WO2022044727A1 - 有用物質の精製方法 - Google Patents

有用物質の精製方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2022044727A1
WO2022044727A1 PCT/JP2021/028824 JP2021028824W WO2022044727A1 WO 2022044727 A1 WO2022044727 A1 WO 2022044727A1 JP 2021028824 W JP2021028824 W JP 2021028824W WO 2022044727 A1 WO2022044727 A1 WO 2022044727A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
useful substance
containing liquid
soluble magnesium
liquid
magnesium compound
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/028824
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
史憲 鴻池
鉄馬 岸
和信 水口
大 村田
正克 西八條
Original Assignee
株式会社カネカ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社カネカ filed Critical 株式会社カネカ
Priority to JP2022545595A priority Critical patent/JPWO2022044727A1/ja
Priority to EP21861155.6A priority patent/EP4206329A1/en
Priority to KR1020237003532A priority patent/KR20230056661A/ko
Publication of WO2022044727A1 publication Critical patent/WO2022044727A1/ja

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/04—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising compounds of alkali metals, alkaline earth metals or magnesium
    • B01J20/043—Carbonates or bicarbonates, e.g. limestone, dolomite, aragonite
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/04—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising compounds of alkali metals, alkaline earth metals or magnesium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying a useful substance while effectively suppressing the generation of precipitates after adsorbing and removing impurities from a useful substance-containing liquid using a specific adsorbent.
  • Useful peptides such as antibodies and antibody-like molecules are often produced by transformed cells.
  • viruses and virus-like particles are also generally produced by transformed cells and chicken eggs.
  • These useful substances are purified from cell lysate and syrup, but cell lysate and syrup contain many impurities. Therefore, antibodies and antibody-like molecules are purified by using an affinity separation matrix or the like, and viruses and virus-like particles are purified by ultracentrifugation, membrane separation, chromatography and the like.
  • these purification methods are costly and laborious, it is preferable to reduce the amount of impurities in advance to reduce the load of these purification methods.
  • Patent Document 1 describes a high molecular weight organic acid chemically and biologically synthesized from plant residues, microorganisms, and decomposition products of plankton remains by adjusting the concentration and pH of the inorganic salt of the sample solution containing the virus.
  • An invention has been described in which fumic acid, which is a mixture of acids, is easily adsorbed on the surface of hydrophobic beads to purify a virus.
  • the cell disruption solution containing the virus and the urinary fluid also contain impurities such as proteins and nucleic acids, and it is unclear whether the virus can be separated from the proteins and nucleic acids by such a method.
  • Patent Document 2 describes a method of capturing and purifying virus-like particles in an expansion bed of an adsorbent.
  • Insoluble inorganic compounds such as magnesium oxide are also exemplified as the material of the adsorbent, but they are only exemplified as the inert core material of the adsorbent, and the adsorbent actually applied to the test is It has an ion exchanger such as diethylaminoethyl (DEAE) on its surface as a ligand. Therefore, in order to selectively adsorb the target virus-like particles to the adsorbent and prevent other proteins and nucleic acids from being adsorbed, it is necessary to consider conditions such as salt concentration and pH for each sample containing the virus-like particles. It is thought that there is.
  • DEAE diethylaminoethyl
  • the present inventors have developed a method for purifying an antibody or an antibody-like molecule by adsorbing and removing DNA or the like from a culture solution using basic magnesium carbonate or the like (Patent Document 3).
  • the present inventors can adsorb DNA and the like with basic magnesium carbonate and the like, and in order to remove DNA and the like which are impurities from the culture solution of transformed cells that produce useful substances, the basic magnesium carbonate and the like.
  • the present inventors have found that when DNA or the like is adsorbed and removed from a culture solution or the like using basic magnesium carbonate or the like, precipitates are likely to be generated from the culture solution or the like. For example, we have found a problem that precipitates are formed from the obtained treated liquid after removing basic magnesium carbonate or the like that has adsorbed impurities such as DNA. The precipitates produced at this stage interfere with the subsequent purification process.
  • an object of the present invention is to provide a method for purifying a useful substance while effectively suppressing the generation of precipitates after adsorbing and removing impurities from a useful substance-containing liquid using a specific adsorbent.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, they have found that the generation of precipitates can be remarkably suppressed by lowering the pH of the treated liquid after removing a specific adsorbent, and completed the first invention. Hereinafter, the first invention will be shown.
  • a method for purifying a useful substance from a solution containing a useful substance The step of bringing the useful substance-containing liquid into contact with the sparingly soluble magnesium compound, A step of removing the poorly soluble magnesium compound from the useful substance-containing liquid in contact with the poorly soluble magnesium compound to obtain a treated liquid, and A method comprising a step of adjusting the pH of the treated liquid to 8.0 or less.
  • the useful substance-containing liquid is a cell culture liquid or a crude purified liquid thereof.
  • the sparingly soluble magnesium compound is one or more selected from magnesium carbonate, magnesium hydroxide, and magnesium oxide.
  • the poorly soluble magnesium compound contains magnesium carbonate.
  • the useful substance-containing liquid contains nucleic acid, and by contacting the useful substance-containing liquid with the poorly soluble magnesium compound, at least a part of the nucleic acid is adsorbed on the poorly soluble magnesium compound. The method according to any one of [6].
  • the present inventors have found that the generation of precipitates can be remarkably suppressed by treating a liquid containing a useful substance in combination with a specific adsorbent, and completed the second invention.
  • the second invention will be shown.
  • a method for purifying a useful substance from a solution containing a useful substance The step of bringing the useful substance-containing liquid into contact with the sparingly soluble magnesium compound, and A method comprising contacting the useful substance-containing liquid with an aluminum compound.
  • the step of contacting the useful substance-containing liquid with the sparingly soluble magnesium compound is carried out after the step of contacting the useful substance-containing liquid with the aluminum compound.
  • the adsorbent used in the method of the present invention is a specific sparingly soluble magnesium compound that does not require binding of an ion exchange group, a ligand, or the like, or a combination of the sparingly soluble magnesium compound and an aluminum compound, and is therefore very inexpensive and has a surface surface. It does not require the labor of preparation required by an adsorbent having a ligand.
  • the sparingly soluble magnesium compound used in the method of the present invention can reduce the total amount of impurities such as nucleic acids contained in cell disruption solutions containing useful substances such as antibodies, but has low affinity for useful substances. Therefore, useful substances can be purified.
  • the aluminum compound which is another adsorbent used in the second method of the present invention, can adsorb ions derived from the useful substance-containing liquid constituting the precipitate and ions derived from the sparingly soluble magnesium compound, the precipitate in the useful substance-containing liquid. Precipitation can be suppressed. Further, in the first invention, the precipitation of the precipitate from the treated liquid by the adsorbent can be suppressed only by a very simple operation of lowering the pH. Therefore, the present invention is industrially excellent as a technique for easily and efficiently purifying useful substances such as antibodies, antibody-like molecules, viruses, and virus-like particles.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of analysis of the components constituting the solid precipitated from the cell culture medium.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of analysis of ions contained in the untreated cell culture solution, the cell culture solution treated only with basic magnesium carbonate, and the cell culture solution treated with basic magnesium carbonate and acidic alumina. Is.
  • Step 1 Preparation step of useful substance-containing liquid
  • a useful substance-containing liquid to be purified is prepared.
  • the implementation of this step is optional, and it is not necessary to carry out this step when such a useful substance-containing liquid has already been obtained.
  • the useful substance is not particularly limited as long as it is a useful substance produced by cells such as transformed cells, but for example, antibodies, antibody-like molecules, antibody-binding proteins, viruses, virus-like particles, vaccines, hormones, cytokines, etc. Growth factors, enzymes, and plasma proteins can be mentioned.
  • an “antibody” is a protein that specifically recognizes an antigen, and binds to and incapacitates foreign substances such as pathogens that have invaded the body, or activates the complement system to puncture the cell wall of bacteria and kill them. , Has the effect of promoting phagocytosis by phagocytic cells.
  • Human antibodies are roughly classified into five isotypes, IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, and the properties and roles of each isotype differ greatly.
  • IgG is the most abundant antibody in blood and is important for detoxification of risk factors and recognition of antigen-antibody complex by leukocytes and macrophages.
  • the "antibody-like molecule” is a complex of an antibody fragment, a compound other than an antibody such as an antibody or an antibody fragment such as another functional protein, and the antibody fragment, and is particularly similar to an antibody such as mediation of antigen recognition or immune reaction.
  • the "antibody or antibody-like molecule” is not particularly limited, and is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, a single-stranded antibody, a heavy chain antibody, or a multivalent antibody.
  • Antibody Fab, F (ab'), F (ab') 2 , Fc, Fc fusion protein, bispecific antibody, heavy chain (H chain), light chain (L chain), single chain Fv (scFv), sc ( Examples thereof include Fv) 2 , disulfide-bound Fv (sdFv), Diabody, and antibody-like molecular target peptide (microantibody).
  • these antibodies or antibody-like molecules may be Fc-containing proteins such as immunoglobulins and Fc fusion proteins having an Fc moiety, as described above in Fab, F (ab'), F (ab') 2 , Fc, heavy chain (H chain), light chain (L chain), single chain Fv (scFv), sc (Fv) 2 , disulfide bond Fv (sdFv), single chain antibody, heavy chain antibody, multivalent antibody, bi Even low-molecular-weight antibodies such as specific antibodies, diabodies, and antibody-like molecular target peptides (microantibodies) can be preferably targeted.
  • Fc-containing proteins such as immunoglobulins and Fc fusion proteins having an Fc moiety, as described above in Fab, F (ab'), F (ab') 2 , Fc, heavy chain (H chain), light chain (L chain), single chain Fv (scFv), sc (Fv) 2 , disulfide bond Fv (sdF
  • the antibody-binding protein is not particularly limited as long as it is a protein having a specific binding ability to an antibody or an antibody-like molecule, and for example, protein A, protein G, protein L, Fc ⁇ receptor and functional variants thereof can be used. Can be mentioned.
  • Virus refers to a complex in which DNA or RNA has a capsid-coated structure consisting of proteins and does not have self-proliferating ability.
  • non-enveloped viruses include adeno-related virus, adenovirus, enterovirus, parvovirus, papovavirus, human papillomavirus, rotavirus, coxsackie virus, sapovirus, norovirus, poliovirus, echovirus, hepatitis A virus, and hepatitis E virus.
  • Rhinovirus Astrovirus and the like.
  • Adeno-associated viruses are AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV. It has an AAV capsid serum type selected from the group consisting of -12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 and AAV-16.
  • the envelope virus include retrovirus, lentivirus, Sendai virus, simple herpes virus, vaccinia virus, measles virus, baculovirus, influenza virus and the like.
  • Virus-like particles are all or part of the virus shell protein that mainly constitutes capsid, and while there is no concern about infection because they do not contain nucleic acids, they are used as the active ingredient of vaccines because they elicit an immune response. be able to. It is also possible to use it as a drug delivery system by introducing a synthetic nucleic acid into a virus-like particle or enclosing a physiologically active substance or the like by decomposing and reconstructing the virus-like particle.
  • a "vaccine” is a detoxified, attenuated, or partial structure of a pathogen such as a virus or bacterium, and is an antigen used to immunize a living body and prevent an infectious disease or its aggravation. ..
  • a virus vaccine all or part of the virus shell protein constituting the capsid can be used.
  • Hormones “Hormones,” “cytokines,” and “growth factors” are produced and secreted in specific cells, and by binding to specific receptors in other cells with high affinity, they differentiate, exercise, secrete, and take up even trace amounts.
  • a molecule that induces proliferation, etc. and is particularly composed of proteins in the present disclosure.
  • hormones include insulin, glucagon, somatostatin, growth hormone, parathyroid hormone, prolactin, leptin, and calcitonin.
  • cytokines include interleukins, interferons (IFN ⁇ , IFN ⁇ , IFN ⁇ ), and tumor necrosis factor (TNF).
  • growth factors examples include epithelial growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), transforming growth factor (TGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), and vascular endothelial cell proliferation.
  • EGF epithelial growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • TGF nerve growth factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • VEGF vascular endothelial cell proliferation.
  • G-CSF Granulocyte Colony Stimulator
  • GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Stimulator
  • PDGF Thrombotic Growth Factor
  • EPO Erythropoetin
  • TPO Thrombopoetin
  • FGF Fibroblast Growth Factor Factors
  • HGF hepatocellular growth factor
  • Enzyme refers to a protein that is produced in the cells of a living body and has a specific catalytic action against a chemical change in the living body, acts in an extremely small amount, is a remarkably specific catalyst, and is generally a substrate. Catalyze only certain changes in certain groups of.
  • the enzyme include lipase, protease, steroid synthase, kinase, phosphatase, xylanase, esterase, methylase, demethylase, oxidase, reductase, cellulase, aromatase, collagenase, transglutaminase, glycosidase and chitinase.
  • Protein refers to a protein dissolved in plasma, and examples thereof include thrombin, serum albumin, VII factor, VIII factor, IX factor, X factor, and tissue plasminogen activating factor.
  • the useful substance-containing liquid is not particularly limited as long as it is a dispersion liquid or a solution containing a useful substance, and for example, a useful substance obtained from a culture solution of cells for producing a useful substance or a cell culture solution containing a useful substance.
  • the crude purified liquid of is mentioned.
  • the cell culture solution can be produced by culturing cells that produce useful substances. For example, using a vector having a nucleic acid encoding a useful substance, the nucleic acid is introduced into a host cell and transformed, and the transformed cell is cultured. When the useful substance accumulates in the cells, the transformed cells are then separated from the culture medium by centrifugation or filtration, and the obtained cells are disrupted in a buffer solution containing a surfactant or the like.
