JP2011041475A - 抗体製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】抗体に対する抗体凝集体の比率を低く抑えつつ、ウイルスの量を低減可能な抗体製造法を提供する。
【解決手段】リガンドとの相互作用を利用して抗体を含有する溶液から医薬品としての抗体を得る抗体製造方法において、抗体を含有する溶液をpH２．５乃至３．５で０．５乃至１０分間保持する工程を含む抗体製造方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、医薬品としての抗体を得る製造方法に関するものであり、医薬原料溶液から目的抗体を精製する工程を含む抗体製造方法に関する。

抗体は、それが認識し、結合する標的物質に対する特異性の高さから、研究用試薬や臨床検査試薬として極めて有用である。ことに近年においては、遺伝子組換え技術などのバイオテクノロジーを利用して種々の治療用抗体が開発され、従来治療が困難であったリウマチや癌などの分野において、画期的な治療薬として医療技術の進歩に大きく貢献している。これらは一般に抗体医薬と称されている。また、抗体は動物の体液からも精製することが可能であり、ヒトの血漿から精製された抗体はガンマグロブリン製剤と称され、医薬品として使用されている。

医薬品としての抗体製造においては、ヒトや免疫した動物の血液や腹水などの体液あるいは抗体産生能を持つ細胞の培養液が、抗体の原料として使用される。これらの医薬原料溶液には、目的とする抗体以外に様々なタンパク質やデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等の不純物が含まれているため、精製工程において、古くは分別沈殿法やイオン交換法等の古典的手法を駆使して精製が行われていた。さらに、抗体の精製度をより高め、しかも生産性も高めるために、クロマトグラフィーを利用した分離技術も導入され、数多く検討されてきた。例えば、イオン交換クロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィー、あるいはそれらの組合せがあるが（例えば、特許文献１参照。）、これらの方法では、溶液のｐＨを大きく変化させる、あるいは種々の塩を添加する等して抗体の吸着や解離を行うため、最終製品としての抗体を得る前に、溶液から不要な成分を除去する必要がある等の問題がある。しかも、溶液から不要な成分を除去してもなお、抗体の精製度は充分でなく、後述する特異的結合による方法には到底比肩するものではない。

イオン交換クロマトグラフィー技術や疎水クロマトグラフィー技術をさらに発展させた技術がアフィニティ分離技術である。アフィニティ分離技術は、目的物に親和性の高いリガンドを有する担体を用いるので、抗体の回収率や生産性の点では非常に優れた技術である。抗体の精製工程にもアフィニティ分離が積極的に導入されており、アフィニティリガンドとして近年重要な役割を果たしているのが、スタフィロコッカス属黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のプロテインＡである。プロテインＡは、抗体、すなわち免疫グロブリンのＦｃ領域に対して高い特異性と親和性とを有することから、これを担体のリガンドに用いた抗体精製方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。プロテインＡは、中性条件下で抗体のＦｃ領域に高い親和性を示すため、医薬原料溶液から抗体を精製する際には、プロテインＡ等をリガンドとして有する不溶性担体に医薬原料溶液を接触させて抗体を特異的に吸着させる。そして、中性の生理的溶液で非吸着成分を洗浄し、除去した後、酸性の生理的溶液で吸着抗体をリガンドから解離させると、抗体を高率に回収できることがよく知られている。

このように、プロテインＡ等を用いた抗体の精製方法は、結合特異性に優れるという長所があるものの、抗体を高率に回収するためには、ｐＨ３付近という低いｐＨ条件が必要となる。低いｐＨ条件はウイルス不活化工程も兼用できるという利点もあるので、プロテインＡを用いた抗体の精製方法は、低ｐＨに対して頑健なモノクローナル抗体を精製する場合には有効な方法といえる（例えば、特許文献３参照。）。しかし、プロテインＡを用いた抗体の精製方法は、低ｐＨで変性して失活する抗体には適用できない。また、低ｐＨ下では抗体の高次構造が変化しやすいため、失活には至らなくとも、凝集体の生成を引き起こす場合があることが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。この抗体凝集体は、ヒトに投与した場合に抗原性を示すことが懸念されている（例えば、非特許文献２、３、４参照。）ので、こと治療用抗体の製造においては、後段の精製工程における凝集体の除去及び残留量のモニタリングが求められる。これまでの研究において、凝集体の不活化条件として、凝集体を含む溶液を、３０分以上ｐH３．８以上にすること等が見出されている（例えば、非特許文献５、６、７参照。）。

