JPWO2004087761A1 - ヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の精製 - Google Patents
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Abstract
主として治療の用途に使用する、場合によっては、診断および試薬の用途に使用するヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の分離・精製方法を提供し、少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法、 （１）陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および （２）（１）に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、およびヒト抗体と偶蹄目の動物の抗体を含有する混合物から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いたｐＨグラージェントにより該ヒト抗体と該偶蹄目の動物の抗体を分離する方法を提供する。
Description
本発明は、抗体精製に関する。より詳細には本発明は主として治療の用途に使用する、場合によっては、診断および試薬の用途に使用するヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の分離・精製方法に関する。
（１）モノクローナル抗体の精製
抗体の精製においては一般的にＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムが用いられている。近年注目されている抗体医薬、例えばモノクローナル抗体医薬の場合には、治療に用いるために高純度が要求されている。従って、抗体医薬の精製プロセスでは一般に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーに加えて、コンベンショナルなクロマトグラフィーモード（ゲルろ過、イオン交換、疎水など）による精製が行われている。
例えば、Ｒｈｏｎａ Ｍ．Ｏ’ＬｅａｒｙらはＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー→陽イオン交極クロマトグラフィー→陰イオン交換クロマトグラフィーのシークエンスで治療用抗体の精製を行っている（ＢｉｏＰｈａｒｍ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００１，１０−１８）。しかしながら、この精製方法における「陽イオン交換クロマトグラフィー→陰イオン交換クロマトグラフィー」という順番でのカラムの組み合わせでは以下の問題点がある。すなわち、陰イオン交換クロマトグラフィーに陽イオン交換クロマトグラフィーでの抗体溶出液を供する前に、該抗体溶出液のイオン強度を下げるための希釈（通常は、導電率５ｍＳ／ｃｍ以下）が必要となる。その結果本希釈工程は一連の精製プロセスにおいて例えば、▲１▼希釈溶液が必要となる、▲２▼希釈による容量増加の結果装置が大型化する、▲３▼作業が長時間化する、などの問題を生じる。該希釈工程が必要なのは、陽イオン交換クロマトグラフィーが一般にイオン強度を上げて溶出させる方法であるのに対して、次工程の陰イオン交換クロマトグラフィーでは一般にイオン強度を下げて、抗体を陰イオンカラムから素通りさせて、不純物は陰イオンカラムに吸着させる、という原理に基づいているからである。
（２）非ヒト動物ポリクローナル抗体からのヒト抗体の精製
ヒト抗体を産生する方法として種々の方法が開発されている。例えば、動物細胞にヒト抗体をコードするＤＮＡを導入することにより、該動物細胞で該ヒト抗体を産生することができる。この場合、該動物細胞の培養には通常非ヒト動物血清を添加するので、該ヒト抗体を含む該動物細胞の培養上清中には、該非ヒト動物抗体が含まれている。
また、ヒトの抗体の遺伝子座を導入したトランスジェニック非ヒト動物が作出されており、該動物を抗原で免疫することにより、該動物中で前記抗原に対するヒト抗体が産生される。しかし、免疫された該動物の体液、例えば乳液あるいは血液、にはヒト抗体だけではなく、該動物自体の抗体も含まれている。
ヒト抗体産生細胞が産生するヒト抗体を精製するにあたり、非ヒト動物由来抗体を含有する血清成分を含む培地から、該ヒト抗体を分離する必要がある。またヒト抗体産生能力を有するトランスジェニック非ヒト動物の体液、例えば乳液あるいは血液、から該ヒト抗体を精製するにあたり、該トランスジェニック非ヒト動物由来の抗体を含有する体液から該ヒト抗体を分離する必要がある。
例えば、マウスモノクローナル抗体とウシ血清由来のウシＩｇＧの分離において、疎水性クロマトグラフィーが用いられる。（Ｇｒｕｎｆｅｌｄ Ｈら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９７ ２０１（２））。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡアフィニティークロマトグラフィーでのｐＨグラージェント溶出にて、マウスモノクローナル抗体とウシ血清由来ＩｇＧを分離した例がある（初めての抗体精製ハンドブックＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，７２−０８２３−０１，ｐ８８）。また、トランスジェニックヤギにて生産されたモノクローナル抗体の分離精製に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーを用いてヤギ由来のＩｇＧを＞３ Ｌｏｇ１０のレベル低減したという報告がある（Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｐｏｌｌｏｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１ １９９９）。
しかしながら、これまでにウシ抗体またはヒツジ抗体とヒト抗体を分離した報告はない。さらにはヒトポリクローナル抗体からウシポリクローナル抗体、ヤギポリクローナル抗体、またはヒツジポリクローナル抗体を分離した報告はない。
ＢｉｏＰｈａｒｍ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００１，１０−１８ Ｇｒｕｎｆｅｌｄ Ｈら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９７ ２０１（２），ｐ２３３−２４１ 初めての抗体精製ハンドブックＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，７２−０８２３−０１，ｐ８８ Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｐｏｌｌｏｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１ １９９９，ｐ１４７−１５７
抗体の精製においては一般的にＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムが用いられている。近年注目されている抗体医薬、例えばモノクローナル抗体医薬の場合には、治療に用いるために高純度が要求されている。従って、抗体医薬の精製プロセスでは一般に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーに加えて、コンベンショナルなクロマトグラフィーモード（ゲルろ過、イオン交換、疎水など）による精製が行われている。
例えば、Ｒｈｏｎａ Ｍ．Ｏ’ＬｅａｒｙらはＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー→陽イオン交極クロマトグラフィー→陰イオン交換クロマトグラフィーのシークエンスで治療用抗体の精製を行っている（ＢｉｏＰｈａｒｍ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００１，１０−１８）。しかしながら、この精製方法における「陽イオン交換クロマトグラフィー→陰イオン交換クロマトグラフィー」という順番でのカラムの組み合わせでは以下の問題点がある。すなわち、陰イオン交換クロマトグラフィーに陽イオン交換クロマトグラフィーでの抗体溶出液を供する前に、該抗体溶出液のイオン強度を下げるための希釈（通常は、導電率５ｍＳ／ｃｍ以下）が必要となる。その結果本希釈工程は一連の精製プロセスにおいて例えば、▲１▼希釈溶液が必要となる、▲２▼希釈による容量増加の結果装置が大型化する、▲３▼作業が長時間化する、などの問題を生じる。該希釈工程が必要なのは、陽イオン交換クロマトグラフィーが一般にイオン強度を上げて溶出させる方法であるのに対して、次工程の陰イオン交換クロマトグラフィーでは一般にイオン強度を下げて、抗体を陰イオンカラムから素通りさせて、不純物は陰イオンカラムに吸着させる、という原理に基づいているからである。
（２）非ヒト動物ポリクローナル抗体からのヒト抗体の精製
ヒト抗体を産生する方法として種々の方法が開発されている。例えば、動物細胞にヒト抗体をコードするＤＮＡを導入することにより、該動物細胞で該ヒト抗体を産生することができる。この場合、該動物細胞の培養には通常非ヒト動物血清を添加するので、該ヒト抗体を含む該動物細胞の培養上清中には、該非ヒト動物抗体が含まれている。
また、ヒトの抗体の遺伝子座を導入したトランスジェニック非ヒト動物が作出されており、該動物を抗原で免疫することにより、該動物中で前記抗原に対するヒト抗体が産生される。しかし、免疫された該動物の体液、例えば乳液あるいは血液、にはヒト抗体だけではなく、該動物自体の抗体も含まれている。
ヒト抗体産生細胞が産生するヒト抗体を精製するにあたり、非ヒト動物由来抗体を含有する血清成分を含む培地から、該ヒト抗体を分離する必要がある。またヒト抗体産生能力を有するトランスジェニック非ヒト動物の体液、例えば乳液あるいは血液、から該ヒト抗体を精製するにあたり、該トランスジェニック非ヒト動物由来の抗体を含有する体液から該ヒト抗体を分離する必要がある。
例えば、マウスモノクローナル抗体とウシ血清由来のウシＩｇＧの分離において、疎水性クロマトグラフィーが用いられる。（Ｇｒｕｎｆｅｌｄ Ｈら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９７ ２０１（２））。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡアフィニティークロマトグラフィーでのｐＨグラージェント溶出にて、マウスモノクローナル抗体とウシ血清由来ＩｇＧを分離した例がある（初めての抗体精製ハンドブックＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，７２−０８２３−０１，ｐ８８）。また、トランスジェニックヤギにて生産されたモノクローナル抗体の分離精製に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーを用いてヤギ由来のＩｇＧを＞３ Ｌｏｇ１０のレベル低減したという報告がある（Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｐｏｌｌｏｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１ １９９９）。
しかしながら、これまでにウシ抗体またはヒツジ抗体とヒト抗体を分離した報告はない。さらにはヒトポリクローナル抗体からウシポリクローナル抗体、ヤギポリクローナル抗体、またはヒツジポリクローナル抗体を分離した報告はない。
ＢｉｏＰｈａｒｍ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００１，１０−１８ Ｇｒｕｎｆｅｌｄ Ｈら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９７ ２０１（２），ｐ２３３−２４１ 初めての抗体精製ハンドブックＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，７２−０８２３−０１，ｐ８８ Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｐｏｌｌｏｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１ １９９９，ｐ１４７−１５７
（１）抗体の精製において、従来の「陽イオン交換クロマトグラフィー→陰イオン交換クロマトグラフィー」の一連のプロセスにおいて必須である希釈工程においては、▲１▼希釈溶液が必要となる、▲２▼希釈による容量増加の結果装置が大型化する、▲３▼作業が長時間化する、などの問題があった。（２）有蹄動物の抗体およびヒト抗体を含有する混合物から該ヒト抗体を単離する方法に関しては未解決である。さらにはヒトポリクローナル抗体および有蹄動物のポリクローナル抗体を含有する混合物から該ヒトポリクローナル抗体を単離する方法に関しては未解決である。
本発明は、上記の問題点あるいは未解決課題を解決することを目的とする。
本発明者は抗体を効率的に精製することを目的として鋭意検討を進めた。その結果「陰イオン交換クロマトグラフィー→陽イオン交換クロマトグラフィー」という精製シークエンスが上記の課題を解決することを見出し、本発明を完成させるに至った。また、一方でヒト抗体とウシ抗体、ヒツジ抗体またはヤギ抗体等の有蹄動物の抗体を含有する混合物からヒト抗体を単離する方法を鋭意検討した。その結果、該混合物をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムに供した後、溶出方法をｐＨグラージェントとすることによりヒト抗体を単離できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
１． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および
（２）（１）に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程
２． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製する工程、および
（２）（１）に次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および
（３）（２）に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程
３． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製する工程、および
（２）（１）に次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および
（３）（２）に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および
（４）（３）に次いで、疎水性クロマトグラフィーで精製する工程
４． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）リン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、平衡化に用いた（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、クエン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液をリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ４．０〜８．５に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、平衡化に用いた（６）の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液を酢酸またはクエン酸でｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、酢酸ナトリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム：クエン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、平衡化に用いた（９）の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム：クエン酸緩衝液ならびに塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程
５． さらに、
（１２） 上記４記載の工程（１１）に次いで、上記４記載の工程（１１）の溶出液に硫酸アンモニウムを添加し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整する工程、および
（１３） （１２）に次いで、硫酸アンモニウムおよびリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および
（１４） （１３）に次いで、平衡化に用いた（１３）の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１４）に次いで、（１３）の緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
６． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記１から５のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
７． ウイルスを不活化する工程が、プロテインＡクロマトグラフィーで精製する工程の後に行われる、上記６記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
８． ウイルスの不活化が、上記４の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記７記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
９． ウイルス除去フィルターを用いてのろ過によるウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法の最終工程で行われる、上記６から８のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１０． 上記４記載の工程（４）のリン酸ナトリウム緩衝液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた上記４〜９のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１１． 上記４記載の工程（４）および（５）を、下記の工程に代えた、上記４〜９のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（３）に次いで、溶出液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程
１２． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１） １０〜１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび０〜４．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、平衡化に用いた（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、１０〜１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液を１０〜２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ４．０〜８．５に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液を０．５〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、１０〜２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、平衡化に用いた（６）の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液を０．５〜１．５Ｍ酢酸またはクエン酸でｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、１０〜５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液または１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム：１０〜５０ｍＭクエン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、平衡化に用いた（９）の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、１０〜５０ｍＭ酢酸ナトリウムまたは１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム：１０〜５０ｍＭクエン酸緩衝液ならびに０．１〜１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程