  • the obtained cell disruption solution may be treated with a nuclease or the like in order to decompose the nucleic acid derived from the host, but according to the method of the present invention, impurities can be effectively removed, so that the amount of expensive nuclease used can be reduced. be able to.
  • the cell disruption solution is subjected to centrifugation or filtration, and the obtained supernatant can be used as a cell culture solution containing a useful substance. If the useful substance is released extracellularly, the cells may simply be removed from the culture medium by centrifugation or filtration. Further, a cell culture medium in which wild cells capable of producing a useful substance are cultured may be used.
  • a conventionally known one can be used as the host cell to be transformed.
  • animal cells such as HEK293 cells, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, 3T3 cells, BHK cells; insect cells such as S2 cells and Sf cells; bacterial cells such as Escherichia coli, bacillus and Bacillus spp.
  • Fungal cells such as yeast and Aspergillus; plant cells and the like.
  • a solution containing a useful substance containing a virus may be produced by a conventional method using eggs such as chickens and ostriches. For example, after disinfecting a chicken egg, the egg is inoculated for 10 to 12 days, a certain amount of virus strain is inoculated into the allantois cavity, and the egg is cultured for 2 to 3 days. The virus is then allowed to stop growing by cooling for about half a day. Then, the urinary solution in which the virus has propagated can be used as a useful substance-containing solution.
  • the crude purification means is not particularly limited as long as the useful substance can be purified, but for example, membrane separation, chromatography, salting out, and centrifugation are used. Included is one or more crude purification means selected from separation, desalting, concentration, solvent exchange. Further, the same crude purification means may be performed twice or more and five times or less.
  • the concentration of the useful substance in the useful substance-containing liquid within a range in which impurities can be effectively removed.
  • the concentration can be adjusted to 1 ⁇ g / mL or more and 1 g / mL or less, and when the useful substance is a virus or a virus-like particle, the concentration can be adjusted. It can be adjusted to 10 4 vg / mL or more and 10 15 vg / mL or less.
  • the pH of the useful substance-containing liquid is preferably adjusted to more than 8.0 before contacting with the sparingly soluble magnesium compound.
  • the pH is more than 8.0, the dissolution of the sparingly soluble magnesium compound can be sufficiently suppressed.
  • the pH is preferably 11.0 or less. When the pH is 11.0 or less, damage such as denaturation of useful substances can be reduced more reliably.
  • the pH is preferably 8.1 or higher or 8.2 or higher, more preferably 8.4 or higher or 8.5 or higher, further preferably 9.0 or higher, and 10.5 or lower or 10.0 or lower. Is preferable, and 9.5 or less is more preferable.
  • the term “poor solubility” refers to the degree to which the powder of the test compound is dissolved in purified water within 30 minutes when the powder of the test compound is put into purified water and shaken vigorously every 5 minutes at 20 ⁇ 5 ° C. for 30 seconds. Means that the amount of water required to dissolve 1 g of the test compound is 400 mL or more.
  • the sparingly soluble magnesium compound one or more selected from magnesium carbonate, magnesium hydroxide, and magnesium oxide is preferable.
  • basic magnesium carbonate which is a mixture of magnesium hydroxide and magnesium carbonate, is also preferably used.
  • magnesium phosphate is not preferable because it has a relatively high water solubility and may adsorb useful substances.
  • the size of the sparingly soluble magnesium compound may be adjusted as appropriate, but for example, the average particle size can be 0.1 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less. If the average particle size is 1000 ⁇ m or less, the specific surface area of the sparingly soluble magnesium compound is sufficiently large and impurities can be adsorbed more efficiently, and if it is 0.1 ⁇ m or more, it is excessive for pulverization. No need for energy. Further, from the viewpoint of handleability at the time of filling into a column, the average particle diameter is preferably 10 ⁇ m or more. In the present disclosure, the average particle size is measured by a laser diffraction type particle size distribution measuring device, and the standard of the average particle size includes a volume standard, a weight standard, a number standard, and the like, but the volume standard is preferable.
  • the shape and structure of the sparingly soluble magnesium compound are not limited, but for example, particles, plates, needles, and tubes can be used. Further, the sparingly soluble magnesium compound having a porous structure has a large specific surface area and is advantageous for removing impurities.
  • tubular basic magnesium carbonate, spherical basic magnesium carbonate in which petal-like crystals are aggregated can be used.
  • the tubular basic magnesium carbonate is microtube particles formed by aggregating leaf-like fine crystals of basic magnesium carbonate, and examples thereof include "Magtube (R) " manufactured by Nittetsu Kogyo Co., Ltd. ..
  • the amount of the sparingly soluble magnesium compound used may be adjusted according to the concentration of the useful substance in the useful substance-containing liquid, and for example, 0.1 g or more and 20 g or less of the sparingly soluble magnesium compound may be used with respect to 100 mL of the useful substance-containing liquid. Just do it.
  • the ratio is preferably 15 g / 100 mL or less.
  • a sparingly soluble magnesium compound of 1% by mass or more and 20% by mass or less can be used with respect to the useful substance, and the ratio is preferably 15% by mass or less.
  • the contact method between the useful substance-containing liquid and the sparingly soluble magnesium compound may be appropriately selected.
  • a sparingly soluble magnesium compound may be added to a liquid containing a useful substance, and the mixture may be shaken or stirred.
  • the temperature at the time of contact may be room temperature, specifically, 1 ° C. or higher and 30 ° C. or lower, and 15 ° C. or higher and 25 ° C. or lower.
  • the contact time can be 5 seconds or more and 10 hours or less.
  • Step for removing the sparingly soluble magnesium compound In this step, the sparingly soluble magnesium compound is removed from the useful substance-containing liquid contacted with the poorly soluble magnesium compound in the previous step 2 to obtain a treated liquid.
  • this step is essential in the first invention, it may also be carried out in the second invention.
  • the sparingly soluble magnesium compound may be separated from the treated liquid by centrifugation, filtration, or the like.
  • the useful substance is mainly dissolved or dispersed in the liquid, and at least a part of the other impurities is mainly adsorbed on the poorly soluble magnesium compound.
  • some of the useful substances may be adsorbed on the poorly soluble magnesium compound, and some of the impurities may be dissolved or dispersed in the liquid, but at least the total amount of impurities in the liquid can be reduced, and the impurities can be reduced.
  • the ratio of useful substances to is improved.
  • the column may be filled with a sparingly soluble magnesium compound, and a useful substance-containing liquid may be passed through the column.
  • adsorption of impurities and the separation of the liquid component from the poorly soluble magnesium compound can be performed at the same time. That is, the previous step 2 and the main step 3 can be carried out at the same time. It is preferable to adjust the filling amount of the sparingly soluble magnesium compound in the column and the flow rate of the useful substance-containing liquid within a range in which impurities are sufficiently adsorbed by the sparingly soluble magnesium compound.
  • a filter having a layer containing a sparingly soluble magnesium compound may be prepared, and impurities of useful substances may be adsorbed on the filter by filtering the liquid containing useful substances with the filter.
  • the adsorption of impurities and the separation of the liquid component from the poorly soluble magnesium compound can be performed at the same time. That is, the previous step 2 and the main step 3 can be carried out at the same time.
  • the poorly soluble magnesium compound layer may be such that the poorly soluble magnesium compound is only deposited on the supporting base material, or the poorly soluble magnesium compound layer may be sandwiched between the supporting base materials from above and below.
  • Examples of the material of the supporting base material include activated carbon; polysaccharides such as cellulose, cellulose acetate, nitrocellulose, agarose and chitosan; synthetic polymers such as polyacrylonitrile, polyester, polyester sulfone, polypropylene and polytetrafluoroethylene; and , One or more water-insoluble media selected from inorganic substances such as diatomaceous soil, pearlite, glass, silica, alumina, zirconia, barium titanate and the like.
  • the impurities adsorbed on the sparingly soluble magnesium compound by this step are not particularly limited as long as they are compounds other than useful substances to be purified, but for example, damaged viruses or damaged virus-like particles, host cell contaminants, and cells.
  • Examples include cultured contaminants.
  • Host cell contaminants include host cell-derived nucleic acids, plasmids, and host cell-derived proteins.
  • Examples of cell culture contaminants include medium components and plasmid DNA for transfection.
  • pH adjustment step In this step, in the previous step 3, impurities other than the useful substance are selectively adsorbed on the poorly soluble magnesium compound by contacting the liquid containing the useful substance with the poorly soluble magnesium compound, and then the poorly soluble magnesium compound is separated. The pH of the treated liquid thus obtained is adjusted to 8.0 or less.
  • This step is indispensably carried out in the first invention.
  • insoluble components may precipitate from such treated liquids, which may cause problems such as clogging of separation membranes and columns used for further purification of useful substances.
  • the details of the insoluble component are unknown, but the sparingly soluble magnesium compound is slightly dissolved, and magnesium ions and / or counter anions thereof are precipitated by forming an insoluble salt with the component in the culture solution.
  • the precipitation of insoluble components is suppressed by lowering the pH of the treated liquid in this step.
  • the damage caused by the precipitation of insoluble components in purification steps such as membrane separation and chromatography is remarkably reduced.
  • an acidic pH adjuster for adjusting the pH.
  • the pH adjusting agent include inorganic pH adjusting agents such as hydrochloric acid, boric acid and phosphoric acid, and organic pH adjusting agents such as acetic acid, citric acid and tartaric acid.
  • the pH adjuster may be a solid one, or may be used in the form of an aqueous solution thereof or a buffer solution containing the pH adjuster.
  • the pH of the treated liquid that has undergone the contact step with the sparingly soluble magnesium compound it is preferable to lower the pH of the treated liquid that has undergone the contact step with the sparingly soluble magnesium compound to 8.0 or less.
  • the pH value is preferably 5.0 or higher.
  • the value is 5.0 or more, damage to useful substances due to low pH can be suppressed more reliably.
  • 6.0 or more is more preferable, 6.5 or more is further preferable, 7.5 or less is more preferable, and 7.0 or less is further preferable.
  • the concentration of ions considered to constitute an insoluble component, particularly carbonate ion is high, it is preferable to adjust the pH of the treated liquid to a lower level.
  • the pH is 5 or more and 8 or less, and when it is more than 10 mol / mL and less than 100 mol / mL, the pH is 5 or more. , 7 or less, preferably 100 mol / mL or more, the pH is preferably adjusted to 5 or more and 6 or less.
  • contact step with aluminum compound by contacting the useful substance-containing liquid with the aluminum compound, at least a part of the ions that cause the precipitation of insoluble components is selectively adsorbed on the aluminum compound, and the useful substance-containing liquid is used. Suppresses the precipitation of insoluble components in.
  • This step is indispensably carried out in the second invention. Conventionally, even if the insoluble component is removed from the useful substance-containing liquid, the insoluble component may be further precipitated, which may cause problems such as clogging of the separation membrane and the column used for further purification of the useful substance.
  • the sparingly soluble magnesium compound is slightly dissolved, and the magnesium ion and / or its counter anion is precipitated by forming an insoluble salt with the component in the useful substance-containing liquid.
  • the precipitation of the insoluble component is suppressed by removing at least a part of ions and the like that cause the precipitation of the insoluble component in this step. As a result, the damage caused by the precipitation of insoluble components in purification steps such as membrane separation and chromatography is remarkably reduced.
  • the contact step between the aluminum compound and the useful substance-containing liquid may be carried out before the contact step between the poorly soluble magnesium compound and the useful substance-containing liquid, or after the contact step with the poorly soluble magnesium compound. It may be carried out at the same time as the contact step with the poorly soluble magnesium compound.
  • the poorly soluble magnesium compound and the aluminum compound may be mixed and brought into contact with the useful substance-containing liquid.
  • Magnesium ions and / or counter anions thereof constituting the sparingly soluble magnesium compound used in the contact step with the sparingly soluble magnesium compound may form an insoluble salt, and these ions can be effectively adsorbed and removed by this step.
  • the aluminum compound used in the present invention is not particularly limited as long as it can adsorb ions that cause precipitation of insoluble components and contains aluminum as a component element, but is not particularly limited, and is, for example, aluminum oxide (alumina) and hydroxide.
  • aluminum oxide include ⁇ -alumina called activated alumina. Activated alumina is classified into acidic alumina (pH 4), basic alumina (pH 9), and neutral alumina (pH 7.5), with acidic alumina being preferred.
  • the size of the aluminum compound may be adjusted as appropriate, but for example, the average particle size can be 0.1 ⁇ m or more and 5000 ⁇ m or less. If the average particle size is 5000 ⁇ m or less, the specific surface area of the aluminum compound is sufficiently large, and the constituents of the insoluble component can be adsorbed more efficiently, and if it is 0.1 ⁇ m or more, it is for pulverization. Does not require excess energy. Further, from the viewpoint of handleability at the time of filling into a column, the average particle diameter is preferably 10 ⁇ m or more.
  • the shape and structure of the aluminum compound are not limited, but for example, particles, lumps, and spheres can be used. Further, the aluminum compound having a porous structure has a large specific surface area and is advantageous for adsorption.
  • the amount of the aluminum compound used may be adjusted according to the concentration of the useful substance in the useful substance-containing liquid, and for example, 0.1 g or more and 20 g or less of the aluminum compound may be used with respect to 100 mL of the useful substance-containing liquid.
  • the ratio is preferably 15 g / 100 mL or less.
  • an aluminum compound of 1% by mass or more and 20% by mass or less can be used with respect to a useful substance, and the ratio is preferably 15% by mass or less.
  • the contact method between the useful substance-containing liquid and the aluminum compound may be appropriately selected.
  • an aluminum compound may be added to a liquid containing a useful substance, and the mixture may be shaken or stirred.
  • the temperature at the time of contact may be room temperature, specifically, 1 ° C. or higher and 30 ° C. or lower, and 15 ° C. or higher and 25 ° C. or lower.
  • the contact time can be 5 seconds or more and 10 hours or less.