低ｐH暴露による抗体の失活や凝集化を回避するために、微酸性乃至弱酸性で抗体溶出が可能なアフィニティリガンドが開発されている（例えば、非特許文献８、９参照。）。また、アミノ酸を添加した新たな溶離緩衝液により、微酸性乃至弱酸性の溶出の試みも報告されている（例えば、非特許文献１０参照。）。

また、低ｐH暴露を回避する方策として、温度応答性クロマトグラフィーなどの機能性担体を用いたクロマトグラフィー（例えば、特許文献４、５参照。）の開発も進められている。

なお、ウイルス不活化のプロセスとしては、熱処理、ＵＶ照射、色素添加、及びソルベントデタージェント法などが用いられてきている（例えば、非特許文献１１参照。）が、ウイルス不活化のためのロバストな工程として依然として低ｐH処理が行われている。

特開平７−２６７９９７号公報 特開平１−１３５７９８号公報 国際公開第２００８／１４３１９９号パンフレット 特開２００７−６９１９３号公報 特開２００９−８５９３３号公報

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これまで、抗体精製には一般的に抗体を含む医薬品原料液を数時間、低ｐＨに暴露するという方法が用いられてきた。これは、ウイルス不活化に有効である反面、抗体凝集化を促進するので医薬品製造工程としては好ましくない。抗体を精製するためのアフィニティクロマトグラフィープロセスに関して種々検討が成されているが、ウイルス不活化など品質面まで含めたプロセス構築に関しては満足できる提案がなされていない。抗体医薬品を工業的に製造する際に、アフィニティークロマトグラフィーを用いた精製方法を用いるにあたり、抗体活性の低下や抗体凝集を回避しつつ、ウイルス不活化を達成するプロセスを構築する。

本発明者らは、低ｐH条件において抗体の凝集に要する時間とウイルスの不活化に要する時間が異なることに着目し、その特徴を利用したプロセスを組み合わせることが、高品質で安全な抗体医薬品製造に有用であることを見出した。つまり、微酸性乃至弱酸性のアフィニティーカラムから抗体を溶出することにより抗体凝集化を抑え、なおかつその後段に低ｐH処理の短時間処理プロセスを配置する。短時間ｐH処理は抗体凝集化を引き起こすことなく、しかも充分なウイルス不活化能力を発揮しうるため、高品質で安全な抗体医薬品の製造工程を構築する上で有用な方法である。

すなわち、本発明の態様は、リガンドとの相互作用を利用して抗体を含有する溶液から医薬品としての抗体を得る抗体製造方法において、抗体を含有する溶液をｐH２．５乃至ｐH３．５付近で３０秒乃至１０分という短時間保持する工程を含む抗体製造方法であることを要旨とする。

本発明によれば、抗体に対する抗体凝集体の比率を低く抑えつつ、ウイルスの量を低減することが可能となる。

以下、本発明の実施の形態（以下において、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。本実施の形態に係る抗体製造方法は、リガンドとの相互作用を利用して抗体を含有する溶液から医薬品としての抗体を得る抗体製造方法であり、抗体を含有する溶液をpH２．５乃至３．５で０．５乃至１０分間保持する工程を含む。

