マトリックスに吸着させる工程、
　上記アフィニティ分離マトリックスを洗浄し、不純物を除去する工程、および、
　上記アフィニティ分離マトリックスから上記抗体断片を分離する工程を含むことを特徴とする方法。
　［２］　上記プロテインＧ変異体または上記プロテインＧドメイン変異体のＣＨ１領域に対する結合定数が１０6Ｍ-1以上である上記［１］に記載の方法。
　［３］　上記プロテインＧ変異体または上記プロテインＧドメイン変異体が配列番号５のアミノ酸配列を有するものである上記［２］に記載の方法。
　［４］　上記抗体断片が軽鎖を含むものであり、上記不純物が、軽鎖モノマー、軽鎖ダイマーおよび抗体凝集体からなる群より選択される１種以上である上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
　［５］　上記アフィニティ分離マトリックスを洗浄するために用いる洗浄液の量を３カラムボリューム以上とする上記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
　［６］　上記アフィニティ分離マトリックスから上記抗体断片を分離するための洗浄液として、酢酸、クエン酸およびグリシンからなる群から選択される１種以上の酸の水溶液を用いる上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
　［７］　上記水溶液のｐＨを２．５以上４．０以下にする上記［６］に記載の方法。
　本発明方法によれば、抗体を断片化してさらに目的抗体断片を精製する方法に比べ、より効率的な遺伝子工学的技術などを用いて目的抗体断片を選択的に製造する方法において、目的抗体断片と物性が類似するミスフォールディング体などの不純物を除去し、目的の抗体断片をより高い純度で精製することができる。よって、本発明方法によれば、目的の抗体断片と物性が類似する不純物を後段の精製工程にもちこまないため、後段の精製における条件検討の負荷を低減することができ、精製プロセスの構築が容易になる。
図１は、変異が導入されたプロテインＧドメイン変異体を固定化したプロテインＧ変異体担体を用い、酵母形質転換体の培養上清中のＣＨ１領域含有Ｆａｂ断片を精製した場合のクロマトグラムである。 図２は、野生型プロテインＧを固定化した市販プロテインＧアフィニティ分離マトリックスを用い、酵母形質転換体の培養上清中のＣＨ１領域含有Ｆａｂ断片を精製した場合のクロマトグラムである。 図３は、プロテインＬを固定化した市販プロテインＬアフィニティ分離マトリックスを用い、酵母形質転換体の培養上清中のＣＨ１領域含有Ｆａｂ断片を精製した場合のクロマトグラムである。 図４は、図１と図２における各画分の還元および非還元条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。 図５は、図４の非還元条件におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの４５～６６ｋＤａ付近を拡大した図である。 図６は、図３における各画分の還元および非還元条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。
　本発明方法は、プロテインＧ、そのドメイン、またはそれらの変異体を固定化したアフィニティ分離マトリックスを用い、ＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まない抗体断片を高い純度で効率的に精製する方法である。以下、本発明方法を工程毎に説明する。
　工程１：　粗抗体断片試料の作製工程
　本工程では、ＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まない抗体断片を含み、且つＦｃ断片を含まない液体試料を作製する。当該液体試料の製造方法としては、目的の抗体断片を選択的に製造することができ、Ｆｃ領域を含む不純物が副生しない方法であれば特に制限されない。例えば、遺伝子工学的技術により作製することができる。本発明において遺伝子工学的技術とは、目的の抗体断片をコードする遺伝子を細胞に導入して形質転換体を得て、当該形質転換体を培養し、目的抗体断片を選択的に産生させることをいうものとする。その他、上記液体試料は、目的の抗体断片をコードする遺伝子を用い、無細胞タンパク質合成系にて作製してもよい。
　「免疫グロブリン（Ｉｇ）」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、抗原と呼ばれる特定分子に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化したり除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。