１３． さらに、
（１２） 上記１２に記載の工程（１１）に次いで、上記１２に記載の工程（１１）の溶出液に０．８〜１．２Ｍ硫酸アンモニウム濃度になるように硫酸アンモニウムを添加し、１．０〜１０．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整する工程、および
（１３） （１２）に次いで、０．８〜１．２Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０ｍＭ〜１００ｍＭリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および
（１４） （１３）に次いで、平衡化に用いた（１３）の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１４）に次いで、（１３）の緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１４． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記１２または１３に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１５． ウイルスの不活化が、上記１２の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記１４記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１６． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記１２の工程（１１）に次いで行われる、上記１４または１５に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１７． ウイルス除去フィルターを用いてのろ過によるウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記１３の工程（１５）に次いで行われる、上記１４または１５に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１８． 上記１２に記載の工程（４）のリン酸ナトリウム緩衝液を０．５〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた上記１２〜１７のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１９． 上記１２記載の工程（４）および（５）を、下記の工程に代えた、上記１２〜１７のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（３）に次いで、溶出液を０．５〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程
２０． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１） １０〜２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、平衡化に用いた（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、１０〜２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液を１０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ４．０〜８．５に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液を１．０〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、平衡化に用いた（６）の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液を１Ｍ酢酸またはクエン酸でｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液または２０ｍＭリン酸ナトリウム：１０ｍＭクエン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、平衡化に用いた（９）の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウムまたは２０ｍＭリン酸ナトリウム：１０ｍＭクエン酸緩衝液ならびに０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程
２１． さらに、
（１２） 上記２０に記載の工程（１１）に次いで、上記２０に記載の工程（１１）の溶出液に１．０Ｍ硫酸アンモニウム濃度になるように硫酸アンモニウムを添加し、１０．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整する工程、および
（１３） （１２）に次いで、１．０Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および
（１４） （１３）に次いで、平衡化に用いた（１３）の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１４）に次いで、（１３）の緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
２２． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記２０または２１に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
２３． ウイルスの不活化が、上記２０の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記２２記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
２４． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記２０の工程（１１）に次いで行われる、上記２２または２３に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
２５． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記２１の工程（１５）に次いで行われる、上記２２または２３に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
２６． 上記２０に記載の工程（４）のリン酸ナトリウム緩衝液を１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた上記２０〜２５のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
２７． 上記２０に記載の工程（４）および（５）を、下記の工程に代えた、上記２０〜２５のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（３）に次いで、溶出液を１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程
２８． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）１０〜２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、平衡化に用いた（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、１０〜２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液を１０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ７．０に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液を１．０〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ８．０に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、平衡化に用いた（６）の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液を１．０Ｍ酢酸またはクエン酸でｐＨ５．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液または２０ｍＭリン酸ナトリウム：１０ｍＭクエン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、平衡化に用いた（９）の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウムまたは２０ｍＭリン酸ナトリウム：１０ｍＭクエン酸緩衝液ならびに０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程
２９． さらに、
（１２） 上記２８に記載の工程（１１）に次いで、上記２８に記載の工程（１１）の溶出液に１．０Ｍ硫酸アンモニウム濃度になるように硫酸アンモニウムを添加し、１０．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整する工程、および
（１３） （１２）に次いで、１．０Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および
（１４） （１３）に次いで、平衡化に用いた（１３）の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１４）に次いで、（１３）の緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３０． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記２８または２９に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３１． ウイルスの不活化が、上記２８の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記３０記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３２． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記２８の工程（１１）に次いで行われる、上記３０または３１に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３３． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記２９の工程（１５）に次いで行われる、上記３０または３１に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３４． 上記２８に記載の工程（４）のリン酸ナトリウム緩衝液を１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた上記２８〜３３のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３５． 上記２８記載の工程（４）および（５）を、下記の工程に代えた、上記２８〜３３のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（３）に次いで、溶出液を１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ８．０に調整する工程
３６． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１） ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、
（２） （１）に次いで、ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、ｐＨ２．７〜４．０の緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液をｐＨ４．０〜８．５に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液をｐＨ６．０〜８．５に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液をｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、０．１〜１．０Ｍの塩を含有するｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程
３７． さらに、
（１２） 上記３６に記載の工程（１１）の溶出液に０．８〜１．２Ｍの濃度となるように塩を添加し、さらにｐＨ６．０〜８．０に調整する工程、
（１３） （１２）の塩を０．８〜１．２Ｍの濃度で含有するｐＨ６．０〜８．０の緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、
（１４） （１２）の塩を０．８〜１．２Ｍの濃度で含有する、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１３）の該緩衝液中の塩濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３８． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記３６または３７に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３９． ウイルスの不活化が、上記３６の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記３８記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４０． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記３６の工程（１１）に次いで行われる、上記３８または３９に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４１． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記３７の工程（１５）に次いで行われる、上記３８または３９に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４２． 上記３６に記載の工程（２）のｐＨ６．０〜８．５の緩衝液が工程（１）の緩衝液と同一であり、上記３６に記載の工程（７）のｐＨ６．０〜８．５の緩衝液が工程（６）の緩衝液と同一であり、かつ上記３６に記載の工程（１０）のｐＨ４．０〜７．０の緩衝液が工程（９）の緩衝液と同一である、上記３６記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４３． 上記３７に記載の工程（１４）の（１２）の塩を０．８〜１．２Ｍの濃度で含有する、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液が工程（１３）の緩衝液と同一である、上記３７〜４２のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４４． 上記３６に記載の工程（１１）の塩が塩化ナトリウムである上記３６〜４３のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４５． 上記３７に記載の工程（１２）の塩が硫酸アンモニウムである上記３６〜４５のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４６． 上記３６記載の工程（１）の緩衝液が、４．０Ｍ以下の塩を含有する上記３６〜４５のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４７． 塩が塩化ナトリウムである上記４６記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４８． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１） ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（３） （２）に次いで、（２）の溶出液をｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（４） （３）に次いで、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（３）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（５） （４）に次いで、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（６） （５）に次いで、０．１〜１．０Ｍの塩を含有するｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程
４９． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記４８記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５０． ウイルスの不活化が、上記４８の工程（１）の前に、抗体含有溶液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記４９記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５１． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記４８の工程（６）に次いで行われる、上記４９または５０に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５２． 上記４８に記載の工程（２）のｐＨ６．０〜８．５の緩衝液が工程（１）の緩衝液と同一であり、かつ上記４８に記載の工程（５）のｐＨ４．０〜７．０の緩衝液が工程（４）の緩衝液と同一である上記４８〜５１のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５３． 上記４８に記載の工程（６）の塩が塩化ナトリウムである上記４８〜５２のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５４． 抗体がヒト抗体である上記１〜５３のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５５． 抗体がモノクローナル抗体である上記１〜５４のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５６． 抗体がＩｇＧである上記１〜５５のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５７． 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である上記５６記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５８． 抗体が、抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列において、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が欠失し、または天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換し、または天然に存在する重鎖定常領域に少なくとも一つのアミノ酸が付加した抗体である、上記５４〜５７のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５９． 抗体が他の化合物と共有あるいは配位結合した上記５４〜５８のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