本実施の形態でいうリガンドとは、特定の受容体タンパク質に特異的に結合する物質のことである。一般にリガンドが対象物質と結合する部位は決まっており、選択的又は特異的に高い親和性を発揮する。酵素タンパク質とその基質、ホルモンや神経伝達物質などのシグナル物質とその受容体などが顕著な例であるが、本実施の形態においては、リガンドとは、受容体タンパク質としての抗体に特異的に結合する物質をいう。

本実施の形態でいう抗体とは、生化学における一般的な定義のとおり、脊椎動物の感染防禦機構としてBリンパ球が産生する糖タンパク質分子（ガンマグロブリン又は免疫グロブリンともいう）のことであるが、特に本実施の形態では、ヒトに対して医薬品として使用できるものをいう。すなわち、ウイルス等の病原微生物との混合が実質的に認められず、投与対象であるヒトの体内にある抗体と実質的に同一の構造を有するものである。

本実施の形態において、ヒトＩｇＧとのキメラ抗体とは、可変領域はマウスなどのヒト以外の生物由来であるが、その他の定常領域をヒト由来の免疫グロブリンに置換したものをいう。また、ヒト化抗体とは可変領域のうち、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ： ＣＤＲ）がヒト以外の生物由来で、その他のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ： ＦＲ）をヒト由来としたものをいう。ヒト化抗体は、キメラ抗体よりも免疫原性がさらに低減される。

抗体の種類については、医薬品として適用できるものであればよく、クラス（アイソタイプ）やサブクラスは特に限定されない。例えば、抗体は定常領域の構造の違いにより、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，及びＩｇＥの5種類のクラスに分類されるが、各免疫グロブリンの何れであってもよい。ヒト抗体においては、ＩｇＧにはＩｇＧ１〜ＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがあるが、これも特に限定されない。なお、医薬品として適用可能であれば、Ｆｃ領域が結合された抗体関連タンパク質も本実施の形態でいう抗体の範疇である。

さらに、抗体は由来や製造方法によっても分類することができ、天然のヒト抗体や遺伝子組換え技術により生産された組換えヒト抗体、あるいはモノクローナル抗体やポリクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体の中でも、抗体医薬としての需要や重要性の観点から、ヒトＩｇＧへの適用が好適である。また、後述する特定のリガンドと特定の液性による本実施の形態の抗体精製条件は、ヒトＩｇＧの精製に好適である。

医薬品としての抗体は、大略、以下の工程を経て製造される。すなわち、細胞培養工程、細胞分離工程、精製工程、ウイルス除去工程、濃縮・液交換工程、ボトリング工程という順番である。勿論このフローに限定されるものではなく、付加的な工程が挿入されることや、各工程の一部が入れ替わることもある。上記は、細胞培養法によって目的抗体の生産を行う場合の代表的フローであるが、ヒトの体液又は細胞培養液から目的抗体を精製する場合は、細胞培養工程と細胞分離工程とが省略され、体液又は細胞培養液は精製工程に投入される。

ここで、ヒトの体液とは、血液、血漿、血清、リンパ液、腹水、胸水、あるいはそれらの混合液、それらに生理的食塩水、緩衝液、無菌水等の生理的溶液を加えた希釈液、並びに血液製剤等を全て含む。本実施の形態での細胞培養液とは医薬原料溶液を得ることを目的として培養された細胞が懸濁した液をさし、細胞としては動物の体液や組織から採取した細胞、人工的に癌化させた株化細胞、さらにはこれら細胞を生体外で培養したもの等をさす。また、細胞培養後、細胞分離工程を経て精製工程に投入される液とは、目的抗体が細胞外へ放出又は分泌された後、細胞が濾過や沈殿によって分離された溶液である。これに生理的溶液を加えた希釈液であってもよい。あるいは、これらが後述する粗精製を経た溶液であってもよく、例えば、イオン交換やクロマトグラフィー等で回収された溶液であってもよい。本実施の形態においては、このように精製工程のうち、特定のアミノ酸リガンドを用いる抗体の精製工程に投入する前の抗体含有溶液を医薬原料溶液と総称する。