　全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造を基本構造としている。当該４本鎖構造は、軽鎖および重鎖と呼ばれるポリペプチド鎖それぞれ２本ずつから構成される。軽鎖（Ｌ鎖）にはλ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本のγ鎖と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
　免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１～ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１領域からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２領域とＣＨ３領域からなる。ヒンジ部はＣＨ１領域とＣＨ２領域の間に位置する。プロテインＧのＦａｂ領域への結合は、より詳細には、ＩｇＧのＣＨ１領域（ＣＨ１γ）とＣＬ領域への結合であることが知られているが（非特許文献５）、本発明者らによる実験的知見により、ＣＨ１領域を含む目的抗体断片をプロテインＧで精製するに当たり、ＣＨ１領域を含まずＣＬ領域を含む不純物を除去できることが見出されている。
　なお、抗体をパパインで切断するとＦａｂ断片２個とＦｃ断片１個が得られ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）2１個とばらばらに切断されたＦｃ断片が得られる。よって、これら混合物からＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まない抗体断片を精製することは比較的効率が悪いといえ、遺伝子工学的技術および無細胞タンパク質合成によれば比較的効率が良いといえる。
　本発明においては、ＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まない抗体断片を含み、且つＦｃ断片を含まない液体試料を作製する。当該抗体断片は、例えば、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域のみに断片化されたＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆａｂ2断片、Ｆａｂ3断片などの他、薬剤を共有結合したこれら断片、これら断片に組換えタンパク質を融合させた複合体などであってもよく、ＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まない限り特に制限されないものとする。
　本工程において、目的の抗体断片をコードする遺伝子は、常法により作製すればよい。例えば、目的の抗体断片をコードする遺伝子を化学合成し、ＰＣＲにより増幅してもよいし、また、目的の抗体断片をコードする遺伝子を含むＤＮＡを鋳型とし、目的の抗体断片をコードする遺伝子を増幅可能なプライマーを用いてＰＣＲにより得ることもできる。なお、本発明方法で製造すべき抗体断片はＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まないものであるので、Ｆｃ領域をコードする遺伝子は用いない。なお、本発明における「Ｆｃ領域」には、ＣＨ２領域やＣＨ３領域など、ＦＣ領域の一部も含まれるものとする。
　次に、目的の抗体断片をコードする遺伝子をベクターに挿入する。遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。また、当該ベクターは、宿主で機能しうるプロモーターを含むものであることが好ましい。宿主としては、酵母などの真菌；大腸菌や枯草菌などの細菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来細胞などの動物細胞；昆虫細胞などを用いることができる。上記遺伝子を導入した宿主を培養し、上記遺伝子を産生させる。培養後、宿主細胞を濾過や遠心分離などで除去し、目的の抗体断片を含む液体試料を得る。なお、本工程においてはＦｃ領域をコードする遺伝子は用いないため、当該液体試料にはＦｃ断片は含まれない。
　また、上記液体試料のｐＨは６以上８以下程度の中性付近であることが好ましい。当該液体試料の溶媒は水のみでもよいし、また、水を主成分とするものであればＣ1-4アルコールなどの水混和性有機溶媒を含むものであってもよいし、ｐＨが６以上８以下程度の緩衝液であってもよい。
　工程２：　吸着工程
　本工程では、上記液体試料を、プロテインＧ、そのドメイン、またはそれらの変異体がリガンドとして不溶性担体に固定化されているアフィニティ分離マトリックスに接触させることにより、上記抗体断片をアフィニティ分離マトリックスに吸着させる。
　本工程で用いるアフィニティ分離マトリックスは、プロテインＧ、そのドメイン、またはそれらの変異体がリガンドとして不溶性担体に固定化されているものである。以下、プロテインＧ、そのドメイン、またはそれらの変異体を、まとめて「プロテインＧリガンド」という場合がある。