  • the aluminum compound may be separated from the useful substance-containing liquid by centrifugation, filtration, or the like in the same manner as in the previous step 4.
  • the useful substance is mainly dissolved or dispersed in the liquid component, and at least a part of the constituent components of the insoluble component is mainly adsorbed on the aluminum compound.
  • some of the useful substances may be adsorbed on the aluminum compound, and some of the constituents of the insoluble component may be dissolved or dispersed in the liquid, but at least the total amount of the constituents of the insoluble component in the liquid is reduced. And the ratio of useful substances to the constituents of the insoluble component is improved.
  • the column may be filled with an aluminum compound and a useful substance-containing liquid may be passed through the column.
  • a useful substance-containing liquid may be passed through the column.
  • the adsorption of the constituent components of the insoluble component and the separation of the liquid component from the aluminum compound can be performed at the same time. It is preferable to adjust the filling amount of the aluminum compound in the column and the flow rate of the useful substance-containing liquid within a range in which impurities are sufficiently adsorbed by the aluminum compound.
  • the poorly soluble magnesium compound and the aluminum compound may be mixed and filled in the column, or the column filled with the poorly soluble magnesium compound and the column filled with the aluminum compound may be connected, or in one column. May be provided with a layer of a poorly soluble magnesium compound and a layer of an aluminum compound.
  • a filter having a layer containing an aluminum compound may be prepared, and the constituent components of the insoluble component may be adsorbed on the filter by filtering the solution containing a useful substance with the filter.
  • the aluminum compound layer may be such that the aluminum compound is only deposited on the supporting base material, or the aluminum compound layer may be sandwiched between the supporting base materials from above and below.
  • Examples of the material of the supporting base material include activated carbon; polysaccharides such as cellulose, cellulose acetate, nitrocellulose, agarose and chitosan; synthetic polymers such as polyacrylonitrile, polyester, polyester sulfone, polypropylene and polytetrafluoroethylene; and , One or more water-insoluble media selected from inorganic substances such as diatomaceous soil, pearlite, glass, silica, alumina, zirconia, barium titanate and the like.
  • contact step with activated carbon In this step, the amount and concentration of impurities are reduced by contacting the activated carbon with the treated liquid obtained by contacting the useful substance-containing liquid or the sparingly soluble magnesium compound with the useful substance-containing liquid. Implementation of this step is optional and may not be performed.
  • the order of carrying out this step, the contact step with the poorly soluble magnesium compound and the contact step with the aluminum compound is not particularly limited. For example, this step may be carried out before or after the above-mentioned contact step with the poorly soluble magnesium compound, or may be carried out after the contact step with the activated carbon and the contact step with the poorly soluble magnesium compound.
  • the contact step with the aluminum compound may be carried out, or the contact step with the activated carbon may be carried out between the contact step with the sparingly soluble magnesium compound and the contact step with the aluminum compound. Further, two or more selected from the poorly soluble magnesium compound, the aluminum compound and the activated carbon are mixed, and two or more selected from the contact step with the poorly soluble magnesium compound, the contact step with the aluminum compound, and the contact step with the activated carbon. The steps of may be carried out at the same time. For example, the poorly soluble magnesium compound and activated carbon may be used in combination to carry out Step 3 and Step 6 at the same time.
  • Activated carbon is made by calcining charcoal, coconut shells, etc. to develop pores to make it porous, and has excellent adsorption performance.
  • the general specific surface area of activated carbon is about 800 m 2 / g or more and 2500 m 2 / g or less.
  • the average pore diameter of the activated carbon is not particularly limited, but is usually 0.1 nm or more, 20 nm or less, preferably 0.5 nm or more, 5.0 nm or less, more preferably 2.0 nm or more, 5.0 nm or less, still more preferably. It is 3.0 nm or more and 5.0 nm or less.
  • the average pore diameter of activated carbon can be calculated by using the BJH method from the nitrogen adsorption isotherm adsorption curve.
  • the shape of the activated carbon is not particularly limited, but for example, granular activated carbon such as crushed carbon, granular charcoal, spherical charcoal, and pellet charcoal; fibrous activated carbon such as fiber and cloth; special molding such as sheet-like, molded body, and honeycomb-like. Activated carbon; and powdered activated carbon.
  • the means of the purification method using the activated carbon of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a batch method, a membrane treatment method, a column chromatography method, and the like, and an appropriate activated carbon shape is selected according to each means.
  • an appropriate activated carbon shape is selected according to each means.
  • a support agent or fiber such as polypropylene or cellulose, or in the form of a cartridge or the like.
  • the amount of activated carbon used may be adjusted according to the concentration of the useful substance in the useful substance-containing liquid or the treated liquid, and for example, 0.5 g or more and 5 g or less of the activated carbon with respect to 100 mL of the useful substance-containing liquid or the treated liquid. Should be used.
  • the contact method between the useful substance-containing liquid or the treated liquid and the activated charcoal is the same as in the case of the sparingly soluble magnesium compound or the aluminum compound.
  • the activated charcoal may be separated by filtration or the like, or the column may be filled with the activated charcoal and a useful substance-containing liquid or a treated liquid may be passed through.
  • the poorly soluble magnesium compound and / or the aluminum compound and the activated carbon may be mixed and used.
  • the above-mentioned contact step with the sparingly soluble magnesium compound, the contact step with the aluminum compound, the contact step with the activated carbon, and the combination of these two or more steps do not sufficiently purify the useful substance in one operation. In that case, it may be repeated twice or more.
  • the upper limit of the number of repetitions is not particularly limited, but can be, for example, 10 times or less, preferably 5 times or less.
  • useful substances cannot be isolated and purified only by the contact step with the sparingly soluble magnesium compound, the contact step with the aluminum compound, and the contact step with the activated carbon, the contact step with the sparingly soluble magnesium compound, optionally aluminum.
  • treatment with a nuclease or the like may be used to decompose the host-derived nucleic acid contained in the treated liquid, but impurities can be effectively removed according to the method of the present invention. Therefore, the amount of expensive nuclease used can be reduced.
  • affinity chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography and the like, and affinity chromatography is particularly preferable.
  • affinity chromatography it is not necessary to adjust the pH of the eluate or the salt concentration in advance, and purification can be performed efficiently.
  • the useful substance to be purified is a virus
  • the amount of virus contained in the solution containing the useful substance is generally small and the amount of impurities is large. Therefore, when the virus or virus-like particles are purified by chromatography, the virus or virus-like particles are to be purified. In advance, impurities are removed by ultrafiltration and viruses or virus-like particles are concentrated.
  • the present invention after treating a useful substance-containing liquid containing a virus or virus-like particles with a sparingly soluble magnesium compound, it is also possible to purify by chromatography without prior ultrafiltration.
  • the amount of the solvent may be reduced to concentrate the useful substance, or the solvent may be replaced.
  • Example 1- First Example of the present invention A resin column (manufactured by Tomoe Seisakusho Co., Ltd.) having an inner diameter of 0.7 cm and a length of 2.5 cm is filled with basic magnesium carbonate (1 g) and a chromatography system (“AKTA”). Connected to "Avant 25” (manufactured by GE Healthcare). In addition, a syringe pump (“YSP-101” manufactured by YMC) was connected immediately after the column, and a static mixer was installed downstream of the syringe pump.
  • YSP-101 manufactured by YMC
  • a CHO culture solution (100 mL, pH 8.18) containing 3.5 mg / mL IgG was sent to the column at a rate of 1 mL / min, and at the same time, a 1 M citrate buffer (pH 5.5) was added to the column using a syringe pump. The liquid was sent at a rate of 08 mL / min, and 10 mL of the treatment liquid was collected in a 15 mL centrifuge tube, for a total of 100 mL. The pH of the treatment solution was lowered to 7.19 by the addition of citric acid buffer.
  • Each recovered liquid was filtered with a filter (manufactured by Kiriyama Glass Co., Ltd., pore size: 1 ⁇ m), and the weight of the collected precipitate was measured.
  • IgG contained in the filtrate was captured by a protein A affinity column (“TSKgel Protein A-5PW” manufactured by Tosoh Corporation), and the IgG concentration in the recovered solution was calculated.
  • the HCP concentration in the recovered solution was calculated using a host cell-derived protein (HCP) detection kit (“CHO Host Cell Protein ELISA Kit, 3rd Generation” manufactured by Cygnus).
  • the DNA concentration in the recovered solution was calculated using a host cell-derived DNA detection kit (“CHO DNA Amplification Kit in Tubes” manufactured by Cygnus). The results are shown in Table 1.
  • Comparative Example 1 A recovery solution was obtained in the same manner as in Example 1 except that the citric acid buffer was not supplied, and the concentrations of IgG, HCP and DNA were determined. The results are shown in Table 1. The pH of the recovered solution increased to 8.60, probably due to the influence of basic magnesium carbonate.
  • Example 1 the IgG concentration, HCP concentration, and DNA concentration values (*) of Example 1 are compared with the results of Comparative Example 1 because the column treatment solution was diluted 8% with the citric acid buffer. Therefore, it is a value obtained by multiplying the calculated value by 1.08.
  • Comparative Example 1 in which the culture solution was only treated with basic magnesium carbonate, a solid was precipitated in the treatment solution. Such solids are believed to adversely affect subsequent chromatography and filtration for purification of IgG.
  • the pH of the culture solution was adjusted to 7.19 by adding an acidic buffer to the treatment solution obtained by treating the culture solution with basic magnesium carbonate, no solid precipitation was observed, and HCP and DNA were found. IgG could be recovered while effectively reducing the concentration.
  • Example 2- First Example of the present invention 0.1 g / L salmon sperm-derived DNA-containing solution prepared using each buffer, IgG-containing CHO culture supernatant, medium for HEK cells (“Advanced DMEM” manufactured by gibco). ) Or the medium for CHO cells ("ExpiCHO Expression Medium” manufactured by gibco), basic magnesium carbonate was added at a concentration of 1% by mass, and the mixture was stirred.
  • the buffers used to prepare the salmon sperm-derived DNA-containing solution include phosphate buffered saline (PBS), 25 mM MES (pH 7.0), 25 mM HEPES (pH 7.0), 25 mM tricine (pH 7.8), and A 25 mM Tris buffer (pH 7.5) was used. Then, the basic magnesium carbonate was precipitated by centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was recovered. 1M citric acid buffer (pH 5.5) was added to the recovered supernatant to neutralize it. The DNA concentration was determined by measuring the absorbance (UV260 nm) of the neutralized supernatant. Then, the neutralized supernatant was once frozen and then thawed, and the presence or absence of precipitates was confirmed. The results are shown in Table 2.
  • Example 3 Suppression of insoluble solid precipitation after treatment with a sparingly soluble magnesium compound-Second Example of the present invention
  • Adsorption treatment 1w / v% basic magnesium carbonate (Kishida) in an IgG-containing CHO culture solution (Chemical Co., Ltd.) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour with a mix rotor. Then, the supernatant was collected by centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute to obtain a primary treatment liquid.
  • HCP host cell-derived protein
  • the major ions in the solid precipitated in the culture solution after the basic magnesium carbonate treatment are Mg 2+ , NH 4+ , PO 4 3- , CO 3 2- , and SO 4 2- . Therefore, it was considered that solid precipitation could be suppressed if some or all of these could be reduced.
  • Example 3 Quantification of Ions in Culture Solution and Treatment Solution
  • the main ions identified in Example 3 (5) were quantified.
  • the results are shown in FIG.
  • the concentrations of Mg 2+ and CO 3 2- increase, but due to the acid alumina treatment in the subsequent stage, Mg 2+ , PO 4 3- and CO 3 2- were reduced. From this result, it was shown that the precipitation suppression mechanism by the acidic alumina treatment is due to the reduction of Mg 2+ , PO 4 3- , and CO 3 2- , which are the main components of the precipitated solid.
  • Example 4 Precipitation Suppressing Effect by Aluminum Compound-Second Example of the Present Under the same conditions as in Example 1, various aluminum compounds (manufactured by Merck) are used as a secondary adsorbent to measure the amount of solid precipitate. However, it was evaluated according to the following criteria. The results are shown in Table 6. ⁇ : No precipitation ⁇ : Precipitation amount is about 25% of the precipitation amount without the secondary adsorbent ⁇ : Precipitation amount is about 50% of the precipitation amount without the secondary adsorbent ⁇ : Precipitation amount is Similar to the amount of precipitation without a secondary adsorbent
  • Example 5 Examination of Treatment Conditions with Acid Alumina-Second Example A solid when the order of treatment with basic magnesium carbonate and treatment with acidic alumina is changed based on the same method as in Example 3 of the present invention. The effects on the precipitation suppression effect were compared. The results are shown in Table 7.
  • Example 6 Deposition inhibitory effect of DNA on PBS solution-A PBS solution of salmon semen-derived DNA having a concentration of 100 mg / L was prepared as a second example model solution of the present invention. Then, in the same manner as in Example 3, the solution was treated under the conditions shown in Table 8, and then the absorbance (UV 260 nm) was measured to determine the DNA concentration. The results are shown in Table 8.
  • Example 7 Precipitation suppressing effect of a column packed with basic magnesium carbonate and acidic alumina-Column A in which 1000 mg of basic magnesium carbonate is filled in a commercially available column of 1 mL of the second Example Solid Volume (CV) of the present invention, said.
  • Column B is filled with two layers of basic magnesium carbonate 500 mg upstream and acidic alumina 500 mg downstream, and the column is filled with two layers of acidic alumina 500 mg upstream and basic magnesium carbonate 500 mg downstream.
  • 50 mL of the IgG-containing CHO culture solution was passed through the column C in which the layer order of the above was changed at a rate of 1 mL / min, and 10 CVs were separated and the state of solid precipitation was visually evaluated. The results are shown in Table 9.
  • Example 8 Precipitation suppressing effect on various culture solutions-Second Example of the present invention
  • culture solutions derived from various hosts expressing various useful proteins are treated and solid precipitation is performed. The state of was visually evaluated.
  • the recovery rate of the expressed protein was calculated by the densitometry intensity ratio of the band using general SDS-PAGE. The results are shown in Table 10.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