精製工程には、一段階の本精製のみ、粗精製と本精製との組合せ、あるいは複数の粗精製と複数の本精製との組合せという幾つかの精製パターンが含まれるが、本実施の形態ではいずれかに限定する必要はない。本精製においては、抗体と相互作用するリガンドを有するアフィニティクロマトグラフィー工程が実施される。さらに、本精製においては、抗体の凝集を抑制するため、低ｐＨ処理を回避可能なアフィニティクロマトグラフィー工程が好適に実施される。低ｐＨ処理を回避可能なアフィニティクロマトグラフィーとして、温度応答性高分子を用いたクロマトグラフィーが利用可能である。温度応答性高分子を用いたクロマトグラフィーとは、温度変化によりタンパク質を吸脱着する吸着剤に目的タンパク質としての抗体を含む医薬原料液を接触させ、その後、溶液の温度を変化させて目的抗体を吸着材から離脱させ、回収する方法である。粗精製は、本実施の形態の特定リガンドを利用した本精製の前後に実施可能である。粗精製には、本精製とは異なる分離様式、例えば種々のクロマトグラフィーや膜分離等に基づく精製が利用可能である。

低ｐＨ処理を回避可能なアフィニティクロマトグラフィーと短時間低ｐＨ処理工程とを組み合わせることよって、抗体分子に変異を与えずにウイルスを除去可能なプロセスを構築することが可能となる。具体的には、アフィニティクロマトグラフィーで得られた抗体を含有する溶液の水素イオン指数を、短時間低ｐＨとすることにより、抗体に対する抗体凝集体の比率を低く抑えつつ、溶液中のウイルスの量を低減することが可能となる。ウイルス除去の観点から、水素イオン指数は、ｐＨ２．５乃至３．５が好ましい。また、抗体に対する抗体凝集体の比率を低く抑えるという観点から、水素イオン指数をｐＨ２．５乃至３．５にする時間は、０．５乃至１０分間であることが好ましく、０．５乃至５分間であることがさらに好ましい。

以下、実施例によって本実施の形態をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。

［抗体凝集度の評価方法］
本実施の形態の抗体凝集の評価系として、高速液体クロマトグラフィーのシステムを利用した。すなわち、リザーバタンク（移動相、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸、０．２ｍｏｌ／Ｌアルギニン、ｐH６．８）、送液ポンプ（送液線速１．６８ｃｍ／ｍｉｎ）、サンプルループ（容量１００μＬ）、カラム（室温）、検出器（紫外線、波長２８０ｎｍ）、ドレンの順に接続した該システムを用いて目的物をロードした後、検出器から検出された吸光度から、目的物に含有される凝集体の比率を定量した。内径（直径）７．８ｍｍ、ベッド高さ３００ｍｍの東ソーＴＳＫＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを用いた。典型的には、溶出時間７分乃至８分に３量体以上の多量体ピーク（ピークＡ）が検出され、溶出時間９分乃至１０分に２量体ピーク（ピークＢ）が検出され、溶出時間１１分付近に単量体ピーク（ピークＣ）が検出される。これらのピークの面積比から、下記（１）式を用いるプログラムを用いて抗体凝集度を算出した。