　「プロテインＧ（ＳｐＧ）」は、グループＧの連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ.）の細胞壁に由来するタンパク質である。ＳｐＧは、ほとんどの哺乳類のＩｇＧと結合する能力を有しており、ＩｇＧのＦｃ領域に強く結合し、ＩｇＧのＦａｂ領域、特にＣＨ１領域とＣＬ領域にも弱く結合することが知られている。
　ＳｐＧのＩｇＧ結合性を示す機能ドメインは、βドメイン（ＳｐＧ－β）と呼ばれる。なお、β（Ｂ）ドメインと呼ぶ場合と、Ｃドメインと呼ぶ場合の２通りがあり（Akerstrom et al．，J．Biol．Chem．，1987，28，13388-，Fig．5参照）、本明細書では、Fahnestockらの定義に従ってβドメインと呼ぶ（Fahnestock et al．，J．Bacteriol．，1986167，870-）。ＳｐＧ－βのアミノ酸配列は、由来する細菌種や細菌株によって細部が異なっている。代表的なアミノ酸配列として、グループＧの連鎖球菌のＧＸ７８０９株由来の２つのβドメイン（β１とβ２）について、β１ドメイン（ＳｐＧ－β１）のアミノ酸配列を配列番号１に、β２ドメイン（ＳｐＧ－β２）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＳｐＧの各βドメインのアミノ酸配列は互いに配列相同性が高く、これらを一括りとしてプロテインＧ－βドメイン（ＳｐＧ－β）と呼ぶ。
　「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、例えば数十から数百のアミノ酸配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。
　タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加および／または欠失が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。本発明において「変異体」は、天然型ＳｐＧまたはそのドメインに比べて少なくともＣＨ１領域への親和性が維持されているかまたは向上しているものをいう。
　プロテインＧ（ＳｐＧ）は、ＩｇＧ結合性ドメインが２個または３個タンデムに並んだ形で含んだタンパク質である。本発明のアフィニティ分離マトリックスでリガンドとして使用するプロテインＧリガンドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである野生型および／または変異体のＳｐＧのＩｇＧ結合性ドメインが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、さらに好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは６個以下である。これらの多量体は、単一の野生型および／または変異体のＳｐＧのＩｇＧ結合性ドメインの連結体であるホモダイマーやホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類の野生型および／または変異体のＳｐＧのＩｇＧ結合性ドメインの連結体であるヘテロダイマーやヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。前述したように、これらの複数ドメイン多量体にも１または数個のアミノ酸が付加されていてもよい。付加される部位としては、Ｎ末端およびＣ末端が好ましい。実施形態の一つとしては、野生型および／または変異体のＳｐＧのＩｇＧ結合性ドメインの２ドメイン型のＣ末端にＣｙｓが付与されていてもよい。
　ＳｐＧまたはそのドメインの変異体としては、ＣＨ１領域に対する結合定数が１０6Ｍ-1以上であるものが好ましい。本発明に係るアフィニティ分離マトリックスのリガンドであるプロテインＧリガンドのＣＨ１領域に対する結合定数は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社）やバイオレイヤー干渉法を用いたＯｃｔｅｔシステム（ポール社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。ＣＨ１領域に対する親和性を評価するための結合パラメータとしては、例えば、結合定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田ら著「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。プロテインＧリガンドのＣＨ１領域に対する結合定数を評価する材料としては、遺伝子工学的技術で調製したＣＨ１領域ペプチドが挙げられる。しかし本方法ではＣＨ１領域が正しい構造をとらない可能性がある。そこで別の方法として、抗原認識部位の異なる２種類のＦａｂに対する結合定数を、ＣＨ１領域に対する擬似的な結合定数と考えることができる。例えば、アミノ酸配列が既知であって、抗原認識部位が異なるがＣＨ１領域の相同性が高い２種類のＩｇＧをそれぞれ酵素により断片化・分離精製したＦａｂフラグメントを用いる。この２種類のＦａｂフラグメントに対する結合定数が同程度であれば、得られた結合定数はＣＨ１領域に対する擬似的な結合定数と考えることができる。