本発明は、特定の吸着剤を使って有用物質含有液から不純物を吸着除去した後における析出物の発生を有効に抑制しつつ有用物質を精製する方法を提供することを目的とする。本発明に係る第一の有用物質含有液から有用物質を精製するための方法は、前記有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物に接触させる工程、前記難溶性マグネシウム化合物に接触させた前記有用物質含有液から前記難溶性マグネシウム化合物を除去して処理済液を得る工程、および、前記処理済液のｐＨを８．０以下に調整する工程を含むことを特徴とする。本発明に係る第二の有用物質含有液から有用物質を精製するための方法は、前記有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物に接触させる工程、および、前記有用物質含有液をアルミニウム化合物に接触させる工程を含むことを特徴とする。

Description

有用物質の精製方法
　本発明は、特定の吸着剤を使って有用物質含有液から不純物を吸着除去した後における析出物の発生を有効に抑制しつつ有用物質を精製する方法に関するものである。
　抗体や抗体様分子などの有用ペプチドは、形質転換細胞に生産させることが多い。また、ウイルスやウイルス様粒子も、一般的に形質転換細胞や鶏卵などに生産させる。これら有用物質は、細胞破砕液や漿尿液から精製されるが、細胞破砕液や漿尿液は多くの不純物を含む。よって、抗体や抗体様分子はアフィニティ分離マトリックス等を使って精製され、ウイルスやウイルス様粒子は、超遠心法、膜分離、クロマトグラフィー等を使って精製される。しかし、これら精製方法にはコストや手間がかかるため、事前に不純物量を低減してこれら精製方法の負荷を軽減することが好ましい。
　例えば特許文献１には、ウイルスを含有するサンプル液の無機塩濃度とｐＨを調整することにより、植物残渣、微生物、プランクトンの遺骸の分解生成物から化学的・生物的に合成される高分子有機酸の混合物であるフミン酸が疎水性ビーズの表面に吸着され易くして、ウイルスを精製する発明が記載されている。しかし、ウイルスを含む細胞破砕液や漿尿液にはタンパク質や核酸などの不純物も含まれており、かかる方法によりタンパク質や核酸などからウイルスを分離できるかは不明である。
　特許文献２には、吸着体の拡張ベッドにウイルス様粒子を捕捉して精製する方法が記載されている。かかる吸着体の材料としては酸化マグネシウム等の不溶性無機化合物も例示されているが、それらは吸着体の不活性コア材料として例示されているのみであり、実際に試験に付されている吸着剤はジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等のイオン交換体をリガンドとして表面に有するものである。よって、目的のウイルス様粒子を吸着体へ選択的に吸着させ、その他のタンパク質や核酸を吸着しないようにするには、ウイルス様粒子を含むサンプル毎に塩濃度やｐＨ等の条件を検討する必要があると考えられる。
　本発明者らは、塩基性炭酸マグネシウム等を用いて培養液からＤＮＡ等を吸着除去し、抗体または抗体様分子を精製する方法を開発している（特許文献３）。
国際公開第２０１５／１１１６０６号パンフレット 特開２０１７－５５７６６号公報 国際公開第２０２０／０４５２９０号パンフレット
　上述したように、本発明者らは塩基性炭酸マグネシウム等がＤＮＡ等を吸着でき、有用物質を生産する形質転換細胞の培養液などから不純物であるＤＮＡ等を除去するために塩基性炭酸マグネシウム等が使えることを見出している。
　しかし本発明者らは、培養液などから塩基性炭酸マグネシウム等を使ってＤＮＡ等を吸着除去すると、培養液などから析出物が生じ易くなるという問題を見出した。例えば、ＤＮＡ等の不純物を吸着した塩基性炭酸マグネシウム等を除去した後に、得られた処理済液から析出物が生じるという問題を見出した。この段階で生じる析出物は、その後の精製工程の障害となる。例えば、有用物質を濾過やクロマトグラフィーにより精製する場合には、析出物がフィルターやカラム、配管などの目詰まりの原因になり得る。
　そこで本発明は、特定の吸着剤を使って有用物質含有液から不純物を吸着除去した後における析出物の発生を有効に抑制しつつ有用物質を精製する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特定の吸着剤を除去した後の処理済液のｐＨを低下させることで析出物の発生を顕著に抑制できることを見出して、第一の本発明を完成した。
　以下、第一の本発明を示す。
　［１］　有用物質含有液から有用物質を精製するための方法であって、
　前記有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物に接触させる工程、
　前記難溶性マグネシウム化合物に接触させた前記有用物質含有液から前記難溶性マグネシウム化合物を除去して処理済液を得る工程、および、
　前記処理済液のｐＨを８．０以下に調整する工程を含むことを特徴とする方法。
　［２］　前記有用物質含有液のｐＨが８．０超である前記［１］に記載の方法。
　［３］　前記処理済液のｐＨを５．０以上、８．０以下に調整する前記［１］または［２］に記載の方法。
　［４］　前記有用物質含有液が細胞培養液またはその粗精製液である前記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
　［５］　前記難溶性マグネシウム化合物が、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、および酸化マグネシウムから選択される１以上である前記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
　［６］　前記難溶性マグネシウム化合物が炭酸マグネシウムを含む前記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
　［７］　前記有用物質含有液が核酸を含み、前記有用物質含有液を前記難溶性マグネシウム化合物に接触させることにより、前記核酸の少なくとも一部を前記難溶性マグネシウム化合物に吸着させる前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
　［８］　前記有用物質含有液が有用物質として抗体または抗体様分子を含む前記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
　［９］　前記有用物質含有液が有用物質としてウイルスまたはウイルス様粒子を含む前記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
　また、本発明者らは、特定の吸着剤を組み合わせて有用物質含有液を処理することにより析出物の発生を顕著に抑制できることを見出して、第二の本発明を完成した。
　以下、第二の本発明を示す。
　［１０］　有用物質含有液から有用物質を精製するための方法であって、
　前記有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物に接触させる工程、および、
　前記有用物質含有液をアルミニウム化合物に接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
　［１１］　前記有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物に接触させる工程の後に、前記有用物質含有液をアルミニウム化合物に接触させる工程を実施する前記［１０］に記載の方法。
　［１２］　前記有用物質含有液をアルミニウム化合物に接触させる工程の後に、前記有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物に接触させる工程を実施する前記［１０］に記載の方法。
　［１３］　前記有用物質含有液が細胞培養液またはその粗精製液である前記［１０］～［１２］のいずれかに記載の方法。
　［１４］　マグネシウムイオン、リン酸イオン、および炭酸イオンから選択される１以上のイオンを前記アルミニウム化合物に吸着させる前記［１０］～［１３］のいずれかに記載の方法。
　［１５］　前記難溶性マグネシウム化合物が、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、および酸化マグネシウムから選択される１以上である前記［１０］～［１４］のいずれかに記載の方法。
　［１６］　前記難溶性マグネシウム化合物が炭酸マグネシウムを含む前記［１０］～［１５］のいずれかに記載の方法。
　［１７］　前記アルミニウム化合物が、酸化アルミニウム、および水酸化アルミニウムから選択される１以上である前記［１０］～［１６］のいずれかに記載の方法。
　［１８］　前記有用物質含有液が有用物質として抗体または抗体様分子を含む前記［１０］～［１７］のいずれかに記載の方法。
　［１９］　前記有用物質含有液が有用物質としてウイルスまたはウイルス様粒子を含む前記［１０］～［１７］のいずれかに記載の方法。
　本発明方法で用いる吸着剤は、イオン交換基やリガンド等を結合させる必要のない特定の難溶性マグネシウム化合物、または難溶性マグネシウム化合物とアルミニウム化合物との組み合わせであるので、非常に安価であり、表面にリガンドを有する吸着剤が必要とするような作製の手間がかからない。また、本発明方法で用いる吸着剤である難溶性マグネシウム化合物は、抗体などの有用物質を含む細胞破砕液などに含まれる核酸などの不純物の総量を低減できる一方で、有用物質に対する親和性は低いため、有用物質を精製することができる。第二の本発明方法で用いる別の吸着剤であるアルミニウム化合物は、析出物を構成する有用物質含有液由来のイオンや難溶性マグネシウム化合物由来のイオンを吸着できるため、有用物質含有液における析出物の析出を抑制することができる。更に第一の本発明では、ｐＨを低下させるという極めて簡便な操作のみで、吸着剤による処理済液からの析出物の析出を抑制することができる。よって本発明は、抗体、抗体様分子、ウイルス、およびウイルス様粒子といった有用物質を簡便かつ効率的に精製できる技術として、産業上非常に優れている。
図１は、細胞培養液から析出する固体を構成する成分を分析した結果を示すグラフである。 図２は、未処理細胞培養液、塩基性炭酸マグネシウムのみで処理した細胞培養液、及び塩基性炭酸マグネシウムと酸性アルミナで処理した細胞培養液の液分に含まれるイオンを分析した結果を示すグラフである。
　以下、本発明方法を工程に分けて説明するが、本発明は以下の具体例に限定されるものではない。例えば、以下において記載する本発明の個々の好ましい態様を２つ以上組み合わせた態様もまた、本発明の好ましい態様である。
　１．有用物質含有液の調製工程
　本工程では、精製対象である有用物質含有液を調製する。本工程の実施は任意であり、既にかかる有用物質含有液が得られている場合などには本工程を実施する必要は無い。
　有用物質は、形質転換細胞などの細胞により製造される有用なものであれば特に制限されないが、例えば、抗体、抗体様分子、抗体結合性タンパク質、ウイルス、ウイルス様粒子、ワクチン、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、および血漿タンパク質が挙げられる。
　「抗体」とは、抗原を特異的に認識するタンパク質であり、体内に侵入した病原体などの異物に結合して無力化したり、補体系を活性化してバクテリアの細胞壁に穴を開けて殺傷したり、貪食細胞による食作用を促すといった作用を有する。ヒトの抗体はＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のアイソタイプに大別され、各アイソタイプの性質や役割は大きく異なる。特にＩｇＧは血液中で最も多い抗体であり、危険因子の無毒化、白血球やマクロファージによる抗原・抗体複合体の認識に重要である。
　本開示において「抗体様分子」とは、抗体断片や、他の機能性タンパク質など抗体や抗体断片以外の化合物と抗体断片との複合体であり、特に抗原認識や免疫反応の媒介など抗体と同様の機能を有するタンパク質をいい、「抗体または抗体様分子」としては、特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、重鎖抗体、多価抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ、Ｆｃ融合タンパク質、バイスペシフィック抗体、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）2、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙ、抗体様分子標的ペプチド（マイクロ抗体）などが挙げられる。本開示においては、これら抗体または抗体様分子として、免疫グロブリン、Ｆｃ部を有するＦｃ融合タンパク質などのＦｃ含有タンパク質であってもよく、上記Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）2、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、一本鎖抗体、重鎖抗体、多価抗体、バイスペシフィック抗体、Ｄｉａｂｏｄｙ、抗体様分子標的ペプチド（マイクロ抗体）といった低分子化抗体であっても、いずれも好ましく対象とすることができる。
　抗体結合性タンパク質は、抗体または抗体様分子に特異的な結合能をもつタンパク質であれば特に限定されず、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃγ受容体およびそれらの機能性変異体が挙げられる。
　「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡがタンパク質からなるカプシドで被覆された構造を有し、自己増殖能を有さない複合体をいう。例えば、ノンエンベロープウイルスとしては、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ヒトパピローマウイルス、ロタウイルス、コクサッキーウイルス、サポウイルス、ノロウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、アストロウイルス等が挙げられる。アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５およびＡＡＶ－１６からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型を有する。エンベロープウイルスとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、バキュロウイルス、インフルエンザウイルス等が挙げられる。