６０． ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより該ヒト抗体と該有蹄動物の抗体を分離する方法。
６１． 有蹄動物が、ウシ、ヤギおよびヒツジからなる群から選択される上記６０記載の該ヒト抗体と該有蹄動物の抗体を分離する方法。
６２． 分離が、ｐＨグラージェント溶出である上記６０または６１記載の方法。
６３． 分離が、ｐＨ段階溶出である上記６０または６１記載の方法。
６４． 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
（１） リン酸二ナトリウム、酢酸ナトリウム、グリシンおよび塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）についで、（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）についで、（１）の緩衝液中のｐＨを低下させることにより該プロテインＡカラムから該ヒト抗体を溶出する工程
６５． 有蹄動物がウシ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される上記６４記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
６６． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記６４または６５に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
６７． ウイルスの不活化が、上記６４の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記６６記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
６８． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、上記６６または６７記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
６９． ｐＨの低下が、グラージェント的である上記６４〜６８のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７０． ｐＨの低下が、段階的である上記６４〜６８のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７１． 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
（１） ０．０５〜０．１５Ｍリン酸二ナトリウム、０．０５〜０．１５Ｍ酢酸ナトリウム、０．０５〜０．１５Ｍグリシンおよび０．０５〜０．２０Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）についで、（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）についで、（１）の緩衝液中のｐＨを低下させることにより該プロテインＡカラムから該ヒト抗体を溶出する工程
７２． 有蹄動物がウシ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される上記７１記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７３． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記７１または７２に記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７４． ウイルスの不活化が、上記７１の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記７３記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７５． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、上記７３または７４に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７６． ｐＨの低下が、グラージェント的である上記７１〜７５のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７７． ｐＨの低下が、段階的である上記７１〜７５のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。。
７８． 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
（１） ０．１０Ｍリン酸二ナトリウム、０．１０Ｍ酢酸ナトリウム、０．１０Ｍグリシンおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、（１）の緩衝液中のｐＨを低下させることにより該プロテインＡカラムから該ヒト抗体を溶出する工程
７９． 有蹄動物がウシ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される上記７８記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８０． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記７８または７９に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８１． ウイルスの不活化が、上記７８の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記８０記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８２． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、上記８０または８１に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８３． ｐＨの低下が、グラージェント的である上記７８〜８２のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８４． ｐＨの低下が、段階的である上記７８〜８２のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８５． 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
（１） ｐＨ７．５〜８．５の緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、
（２） ｐＨ７．５〜８．５の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、
（３） （２）の緩衝液のｐＨを低下させることにより該プロテインＡカラムから該ヒト抗体を溶出する工程
８６． 有蹄動物がウシ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される上記８５記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８７． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記８５または８６に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８８． ウイルスの不活化が、上記８５の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記８７記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８９． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、上記８７または８８に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９０． ｐＨの低下が、グラージェント的である上記８５〜８９のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９１． ｐＨの低下が、段階的である上記８５〜８９のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９２． 上記８５記載の工程（２）のｐＨ７．５〜８．５の緩衝液が、工程（１）の緩衝液と同一である、上記８５〜９１のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９３． 上記８５記載の工程（１）のｐＨ７．５〜８．５の緩衝液が、０．０５〜０．２０Ｍの濃度で塩を含有する、上記８５〜９２のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９４． 塩が塩化ナトリウムである、上記９３記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９５． ヒト抗体がヒトポリクローナル抗体である上記６０〜９４のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９６． 有蹄動物の抗体がウシポリクローナル抗体、ヤギポリクローナル抗体およびヒツジポリクローナル抗体からなる群から選択される上記６０〜９５のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９７． ヒト抗体がＩｇＧである上記６０〜９６のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９８． ヒト抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である、上記９７記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−０９７４０７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明は、上記の問題点あるいは未解決課題を解決することを目的とする。
本発明者は抗体を効率的に精製することを目的として鋭意検討を進めた。その結果「陰イオン交換クロマトグラフィー→陽イオン交換クロマトグラフィー」という精製シークエンスが上記の課題を解決することを見出し、本発明を完成させるに至った。また、一方でヒト抗体とウシ抗体、ヒツジ抗体またはヤギ抗体等の有蹄動物の抗体を含有する混合物からヒト抗体を単離する方法を鋭意検討した。その結果、該混合物をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムに供した後、溶出方法をｐＨグラージェントとすることによりヒト抗体を単離できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
１． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および
（２）（１）に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程
２． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製する工程、および
（２）（１）に次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および
（３）（２）に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程
３． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製する工程、および
（２）（１）に次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および
（３）（２）に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および
（４）（３）に次いで、疎水性クロマトグラフィーで精製する工程
４． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）リン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、平衡化に用いた（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、クエン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液をリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ４．０〜８．５に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、平衡化に用いた（６）の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液を酢酸またはクエン酸でｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、酢酸ナトリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム：クエン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、平衡化に用いた（９）の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム：クエン酸緩衝液ならびに塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程
５． さらに、
（１２） 上記４記載の工程（１１）に次いで、上記４記載の工程（１１）の溶出液に硫酸アンモニウムを添加し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整する工程、および
（１３） （１２）に次いで、硫酸アンモニウムおよびリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および
（１４） （１３）に次いで、平衡化に用いた（１３）の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１４）に次いで、（１３）の緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
６． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記１から５のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
７． ウイルスを不活化する工程が、プロテインＡクロマトグラフィーで精製する工程の後に行われる、上記６記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
８． ウイルスの不活化が、上記４の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記７記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
９． ウイルス除去フィルターを用いてのろ過によるウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法の最終工程で行われる、上記６から８のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１０． 上記４記載の工程（４）のリン酸ナトリウム緩衝液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた上記４〜９のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１１． 上記４記載の工程（４）および（５）を、下記の工程に代えた、上記４〜９のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（３）に次いで、溶出液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程
１２． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１） １０〜１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび０〜４．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、平衡化に用いた（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、１０〜１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液を１０〜２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ４．０〜８．５に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液を０．５〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、１０〜２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、平衡化に用いた（６）の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液を０．５〜１．５Ｍ酢酸またはクエン酸でｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、１０〜５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液または１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム：１０〜５０ｍＭクエン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、平衡化に用いた（９）の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、１０〜５０ｍＭ酢酸ナトリウムまたは１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム：１０〜５０ｍＭクエン酸緩衝液ならびに０．１〜１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程
１３． さらに、
（１２） 上記１２に記載の工程（１１）に次いで、上記１２に記載の工程（１１）の溶出液に０．８〜１．２Ｍ硫酸アンモニウム濃度になるように硫酸アンモニウムを添加し、１．０〜１０．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整する工程、および
（１３） （１２）に次いで、０．８〜１．２Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０ｍＭ〜１００ｍＭリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および