　ＣＨ１領域に対する結合定数の上限は特に制限されず、当該結合定数が高いほど標的分子であるＣＨ１領域を含む且つＦｃ領域を含まない抗体断片を強く吸着できるため好ましいといえる。しかし、当該結合定数が過剰に高いと、吸着した標的断片抗体の解離に低ｐＨ溶液が必要となり、標的断片抗体がダメージを受けるおそれがあり得る。よって、上記結合定数としては、例えば、１０11Ｍ-1以下が好ましい。
　なお、ＢｉａｃｏｒｅシステムやＯｃｔｅｔシステムを利用した実験では、実験条件、解析方法および／または元となる抗体断片の種類によって、パラメータのオーダーが大きく変わることがある。この場合の判断基準の１つとしては、野生型のプロテインＧを有するペプチドを同じ実験条件や解析方法で評価した場合に、結合定数がより大きいことが基準となる。なお、野生型プロテインＧは、市販の研究用試薬（例えばライフテクノロジーズ社）として容易に入手可能である。
　変異型ＳｐＧドメインとしては、配列番号５のアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。配列番号５のアミノ酸配列を有する変異型ＳｐＧドメインは、Ｆａｂ断片に対する親和性が特に高く、ＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まない抗体断片をより効率的に精製することができる。
　本発明のアフィニティ分離マトリックスのリガンドとして使用する単量体タンパク質の連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下である。好ましくは、野生型ＳｐＧのβ１とβ２の間、または、β２とβ３の間を連結している配列を利用するのがよい。また、別の観点からは、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
　また、実施形態の１つとして、本発明のアフィニティ分離マトリックスのリガンドとしては、野生型および／または変異体のＳｐＧのＩｇＧ結合性ドメイン、または、当該ドメインが２個以上連結されたペプチド多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドも挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたアフィニティ分離マトリックスに対して有用性であれば、本発明に包含される。
　本発明で用いるプロテインＧリガンドは、常法により調製することが可能である。すなわち、所望のプロテインＧリガンドのアミノ酸配列またはその断片をコードするＤＮＡを化学的に合成し、プロテインＧリガンドをコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、プラスミドなどのベクターに組み込む。得られたベクターを大腸菌などに感染させた上で培養し、培養された菌体または培養液から所望のプロテインＧリガンドをクロマトグラフィなどで精製すればよい。
　本発明で用いるアフィニティ分離マトリックスは、上記プロテインＧリガンドが不溶性担体に固定化されたものである。本発明で用いる「不溶性担体」とは、ＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まない抗体断片を含む液体試料の溶媒である水系溶媒に対して不溶性を示し、且つリガンドを担持することにより、リガンドへ特異的に結合する上記抗体断片の精製に用いることができるものをいう。本発明で用いる不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や；結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
　また、本発明に用いる不溶性担体は、アフィニティ分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
　本発明においてリガンドであるプロテインＧリガンドを不溶性担体に固定化する方法としては常法を用いればよい。例えば、不溶性担体の表面に存在する反応性基を利用して固定化する。具体的には、一般的な不溶性担体の表面には、アミノ基、水酸基、カルボキシ基などの反応性基が存在し、これらを活性化したり、別の反応性基に置換したり、これらに反応性基を有するリンカー基を導入してもよい。例えば、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、１，４－ビス（２，３－エポキシプロポキシ）ブタンなどを用いて水不溶性担体の表面にエポキシ基を導入したり、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、マレイミド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基などを導入すれば、プロテインＧリガンドの反応性基との間でカップリング反応が容易に進行する。