抗体凝集度（％）＝１００×（（ピークAの面積比）＋（ピークBの面積比））・・・（１）

［ウイルス活性の評価方法］
本実施の形態のウイルス活性の評価系として、ＴＣＩＤ５０法を採用した。ＴＣＩＤ５０法を実施する際には、測定キット製造業者が推奨する下記の手順に従った。
手順１ 細胞培養用シャーレ１枚にコンフルエントまで培養した培養細胞を用意する。
手順２ ウイルス液を培地で１０倍ずつ段階希釈したウイルス液を用意する。
手順３ ９６ウエルプレート１枚の全てのウエルに５０マイクロリットルずつ培地を入れる。
手順４ ９６ウエルプレートの第１列目に１０の４乗倍希釈した組換えウイルスを２５マイクロリットルずつ加える。
手順５ ２５マイクロリットルを第２列目のウエルに移す。
以下同じ操作を第１１列目まで繰り返し最後の２５マイクロリットルを捨てる。第１２列目は非感染細胞のコントロールとする。チップは１列ごとに替える。
手順６ 予め培養しておいた培養細胞を６ｍＬの培地に懸濁する。
手順７ 細胞懸濁液を５０マイクロリットルずつ各ウエルに加える。
手順８ 数日後に各ウエルに５０マイクロリットルずつ１０％ 培地を穏やかに加える。
手順９ 約２週間後に細胞変性の終末点を顕微鏡で判定する。その際、ウイルスが存在しているウエルの細胞は変性を起こして剥がれる。
手順１０ 下記（２）式で与えられるＫａｒｂｅｒの式を用いて、統計学的に５０％細胞変性終末点（ＴＣＩＤ５０）を計算する。
ＴＣＩＤ５０ ＝ （１列目の希釈率） × （希釈率）Σ−０．５ ・・・（２）
ただし、Σ＝各希釈段階における（変性ウエル数）／（検体数）の総和である。
所定時間低ｐＨに暴露されたサンプルのＴＣＩＤ５０の対数と、出発試料に相当するウイルススパイクサンプルのＴＣＩＤ５０の対数との差を、ウイルス溶液の対数減少値（ＬＲＶ：Ｌｏｇ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｖａｌｕｅ）とした。

（実施例１）
＜低ｐH処理時間と抗体凝集度との関係＞
以下の表１に示すように、１０ｍｍｏｌ／Ｌのグリシンを含むｐＨ２．５の緩衝液、１００ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸を含むｐＨ３．０の緩衝液、及び４０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸を含むｐＨ３．５の緩衝液をそれぞれ調製した。

これらの緩衝液に対し、モデル抗体溶液として、ベネシス製の５０ｍｇ／ｍＬのポリクローナル抗体ヴェノグロブリン−I Hを抗体終濃度が５ｍｇ／ｍLになるように添加した。抗体溶液を緩衝液に添加した後、表２に示す各所定時間後に溶液のｐHをｐH６．５乃至ｐH８．５に中和し、その後冷蔵保存した。なお中和に必要なトリス緩衝液の濃度と量は、あらかじめ実験によって決めておいた。

中和後、フィルターチューブを用いて、溶液から不溶性成分を除去した。フィルターチューブには、孔径０．２２マイクロメートルのミリポア製ウルトラフリーＭＣを使用した。その後、溶液中の抗体凝集度を、上述した抗体凝集度の評価方法に従って計測した。結果を、表３に示す。

表３の結果から、水素イオン指数をｐＨ２．５乃至３．５にするのを１０分以内にすれば、抗体凝集が１０％程度に抑えられることが示された。これに対し、１０分より長い１８０分の間、水素イオン指数をｐＨ２．５乃至３．５にすると、抗体凝集が生じることが示された。

＜低ｐH処理時間とウイルス不活化との関係＞
ｐH３．５で０．１ｍｏｌ／Ｌのグリシン緩衝液、及びｐH３．５で０．３ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム緩衝液を調製し、表４に示すウイルスをそれぞれ添加し、ウイルス溶液とした。ここで添加したマウス白血病ウイルスの量は、ＴＣＩＤ５０の対数値で５．８０であった。また、仮性狂犬病ウイルスの量は、ＴＣＩＤ５０の対数値で５．６１であった。

これらのウイルス溶液に対し、表５に示す所定時間後に０．５ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム溶液を１０分の１体積添加して、溶液の水素イオン指数をｐH７．３に戻した。なお中和に必要なリン酸緩衝液量はあらかじめ実験によって決めておいた。