（１４） （１３）に次いで、平衡化に用いた（１３）の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１４）に次いで、（１３）の緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１４． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記１２または１３に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１５． ウイルスの不活化が、上記１２の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記１４記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１６． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記１２の工程（１１）に次いで行われる、上記１４または１５に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１７． ウイルス除去フィルターを用いてのろ過によるウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記１３の工程（１５）に次いで行われる、上記１４または１５に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１８． 上記１２に記載の工程（４）のリン酸ナトリウム緩衝液を０．５〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた上記１２〜１７のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
１９． 上記１２記載の工程（４）および（５）を、下記の工程に代えた、上記１２〜１７のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（３）に次いで、溶出液を０．５〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程
２０． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１） １０〜２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、平衡化に用いた（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、１０〜２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液を１０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ４．０〜８．５に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液を１．０〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、平衡化に用いた（６）の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液を１Ｍ酢酸またはクエン酸でｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液または２０ｍＭリン酸ナトリウム：１０ｍＭクエン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、平衡化に用いた（９）の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウムまたは２０ｍＭリン酸ナトリウム：１０ｍＭクエン酸緩衝液ならびに０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程
２１． さらに、
（１２） 上記２０に記載の工程（１１）に次いで、上記２０に記載の工程（１１）の溶出液に１．０Ｍ硫酸アンモニウム濃度になるように硫酸アンモニウムを添加し、１０．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整する工程、および
（１３） （１２）に次いで、１．０Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および
（１４） （１３）に次いで、平衡化に用いた（１３）の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１４）に次いで、（１３）の緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
２２． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記２０または２１に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
２３． ウイルスの不活化が、上記２０の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記２２記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
２４． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記２０の工程（１１）に次いで行われる、上記２２または２３に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
２５． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記２１の工程（１５）に次いで行われる、上記２２または２３に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
２６． 上記２０に記載の工程（４）のリン酸ナトリウム緩衝液を１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた上記２０〜２５のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
２７． 上記２０に記載の工程（４）および（５）を、下記の工程に代えた、上記２０〜２５のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（３）に次いで、溶出液を１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程
２８． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）１０〜２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、平衡化に用いた（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、１０〜２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液を１０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ７．０に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液を１．０〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ８．０に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、平衡化に用いた（６）の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液を１．０Ｍ酢酸またはクエン酸でｐＨ５．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液または２０ｍＭリン酸ナトリウム：１０ｍＭクエン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、平衡化に用いた（９）の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウムまたは２０ｍＭリン酸ナトリウム：１０ｍＭクエン酸緩衝液ならびに０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程
２９． さらに、
（１２） 上記２８に記載の工程（１１）に次いで、上記２８に記載の工程（１１）の溶出液に１．０Ｍ硫酸アンモニウム濃度になるように硫酸アンモニウムを添加し、１０．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整する工程、および
（１３） （１２）に次いで、１．０Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および
（１４） （１３）に次いで、平衡化に用いた（１３）の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１４）に次いで、（１３）の緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３０． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記２８または２９に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３１． ウイルスの不活化が、上記２８の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記３０記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３２． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記２８の工程（１１）に次いで行われる、上記３０または３１に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３３． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記２９の工程（１５）に次いで行われる、上記３０または３１に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３４． 上記２８に記載の工程（４）のリン酸ナトリウム緩衝液を１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた上記２８〜３３のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３５． 上記２８記載の工程（４）および（５）を、下記の工程に代えた、上記２８〜３３のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（３）に次いで、溶出液を１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ８．０に調整する工程
３６． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１） ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、
（２） （１）に次いで、ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、ｐＨ２．７〜４．０の緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液をｐＨ４．０〜８．５に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液をｐＨ６．０〜８．５に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液をｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、０．１〜１．０Ｍの塩を含有するｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程
３７． さらに、
（１２） 上記３６に記載の工程（１１）の溶出液に０．８〜１．２Ｍの濃度となるように塩を添加し、さらにｐＨ６．０〜８．０に調整する工程、
（１３） （１２）の塩を０．８〜１．２Ｍの濃度で含有するｐＨ６．０〜８．０の緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、
（１４） （１２）の塩を０．８〜１．２Ｍの濃度で含有する、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１３）の該緩衝液中の塩濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３８． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記３６または３７に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
３９． ウイルスの不活化が、上記３６の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記３８記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４０． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記３６の工程（１１）に次いで行われる、上記３８または３９に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４１． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記３７の工程（１５）に次いで行われる、上記３８または３９に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４２． 上記３６に記載の工程（２）のｐＨ６．０〜８．５の緩衝液が工程（１）の緩衝液と同一であり、上記３６に記載の工程（７）のｐＨ６．０〜８．５の緩衝液が工程（６）の緩衝液と同一であり、かつ上記３６に記載の工程（１０）のｐＨ４．０〜７．０の緩衝液が工程（９）の緩衝液と同一である、上記３６記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４３． 上記３７に記載の工程（１４）の（１２）の塩を０．８〜１．２Ｍの濃度で含有する、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液が工程（１３）の緩衝液と同一である、上記３７〜４２のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４４． 上記３６に記載の工程（１１）の塩が塩化ナトリウムである上記３６〜４３のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４５． 上記３７に記載の工程（１２）の塩が硫酸アンモニウムである上記３６〜４５のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４６． 上記３６記載の工程（１）の緩衝液が、４．０Ｍ以下の塩を含有する上記３６〜４５のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４７． 塩が塩化ナトリウムである上記４６記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
４８． 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１） ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（３） （２）に次いで、（２）の溶出液をｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（４） （３）に次いで、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（３）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（５） （４）に次いで、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（６） （５）に次いで、０．１〜１．０Ｍの塩を含有するｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程
４９． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記４８記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５０． ウイルスの不活化が、上記４８の工程（１）の前に、抗体含有溶液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記４９記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５１． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、上記４８の工程（６）に次いで行われる、上記４９または５０に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５２． 上記４８に記載の工程（２）のｐＨ６．０〜８．５の緩衝液が工程（１）の緩衝液と同一であり、かつ上記４８に記載の工程（５）のｐＨ４．０〜７．０の緩衝液が工程（４）の緩衝液と同一である上記４８〜５１のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５３． 上記４８に記載の工程（６）の塩が塩化ナトリウムである上記４８〜５２のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５４． 抗体がヒト抗体である上記１〜５３のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５５． 抗体がモノクローナル抗体である上記１〜５４のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５６． 抗体がＩｇＧである上記１〜５５のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５７． 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である上記５６記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５８． 抗体が、抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列において、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が欠失し、または天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換し、または天然に存在する重鎖定常領域に少なくとも一つのアミノ酸が付加した抗体である、上記５４〜５７のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
５９． 抗体が他の化合物と共有あるいは配位結合した上記５４〜５８のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
６０． ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより該ヒト抗体と該有蹄動物の抗体を分離する方法。
６１． 有蹄動物が、ウシ、ヤギおよびヒツジからなる群から選択される上記６０記載の該ヒト抗体と該有蹄動物の抗体を分離する方法。
６２． 分離が、ｐＨグラージェント溶出である上記６０または６１記載の方法。
６３． 分離が、ｐＨ段階溶出である上記６０または６１記載の方法。
６４． 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
（１） リン酸二ナトリウム、酢酸ナトリウム、グリシンおよび塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）についで、（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）についで、（１）の緩衝液中のｐＨを低下させることにより該プロテインＡカラムから該ヒト抗体を溶出する工程
６５． 有蹄動物がウシ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される上記６４記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
６６． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記６４または６５に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
６７． ウイルスの不活化が、上記６４の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記６６記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