　水不溶性担体へのリガンドの固定化にリンカー基を用いる場合、当該リンカー基は特に制限されるものではないが、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基（－ＮＨ－）、イミノ基（＞Ｃ＝Ｎ－または－Ｎ＝Ｃ＜）、エーテル基（－Ｏ－）、チオエーテル基（－Ｓ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、チオニル基（－Ｃ（＝Ｓ）－）、エステル基（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－または－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－）、アミド基（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－または－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－）、スルホキシド基（－Ｓ（＝Ｏ）－）、スルホニル基（－Ｓ（＝Ｏ）2－）、スルホニルアミド基（－ＮＨ－Ｓ（＝Ｏ）2－および－Ｓ（＝Ｏ）2－ＮＨ－）、並びにこれら２以上が結合した基を挙げることができる。２以上のこれら基が結合して上記リンカー基が構成されている場合、当該結合数としては、１０以下または５以下が好ましく、３以下がより好ましい。
　また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。また、固定化のために、本発明に係るプロテインＧリガンドを化学修飾してもよい。
　本工程では、上記液体試料と上記アフィニティ分離マトリックスとを接触させることにより、抗体断片を、上記アフィニティ分離マトリックス中の上記プロテインＧリガンドに選択的に吸着させる。その具体的な態様は特に制限されず、上記液体試料と上記アフィニティ分離マトリックスとを混合するのみでもよいが、例えば、利便性の観点から、本発明に係るアフィニティ分離マトリックスをカラムに充填してアフィニティカラムとし、当該アフィニティカラムに上記液体試料を通過させ、プロテインＧリガンドに上記抗体断片を選択的に吸着させることが好ましい。
　本工程の条件は、上記液体試料に含まれる上記抗体断片が上記アフィニティ分離マトリックスに十分に吸着される範囲で適宜調整すればよい。例えば、本工程のｐＨは６以上、８以下に調整すればよい。
　工程３：　アフィニティ分離マトリックスの洗浄工程
　本工程では、上記工程２により上記抗体断片が吸着保持されたアフィニティ分離マトリックスを洗浄し、上記抗体断片以外の不純物を除去する。なお、この時点では、上記抗体断片はアフィニティ分離マトリックスに吸着されている一方で、たとえ軽鎖モノマーなどの不純物がいったんは吸着されていても、本工程で除去することが可能である。
　本工程においてアフィニティ分離マトリックスの洗浄に用いられる洗浄液としては、上記抗体断片とプロテインＧリガンドとの相互作用を妨げないものを使用する。例えば、ｐＨが５以上８以下の水や緩衝液を洗浄液として用いることができる。洗浄液の使用量としては、カラムボリューム（ＣＶ）を基準とする。カラムボリュームとは、カラムに充填されたアフィニティ分離マトリックスの量を基準とし、例えば、１ｍＬ－ｇｅｌのアフィニティ分離マトリックスが充填されたカラムにおいて、１ＣＶの使用量とは１ｍＬである。基準となるアフィニティ分離マトリックスの体積は、懸濁状態であり、その体積が減少しなくなるまでタッピングまたは静置したゲル状態のアフィニティ分離マトリックスの体積とする。洗浄液の使用量は、アフィニティ分離マトリックスから不純物を十分に除去できる範囲で適宜調整すればよいが、３ＣＶ以上が好ましく、４ＣＶ以上がより好ましく、５ＣＶ以上がさらにより好ましい。洗浄液の使用量が多くなるほど、不純物の除去効率が高くなり、次の工程の抗体断片の純度が高くなる傾向があるが、回収率は低下する可能性がある。しかし、ＣＨ１領域に対する結合能が高いＳｐＧまたはＳｐＧドメインの変異体をリガンドとしたアフィニティ分離マトリックスを使用する場合、洗浄液の使用量が多くても高い回収率を達成することが可能である。不純物が十分に除去できたか否かは、例えば、クロマトグラフィシステムを用いる場合、溶出プロファイルのモニターにより容易に判断することが可能である。