中和後、上述したウイルス活性の評価方法に従って、ウイルス溶液の対数減少値（ＬＲＶ：Ｌｏｇ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｖａｌｕｅ）を計測した。結果を表６に示す。

表６に示す結果から、水素イオン指数をｐＨ３．５にする時間が０．５分未満では充分なウイルス不活化効果を得られない傾向にあるが、０．５分で充分なウイルス不活化効果が得られることが分かった。０．５分より長い処理時間でウイルスが不活化することは自明である。またｐＨ３．５以下でウイルス不活化効果が得られることも自明である。

＜低ｐH処理時間と抗体凝集度との関係＞で示した結果と、＜低ｐH処理時間とウイルス不活化との関係＞で示した結果とから、０．５乃至１０分の間、抗体を含む溶液の水素イオン指数をｐＨ２．５乃至３．５にすることにより、抗体凝集抑制効果とウイルス不活化効果の両方が得られることが示された。また抗体凝集を１０％以下に抑制できるより好ましい条件は、ｐH２．５乃至３．５かつ処理時間０．５乃至５分であった。

（実施例２）
低ｐH暴露を回避した抗体精製方法として、温度応答性クロマトグラフィーを表７に示す手順に従って実施した。また、比較例として、ｐＨ３．０で抗体を溶出する従来のクロマトグラフィーも、表７に示す手順に従って実施した。

それぞれのクロマトグラフィーにおいて、素通り画分及び洗浄画分（ＦＴ＆Ｗ）、溶出画分（Ｅ）、並びに溶出確認画分（Ｅ−Ｃｏｎｆ）の３つのフラクションを採取し、それぞれのフラクションに含まれる抗体量を吸光度測定によって算出した。その後、溶出画分をゲルろ過クロマトグラフィーにかけて、溶出時に形成されたと考えられる多量体の形成率を測定し、上述した抗体凝集度の評価方法に従って抗体凝集度を算出した。結果を表８に示す。

次に、温度応答性クロマトグラフィープロセスで得られた溶出画分と従来プロセスで得られた溶出画分とを用いて、ウイルス不活化実験を、実施例１の＜低ｐH処理時間とウイルス不活化との関係＞で示した方法と同様に実施した。結果を表９に示す。

以上の結果から、低ｐH暴露を回避した温度応答性クロマトグラフィーで得られた溶出画分を用いた場合でも、ｐＨ３．５条件下、０．５分で充分なウイルス不活化効果が得られることが分かった。０．５分より長い処理時間でウイルスが不活化することは自明である。またpH３．５以下でウイルス不活化効果が得られることも自明である。

よって、温度応答性クロマトグラフィーと短時間低ｐＨ処理とを実施することが、ウイルス不活性化と抗体の凝集形成回避との両者を達成するための有効な手段であることが示された。

Claims (7)

1. リガンドとの相互作用を利用して抗体を含有する溶液から医薬品としての前記抗体を得る抗体製造方法において、前記抗体を含有する溶液をpH２．５乃至３．５で０．５乃至１０分間保持する工程を含む、抗体製造方法。
2. 前記抗体を含有する溶液が体液又は細胞培養液である、請求項１に記載の抗体製造方法。
3. 前記抗体が哺乳動物由来抗体、ヒトＩｇＧとのキメラ抗体、又はヒト化抗体である、請求項１又は２に記載の抗体製造方法。
4. 前記哺乳動物がヒト、ウシ、又はマウスである、請求項３に記載の抗体製造方法。
5. 前記抗体がヒトＩｇＧである請求項１又は２に記載の抗体製造方法。
6. 前記抗体を含有する溶液をpH２．５乃至３．５で０．５乃至１０分間保持する工程の前に、低ｐH処理を回避したクロマトグラフィーで前記抗体を含有する溶液を得る工程を更に含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の抗体製造方法。
7. 前記低ｐH処理を回避したクロマトグラフィーが、温度応答性クロマトグラフィーである、請求項６に記載の抗体製造方法。