６８． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、上記６６または６７記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
６９． ｐＨの低下が、グラージェント的である上記６４〜６８のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７０． ｐＨの低下が、段階的である上記６４〜６８のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７１． 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
（１） ０．０５〜０．１５Ｍリン酸二ナトリウム、０．０５〜０．１５Ｍ酢酸ナトリウム、０．０５〜０．１５Ｍグリシンおよび０．０５〜０．２０Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）についで、（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）についで、（１）の緩衝液中のｐＨを低下させることにより該プロテインＡカラムから該ヒト抗体を溶出する工程
７２． 有蹄動物がウシ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される上記７１記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７３． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記７１または７２に記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７４． ウイルスの不活化が、上記７１の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記７３記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７５． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、上記７３または７４に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７６． ｐＨの低下が、グラージェント的である上記７１〜７５のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
７７． ｐＨの低下が、段階的である上記７１〜７５のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。。
７８． 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
（１） ０．１０Ｍリン酸二ナトリウム、０．１０Ｍ酢酸ナトリウム、０．１０Ｍグリシンおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、（１）の緩衝液中のｐＨを低下させることにより該プロテインＡカラムから該ヒト抗体を溶出する工程
７９． 有蹄動物がウシ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される上記７８記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８０． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記７８または７９に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８１． ウイルスの不活化が、上記７８の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記８０記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８２． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、上記８０または８１に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８３． ｐＨの低下が、グラージェント的である上記７８〜８２のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８４． ｐＨの低下が、段階的である上記７８〜８２のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８５． 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
（１） ｐＨ７．５〜８．５の緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、
（２） ｐＨ７．５〜８．５の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、
（３） （２）の緩衝液のｐＨを低下させることにより該プロテインＡカラムから該ヒト抗体を溶出する工程
８６． 有蹄動物がウシ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される上記８５記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８７． さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、上記８５または８６に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８８． ウイルスの不活化が、上記８５の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、上記８７記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
８９． ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、上記８７または８８に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９０． ｐＨの低下が、グラージェント的である上記８５〜８９のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９１． ｐＨの低下が、段階的である上記８５〜８９のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９２． 上記８５記載の工程（２）のｐＨ７．５〜８．５の緩衝液が、工程（１）の緩衝液と同一である、上記８５〜９１のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９３． 上記８５記載の工程（１）のｐＨ７．５〜８．５の緩衝液が、０．０５〜０．２０Ｍの濃度で塩を含有する、上記８５〜９２のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９４． 塩が塩化ナトリウムである、上記９３記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９５． ヒト抗体がヒトポリクローナル抗体である上記６０〜９４のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９６． 有蹄動物の抗体がウシポリクローナル抗体、ヤギポリクローナル抗体およびヒツジポリクローナル抗体からなる群から選択される上記６０〜９５のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９７． ヒト抗体がＩｇＧである上記６０〜９６のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
９８． ヒト抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である、上記９７記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−０９７４０７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
図１は、ヒトポリクローナル抗体Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
図２は、ウシポリクローナル抗体Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
図３は、ヒトポリクローナル抗体、ウシポリクローナル抗体混合物Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
図４は、ヤギポリクローナル抗体Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
図５は、ヒトポリクローナル抗体とヤギポリクローナル抗体混合物のＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
図６は、ヒツジポリクローナル抗体Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
図７は、ヒトポリクローナル抗体とヒツジポリクローナル抗体混合物のＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
図２は、ウシポリクローナル抗体Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
図３は、ヒトポリクローナル抗体、ウシポリクローナル抗体混合物Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
図４は、ヤギポリクローナル抗体Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
図５は、ヒトポリクローナル抗体とヤギポリクローナル抗体混合物のＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
図６は、ヒツジポリクローナル抗体Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
図７は、ヒトポリクローナル抗体とヒツジポリクローナル抗体混合物のＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抗体を含有する混合物から該抗体を精製する方法において、抗体を含有する混合物には、抗体を産生するハイブリドーマ、ＮＳＯ等のミエローマ細胞、抗体をコードする遺伝子で形質転換され該抗体を発現産生し得る動物細胞、酵母等の培養上清が含まれる。好ましくは、本発明の方法による精製を行なうときはこれらの培養上清は清澄化しておく。清澄化は例えば、０．２μｍのメンブランフィルターによる濾過等により行なえばよい。本発明で精製する抗体には、限定はなく例えばヒト抗体、マウスやウシ、ヤギ、ヒツジなどの有蹄動物等の非ヒト動物抗体、ヒトと非ヒト動物とのキメラ抗体、非ヒト動物抗体をヒト化したヒト化抗体等が含まれ、好ましくはヒト抗体である。更に好ましくはヒトモノクローナル抗体である。また、抗体のクラス、サブクラスは限定されず、いずれのクラス、サブクラスの抗体も本願発明において精製し得るが、好ましくはＩｇＧ、その中でもＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４である。また、抗体が、抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列において、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が欠失し、または天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換し、または天然に存在する重鎖定常領域に少なくとも一つのアミノ酸が付加した抗体であってもよい。さらに、抗体が他の化合物と共有あるいは配位結合していてもよい。
本発明においては、少なくとも前記抗体を含有する混合物は陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーにより、この順番で精製される。さらに、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製する前にＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーにより精製してもよく、また陽イオンクロマトグラフィーの後に疎水性クロマトグラフィーにより精製してもよい。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの代わりにＰｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーを行なってもよい。またさらに、疎水性クロマトグラフィーの代わりにゲルろ過、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーあるいは金属キレートアフィニティークロマトグラフィーを行ってもよい。
これらのクロマトグラフィーには、それぞれ陰イオン交換樹脂を含むカラム、陽イオン交換樹脂を含むカラム、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ結合樹脂を含むカラムおよび疎水性リガンドを結合させた樹脂を含むカラムが用いられる。これらのカラムとしては市販の分取クロマトグラフィー用のカラムを用いてもよいし、市販のまたはガラス管から作製した空カラムに上記樹脂を詰めて用いてもよい。前記樹脂としても市販のものを用いることができる。
市販のＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムとしては、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ｐｒｏｓｅｐ ｒＡ、Ｐｒｏｓｅｐ Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＰＯＲＯＳ Ａ／２０などがあり、市販の陰イオン交換カラムとしてはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ等があり、市販の陽イオン交換カラムとしては、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ等がある。さらに、市販の疎水性カラムとしては、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、東ソー社製Ｐｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ Ｓ、Ｐｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ Ｍ等がある。
また、カラム作製のためのイオン交換クロマトグラフィー用樹脂もイオン交換基を結合させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ等のセルロース、アガロース、デキストラン、シリカ、合成ポリマー等の樹脂を用いることができ、陰イオン交換基としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基や、それより塩基性の強い第四級アミノエチル（ＱＡＥ）基等を、陽イオン交換基としては、カルボキシメチル（ＣＭ）基や、それより酸性度の強いスルホプロピル（ＳＰ）基、リン酸基等を選択すればよい。また、疎水性クロマトグラフィーに用いる樹脂に結合した疎水性リガンドもＰｈｅｎｙｌ、Ｂｕｔｙｌ、Ｏｃｔｙｌ、Ｅｔｈｙｌ等がありいずれも用いることができる。
以下、各クロマトグラフィーによる精製方法について記載するが、以下の記載は例えば、目的の抗体を７００ｍｇ／Ｌの濃度で含む混合物を２２０〜１５００ｍＬ用いる場合を想定している。用いる抗体の濃度、量は限定されず、濃度、量によりカラムサイズ、使用緩衝液量等を適宜調整することができる。
陰イオン交換クロマトグラフィーを行なう場合、あらかじめカラムをｐＨ６〜８．５、好ましくはｐＨ８．０の緩衝液で平衡化しておく、この時用いる緩衝液はＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）やＢｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ（１，３−ｂｉｓ［ｔｒｉｓ（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｅ））等がある。この時の緩衝液の濃度は１０ｍＭ〜２０ｍＭが好ましく、１０ｍＭがさらに好ましい。平衡化したかどうかは、カラムを通過してきた緩衝液のｐＨと導電率が開始緩衝液と同じであることを確認すればよい。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体含有混合物の容積にもよるが、例えば長さ２．５〜３０ｃｍのものを用いればよい。陰イオン交換カラムにアプライする抗体含有混合物またはＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーにより精製した抗体含有混合物は、ｐＨ６．０〜８．５、好ましくはｐＨ８．０に調整しておく。この際、ｐＨの調整に用いる緩衝液の種類は限定されず、例えばリン酸ナトリウム緩衝液あるいはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等が用いられるが、陰イオン交換カラムの平衡化に用いた緩衝液と同じ種類の緩衝液を用いるのが好ましく、平衡化に用いる緩衝液のｐＨと抗体含有混合物のｐＨを同等に調整しておくか、平衡化に用いる緩衝液のｐＨをやや高く調整しておくのが望ましい。サンプルをアプライした後に、カラム容量の数倍、好ましくは約３倍の量のｐＨ６．０〜８．５の緩衝液、好ましくは平衡化に用いた緩衝液を流し、溶出する。カラム非吸着画分に目的の抗体が含まれている。この際緩衝液を流す線速度もカラムサイズにより異なるが、５０〜５００ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。
次いで、得られた陰イオン交換カラム非吸着画分を陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。陽イオン交換クロマトグラフィーを行う場合、あらかじめカラムをｐＨ４．０〜７．０、好ましくはｐＨ５．０の緩衝液で平衡化しておく。この時用いる緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液やクエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液あるいはＭＥＳ；２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ等が挙げられる。この際の緩衝液の濃度は、１０〜５０ｍＭが好ましく、２０ｍＭがさらに好ましい。平衡化したかどうかは、カラムを通過してきた緩衝液のｐＨと導電率が開始緩衝液と同じであることを確認すればよい。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体含有混合物の容積にもよるが、例えば長さ２．５〜３０ｃｍのものを用いればよい。陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにアプライする陰イオン交換カラム非吸着画分は、ｐＨ４．０〜７．０、好ましくはｐＨ５．０に調整しておく。この際、ｐＨの調整に用いる溶液、緩衝液は適宜選択できる。例えば酢酸、クエン酸や酢酸、クエン酸緩衝液が挙げられる。酢酸を用いてｐＨを調整する場合、酢酸の濃度は０．５〜１．５Ｍが好ましく、１．０Ｍがさらに好ましい。結果として陽イオン交換カラムの平衡化に用いる緩衝液のｐＨと陰イオン交換カラム非吸着画分のｐＨを同等に調整しておくか、平衡化に用いる緩衝液のｐＨをやや低く調整しておくのが望ましい。陰イオン交換カラム非吸着画分をアプライした後に、カラム容量の数倍、好ましくは約５倍量の緩衝液で洗浄する。洗浄に用いる緩衝液としては、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液が挙げられ、好ましくは、平衡化に用いた緩衝液である。次いで、カラム容量の数倍、好ましくは約５倍の量の０．１Ｍ〜１．０Ｍの塩を含有する緩衝液を流し目的の抗体を溶出する。この際、平衡化に用いた緩衝液、例えば１０〜５０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭの酢酸ナトリウムに塩化ナトリウムを０．１〜１．０Ｍ、好ましくは０．３Ｍ添加した緩衝液を用いればよい。または、２０ｍＭ酢酸ナトリウムの替りに、２０ｍＭリン酸ナトリウム−１０ｍＭクエン酸緩衝液を用いてもよい。