　不純物としては、培養した細胞の宿主由来のタンパク質やＤＮＡの他に、抗体由来の不純物が挙げられる。例えば、軽鎖モノマーや軽鎖ダイマー、抗体の凝集体といった、過剰に発現した抗体由来の成分やミスフォールディングにより生じた成分が挙げられる。抗体由来の不純物は、目的の抗体断片と物性が類似しているため、一般的に分離し難いといえるが、本発明方法によれば、効率的に分離除去することが可能である。これらの不純物は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥや、ＨＰＬＣなどによって確認することができるが、方法はその限りではない。
　工程４：　抗体断片の分離工程
　本工程では、溶出液を使って、上記抗体断片が吸着されたアフィニティ分離マトリックスから上記抗体断片を分離する。本工程によって、精製された上記抗体断片が得られる。
　本発明では、上記抗体断片を溶出するための溶出液として、酸性水溶液を用いることができる。酸性水溶液としては、例えば、酢酸、クエン酸、グリシンの水溶液を用いることができる。当該水溶液のｐＨを低くすると、効率的に上記抗体断片を溶出することができ、溶出液の量を低減することが可能である。また当該水溶液のｐＨを高くすると上記抗体断片への酸によるダメージを低減することが可能となる。溶出液のｐＨとしては、２．５以上４．０以下が好ましい。当該ｐＨが２．５以上であれば、上記抗体断片の化学変化などをより確実に抑制することができる。一方、当該ｐＨが４．０以下であれば、上記抗体断片の溶出をより確実なものとすることができる。当該ｐＨとしては、２．８以上がより好ましく、３．０以上がよりさらに好ましく、また、３．８以下がより好ましく、３．５以下がよりさらに好ましい。得られた上記抗体断片の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥやＨＰＬＣなどによって確認することができるが、方法はその限りではない。
　工程５：　後処理工程
　上記工程４により、上記抗体断片の水溶液が得られる。上記抗体断片は、塩析、クロマトグラフィ、再結晶などによりさらに精製してもよいし、凍結乾燥、スプレードライ、薄膜乾燥法などにより乾燥してもよい。
　工程６：　アフィニティ分離マトリックスの再生工程
　本工程では、上記工程４において上記断片を分離したアフィニティ分離マトリックスを再生溶液で洗浄することによって再生する。但し、本工程は、上記工程４の後に必須的に実施する必要はなく、上記工程１～３の３回に１回、５回に１回、または１０回に１回の実施でも構わない。即ち、結合容量などアフィニティ分離マトリックスの性能が維持されている状態では本工程は必ずしも実施する必要はなく、精製対象である上記抗体断片を含む液体試料によってもその実施頻度や条件が異なる。
　アフィニティ分離マトリックスの再生に用いる「再生溶液」は、洗浄や殺菌などの目的を達成し得る程度の水溶液である。例えば、１Ｍ酢酸溶液（ｐＨ２．０）、２０ｍＭリン酸－１％ＳＤＳ溶液（ｐＨ７．０）、６Ｍグアニジン－塩酸溶液（ｐＨ７．０）、７０％エタノール、０．１Ｍ塩酸（ｐＨ１．０）、８Ｍ尿素溶液（ｐＨ１０．５）、０．１Ｍグリシン－水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ１１）を再生溶液として用いることができるが、これに限定されるものではない。
　上記工程４を経たアフィニティ分離マトリックスを再生溶液により処理する時間は、再生溶液の種類や処理時の温度によってプロテインＧリガンドの受けるダメージは異なるので、特に限定はされず、適宜調整すればよい。例えば、再生溶液として０．１Ｍ塩酸（ｐＨ１．０）を用いて、浸漬時の温度が室温の場合、１時間が好ましく、２時間がより好ましい。再生溶液として８Ｍ尿素（ｐＨ１０．５）溶液を用いて、浸漬時の温度が室温の場合、１時間が好ましく、２時間がより好ましい。
　本工程を経て再生されたアフィニティ分離マトリックスは、再び上記工程１～３で使用し得る。
　本願は、２０１６年７月２８日に出願された日本国特許出願第２０１６－１４８８２０号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１６年７月２８日に出願された日本国特許出願第２０１６－１４８８２０号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　実施例１
　（１）Ｆａｂ断片含有上清の調製
　重鎖定常領域（ＣＨ１領域）を含み且つＦｃ領域を含まない抗体断片として、完全ヒト型化抗ＴＮＦ－α抗体の配列（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）の公開配列情報に基づいて設計したＦａｂ断片を選択した。Ｆａｂ遺伝子は、前記抗ＴＮＦ－α抗体のＦｄ鎖アミノ酸配列（ＣＨ１領域とＶＨ領域：配列番号３）、および軽鎖アミノ酸配列（配列番号４）をコードする遺伝子を設計し、化学合成したものをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。得られた遺伝子を用い、前記Ｆａｂ断片をメタノール資化酵母にて産生した。本Ｆａｂ断片産生酵母の取得と培養は、ＷＯ２０１２／１０２１７１号公報の実施例１，８，９に記載された方法に準じて行った。得られたＦａｂ断片を含む培養液を遠心分離し、培養上清を回収した。回収した培養上清を、孔径０．２２μｍの滅菌濾過フィルター（「ミニザルト」ザルトリウス社）を用いて濾過した。