　「ウイルス様粒子」は、主にカプシドを構成するウイルス外殻タンパク質の全部または一部であり、核酸を含まないため感染の懸念が無い一方で、免疫反応を惹起するためワクチンの有効成分として用いることができる。また、ウイルス様粒子に合成核酸を導入したり、ウイルス様粒子を分解・再構築することで生理活性物質などを封入する等して、ドラッグデリバリーシステムとして利用することも可能である。
　「ワクチン」は、ウイルスや細菌などの病原体の無毒化体、弱毒化体、または一部構造であり、生体に免疫をつくらせて感染症やその重症化を予防するために用いられる抗原である。例えばウイルスワクチンとしては、カプシドを構成するウイルス外殻タンパク質の全部または一部を利用することができる。
　「ホルモン」、「サイトカイン」、「成長因子」とは、特定の細胞で生産、分泌され、別の細胞の特異的受容体に高親和性結合することで、微量でも分化、運動、分泌、取り込み、増殖などを誘導する分子であり、本開示では特に、タンパク質で構成されたものを示す。ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、レプチン、カルシトニンが挙げられる。サイトカインとしては、例えば、インターロイキン、インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。成長因子としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が挙げられる。
　「酵素」とは、生体の細胞内で生産され、生体内の化学変化に対して特異的触媒作用のあるタンパク質をいい、極めて微量で作用し、また、著しく特異的な触媒であり、一般に基質のある特定の基の特定の変化のみを触媒する。酵素としては、例えば、リパーゼ、プロテアーゼ、ステロイド合成酵素、キナーゼ、フォスファターゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、酸化酵素、還元酵素、セルラーゼ、アロマターゼ、コラゲナーゼ、トランスグルタミナーゼ、グリコシダーゼおよびキチナーゼが挙げられる。
　「血漿タンパク質」とは、血漿中に溶解しているタンパク質をいい、例えば、トロンビン、血清アルブミン、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、組織プラスミノゲン活性化因子が挙げられる。
　本発明において有用物質含有液は、有用物質を含む分散液や溶液であれば特に制限されないが、例えば、有用物質を製造する細胞の培養液や、有用物質を含む細胞培養液から得られる有用物質の粗精製液が挙げられる。
　細胞培養液は、有用物質を製造する細胞を培養することにより製造することができる。例えば、有用物質をコードする核酸を有するベクターを用い、宿主細胞に核酸を導入して形質転換し、形質転換細胞を培養する。有用物質が細胞内に蓄積する場合には、次いで、形質転換細胞を遠心分離や濾過により培養液から分離し、界面活性剤などを含む緩衝液などの中で得られた細胞を破砕する。得られた細胞破砕液は、宿主由来の核酸を分解するためにヌクレアーゼ等で処理してもよいが、本発明方法によれば不純物を有効に除去できるため、高価なヌクレアーゼの使用量を低減することができる。細胞破砕液を遠心分離や濾過に付し、得られた上清を、有用物質を含む細胞培養液として用いることができる。有用物質が細胞外に放出される場合には、遠心分離や濾過により培養液から細胞を単に除去するのみでもよい。また、有用物質を製造できる野生細胞を培養した細胞培養液を用いてもよい。
　形質転換すべき宿主細胞としては、従来公知のものを用いることができる。例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞などの動物細胞；Ｓ２細胞、Ｓｆ細胞などの昆虫細胞；大腸菌、枯草菌、バチルス属菌などの細菌細胞；酵母、アスペルギルスなどの真菌細胞；植物細胞などが挙げられる。
　その他、ウイルスを含む有用物質含有液は、ニワトリやダチョウ等の卵を用いる常法により製造すればよい。例えば、鶏卵を消毒した後、１０～１２日間ふ卵させ、尿膜腔内に一定量のウイルス株を接種し、２～３日間培養する。次いで約半日間冷却することによりウイルスの増殖を中止させる。その後、ウイルスが増殖した漿尿液を有用物質含有液として用いることができる。
　細胞培養液から有用物質を粗精製して粗精製液を得る場合、粗精製手段としては、有用物質を精製できるものであれば特に制限されないが、例えば、膜分離、クロマトグラフィー、塩析、遠心分離、脱塩、濃縮、溶媒交換から選択される１以上の粗精製手段が挙げられる。また、同一の粗精製手段を２回以上、５回以下行ってもよい。
　有用物質含有液における有用物質の濃度は、不純物を有効に除去できる範囲で適宜調整することが好ましい。例えば有用物質が抗体などのタンパク質である場合には、前記濃度を１μｇ／ｍＬ以上、１ｇ／ｍＬ以下に調整することができ、有用物質がウイルスまたはウイルス様粒子である場合には、前記濃度を１０4ｖｇ／ｍＬ以上、１０15ｖｇ／ｍＬ以下に調整することができる。
　第一の本発明においては、有用物質含有液のｐＨは、難溶性マグネシウム化合物と接触させる前に、８．０超に調整しておくことが好ましい。当該ｐＨが８．０超であれば、難溶性マグネシウム化合物の溶解を十分に抑制することができる。一方、前記ｐＨとしては１１．０以下が好ましい。前記ｐＨが１１．０以下であれば、有用物質の変性などのダメージをより確実に低減することができる。前記ｐＨとしては、８．１以上または８．２以上が好ましく、８．４以上または８．５以上がより好ましく、９．０以上がより更に好ましく、また、１０．５以下または１０．０以下が好ましく、９．５以下がより好ましい。
　２．難溶性マグネシウム化合物との接触工程
　本工程では、有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物に接触させることにより、有用物質以外の少なくとも一部の不純物を選択的に難溶性マグネシウム化合物に吸着させ、有用物質含有液における不純物に対する有用物質の相対割合を高め、精製する。なお、本工程での「精製」とは、難溶性マグネシウム化合物に接触させる前の有用物質含有液における不純物に対する有用物質の割合が向上することをいう。
　本開示において難溶性とは、被検化合物の粉末を精製水に入れ、２０±５℃で５分ごとに強く３０秒間振り混ぜるとき、３０分以内に精製水に溶ける度合をいい、具体的には被検化合物１ｇを溶かすのに要する水の量が、４００ｍＬ以上であることをいう。
　難溶性マグネシウム化合物としては、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、および酸化マグネシウムから選択される１以上が好ましい。例えば、水酸化マグネシウムと炭酸マグネシウムの混合物である塩基性炭酸マグネシウムも好適に用いられる。但し、マグネシウムのリン酸塩は、水溶性が比較的高かったり、有用物質を吸着してしまうおそれがあり得るため、好ましくない。
　難溶性マグネシウム化合物の大きさは適宜調整すればよいが、例えば、平均粒子径を０．１μｍ以上、１０００μｍ以下とすることができる。当該平均粒子径が１０００μｍ以下であれば、難溶性マグネシウム化合物の比表面積は十分に大きく、不純物をより効率的に吸着することができ、また、０．１μｍ以上であれば、粉砕のために過剰なエネルギーが必要無い。また、カラムへの充填の際などにおける取扱性の観点から、上記平均粒子径としては１０μｍ以上が好ましい。なお、本開示において平均粒子径は、レーザー回折式粒度分布測定装置により測定するものとし、平均粒子径の基準としては、体積基準、重量基準、数基準などがあるが、体積基準が好ましい。
　難溶性マグネシウム化合物の形状や構造には制限はないが、例えば、粒子状、板状、針状、チューブ状のものを使用することができる。また、多孔質構造の難溶性マグネシウム化合物は比表面積が大きく、不純物除去に有利である。例えば、チューブ状塩基性炭酸マグネシウム、花弁状結晶が集合した球状塩基性炭酸マグネシウム（特開２００８－１３７８２７号公報を参照）などを使用することができる。なお、チューブ状塩基性炭酸マグネシウムは、塩基性炭酸マグネシウムのリーフ状微細結晶が集合して形成されたマイクロチューブ粒子であり、例えば、日鉄工業社製の「マグチューブ(R)」が挙げられる。
　難溶性マグネシウム化合物の使用量は、有用物質含有液における有用物質の濃度などにより調整すればよいが、例えば、有用物質含有液１００ｍＬに対して０．１ｇ以上、２０ｇ以下の難溶性マグネシウム化合物を用いればよい。当該割合としては、１５ｇ／１００ｍＬ以下が好ましい。また、有用物質に対して１質量％以上、２０質量％以下の難溶性マグネシウム化合物を用いることができ、当該割合としては１５質量％以下が好ましい。
　有用物質含有液と難溶性マグネシウム化合物との接触方法は、適宜選択すればよい。例えば、有用物質含有液に難溶性マグネシウム化合物を加え、振とうや攪拌すればよい。接触の際の温度は常温でよく、具体的には１℃以上、３０℃以下とすることができ、１５℃以上、２５℃以下としてもよい。また、接触時間としては、５秒間以上、１０時間以下とすることができる。
　３．難溶性マグネシウム化合物の除去工程
　本工程では、前工程２において難溶性マグネシウム化合物に接触させた有用物質含有液から難溶性マグネシウム化合物を除去して処理済液を得る。本工程は、第一の本発明では必須的に実施するが、第二の本発明でも実施してもよい。
　前工程２における接触後は、遠心分離や濾過などにより処理済液から難溶性マグネシウム化合物を分離すればよい。この際、有用物質は主に液分に溶解または分散しており、それ以外の不純物の少なくとも一部は主に難溶性マグネシウム化合物に吸着されている。また、有用物質の一部が難溶性マグネシウム化合物に吸着され、不純物の一部が液分に溶解または分散していることもあるが、少なくとも液分における不純物の総量は低減することができ、不純物に対する有用物質の割合は向上する。
　難溶性マグネシウム化合物をカラムに充填し、有用物質含有液を当該カラムに通液してもよい。この場合、不純物の吸着と、難溶性マグネシウム化合物からの液分の分離を同時に行うことができる。即ち、前工程２と本工程３を同時に実施することができる。カラムにおける難溶性マグネシウム化合物の充填量や、有用物質含有液の流速は、不純物が難溶性マグネシウム化合物に十分に吸着される範囲で調整することが好ましい。
　難溶性マグネシウム化合物を含む層を有するフィルターを作製し、有用物質含有液を当該フィルターで濾過することにより有用物質の不純物をフィルターに吸着させてもよい。この場合も、不純物の吸着と、難溶性マグネシウム化合物からの液分の分離を同時に行うことができる。即ち、前工程２と本工程３を同時に実施することができる。難溶性マグネシウム化合物層は、難溶性マグネシウム化合物が支持基材上に堆積しているのみであってもよいし、或いは、難溶性マグネシウム化合物層を支持基材で上下から挟んでもよい。支持基材層の材質としては、例えば、活性炭；セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、アガロース、キトサン等の多糖類；ポリアクリロニトリル、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン等の合成ポリマー；および、珪藻土、パーライト、ガラス、シリカ、アルミナ、ジルコニア、チタン酸バリウム等の無機物質から選択される１以上の水不溶性媒体が挙げられる。
　本工程により難溶性マグネシウム化合物に吸着される不純物は、精製対象である有用物質以外の化合物であれば特に制限されないが、例えば、損傷したウイルスまたは損傷したウイルス様粒子、宿主細胞夾雑物、および細胞培養夾雑物が挙げられる。宿主細胞夾雑物としては、宿主細胞由来の核酸、プラスミド、宿主細胞由来のタンパク質が挙げられる。細胞培養夾雑物としては、培地成分やトランスフェクション用のプラスミドＤＮＡが挙げられる。
　４．ｐＨ調整工程
　本工程では、前工程３において、有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物に接触させることにより有用物質以外の不純物を選択的に難溶性マグネシウム化合物に吸着させ、次いで難溶性マグネシウム化合物を分離して得られた処理済液のｐＨを、８．０以下に調整する。本工程は、第一の本発明では必須的に実施する。従来、かかる処理済液からは不溶成分が析出し、有用物質の更なる精製に用いる分離膜やカラムに目詰まり等の障害を与えることがあった。かかる不溶成分の詳細は不明であるが、難溶性マグネシウム化合物が僅かに溶解しており、マグネシウムイオン及び／又はそのカウンターアニオンが培養液中の成分と不溶性の塩を形成して析出したものである可能性がある。それに対して本発明では、本工程で処理済液のｐＨを低下させることにより、不溶成分の析出を抑制している。その結果、膜分離やクロマトグラフィー等などの精製工程における不溶成分の析出による障害が顕著に軽減されている。
　ｐＨの調整には、酸性のｐＨ調整剤を用いることが好ましい。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、ホウ酸、リン酸などの無機ｐＨ調整剤や、酢酸、クエン酸、酒石酸などの有機ｐＨ調整剤が挙げられる。ｐＨ調整剤は、固形のものを用い得る他、その水溶液や、それを含む緩衝液の形態で用いることもできる。
　本工程では、難溶性マグネシウム化合物との接触工程を経た処理済液のｐＨを８．０以下へ低下させることが好ましい。前記ｐＨ調整前後におけるｐＨ値が８．０以下であれば、不溶成分の析出をより確実に抑制することができる。また、前記ｐＨ値としては５．０以上が好ましい。当該値が５．０以上であれば、低ｐＨによる有用物質のダメージをより確実に抑制することができる。前記値としては、６．０以上がより好ましく、６．５以上がより更に好ましく、また、７．５以下がより好ましく、７．０以下がより更に好ましい。
　また、不溶成分を構成すると考えられるイオン、特に炭酸イオンの濃度が高い場合には、処理済液のｐＨをより低く調整することが好ましい。例えば、処理済液における炭酸イオンが１ｍｏｌ／ｍＬ以上、１０ｍｏｌ／ｍＬ未満である場合にはｐＨを５以上、８以下に、１０ｍｏｌ／ｍＬ超、１００ｍｏｌ／ｍＬ未満である場合にはｐＨを５以上、７以下に、１００ｍｏｌ／ｍＬ以上である場合にはｐＨを５以上、６以下に調整することが好ましい。かかるｐＨ調整により、処理済液における不溶成分の析出をより効率的に抑制することができる。