塩は適宜選択可能であり塩化ナトリウム以外に、例えば塩化カリウムなども使用できる。カラム非吸着画分に目的の抗体が含まれている。この際緩衝液を流す線速度もカラムサイズにより異なるが、５０〜５００ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。また、この際塩化ナトリウム濃度を徐々に増加させていく塩濃度勾配溶出により溶出してもよい。この際の勾配容量はカラム体積の５〜４０倍、好ましくは２０倍である。濃度勾配溶出を行うためには、自動混合装置を用いたり、あるいは、２つの溶媒槽のあるグラージェント作成器を用いればよい。さらに、この際塩濃度は段階的に上げていってもよい。ここでグラージェント溶出とは、カラム中を流下させる溶媒の濃度あるいは組成を連続的に変化させることによって溶出を行う方式をいい、段階溶出とは、カラム中を流下させる溶媒を、濃度あるいは組成を異にしていて、溶出能がより高いものに、不連続的に切替えて溶出を行う方式をいう。ｐＨグラージェント溶出とは溶媒のｐＨを連続的に変化させて行う溶出であり、ｐＨ段階的溶出とはｐＨを不連続的に切替えて行う溶出である。グラージェント的とは、変化が連続的であることをいい、段階的とは変化が不連続的であることをいう。
陰イオン交換クロマトグラフィーの前にＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行なう場合は以下のように行なう。あらかじめカラムをｐＨ６．０〜８．５、好ましくはｐＨ７．０の緩衝液で平衡化しておく。この時用いる緩衝液はリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ；２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＭＥＳ；２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ等がある。さらに好ましくは、該緩衝液は０〜４．０Ｍまでの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む。例えば、１０〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０〜４．０Ｍ、好ましくは０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液が例示できる。平衡化したかどうかは、カラムを通過してきた緩衝液のｐＨと導電率が開始緩衝液と同じであることを確認すればよい。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体含有混合物の量にもよるが、例えば長さ５〜３０ｃｍのものを用いればよい。抗体含有混合物をアプライした後に緩衝液、例えばｐＨ６．０〜８．５、好ましくはｐＨ６．０〜７．０の緩衝液でカラムを洗浄する。この際用いる緩衝液は好ましくは、平衡化に用いた緩衝液である。また、この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば５カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。緩衝液を流す線速度もカラムサイズにより異なるが、５０〜１０００ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。次いで、ｐＨ２．７〜ｐＨ４．０、好ましくはｐＨ３．４〜３．５の緩衝液、例えばクエン酸ナトリウム緩衝液で抗体をカラムから溶出する。この際のクエン酸ナトリウム緩衝液の濃度は、１０〜１００ｍＭが好ましく、２０ｍＭがさらに好ましい。この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば５カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。線速度もカラムサイズにより異なるが、５０〜１０００ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。溶出液中に目的の抗体が含まれている。このＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー溶出液をｐＨ４．０〜８．５、好ましくはｐＨ８．０に調節して次の陰イオンクロマトグラフィー精製を行なう。この際、用いる緩衝液としては例えばリン酸ナトリウム緩衝液あるいはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等がある。
この際、リン酸ナトリウム緩衝液およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の両方を用いて、例えばリン酸ナトリウム緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の順番に添加してもよいし、リン酸ナトリウム緩衝液またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の一方のみを用いてもよい。用いるリン酸ナトリウムおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の濃度は、それぞれ１０〜２００ｍＭおよび０．５〜１．５Ｍが好ましく、１００ｍＭおよび１．０Ｍがさらに好ましい。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー精製を行なうことにより、抗体の純度は９８％になり、精製収率は約７０％である。抗体純度は例えば、ゲル濾過ＨＰＬＣにより測定できる。
さらに、上述の陽イオン交換クロマトグラフィー精製の後に、疎水性クロマトグラフィーにより以下のような方法で精製してもよい。
あらかじめカラムを塩０．８〜１．２Ｍを含有するｐＨ６．０〜８．０の緩衝液で平衡化しておく。平衡化に用いる緩衝液として、例えばｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ７．０の０．８〜１．２Ｍ、好ましくは１．０Ｍの硫酸アンモニウムを含む緩衝液である。例えば１０ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。このカラムに、陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液に０．８〜１．２Ｍとなるように塩を添加しｐＨ６．０〜８．０に調整したものをアプライする。この調整は、例えば１．０Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、さらに必要ならば水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨを６．０〜８．０、好ましくはｐＨ７．０に調整する。このｐＨ調整に用いる硫酸アンモニウムは硫酸アンモニウム濃度が０．８〜１．２Ｍ、好ましくは１．０Ｍになるように添加し、水酸化ナトリウム水溶液の濃度は、１．０〜１０．０Ｍ、好ましくは５．０Ｍである。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体混合物の量にもよるが、例えば長さ２．５〜２０ｃｍのものを用いればよい。抗体混合物をアプライした後に平衡化緩衝液、例えば塩０．８〜１．２Ｍを含有するｐＨ６．０〜８．０の緩衝液でカラムを洗浄し、非吸着画分を洗い流す。この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば５カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。緩衝液を流す線速度もカラムサイズにより異なるが、５０〜２００ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。次いで、１０〜５０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を徐々に低下させる塩濃度勾配溶出を行なう。この際の勾配容量は５〜３０好ましくは、１０カラム容積である。場合によっては、塩濃度を一定あるいは段階的に上げていってもよい。線濃度は５０〜２００ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。
疎水性クロマトグラフィーを行なうことにより、抗体純度は９９％以上になる。
なお、精製しようとする抗体によっては、それぞれのクロマトグラフィーの前に洗浄工程を追加してもよい。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの場合には、抗体を溶出する前に２０ｍＭリン酸ナトリウム１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）又は／および１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の洗浄工程を入れ、カラムに吸着した非特異的吸着物質を除去できる。この際用いる緩衝液の量は限定されず、例えば５カラム容量の緩衝液を用いればよい。また、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーの場合には、抗体を溶出する前に１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０，６．５，７．０）でカラムを洗浄し、不純物を除去できる。この際用いる緩衝液の量は限定されず、例えば５カラム容量の緩衝液を用いればよい。
さらに、抗体を含む培養上清には、抗体を産生する細胞由来のウイルスが含まれている場合がある。従って、本発明の抗体の精製方法にウイルスを不活化する工程および／またはウイルスを除去する工程を含ませてもよい。ウイルスを不活化するには、精製過程で得られる抗体を含む溶液を一定時間酸性条件下におけばよく、例えばクエン酸溶液等の酸性溶液を添加して、一定時間置けばよい。ウイルス不活化の工程は一連の精製工程のどこに含ませてもよいが、プロテインＡカラムから抗体を溶出する際にクエン酸緩衝液を用いるので、該溶出液に濃いクエン酸溶液、例えば１Ｍクエン酸溶液を添加してｐＨ４以下、好ましくはｐＨ３．５以下に調製し１５分以上、好ましくは３０分以上、さらに好ましくは４５分以上放置すればよい。酸性条件下におけるウイルス不活化を行う場合、より容易に酸性条件に調整できるように、その直前の工程で用いる緩衝液の濃度やｐＨも低めに調整しておくのが望ましい。例えば、プロテインＡカラムによる精製工程の後に、ウイルスの不活化を行う場合は、プロテインＡカラムの平衡化が通常２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７を用いて行われるのに対して、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６を用いて行えばよい。また、溶出も通常クエン酸緩衝液ｐＨ３．５を用いて行われるのに対して、クエン酸緩衝液ｐＨ３．４を用いて行えばよい。
本発明の方法において、プロテインＡカラムから溶出した抗体含有溶液は、次いで中和して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけるが、クエン酸溶液を用いてウイルスを不活化した場合には、中和に用いる緩衝液のｐＨを高くするか、あるいは濃度を大きくする必要がある。ウイルス不活化工程を含まない場合、プロテインＡカラムから溶出した抗体含有溶液を１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ７．０に調整し、その後１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ８．０に調整する例が挙げられるが、この際に例えば、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．２を添加し、次いで１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を添加してｐＨ８．０に合わせればよい。
また、ウイルス除去は、ウイルス除去フィルターによりろ過することにより行うことができる。ウイルス除去フィルターとしては、例えば旭化成社製のプラノバ２０Ｎを用いることができる。さらに本発明の方法で得られた精製抗体は、必要に応じて濃縮あるいは無菌ろ過する。濃縮工程は例えば限外ろ過膜を用いて行えばよい。さらに、抗体の安定化のために濃縮工程時に緩衝液を適当な緩衝液に交換してもよい。例えば、１〜５０ｍＭのグルタミン酸緩衝液に交換すればよい。また、この際抗体の安定化を目的として交換緩衝液にソルビトール等を含ませてもよい。また、無菌ろ過工程は、例えば孔径０．４５μｍ以下のメンブレンフィルターを用いて行えばよい。上記ウイルス除去工程、濃縮工程、無菌ろ過工程は本発明の精製過程のどこで行ってもよいが、抗体の精製終了後の精製抗体を用いて、すなわち精製過程の最後に行うのが望ましい。例えば、ウイルス除去工程および無菌ろ過工程を、陽イオンクロマトグラフィーで抗体を溶出した後に行えばよく、また精製工程が疎水性クロマトグラフィーで精製する工程を含む場合は、疎水性クロマトグラフィーで抗体を溶出した後に行えばよい。ウイルス除去工程および無菌ろ過工程の順序は限定されないが、好ましくはウイルス除去フィルターを通してウイルス除去を行った後に、無菌ろ過を行う。
本発明は、ヒト抗体とウシ抗体、ヒツジ抗体またはヤギ抗体等の有蹄動物の抗体との混合物からヒト抗体とウシ抗体、ヒツジ抗体またはヤギ等の有蹄動物の抗体を分離する方法をも包含する。ヒト抗体およびウシ抗体はモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはポリクローナル抗体である。例えば、本発明は、ウシ血清含培地で培養されたヒトモノクローナル抗体、ヒトと非ヒト動物とのキメラ抗体、非ヒト動物抗体をヒト化したヒト化抗体等を産生し得るＣＨＯ細胞、ＮＳＯミエローマ細胞、ハイブリドーマの培養上清からこれらの抗体とウシ血清中のウシ抗体を分離するのに用いることができる。本発明はまた、ヒトモノクローナル抗体、ヒトと非ヒト動物とのキメラ抗体、非ヒト動物抗体をヒト化したヒト化抗体等を産生し得るトランスジェニックウシの体液、例えば血液または乳液、から前記抗体を分離するのに用いられる。本発明は、さらにヒトポリクローナル抗体とウシ由来の抗体を分離するのに用いられ、例えばヒト抗体の遺伝子座が導入されヒト抗体を産生し得るトランスジェニックウシに抗原を投与して免疫した場合に該ウシの体液、例えば血液または乳液中にはヒトポリクローナル抗体とウシポリクローナル抗体が含まれこの混合物からの両抗体の分離に用いられる。
ヒト抗体とウシ抗体、ヒツジ抗体またはヤギ抗体等の有蹄動物の抗体の分離には、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーが用いられる。この際のカラムサイズ、抗体混合物の容積は適宜決定することができる。Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡカラムはｐＨ７．５〜８．５、好ましくはｐＨ８．０の緩衝液で平衡化する。この際に用いる緩衝液として、リン酸二ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム、グリシンおよび塩化ナトリウムを含有する緩衝液が挙げられる。リン酸二ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム、グリシンの濃度は、すべて０．０５〜０．１５Ｍが好ましく、さらには０．１０Ｍが好ましい。また、塩化ナトリウムの濃度は０．０５〜０．２０Ｍが好ましく、さらには０．１５Ｍが好ましい。具体的には、例えば、０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）が例示できる。平衡化したかどうかは、カラムを通過してきた緩衝液のｐＨと導電率が開始緩衝液と同じであることを確認すればよい。平衡化したカラムに、好ましくは平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液でｐＨを調整したヒト抗体とウシ等の抗体混合物をアプライする。この際、抗体混合物の抗体濃度等により、ｐＨ調整のために添加する緩衝液の容積や濃度を適宜決定すればよい。次いで平衡化に用いた緩衝液、例えばｐＨ７．５〜８．５、好ましくはｐＨ８．０の緩衝液でカラムを洗浄する。この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば５カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。その後、カラムに流す０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）を徐々に添加し、ｐＨを徐々に低下させる、グラージェント的な溶出すなわちｐＨグラージェント溶出を行うことによりヒト抗体とウシ抗体を分離することができる。この際の勾配容量は、２０から４０、好ましくは３０カラム容量である。ｐＨグラージェント溶出におけるｐＨの下限は、例えばｐＨ２．０〜３．０であり、好ましくはｐＨ２．５である。線速度はカラムサイズにより異なるが、５０〜１５０ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。また、この際ｐＨ段階的な溶出を行ってもよい。
以上のクロマトグラフィー操作は、自動機器を用いて自動的に行うことができる。例えば、中高圧液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を適当なプログラム制御の下で用いて行うことができる。
以下、本発明の実施例を説明するが、本実施例の態様は本発明を限定するものではない。
実施例１ ヒトモノクローナル抗体の精製
デプスフィルターおよび０．２μｍのメンブランフィルターで清澄化したヒトモノクローナル抗体（ヒトＩｇＧ１）を含むＣＨＯ細胞無血清培養上清（ヒトモノクローナル抗体発現量：７００ｍｇ／Ｌ）２２０ｍｌを２０ｍＭリン酸ナトリウム−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ８ｍｍ ＩＤ ｘ ２０ｃｍ）に添加した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。培養上清添加後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。次に５カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。溶出液に１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を添加しｐＨ７．０とした。本操作は、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の替りに１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いることでも実施できた。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ溶出液を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）にてｐＨ８．０に調整後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ ７ｍｍ ＩＤ ｘ １５ｃｍ）に添加した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。添加終了後、３カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。カラム非吸着画分をヒトモノクローナル抗体溶出液としてプールした。
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬプール液を１Ｍ酢酸にてｐＨ５．０に調整後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ１０ｍｍ ＩＤ ｘ １０ｃｍ）に添加した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。次に５カラム容量の２０ｍＭ酢酸ナトリウム−０．３Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を通液し、ヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。