　（２）プロテインＧ変異体担体の作製
　ＷＯ２０１６／０３１９０２号公報に記載のプロテインＧドメイン変異体を固定化した担体を作製した。具体的には、配列番号５のアミノ酸配列に、野生型プロテインＧのドメイン間リンカー配列およびＣ末端配列を含めた２ドメイン型にＣ末端Ｃｙｓを付与したコンストラクトのＦａｂ領域結合性ペプチドを、セルロース担体へ固定化した担体を作製した。セルロース担体としては、結晶性高架橋セルロース（ＪＮＣ社製，特開２００９－２４２７７０号公報に記載に方法により得られるゲル）を使用した。上記Ｆａｂ領域結合性ペプチドの抗ＥＧＦＲ抗体－Ｆａｂおよび抗ＴＮＦα抗体－Ｆａｂに対する結合定数は、１０6Ｍ-1以上であった。固定化はＷＯ２０１６／０３１９０２号公報に記載のエポキシ固定化法と同様にして行った。
　（３）Ｆａｂ断片含有上清からのＦａｂ精製
　上記（１）で調製したＦａｂ含有培養上清のｐＨを調整するために、平衡化緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で２倍希釈した。次いで、孔径０．２２μｍのフィルター（「ミニザルト」ザルトリウス社）を通した後、市販のプロテインＧ担体（「Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ」ＧＥヘルスケア社）、および上記（２）で作製したプロテインＧ変異体担体を使用して、Ｆａｂ断片を精製した。比較のために、市販のプロテインＬ担体（「Ｃａｐｔｏ　Ｌ」ＧＥヘルスケア社）を使用した精製も行った。いずれの担体も、市販のカラム（「Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０」ＧＥヘルスケア社）に１ｍＬ－ｇｅｌ分パッキングし、クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ２５（ＧＥヘルスケア社）に接続して使用した。具体的には以下の操作を行った。まず、５ＣＶ（カラムボリューム）分の平衡化緩衝液（２０ｍＭ　Ｎａ2ＨＰＯ4－ＮａＨ2ＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）をカラムに流通させて、担体を平衡化した。次に、上記（１）で調製したＦａｂ断片含有上清を前記の平衡化緩衝液で２倍希釈した試料１００ｍＬをカラムに負荷した。次いで、１０ＣＶ分の前記平衡化緩衝液を流通させて洗浄した後、１０ＣＶ分の溶出液（１００ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ，ｐＨ２．７）を流通させることにより、吸着していたＦａｂ断片を溶出させた。その後、３ＣＶ分の平衡化緩衝液を流通させ、さらに５ＣＶ分の１Ｍ酢酸水溶液を流通して担体を洗浄した後、５ＣＶ分の平衡化緩衝液を流通させて精製を完了した。以上の操作において、流速は１ｍＬ／ｍｉｎとした。またいずれの担体を用いた精製においても、試料負荷、洗浄、溶出の画分を回収した。回収した溶出画分は、２Ｍ　Ｔｒｉｓ溶液にて中和した。プロテインＧ変異体担体、市販プロテインＧ担体、および市販プロテインＬ担体を使用した場合の各クロマトチャートを図１～３に示す。図１～３中、各画分を１～３で表す。
　（４）各画分の成分確認
　上記（３）で回収した、各担体を用いた試料負荷画分、洗浄画分、溶出画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した。具体的には、電源搭載型ミニスラブ電気泳動槽パジェラン（アトー社製）と１５％ポリアクリルアミド・プレキャストゲル（「ｅ・ＰＡＧＥＬ」アトー社製）を用いて、付属のマニュアルに従いＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。溶出画分はタンパク質濃度が高かったため、１０倍希釈したサンプルを使用した。いずれのサンプルも還元処理条件と非還元処理条件でＳＤＳ－ＰＡＧＥの確認を行った。タンパク質検出用ＣＢＢ染色溶液（「ＥｚＳｔａｉｎ　ＡＱｕａ」アトー社）を用いて、付属のマニュアルに従いゲルの染色と脱色を行った。プロテインＧ変異体担体および市販プロテインＧを用いた場合のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図４に、非還元処理条件の場合の拡大写真を図５に示す。また、市販プロテインＬを用いた場合のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図６に示す。