　５．アルミニウム化合物との接触工程
　本工程では、有用物質含有液をアルミニウム化合物に接触させることにより、不溶成分の析出の原因となるイオンの少なくとも一部を選択的にアルミニウム化合物に吸着させ、有用物質含有液における不溶成分の析出を抑制する。本工程は、第二の本発明では必須的に実施する。従来、有用物質含有液から不溶成分を除去しても、不溶成分が更に析出し、有用物質の更なる精製に用いる分離膜やカラムに目詰まり等の障害を与えることがあった。かかる不溶成分の詳細は不明であるが、難溶性マグネシウム化合物が僅かに溶解しており、マグネシウムイオン及び／又はそのカウンターアニオンが有用物質含有液中の成分と不溶性の塩を形成して析出したものである可能性や、有用物質含有液の成分が不溶性の塩を形成する可能性の他、過飽和した難溶性マグネシウム化合物が単に再析出する可能性もある。それに対して本発明では、本工程で不溶成分の析出の原因となるイオン等の少なくとも一部を除去することにより、不溶成分の析出を抑制している。その結果、膜分離やクロマトグラフィー等などの精製工程における不溶成分の析出による障害が顕著に軽減されている。
　なお、アルミニウム化合物と有用物質含有液との接触工程は、前記難溶性マグネシウム化合物と有用物質含有液との接触工程の前に実施してもよいし、前記難溶性マグネシウム化合物との接触工程の後に実施してもよいし、前記難溶性マグネシウム化合物との接触工程と同時に実施してもよい。アルミニウム化合物との接触工程と前記難溶性マグネシウム化合物との接触工程を同時に実施する場合には、難溶性マグネシウム化合物とアルミニウム化合物を混合して有用物質含有液と接触させればよい。但し、前記難溶性マグネシウム化合物との接触工程を実施した後にアルミニウム化合物との接触工程を実施することが好ましい。難溶性マグネシウム化合物との接触工程で用いる難溶性マグネシウム化合物を構成するマグネシウムイオン及び／又はそのカウンターアニオンが不溶性の塩を形成する可能性があり、本工程によりこれらイオンを有効に吸着除去でき得る。
　本発明で用いるアルミニウム化合物は、不溶成分の析出の原因となるイオンを吸着できるものであり且つ成分元素としてアルミニウムを含むものであれば特に制限されないが、例えば、酸化アルミニウム（アルミナ）、および水酸化アルミニウムから選択される１以上が好ましい。酸化アルミニウムとしては、活性アルミナといわれるγ－アルミナが挙げられる。活性アルミナは、酸性アルミナ（ｐＨ４）、塩基性アルミナ（ｐＨ９）、および中性アルミナ（ｐＨ７．５）に分類されるが、酸性アルミナが好ましい。
　アルミニウム化合物の大きさは適宜調整すればよいが、例えば、平均粒子径が０．１μｍ以上、５０００μｍ以下とすることができる。当該平均粒子径が５０００μｍ以下であれば、アルミニウム化合物の比表面積は十分に大きく、不溶成分の構成成分をより効率的に吸着することができ、また、０．１μｍ以上であれば、粉砕のために過剰なエネルギーが必要無い。また、カラムへの充填の際などにおける取扱性の観点から、上記平均粒子径としては１０μｍ以上が好ましい。
　アルミニウム化合物の形状や構造には制限はないが、例えば、粒子状、塊状、球状のものを使用することができる。また、多孔質構造のアルミニウム化合物は比表面積が大きく、吸着に有利である。
　アルミニウム化合物の使用量は、有用物質含有液における有用物質の濃度などにより調整すればよいが、例えば、有用物質含有液１００ｍＬに対して０．１ｇ以上、２０ｇ以下のアルミニウム化合物を用いればよい。当該割合としては、１５ｇ／１００ｍＬ以下が好ましい。また、有用物質に対して１質量％以上、２０質量％以下のアルミニウム化合物を用いることができ、当該割合としては１５質量％以下が好ましい。
　有用物質含有液とアルミニウム化合物との接触方法は、適宜選択すればよい。例えば、有用物質含有液にアルミニウム化合物を加え、振とうや攪拌すればよい。接触の際の温度は常温でよく、具体的には１℃以上、３０℃以下とすることができ、１５℃以上、２５℃以下としてもよい。また、接触時間としては、５秒間以上、１０時間以下とすることができる。
　接触後は、前工程４と同様にして、遠心分離や濾過などにより有用物質含有液からアルミニウム化合物を分離すればよい。この際、有用物質は主に液分に溶解または分散しており、不溶成分の構成成分の少なくとも一部は主にアルミニウム化合物に吸着されている。
　また、有用物質の一部がアルミニウム化合物に吸着され、不溶成分の構成成分の一部が液分に溶解または分散していることもあるが、少なくとも液分における不溶成分の構成成分の総量は低減することができ、不溶成分の構成成分に対する有用物質の割合は向上する。
　アルミニウム化合物をカラムに充填し、有用物質含有液を当該カラムに通液してもよい。この場合、不溶成分の構成成分の吸着と、アルミニウム化合物からの液分の分離を同時に行うことができる。カラムにおけるアルミニウム化合物の充填量や、有用物質含有液の流速は、不純物がアルミニウム化合物に十分に吸着される範囲で調整することが好ましい。また、難溶性マグネシウム化合物とアルミニウム化合物を混合してカラムに充填してもよいし、難溶性マグネシウム化合物を充填したカラムとアルミニウム化合物を充填したカラムを接続してもよいし、一本のカラム中に難溶性マグネシウム化合物の層とアルミニウム化合物の層を設けてもよい。
　アルミニウム化合物を含む層を有するフィルターを作製し、有用物質含有液を当該フィルターで濾過することにより不溶成分の構成成分をフィルターに吸着させてもよい。アルミニウム化合物層は、アルミニウム化合物が支持基材上に堆積しているのみであってもよいし、或いは、アルミニウム化合物層を支持基材で上下から挟んでもよい。支持基材層の材質としては、例えば、活性炭；セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、アガロース、キトサン等の多糖類；ポリアクリロニトリル、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン等の合成ポリマー；および、珪藻土、パーライト、ガラス、シリカ、アルミナ、ジルコニア、チタン酸バリウム等の無機物質から選択される１以上の水不溶性媒体が挙げられる。
　６．活性炭との接触工程
　本工程では、有用物質含有液、または難溶性マグネシウム化合物と有用物質含有液を接触させて得られる処理済液を活性炭に接触させることにより、不純物の量や濃度を低減する。本工程の実施は任意であり、実施しなくてもよい。本工程と、前述の難溶性マグネシウム化合物との接触工程およびアルミニウム化合物との接触工程の実施順序は特に制限されない。例えば、本工程は、前述の難溶性マグネシウム化合物との接触工程の前に実施してもよいし、後に実施してもよいし、活性炭との接触工程の後に難溶性マグネシウム化合物との接触工程とアルミニウム化合物との接触工程を実施してもよいし、難溶性マグネシウム化合物との接触工程とアルミニウム化合物との接触工程の間に活性炭との接触工程を実施してもよい。また、難溶性マグネシウム化合物、アルミニウム化合物および活性炭から選択される２以上を混合して、難溶性マグネシウム化合物との接触工程、アルミニウム化合物との接触工程、および活性炭との接触工程から選択される２以上の工程を同時に実施してもよい。例えば、難溶性マグネシウム化合物と活性炭とを併用して、工程３と本工程６を同時に実施してもよい。
　活性炭とは、木炭やヤシ殻などを焼成して細孔を発達させて多孔質としたものであり、吸着性能に優れたものである。活性炭の一般的な比表面積は、８００ｍ2／ｇ以上、２５００ｍ2／ｇ以下程度である。活性炭の平均細孔径は特に限定されないが、通常は０．１ｎｍ以上、２０ｎｍ以下、好ましくは０．５ｎｍ以上、５．０ｎｍ以下、より好ましくは２．０ｎｍ以上、５．０ｎｍ以下、より更に好ましくは３．０ｎｍ以上、５．０ｎｍ以下である。活性炭の平均細孔径は窒素吸着等温吸着曲線よりＢＪＨ法を用いて算出することができる。活性炭の形状は特に制限されないが、例えば、粉砕炭、顆粒炭、球状炭、およびペレット炭などの粒状活性炭；ファイバー、クロス等の繊維状活性炭；シート状、成形体、およびハニカム状などの特殊成形活性炭；および粉末活性炭が挙げられる。
　本発明の活性炭を用いる精製方法の手段としては、特に限定されないが、例えば、バッチ法、膜処理法またはカラムクロマトグラフィー法などが挙げられ、それぞれの手段に応じて適切な活性炭の形状が選択される。必要に応じて、多孔性ポリマーまたはゲルに活性炭を封入した粒子などの形態、ポリプロピレンまたはセルロース等のサポート剤または繊維などを用いて活性炭を吸着、固定または成形した膜、またはカードリッジ等の形態にて使用することもできる。
　活性炭の使用量は、有用物質含有液または処理済液における有用物質の濃度などにより調整すればよいが、例えば、有用物質含有液または処理済液１００ｍＬに対して０．５ｇ以上、５ｇ以下の活性炭を用いればよい。
　有用物質含有液または処理済液と活性炭との接触方法は、難溶性マグネシウム化合物やアルミニウム化合物の場合と同様に、有用物質含有液または処理済液に活性炭を加えて振とうまたは攪拌した後に遠心分離や濾過などにより活性炭を分離してもよいし、カラムに活性炭を充填して有用物質含有液または処理済液を通液してもよい。本工程と難溶性マグネシウム化合物および／またはアルミニウム化合物との接触工程を同時に行う場合には、難溶性マグネシウム化合物および／またはアルミニウム化合物と活性炭を混合して用いればよい。
　７．更なる精製工程
　前述の難溶性マグネシウム化合物との接触工程、アルミニウム化合物との接触工程、活性炭との接触工程、およびこれら２以上の工程の組み合わせは、１回の実施で有用物質が十分に精製されない場合には、２回以上繰り返して実施してもよい。当該繰り返し回数の上限は特に制限されないが、例えば１０回以下とすることができ、５回以下が好ましい。一般的には、難溶性マグネシウム化合物との接触工程、アルミニウム化合物との接触工程、および活性炭との接触工程のみでは有用物質を単離精製できないため、難溶性マグネシウム化合物との接触工程、任意にアルミニウム化合物との接触工程、またはこれら工程と活性炭との接触工程との組み合わせの後、公知の精製方法を実施することが好ましい。その場合、前述のｐＨ調整工程、またはアルミニウム化合物との接触工程により不溶成分の析出が抑制されているため、不溶成分の析出による精製の阻害が抑制されている。また、本発明に係る難溶性マグネシウム化合物との接触工程により不純物濃度が十分低減され、目的の有用物質が濃縮されているため、精製工程への負荷が顕著に低減される。公知の精製方法としては、超遠心法、膜分離、クロマトグラフィーが挙げられ、大量生産の観点からは膜分離およびクロマトグラフィーが好ましい。また、難溶性マグネシウム化合物との接触工程の後に、処理済液に含まれる宿主由来の核酸を分解するためにヌクレアーゼ等で処理してもよいが、本発明方法によれば不純物を有効に除去できるため、高価なヌクレアーゼの使用量を低減することができる。
　クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー等が挙げられ、特にアフィニティークロマトグラフィーが好ましい。アフィニティークロマトグラフィーでは事前に溶出液のｐＨ調整や塩濃度の調整を行う必要がなく、効率的に精製できる。
　精製対象である有用物質がウイルスである場合、一般的には、有用物質含有液に含まれるウイルスの量は少なく、不純物量は多いため、ウイルスまたはウイルス様粒子をクロマトグラフィーで精製する場合には、事前に限外ろ過により不純物を除去したりウイルスまたはウイルス様粒子を濃縮しておくことが行われる。一方、本発明によりウイルスまたはウイルス様粒子を含む有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物で処理した後は、事前に限外ろ過せずにクロマトグラフィーで精製することも可能である。
　本工程により有用物質が精製された後は、溶媒量を低減して有用物質を濃縮したり、溶媒を交換するなどすればよい。以上の本発明に係る有用物質の精製方法により、純度がより高い有用物質の溶液または分散液や、有用物質の単離精製物を効率的に製造することが可能になる。
　本願は、２０２０年８月２８日に出願された日本国特許出願第２０２０－１４４７５７号および日本国特許出願第２０２０－１４４７５８号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０２０年８月２８日に出願された日本国特許出願第２０２０－１４４７５７号および日本国特許出願第２０２０－１４４７５８号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
　実施例１　－　第一の本発明の実施例
　内径０．７ｃｍ、長さ２．５ｃｍの樹脂製カラム（巴製作所社製）に塩基性炭酸マグネシウム（１ｇ）を充填し、クロマトグラフィーシステム（「ＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ２５」ＧＥヘルスケア社製）に接続した。また、カラムの直後にシリンジポンプ（「ＹＳＰ－１０１」ＹＭＣ社製）を接続し、その下流にスタティックミキサーを設置した。
　３．５ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを含むＣＨＯ培養液（１００ｍＬ，ｐＨ８．１８）を１ｍＬ／ｍｉｎの速度でカラムに送液すると同時に、シリンジポンプを使って１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．５）を０．０８ｍＬ／ｍｉｎの速度で送液し、処理液を１５ｍＬ遠沈管に１０ｍＬずつ、合計１００ｍＬ回収した。処理液のｐＨはクエン酸バッファーの添加により７．１９に低下した。
　各回収液をフィルター（桐山製作所社製，孔径：１μｍ）で濾過し、濾取された析出物の重量を測定した。