本方法によるヒトモノクローナル抗体の精製収率は約７０％であり、ゲルろ過ＨＰＬＣ分析の結果、純度は９８％であった。
また、抗体によってはカラムから抗体を溶出する前に洗浄工程を入れた。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの場合には、ヒトモノクローナル抗体をクエン酸ナトリウム緩衝液で溶出する前に５カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム−１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）又は／および１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）の洗浄工程を入れ、カラムに吸着した非特異的吸着物質を除去した。また、陽イオン交換クロマトグラフィーの場合には、ヒトモノクローナル抗体を２０ｍＭ酢酸ナトリウム−０．３Ｍ塩化ナトリウム緩衝液で溶出する前に５カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄し、不純物を除去した。
さらには、抗体によってはＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー→陰イオン交換クロマトグラフィー→陽イオン交換クロマトグラフィーの精製シークエンスの後に疎水性クロマトグラフィーの工程を入れる場合もある。
そのクロマトグラフィー条件の実施例を以下に示す。
上記で得られた、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦプール液に１Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加後、１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．０に調整した。その溶液を１Ｍ硫酸アンモニウム−１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した疎水性カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ １０ｍｍ ＩＤ ｘ １０ｃｍ）に添加した（線速度１６０ｃｍ／ｈ）。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度１６０ｃｍ／ｈ）。次に、１Ｍ硫酸アンモニウム−１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより（勾配容量：硫酸アンモニウム濃度１Ｍ→０Ｍとするのに１０カラム容量使用）によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度１６０ｃｍ／ｈ）。
疎水性クロマトグラフィー工程を加えることにより、ヒトモノクローナル抗体の純度が９９％以上に向上した（ゲルろ過ＨＰＬＣ分析）。
実施例２ ヒトポリクローナル抗体とウシポリクローナル抗体の分離精製
ヒトポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ４５０６、商品名：Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）およびウシポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ５５０６、商品名：Ｂｏｖｉｎｅ ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）各３ｍｇを０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）３ｍｌに溶解後、０．２μｍのフィルターに通したものをそれぞれヒトポリクローナル抗体溶液、ウシポリクローナル抗体溶液とした。
０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した３つのＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＰＯＲＯＳ Ａ／２０ ４．６ｍｍＩＤ ｘ ５ｃｍ）に次の３サンプルを別個に添加した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。１）ヒトポリクローナル抗体溶液１ｍｌ、２）ウシポリクローナル抗体溶液１ｍｌ、３）ヒトポリクローナル抗体、ウシポリクローナル抗体等量混合溶液２ｍｌを別個に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。次に０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液に０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）を徐々に添加し、ｐＨを徐々に低下させる、ｐＨグラージェント溶出（勾配容量：３０カラム容量の使用でｐＨ８．０→２．５とした）によりヒトポリクローナル抗体およびウシポリクローナル抗体を溶出した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。各クロマトグラフィーの溶出曲線を図１、２、３に示す。
図１、２に示すように、ｐＨグラージェント溶出ではウシポリクローナル抗体の方がヒトポリクローナル抗体より早く溶出し、図３に示すように両者混合物のクロマトにおいて、ヒトポリクローナル抗体とウシポリクローナル抗体は分離された。
実施例３ ヒトモノクローナル抗体の精製その２
デプスフィルターおよび０．２μｍのメンブランフィルターで清澄化したヒトモノクローナル抗体（ヒトＩｇＧ１）を含むＣＨＯ細胞無血清培養上清（ヒトモノクローナル抗体発現量：７００ｍｇ／Ｌ）１５００ｍｌを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ２０ｍｍ ＩＤ ｘ ２０ｃｍ）に添加した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。培養上清添加後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。次に５カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．４）によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。ウイルス不活化の目的で、溶出液に１Ｍクエン酸を添加し、ｐＨ３．５に調整した。室温にて４５分間保持後、この溶液に等量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）を添加し中和した。
ウイルス不活化後溶液を１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにてｐＨ８．０に調整後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ １０ｍｍ ＩＤ ｘ １５ｃｍ）に添加した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。添加終了後、３カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。カラム非吸着画分をヒトモノクローナル抗体溶出液としてプールした。
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬプール液を１Ｍクエン酸にてｐＨ５．０に調整後、２０ｍＭリン酸ナトリウム−１０ｍＭクエン酸−０．０５Ｍ塩化ナトリウ緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ２６ｍｍ ＩＤ ｘ １５ｃｍ）に添加した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。次に５カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム−１０ｍＭクエン酸−０．３Ｍ塩化ナトリウ緩衝液（ｐＨ５．０）を通液し、ヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。
ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦプール液を１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム−２６２ｍＭ Ｄ−ソルビトール（ｐＨ５．５）にて平衡化した限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ｂｉｏｍａｘ ３０ ５０ｃｍ２）で１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、１０倍量以上の同緩衝液にてバッファー交換した。バッファー交換後、ヒトモノクローナル抗体溶液を２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、抗体溶液を回収した。
濃縮・バッファー交換抗体回収液を０．２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製デュラポア親水性マルチメディアフィルター）にて無菌ろ過し、最終精製品とした。
本方法によるヒトモノクローナル抗体の精製収率は約７０％であり、ゲルろ過ＨＰＬＣ分析の結果、純度は９８％であった。
必要に応じて、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦプール液をウイルス除去フィルター（旭化成社製プラノバ２０Ｎ）にてろ過した。ろ過液を限外ろ過膜に供して、濃縮・バッファー交換した。
また、抗体によってはカラムから抗体を溶出する前に洗浄工程を入れた。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの場合には、ヒトモノクローナル抗体をクエン酸ナトリウム緩衝液で溶出する前に５カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム−１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）又は／および１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）の洗浄工程を入れ、カラムに吸着した非特異的吸着物質を除去した。また、陽イオン交換クロマトグラフィーの場合には、ヒトモノクローナル抗体を２０ｍＭりん酸ナトリウム−１０ｍＭクエン酸−０．３Ｍ塩化ナトリウ緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出する前に５カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０，６．５または７．０）でカラムを洗浄し、不純物を除去した。
実施例４ ヒトポリクローナル抗体とヤギポリクローナル抗体の分離精製
ヒトポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ４５０６、商品名：Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）およびヤギポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ５２５６、商品名：Ｇｏａｔ ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）各３ｍｇを０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）３ｍｌに溶解後、０．２μｍのフィルターに通したものをそれぞれヒトポリクローナル抗体溶液、ヤギポリクローナル抗体溶液とした。
０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した３つのＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＰＯＲＯＳ Ａ／２０ ４．６ｍｍＩＤ ｘ ５ｃｍ）に次の３サンプルを別個に添加した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。１）ヒトポリクローナル抗体溶液１ｍｌ、２）ヤギポリクローナル抗体溶液１ｍｌ、３）ヒトポリクローナル抗体、ヤギポリクローナル抗体等量混合溶液２ｍｌを別個に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。次に０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液に０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）を徐々に添加し、ｐＨを徐々に低下させる、ｐＨグラージェント溶出（勾配容量：３０カラム容量の使用でｐＨ８．０→２．５とした）によりヒトポリクローナル抗体およびヤギポリクローナル抗体を溶出した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。各クロマトグラフィーの溶出曲線を図４、５に示す。
図４、５に示すように、ｐＨグラージェント溶出ではヤギポリクローナル抗体の方がヒトポリクローナル抗体より早く溶出し、図５に示すように両者混合物のクロマトにおいて、ヒトポリクローナル抗体とヤギポリクローナル抗体は分離された。
実施例５ ヒトポリクローナル抗体とヒツジポリクローナル抗体の分離精製
ヒトポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ４５０６、商品名：Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）およびヒツジポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ５１３１、商品名：Ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）各３ｍｇを０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）３ｍｌに溶解後、０．２μｍのフィルターに通したものをそれぞれヒトポリクローナル抗体溶液、ヒツジポリクローナル抗体溶液とした。
０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した３つのＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＰＯＲＯＳ Ａ／２０ ４．６ｍｍＩＤ ｘ ５ｃｍ）に次の３サンプルを別個に添加した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。１）ヒトポリクローナル抗体溶液１ｍｌ、２）ヒツジポリクローナル抗体溶液１ｍｌ、３）ヒトポリクローナル抗体、ヒツジポリクローナル抗体等量混合溶液２ｍｌを別個に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。次に０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液に０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）を徐々に添加し、ｐＨを徐々に低下させる、ｐＨグラージェント溶出（勾配容量：３０カラム容量の使用でｐＨ８．０→２．５とした）によりヒトポリクローナル抗体およびヒツジポリクローナル抗体を溶出した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。各クロマトグラフィーの溶出曲線を図６、７に示す。
図６、７に示すように、ｐＨグラージェント溶出ではヒツジポリクローナル抗体の方がヒトポリクローナル抗体より早く溶出し、図７に示すように両者混合物のクロマトにおいて、ヒトポリクローナル抗体とヒツジポリクローナル抗体は分離された。
本発明の抗体を含有する混合物から該抗体を精製する方法において、抗体を含有する混合物には、抗体を産生するハイブリドーマ、ＮＳＯ等のミエローマ細胞、抗体をコードする遺伝子で形質転換され該抗体を発現産生し得る動物細胞、酵母等の培養上清が含まれる。好ましくは、本発明の方法による精製を行なうときはこれらの培養上清は清澄化しておく。清澄化は例えば、０．２μｍのメンブランフィルターによる濾過等により行なえばよい。本発明で精製する抗体には、限定はなく例えばヒト抗体、マウスやウシ、ヤギ、ヒツジなどの有蹄動物等の非ヒト動物抗体、ヒトと非ヒト動物とのキメラ抗体、非ヒト動物抗体をヒト化したヒト化抗体等が含まれ、好ましくはヒト抗体である。更に好ましくはヒトモノクローナル抗体である。また、抗体のクラス、サブクラスは限定されず、いずれのクラス、サブクラスの抗体も本願発明において精製し得るが、好ましくはＩｇＧ、その中でもＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４である。また、抗体が、抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列において、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が欠失し、または天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換し、または天然に存在する重鎖定常領域に少なくとも一つのアミノ酸が付加した抗体であってもよい。さらに、抗体が他の化合物と共有あるいは配位結合していてもよい。
本発明においては、少なくとも前記抗体を含有する混合物は陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーにより、この順番で精製される。さらに、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製する前にＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーにより精製してもよく、また陽イオンクロマトグラフィーの後に疎水性クロマトグラフィーにより精製してもよい。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの代わりにＰｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーを行なってもよい。またさらに、疎水性クロマトグラフィーの代わりにゲルろ過、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーあるいは金属キレートアフィニティークロマトグラフィーを行ってもよい。
これらのクロマトグラフィーには、それぞれ陰イオン交換樹脂を含むカラム、陽イオン交換樹脂を含むカラム、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ結合樹脂を含むカラムおよび疎水性リガンドを結合させた樹脂を含むカラムが用いられる。これらのカラムとしては市販の分取クロマトグラフィー用のカラムを用いてもよいし、市販のまたはガラス管から作製した空カラムに上記樹脂を詰めて用いてもよい。前記樹脂としても市販のものを用いることができる。
市販のＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムとしては、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ｐｒｏｓｅｐ ｒＡ、Ｐｒｏｓｅｐ Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＰＯＲＯＳ Ａ／２０などがあり、市販の陰イオン交換カラムとしてはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ等があり、市販の陽イオン交換カラムとしては、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ等がある。さらに、市販の疎水性カラムとしては、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、東ソー社製Ｐｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ Ｓ、Ｐｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ Ｍ等がある。