　図４に示す結果より、還元条件では軽鎖（分子量：２３，４１２）と重鎖（ＶＨ領域とＣＨ１領域：２３，８７１）は若干異なるものの、３０ｋＤａ近くの位置にバンドを確認した。非還元条件では、４５ｋＤａと６６ｋＤａの間にＦａｂ断片のバンドがあり、２０．１ｋＤａと３０ｋＤａの間にもバンドを確認した。図６の非還元条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果の通り、２０．１ｋＤａと３０ｋＤａの間のバンドは、プロテインＬ担体を使用した場合の試料負荷画分には存在せず、溶出画分には存在する。プロテインＬ担体はκ型軽鎖に対する吸着能を有するため、本バンドは軽鎖に由来する成分であることが分かり、且つ分子量の観点から軽鎖モノマーであると考えられる。また、還元条件と非還元条件で軽鎖モノマーのバンドの位置が異なるが、軽鎖アミノ酸の配列中にはシステインが存在するため、還元条件と非還元条件では構造が異なり、この構造の違いがバンドの位置の違いに起因すると考えられる。
　また、図４の非還元条件の４５～６６ｋＤａ付近を拡大した図５を見ると、精製前培養上清には４５ｋＤａと６６ｋＤａの間に、２本のバンドが存在する。分子量が小さい方のバンドは軽鎖ダイマーであると考えられる。
　上記の軽鎖モノマーと軽鎖ダイマーは、図６に示す結果の通り、プロテインＬ担体を用いた場合には両方とも溶出画分に混入しており、Ｆａｂ断片から分離することができなかった。
　それに対して、図４から分かるように、プロテインＧ変異体担体と市販プロテインＧ担体のどちらを使用した場合でも、軽鎖モノマーのバンドは、精製前培養上清と試料負荷画分に存在する一方で、洗浄画分と溶出画分では確認できなかった。また、プロテインＧ変異体担体と市販プロテインＧ担体のどちらの試料負荷画分においても軽鎖ダイマーのバンドを確認された一方で、洗浄画分と溶出画分では確認されなかった。これらの結果から、プロテインＧ担体を使用することで、培養上清中の軽鎖モノマーや軽鎖ダイマーといったミスフォールディング体や不要な成分を除去し、高い純度でＦａｂ断片を精製することが可能であることが判明した。
　また、市販プロテインＧ担体を使用した場合は、試料負荷画分、洗浄画分のどちらにもＦａｂのバンドが存在している点が、プロテインＧ変異体担体を使用した場合と異なっている。即ち市販プロテインＧ担体は、軽鎖モノマーや軽鎖ダイマーを除去できるものの、試料負荷時と洗浄時にＦａｂ断片が漏出していることを示している。一方、プロテインＧ変異体担体を用いた場合には、Ｆａｂ断片は洗浄液に含まれていない。このように、Ｆａｂ断片への結合定数が高いプロテインＧ変異体をリガンドとした担体は、Ｆａｂ断片保持性能が向上していることが分かる。結果として、本担体を用いた精製工程により、高純度のＦａｂ断片を高回収率で取得することが可能になる。

Claims (7)

  1. 　抗体断片を製造する方法であって、
    　上記抗体断片がＣＨ１領域を含み且つＦｃ領域を含まないものであり、
    　上記抗体断片を含み且つＦｃ断片を含まない液体試料を作製する工程、
    　上記液体試料を、プロテインＧ、そのドメイン、またはそれらの変異体がリガンドとして不溶性担体に固定化されているアフィニティ分離マトリックスに接触させることにより、上記抗体断片をアフィニティ分離マトリックスに吸着させる工程、
    　上記アフィニティ分離マトリックスを洗浄し、不純物を除去する工程、および、
    　上記アフィニティ分離マトリックスから上記抗体断片を分離する工程を含むことを特徴とする方法。
  2. 　上記プロテインＧ変異体または上記プロテインＧドメイン変異体のＣＨ１領域に対する結合定数が１０6Ｍ-1以上である請求項１に記載の方法。
  3. 　上記プロテインＧ変異体または上記プロテインＧドメイン変異体が配列番号５のアミノ酸配列を有するものである請求項２に記載の方法。
  4. 　上記抗体断片が軽鎖を含むものであり、上記不純物が、軽鎖モノマー、軽鎖ダイマーおよび抗体凝集体からなる群より選択される１種以上である請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　上記アフィニティ分離マトリックスを洗浄するために用いる洗浄液の量を３カラムボリューム以上とする請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　上記アフィニティ分離マトリックスから上記抗体断片を分離するための洗浄液として、酢酸、クエン酸およびグリシンからなる群から選択される１種以上の酸の水溶液を用いる請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　上記水溶液のｐＨを２．５以上４．０以下にする請求項６に記載の方法。
     
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