　また、濾液に含まれるＩｇＧをプロテインＡアフィニティーカラム（「ＴＳＫｇｅｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ－５ＰＷ」東ソー社製）で捕捉し、回収液中のＩｇＧ濃度を算出した。宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）の検出キット（「ＣＨＯ　Ｈｏｓｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ，３ｒｄ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」シグナス社製）を用いて、回収液中のＨＣＰ濃度を算出した。また、宿主細胞由来ＤＮＡの検出キット（「ＣＨＯ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｉｎ　Ｔｕｂｅｓ」シグナス社製）を用いて、回収液中のＤＮＡ濃度を算出した。結果を表１に示す。
　比較例１
　クエン酸バッファーを供給しない以外は実施例１と同様にして回収液を得、ＩｇＧ、ＨＣＰおよびＤＮＡの濃度を求めた。結果を表１に示す。なお、回収液のｐＨは、おそらく塩基性炭酸マグネシウムの影響により８．６０に上昇した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１中、実施例１のＩｇＧ濃度、ＨＣＰ濃度およびＤＮＡ濃度の値（＊）は、カラム処理液がクエン酸バッファーにより８％希釈されているので、培養液と比較例１の結果との比較のために、算出値を１．０８倍した値である。
　表１に示される結果の通り、培養液を塩基性炭酸マグネシウムで処理したのみの比較例１では、処理液中に固体が析出した。かかる固体は、ＩｇＧを精製するための後続のクロマトグラフィーや濾過に悪影響を与えると考えられる。
　それに対して、培養液を塩基性炭酸マグネシウムで処理して得られた処理液に酸性バッファーを加えてそのｐＨを７．１９に調整した場合には固体の析出は認められず、ＨＣＰとＤＮＡの濃度を効果的に低減しつつＩｇＧを回収することができた。
　実施例２　－　第一の本発明の実施例
　各バッファーを使って調製した０．１ｇ／Ｌサケ精子由来ＤＮＡ含有溶液、ＩｇＧ含有ＣＨＯ培養上清、ＨＥＫ細胞用培地（「Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ」ｇｉｂｃｏ社製）、またはＣＨＯ細胞用培地（「ＥｘｐｉＣＨＯ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ」ｇｉｂｃｏ社製）に１質量％の濃度で塩基性炭酸マグネシウムを加え、攪拌した。サケ精子由来ＤＮＡ含有溶液の調製に用いたバッファーとしては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２５ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ７．０）、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、２５ｍＭトリシン（ｐＨ７．８）、および２５ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．５）を用いた。次いで、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより塩基性炭酸マグネシウムを沈降させ、上澄液を回収した。
　回収した上澄液に１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．５）を加えて中和した。
　中和した上澄液の吸光度（ＵＶ２６０ｎｍ）を測定することにより、ＤＮＡ濃度を求めた。
　その後、中和上澄液をいったん凍結してから融解し、析出物の有無を確認した。結果を表２に示す。
　比較例２
　クエン酸バッファーによる中和を行わなかった以外は実施例２と同様にして上澄液を得、ＤＮＡ濃度を求め、下記式によりＤＮＡ除去率を算出し、また固体の析出の有無を確認した。結果を表２に示す。
　　ＤＮＡ除去率＝［１－（処理後のＤＮＡ濃度）／（処理前のＤＮＡ濃度）］×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示される結果の通り、不純物であるＤＮＡを含む溶液のｐＨは比較的高く、いったん凍結した後に融解すると、固体の析出が認められた。この固体は、ＤＮＡの吸着処理に用いた塩基性炭酸マグネシウムが溶液中わずかに溶解しており、その各イオン成分に由来する不溶性塩が析出したものであると考えられる。
　それに対して、塩基性炭酸マグネシウムを除去した後に中和した場合、中和しない場合と同様にＤＮＡが除去されていた上に、上澄液からは固体の析出は認められなかった。よって、本発明により塩基性炭酸マグネシウムによる処理の後にｐＨを調整することで、塩基性炭酸マグネシウムの析出を有効に抑制できることが証明された。
　実施例３：　難溶性マグネシウム化合物による培養液処理後の不溶性固体析出抑制　－　第二の本発明の実施例
　（１）吸着処理
　ＩｇＧ含有ＣＨＯ培養液に、１ｗ／ｖ％の塩基性炭酸マグネシウム（キシダ化学社製）を加え、室温下、ミックスローターで１時間攪拌した。次いで、５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して上澄みを回収し、一次処理液を得た。前記一次処理液に対し、表１に記載の各種二次吸着剤を１ｗ／ｖ％の濃度で加え、室温下、ミックスローターで１時間攪拌した後、５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して上澄みを回収し、二次処理液を得た。
　（２）析出物の定量
　析出物発生を加速するために、前記二次処理液を－４０℃で凍結させ、次いで融解した後に、３日以上冷蔵し、処理液中に析出した固体を濾過して重量を測定した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示される結果の通り、未処理（比較例３）に対して、塩基性炭酸マグネシウム処理をすると、培養液１Ｌあたり３８９ｍｇの固体が析出した（比較例４）。比較例４に対して、二次処理固体として、ろ過助剤として汎用される珪藻土（富士フィルム和光純薬社製）や、吸着精製用途に繁用される各種シリカゲル（富士シリシア化学社製）を用いても、大きな析出抑制効果は見られなかった（比較例５～９）。一方、二次処理固体に酸性アルミナ（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いた場合、顕著な析出抑制効果が確認できた（実施例３）。
　（３）ＩｇＧ回収率の測定
　前記二次処理液を、プロテインＡアフィニティーカラム（「ＴＳＫｇｅｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ－５ＰＷ」東ソー社製）を用いた一般的なクロマトグラフィーシステムにより分析して含まれているＩｇＧ量を測定した後、ＩｇＧ含有ＣＨＯ培養液に含まれる当初ＩｇＧ量に対する割合を算出した。結果を表４に示す。
　（４）不純物量の測定
　前記二次処理液に含まれる宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）の量を、宿主細胞由来タンパク質の検出キット（「ＣＨＯ　Ｈｏｓｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ，３ｒｄ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」シグナス社製）を用いて、付属のプロトコルに従い計測した。結果を表４に示す。
　前記二次処理液に含まれるＤＮＡ含量を、宿主細胞由来ＤＮＡの検出キット（「ＣＨＯ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｉｎ　Ｔｕｂｅｓ」シグナス社製）を用いて、付属のプロトコルに従い計測した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示される結果の通り、塩基性炭酸マグネシウムによる不純物除去処理（比較例４）に対して酸性アルミナによる析出抑制処理（実施例３）を追加しても、目的物であるＩｇＧの回収率は低下せず、且つＨＣＰやＤＮＡの量を低減できることが分かった。
　（５）析出物の分析
　前記比較例２で二次処理液から析出した析出物を構成するイオンの量を、表５に示す方法で測定した。ＩＣＰ－ＭＳ測定装置としては、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の「７９００」を用い、イオンクロマトグラフィ装置としては、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製の「Ｉｎｔｅｇｒｉｏｎ」を用いた。析出物に含まれるＣＯ3 2-の重量１００に対する相対値を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図１に示される結果の通り、塩基性炭酸マグネシウム処理後の培養液中に析出する固体中の主要イオンはＭｇ2+、ＮＨ4 +、ＰＯ4 3-、ＣＯ3 2-、ＳＯ4 2-であり、これらの一部あるいは全部を低減できれば、固体析出を抑制できると考えられた。
　（６）培養液と処理液中のイオンの定量
　前記実施例３（５）と同様の方法により、処理前の培養液（比較例３）、塩基性炭酸マグネシウムのみで処理した一次処理液（比較例４）、および塩基性炭酸マグネシウムに加えて酸性アルミナで処理した二次処理液（実施例３）に含まれるイオンの内、前記実施例３（５）で特定された主要イオンを定量した。結果を図２に示す。
　図２に示される結果の通り、未処理培養液に対して塩基性炭酸マグネシウム処理をすると、Ｍｇ2+とＣＯ3 2-の濃度が上昇するものの、後段の酸性アルミナ処理により、Ｍｇ2+、ＰＯ4 3-、およびＣＯ3 2-が低減された。本結果より、酸性アルミナ処理による析出抑制機構は、析出固体の主成分であるＭｇ2+、ＰＯ4 3-、およびＣＯ3 2-の低減によるものであることが示された。
　実施例４：　アルミニウム化合物による析出抑制効果　－　第二の本発明の実施例
　前記実施例１と同条件下、二次吸着剤として様々なアルミニウム化合物（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて固体析出量を目測し、以下の基準で評価した。結果を表６に示す。
　　◎：　析出なし
　　〇：　析出量が、二次吸着剤なしの場合の析出量の２５％程度
　　△：　析出量が、二次吸着剤なしの場合の析出量の５０％程度
　　×：　析出量が、二次吸着剤なしの場合の析出量と同程度
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示される結果の通り、酸性アルミナ以外にも、中性アルミナ、塩基性アルミナおよび水酸化アルミニウムにも析出抑制効果が見られた。中でも酸性アルミナと中性アルミナの析出抑制効果が塩基性アルミナや水酸化アルミニウムより比較的高い理由としては、表面における負電荷密度が低いために、析出原因の陰イオンであるＰＯ4 3-やＣＯ3 2-がより効果的に吸着されることによると考えられた。
　実施例５：　酸性アルミナによる処理条件の検討　－　第二の本発明の実施例
　実施例３と同様の方法を基に、塩基性炭酸マグネシウムによる処理と酸性アルミナによる処理の順序を変更した際の固体析出抑制効果への影響を比較した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示される結果の通り、塩基性炭酸マグネシウムと酸性アルミナの処理順を入れ替えても同等の固体析出抑制効果が見られた。その理由としては、培養液を先にアルミニウム化合物で処理しても、培養液に元々含まれるＭｇ2+、ＰＯ4 3-およびＣＯ3 2-を低減することができるためだと考えられた。しかし、塩基性炭酸マグネシウムと酸性アルミナの混合物を処理に用いると、析出抑制効果が僅かに低下した。その理由としては、酸性アルミナが塩基性炭酸マグネシウム表面のＭｇ2+やＣＯ3 2-を直接吸着し、酸性アルミナの吸着能が低下したことによる可能性がある。
　実施例６：　ＤＮＡのＰＢＳ溶液に対する析出抑制効果　－　第二の本発明の実施例
　モデル溶液として濃度１００ｍｇ／Ｌのサケ精液由来ＤＮＡのＰＢＳ溶液を調製した。次いで、前記実施例３と同様にして、当該溶液を表８に示す条件で処理した後、吸光度（ＵＶ２６０ｎｍ）を測定することにより、ＤＮＡ濃度を求めた。結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８に示される結果の通り、溶媒としてリン酸緩衝液を含むモデル溶液を処理した場合でも、不純物であるＤＮＡを除去できるのみならず、固体の析出を抑制することができた。その理由としては、ＰＢＳの主成分であるリン酸イオンを酸性アルミナにより吸着除去できたことによると考えられた。
　実施例７：塩基性炭酸マグネシウムと酸性アルミナを充填したカラムの析出抑制効果　－　第二の本発明の実施例
　Ｃｏｌｕｍｎ　Ｖｏｌｕｍｅ（ＣＶ）１ｍＬの市販カラムに塩基性炭酸マグネシウム１０００ｍｇを充填したカラムＡ、前記カラムに塩基性炭酸マグネシウム５００ｍｇを上流に、酸性アルミナ５００ｍｇを下流に２層充填したカラムＢ、及び前記カラムに酸性アルミナ５００ｍｇを上流に、塩基性炭酸マグネシウム５００ｍｇを下流に２層充填し、カラムＢの層順を入れ替えたカラムＣに対して、前記ＩｇＧ含有ＣＨＯ培養液５０ｍＬを１ｍＬ／ｍｉｎの速度で通液し、１０ＣＶずつ分取して固体析出の様子を目視で評価した。結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示される結果の通り、塩基性炭酸マグネシウムのみを充填したカラムＡでは、全てのフラクションに固体が析出した。
　それに対して、カラム体積の半分を酸性アルミナに置き換えたカラムＢやカラムＣでは、通液量３０ＣＶまでは固体析出を抑制でき、３１ＣＶ以降もカラムＡよりも固体析出量を明らかに抑制することができた。
　実施例８：　様々な培養液に対する析出抑制効果　－　第二の本発明の実施例
　前記実施例３と同様にして、様々な有用タンパク質を発現させた種々宿主由来の培養液を処理し、固体析出の様子を目視で評価した。また、発現タンパク質の回収率を、一般的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いたバンドのデンシトメトリー強度比により算出した。結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示される結果の通り、全ての場合において、塩基性炭酸マグネシウム処理のみを行うと固体が析出したものの、酸性アルミナ処理を追加すると固体析出が抑制できた。発現タンパク回収量はＶＨＨの場合で７６％まで減少したものの、ＩｇＧやｓｃＦｖは９０％以上の回収率を維持した。

Claims (19)

  1. 　有用物質含有液から有用物質を精製するための方法であって、
    　前記有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物に接触させる工程、
    　前記難溶性マグネシウム化合物に接触させた前記有用物質含有液から前記難溶性マグネシウム化合物を除去して処理済液を得る工程、および、
    　前記処理済液のｐＨを８．０以下に調整する工程を含むことを特徴とする方法。
  2. 　前記有用物質含有液のｐＨが８．０超である請求項１に記載の方法。
  3. 　前記処理済液のｐＨを５．０以上、８．０以下に調整する請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記有用物質含有液が細胞培養液またはその粗精製液である請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記難溶性マグネシウム化合物が、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、および酸化マグネシウムから選択される１以上である請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記難溶性マグネシウム化合物が炭酸マグネシウムを含む請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　前記有用物質含有液が核酸を含み、前記有用物質含有液を前記難溶性マグネシウム化合物に接触させることにより、前記核酸の少なくとも一部を前記難溶性マグネシウム化合物に吸着させる請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　前記有用物質含有液が有用物質として抗体または抗体様分子を含む請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　前記有用物質含有液が有用物質としてウイルスまたはウイルス様粒子を含む請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  10. 　有用物質含有液から有用物質を精製するための方法であって、
    　前記有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物に接触させる工程、および、
    　前記有用物質含有液をアルミニウム化合物に接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
  11. 　前記有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物に接触させる工程の後に、前記有用物質含有液をアルミニウム化合物に接触させる工程を実施する請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記有用物質含有液をアルミニウム化合物に接触させる工程の後に、前記有用物質含有液を難溶性マグネシウム化合物に接触させる工程を実施する請求項１０に記載の方法。
  13. 　前記有用物質含有液が細胞培養液またはその粗精製液である請求項１０～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 　マグネシウムイオン、リン酸イオン、および炭酸イオンから選択される１以上のイオンを前記アルミニウム化合物に吸着させる請求項１０～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 　前記難溶性マグネシウム化合物が、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、および酸化マグネシウムから選択される１以上である請求項１０～１４のいずれかに記載の方法。
  16. 　前記難溶性マグネシウム化合物が炭酸マグネシウムを含む請求項１０～１５のいずれかに記載の方法。
  17. 　前記アルミニウム化合物が、酸化アルミニウム、および水酸化アルミニウムから選択される１以上である請求項１０～１６のいずれかに記載の方法。
  18. 　前記有用物質含有液が有用物質として抗体または抗体様分子を含む請求項１０～１７のいずれかに記載の方法。
  19. 　前記有用物質含有液が有用物質としてウイルスまたはウイルス様粒子を含む請求項１０～１８のいずれかに記載の方法。
PCT/JP2021/028824 2020-08-28 2021-08-03 有用物質の精製方法 WO2022044727A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022545595A JPWO2022044727A1 (ja) 2020-08-28 2021-08-03
EP21861155.6A EP4206329A1 (en) 2020-08-28 2021-08-03 Method for purifying useful substance
KR1020237003532A KR20230056661A (ko) 2020-08-28 2021-08-03 유용 물질의 정제 방법

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020144757 2020-08-28
JP2020-144757 2020-08-28
JP2020144758 2020-08-28
JP2020-144758 2020-08-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022044727A1 true WO2022044727A1 (ja) 2022-03-03

Family

ID=80352265

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/028824 WO2022044727A1 (ja) 2020-08-28 2021-08-03 有用物質の精製方法

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4206329A1 (ja)
JP (1) JPWO2022044727A1 (ja)
KR (1) KR20230056661A (ja)
WO (1) WO2022044727A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022202611A1 (ja) * 2021-03-26 2022-09-29 株式会社カネカ 有用物質の製造方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000262280A (ja) * 1999-03-18 2000-09-26 Asahi Optical Co Ltd ウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法およびワクチンの製造方法
JP2008137827A (ja) 2006-11-30 2008-06-19 Nittetsu Mining Co Ltd 塩基性炭酸マグネシウム粒子の製造方法、球状塩基性炭酸マグネシウム粒子
JP2009508486A (ja) * 2005-09-15 2009-03-05 ワイス 塩を用いた蛋白のフロキュレーション
JP2010530734A (ja) * 2007-03-14 2010-09-16 リゴサイト ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド ウイルス様粒子の精製
WO2015111606A1 (ja) 2014-01-23 2015-07-30 Dic株式会社 ウイルス液の製造方法及びウイルス検出方法
JP2017055766A (ja) 2010-10-27 2017-03-23 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 対象粒子を混合物から捕捉する方法
WO2018021012A1 (ja) * 2016-07-28 2018-02-01 株式会社カネカ 抗体断片の製造方法
WO2018203541A1 (ja) * 2017-05-02 2018-11-08 株式会社カネカ 免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの回収精製法
WO2020045290A1 (ja) 2018-08-31 2020-03-05 株式会社カネカ 抗体または抗体様分子の精製方法
JP2020144758A (ja) 2019-03-08 2020-09-10 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 移動物体検出装置、移動物体検出方法およびコンピュータプログラム
JP2020144757A (ja) 2019-03-08 2020-09-10 三菱電機株式会社 制御装置、制御システム、接続状態判定方法およびプログラム

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000262280A (ja) * 1999-03-18 2000-09-26 Asahi Optical Co Ltd ウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法およびワクチンの製造方法
JP2009508486A (ja) * 2005-09-15 2009-03-05 ワイス 塩を用いた蛋白のフロキュレーション
JP2008137827A (ja) 2006-11-30 2008-06-19 Nittetsu Mining Co Ltd 塩基性炭酸マグネシウム粒子の製造方法、球状塩基性炭酸マグネシウム粒子
JP2010530734A (ja) * 2007-03-14 2010-09-16 リゴサイト ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド ウイルス様粒子の精製
JP2017055766A (ja) 2010-10-27 2017-03-23 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 対象粒子を混合物から捕捉する方法
WO2015111606A1 (ja) 2014-01-23 2015-07-30 Dic株式会社 ウイルス液の製造方法及びウイルス検出方法
WO2018021012A1 (ja) * 2016-07-28 2018-02-01 株式会社カネカ 抗体断片の製造方法
WO2018203541A1 (ja) * 2017-05-02 2018-11-08 株式会社カネカ 免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの回収精製法
WO2020045290A1 (ja) 2018-08-31 2020-03-05 株式会社カネカ 抗体または抗体様分子の精製方法
JP2020144758A (ja) 2019-03-08 2020-09-10 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 移動物体検出装置、移動物体検出方法およびコンピュータプログラム
JP2020144757A (ja) 2019-03-08 2020-09-10 三菱電機株式会社 制御装置、制御システム、接続状態判定方法およびプログラム

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022202611A1 (ja) * 2021-03-26 2022-09-29 株式会社カネカ 有用物質の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230056661A (ko) 2023-04-27
EP4206329A1 (en) 2023-07-05
JPWO2022044727A1 (ja) 2022-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6471183B2 (ja) 生体分子の精製
JP5755136B2 (ja) 高濃度モノクローナル抗体溶液中のウイルス除去方法
JP6956824B2 (ja) 生体高分子ユニットおよびウイルスを液体から分離するための方法
RU2632568C2 (ru) Очистка полипептидов с использованием двухстадийной ультрафильтрации в тангенциальном потоке
WO2021172217A1 (ja) 核酸の低減方法および吸着フィルター
JP2008500959A (ja) ウイルスについて安全な免疫グロブリンの製造方法
JP5711369B2 (ja) 蛋白製剤の製造方法
WO2022044727A1 (ja) 有用物質の精製方法
US20220402968A1 (en) Intensified virus filtration using diafiltration buffer
WO2020153390A1 (ja) 活性炭材料を使用する工程を含む抗体精製方法
Acconci et al. Depyrogenation of snake antivenom serum solutions by hollow fiber-based pseudobioaffinity filtration
JP6731055B2 (ja) ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法
WO2021172203A1 (ja) 生体分子精製用製品
WO2023027044A1 (ja) エンドトキシンの低減方法
WO2022202611A1 (ja) 有用物質の製造方法
US20040198957A1 (en) Method for removing endotoxins from protein solutions
US20240173646A1 (en) Product for biomolecule purification
JP2011041475A (ja) 抗体製造方法
JP2021011446A (ja) タンパク質含有溶液のろ過方法
CN114555622A (zh) 蛋白质的纯化和病毒灭活
US20150376232A1 (en) Selective removal of a protein from a mixture of proteins using activated carbon by adjusting solution conditions
JP2011184299A (ja) モノクローナル抗体を含む製剤の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21861155

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022545595

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021861155

Country of ref document: EP

Effective date: 20230328