また、カラム作製のためのイオン交換クロマトグラフィー用樹脂もイオン交換基を結合させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ等のセルロース、アガロース、デキストラン、シリカ、合成ポリマー等の樹脂を用いることができ、陰イオン交換基としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基や、それより塩基性の強い第四級アミノエチル（ＱＡＥ）基等を、陽イオン交換基としては、カルボキシメチル（ＣＭ）基や、それより酸性度の強いスルホプロピル（ＳＰ）基、リン酸基等を選択すればよい。また、疎水性クロマトグラフィーに用いる樹脂に結合した疎水性リガンドもＰｈｅｎｙｌ、Ｂｕｔｙｌ、Ｏｃｔｙｌ、Ｅｔｈｙｌ等がありいずれも用いることができる。
以下、各クロマトグラフィーによる精製方法について記載するが、以下の記載は例えば、目的の抗体を７００ｍｇ／Ｌの濃度で含む混合物を２２０〜１５００ｍＬ用いる場合を想定している。用いる抗体の濃度、量は限定されず、濃度、量によりカラムサイズ、使用緩衝液量等を適宜調整することができる。
陰イオン交換クロマトグラフィーを行なう場合、あらかじめカラムをｐＨ６〜８．５、好ましくはｐＨ８．０の緩衝液で平衡化しておく、この時用いる緩衝液はＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）やＢｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ（１，３−ｂｉｓ［ｔｒｉｓ（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｅ））等がある。この時の緩衝液の濃度は１０ｍＭ〜２０ｍＭが好ましく、１０ｍＭがさらに好ましい。平衡化したかどうかは、カラムを通過してきた緩衝液のｐＨと導電率が開始緩衝液と同じであることを確認すればよい。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体含有混合物の容積にもよるが、例えば長さ２．５〜３０ｃｍのものを用いればよい。陰イオン交換カラムにアプライする抗体含有混合物またはＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーにより精製した抗体含有混合物は、ｐＨ６．０〜８．５、好ましくはｐＨ８．０に調整しておく。この際、ｐＨの調整に用いる緩衝液の種類は限定されず、例えばリン酸ナトリウム緩衝液あるいはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等が用いられるが、陰イオン交換カラムの平衡化に用いた緩衝液と同じ種類の緩衝液を用いるのが好ましく、平衡化に用いる緩衝液のｐＨと抗体含有混合物のｐＨを同等に調整しておくか、平衡化に用いる緩衝液のｐＨをやや高く調整しておくのが望ましい。サンプルをアプライした後に、カラム容量の数倍、好ましくは約３倍の量のｐＨ６．０〜８．５の緩衝液、好ましくは平衡化に用いた緩衝液を流し、溶出する。カラム非吸着画分に目的の抗体が含まれている。この際緩衝液を流す線速度もカラムサイズにより異なるが、５０〜５００ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。
次いで、得られた陰イオン交換カラム非吸着画分を陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。陽イオン交換クロマトグラフィーを行う場合、あらかじめカラムをｐＨ４．０〜７．０、好ましくはｐＨ５．０の緩衝液で平衡化しておく。この時用いる緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液やクエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液あるいはＭＥＳ；２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ等が挙げられる。この際の緩衝液の濃度は、１０〜５０ｍＭが好ましく、２０ｍＭがさらに好ましい。平衡化したかどうかは、カラムを通過してきた緩衝液のｐＨと導電率が開始緩衝液と同じであることを確認すればよい。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体含有混合物の容積にもよるが、例えば長さ２．５〜３０ｃｍのものを用いればよい。陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにアプライする陰イオン交換カラム非吸着画分は、ｐＨ４．０〜７．０、好ましくはｐＨ５．０に調整しておく。この際、ｐＨの調整に用いる溶液、緩衝液は適宜選択できる。例えば酢酸、クエン酸や酢酸、クエン酸緩衝液が挙げられる。酢酸を用いてｐＨを調整する場合、酢酸の濃度は０．５〜１．５Ｍが好ましく、１．０Ｍがさらに好ましい。結果として陽イオン交換カラムの平衡化に用いる緩衝液のｐＨと陰イオン交換カラム非吸着画分のｐＨを同等に調整しておくか、平衡化に用いる緩衝液のｐＨをやや低く調整しておくのが望ましい。陰イオン交換カラム非吸着画分をアプライした後に、カラム容量の数倍、好ましくは約５倍量の緩衝液で洗浄する。洗浄に用いる緩衝液としては、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液が挙げられ、好ましくは、平衡化に用いた緩衝液である。次いで、カラム容量の数倍、好ましくは約５倍の量の０．１Ｍ〜１．０Ｍの塩を含有する緩衝液を流し目的の抗体を溶出する。この際、平衡化に用いた緩衝液、例えば１０〜５０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭの酢酸ナトリウムに塩化ナトリウムを０．１〜１．０Ｍ、好ましくは０．３Ｍ添加した緩衝液を用いればよい。または、２０ｍＭ酢酸ナトリウムの替りに、２０ｍＭリン酸ナトリウム−１０ｍＭクエン酸緩衝液を用いてもよい。
塩は適宜選択可能であり塩化ナトリウム以外に、例えば塩化カリウムなども使用できる。カラム非吸着画分に目的の抗体が含まれている。この際緩衝液を流す線速度もカラムサイズにより異なるが、５０〜５００ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。また、この際塩化ナトリウム濃度を徐々に増加させていく塩濃度勾配溶出により溶出してもよい。この際の勾配容量はカラム体積の５〜４０倍、好ましくは２０倍である。濃度勾配溶出を行うためには、自動混合装置を用いたり、あるいは、２つの溶媒槽のあるグラージェント作成器を用いればよい。さらに、この際塩濃度は段階的に上げていってもよい。ここでグラージェント溶出とは、カラム中を流下させる溶媒の濃度あるいは組成を連続的に変化させることによって溶出を行う方式をいい、段階溶出とは、カラム中を流下させる溶媒を、濃度あるいは組成を異にしていて、溶出能がより高いものに、不連続的に切替えて溶出を行う方式をいう。ｐＨグラージェント溶出とは溶媒のｐＨを連続的に変化させて行う溶出であり、ｐＨ段階的溶出とはｐＨを不連続的に切替えて行う溶出である。グラージェント的とは、変化が連続的であることをいい、段階的とは変化が不連続的であることをいう。
陰イオン交換クロマトグラフィーの前にＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行なう場合は以下のように行なう。あらかじめカラムをｐＨ６．０〜８．５、好ましくはｐＨ７．０の緩衝液で平衡化しておく。この時用いる緩衝液はリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ；２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＭＥＳ；２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ等がある。さらに好ましくは、該緩衝液は０〜４．０Ｍまでの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む。例えば、１０〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０〜４．０Ｍ、好ましくは０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液が例示できる。平衡化したかどうかは、カラムを通過してきた緩衝液のｐＨと導電率が開始緩衝液と同じであることを確認すればよい。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体含有混合物の量にもよるが、例えば長さ５〜３０ｃｍのものを用いればよい。抗体含有混合物をアプライした後に緩衝液、例えばｐＨ６．０〜８．５、好ましくはｐＨ６．０〜７．０の緩衝液でカラムを洗浄する。この際用いる緩衝液は好ましくは、平衡化に用いた緩衝液である。また、この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば５カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。緩衝液を流す線速度もカラムサイズにより異なるが、５０〜１０００ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。次いで、ｐＨ２．７〜ｐＨ４．０、好ましくはｐＨ３．４〜３．５の緩衝液、例えばクエン酸ナトリウム緩衝液で抗体をカラムから溶出する。この際のクエン酸ナトリウム緩衝液の濃度は、１０〜１００ｍＭが好ましく、２０ｍＭがさらに好ましい。この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば５カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。線速度もカラムサイズにより異なるが、５０〜１０００ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。溶出液中に目的の抗体が含まれている。このＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー溶出液をｐＨ４．０〜８．５、好ましくはｐＨ８．０に調節して次の陰イオンクロマトグラフィー精製を行なう。この際、用いる緩衝液としては例えばリン酸ナトリウム緩衝液あるいはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等がある。
この際、リン酸ナトリウム緩衝液およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の両方を用いて、例えばリン酸ナトリウム緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の順番に添加してもよいし、リン酸ナトリウム緩衝液またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の一方のみを用いてもよい。用いるリン酸ナトリウムおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の濃度は、それぞれ１０〜２００ｍＭおよび０．５〜１．５Ｍが好ましく、１００ｍＭおよび１．０Ｍがさらに好ましい。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー精製を行なうことにより、抗体の純度は９８％になり、精製収率は約７０％である。抗体純度は例えば、ゲル濾過ＨＰＬＣにより測定できる。
さらに、上述の陽イオン交換クロマトグラフィー精製の後に、疎水性クロマトグラフィーにより以下のような方法で精製してもよい。
あらかじめカラムを塩０．８〜１．２Ｍを含有するｐＨ６．０〜８．０の緩衝液で平衡化しておく。平衡化に用いる緩衝液として、例えばｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ７．０の０．８〜１．２Ｍ、好ましくは１．０Ｍの硫酸アンモニウムを含む緩衝液である。例えば１０ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。このカラムに、陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液に０．８〜１．２Ｍとなるように塩を添加しｐＨ６．０〜８．０に調整したものをアプライする。この調整は、例えば１．０Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、さらに必要ならば水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨを６．０〜８．０、好ましくはｐＨ７．０に調整する。このｐＨ調整に用いる硫酸アンモニウムは硫酸アンモニウム濃度が０．８〜１．２Ｍ、好ましくは１．０Ｍになるように添加し、水酸化ナトリウム水溶液の濃度は、１．０〜１０．０Ｍ、好ましくは５．０Ｍである。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体混合物の量にもよるが、例えば長さ２．５〜２０ｃｍのものを用いればよい。抗体混合物をアプライした後に平衡化緩衝液、例えば塩０．８〜１．２Ｍを含有するｐＨ６．０〜８．０の緩衝液でカラムを洗浄し、非吸着画分を洗い流す。この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば５カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。緩衝液を流す線速度もカラムサイズにより異なるが、５０〜２００ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。次いで、１０〜５０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を徐々に低下させる塩濃度勾配溶出を行なう。この際の勾配容量は５〜３０好ましくは、１０カラム容積である。場合によっては、塩濃度を一定あるいは段階的に上げていってもよい。線濃度は５０〜２００ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。
疎水性クロマトグラフィーを行なうことにより、抗体純度は９９％以上になる。
なお、精製しようとする抗体によっては、それぞれのクロマトグラフィーの前に洗浄工程を追加してもよい。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの場合には、抗体を溶出する前に２０ｍＭリン酸ナトリウム１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）又は／および１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の洗浄工程を入れ、カラムに吸着した非特異的吸着物質を除去できる。この際用いる緩衝液の量は限定されず、例えば５カラム容量の緩衝液を用いればよい。また、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーの場合には、抗体を溶出する前に１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０，６．５，７．０）でカラムを洗浄し、不純物を除去できる。この際用いる緩衝液の量は限定されず、例えば５カラム容量の緩衝液を用いればよい。
さらに、抗体を含む培養上清には、抗体を産生する細胞由来のウイルスが含まれている場合がある。従って、本発明の抗体の精製方法にウイルスを不活化する工程および／またはウイルスを除去する工程を含ませてもよい。ウイルスを不活化するには、精製過程で得られる抗体を含む溶液を一定時間酸性条件下におけばよく、例えばクエン酸溶液等の酸性溶液を添加して、一定時間置けばよい。ウイルス不活化の工程は一連の精製工程のどこに含ませてもよいが、プロテインＡカラムから抗体を溶出する際にクエン酸緩衝液を用いるので、該溶出液に濃いクエン酸溶液、例えば１Ｍクエン酸溶液を添加してｐＨ４以下、好ましくはｐＨ３．５以下に調製し１５分以上、好ましくは３０分以上、さらに好ましくは４５分以上放置すればよい。酸性条件下におけるウイルス不活化を行う場合、より容易に酸性条件に調整できるように、その直前の工程で用いる緩衝液の濃度やｐＨも低めに調整しておくのが望ましい。例えば、プロテインＡカラムによる精製工程の後に、ウイルスの不活化を行う場合は、プロテインＡカラムの平衡化が通常２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７を用いて行われるのに対して、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６を用いて行えばよい。また、溶出も通常クエン酸緩衝液ｐＨ３．５を用いて行われるのに対して、クエン酸緩衝液ｐＨ３．４を用いて行えばよい。
本発明の方法において、プロテインＡカラムから溶出した抗体含有溶液は、次いで中和して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけるが、クエン酸溶液を用いてウイルスを不活化した場合には、中和に用いる緩衝液のｐＨを高くするか、あるいは濃度を大きくする必要がある。ウイルス不活化工程を含まない場合、プロテインＡカラムから溶出した抗体含有溶液を１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ７．０に調整し、その後１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ８．０に調整する例が挙げられるが、この際に例えば、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．２を添加し、次いで１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を添加してｐＨ８．０に合わせればよい。
また、ウイルス除去は、ウイルス除去フィルターによりろ過することにより行うことができる。ウイルス除去フィルターとしては、例えば旭化成社製のプラノバ２０Ｎを用いることができる。さらに本発明の方法で得られた精製抗体は、必要に応じて濃縮あるいは無菌ろ過する。濃縮工程は例えば限外ろ過膜を用いて行えばよい。さらに、抗体の安定化のために濃縮工程時に緩衝液を適当な緩衝液に交換してもよい。例えば、１〜５０ｍＭのグルタミン酸緩衝液に交換すればよい。また、この際抗体の安定化を目的として交換緩衝液にソルビトール等を含ませてもよい。また、無菌ろ過工程は、例えば孔径０．４５μｍ以下のメンブレンフィルターを用いて行えばよい。上記ウイルス除去工程、濃縮工程、無菌ろ過工程は本発明の精製過程のどこで行ってもよいが、抗体の精製終了後の精製抗体を用いて、すなわち精製過程の最後に行うのが望ましい。例えば、ウイルス除去工程および無菌ろ過工程を、陽イオンクロマトグラフィーで抗体を溶出した後に行えばよく、また精製工程が疎水性クロマトグラフィーで精製する工程を含む場合は、疎水性クロマトグラフィーで抗体を溶出した後に行えばよい。ウイルス除去工程および無菌ろ過工程の順序は限定されないが、好ましくはウイルス除去フィルターを通してウイルス除去を行った後に、無菌ろ過を行う。
本発明は、ヒト抗体とウシ抗体、ヒツジ抗体またはヤギ抗体等の有蹄動物の抗体との混合物からヒト抗体とウシ抗体、ヒツジ抗体またはヤギ等の有蹄動物の抗体を分離する方法をも包含する。ヒト抗体およびウシ抗体はモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはポリクローナル抗体である。例えば、本発明は、ウシ血清含培地で培養されたヒトモノクローナル抗体、ヒトと非ヒト動物とのキメラ抗体、非ヒト動物抗体をヒト化したヒト化抗体等を産生し得るＣＨＯ細胞、ＮＳＯミエローマ細胞、ハイブリドーマの培養上清からこれらの抗体とウシ血清中のウシ抗体を分離するのに用いることができる。本発明はまた、ヒトモノクローナル抗体、ヒトと非ヒト動物とのキメラ抗体、非ヒト動物抗体をヒト化したヒト化抗体等を産生し得るトランスジェニックウシの体液、例えば血液または乳液、から前記抗体を分離するのに用いられる。本発明は、さらにヒトポリクローナル抗体とウシ由来の抗体を分離するのに用いられ、例えばヒト抗体の遺伝子座が導入されヒト抗体を産生し得るトランスジェニックウシに抗原を投与して免疫した場合に該ウシの体液、例えば血液または乳液中にはヒトポリクローナル抗体とウシポリクローナル抗体が含まれこの混合物からの両抗体の分離に用いられる。
ヒト抗体とウシ抗体、ヒツジ抗体またはヤギ抗体等の有蹄動物の抗体の分離には、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーが用いられる。この際のカラムサイズ、抗体混合物の容積は適宜決定することができる。Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡカラムはｐＨ７．５〜８．５、好ましくはｐＨ８．０の緩衝液で平衡化する。この際に用いる緩衝液として、リン酸二ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム、グリシンおよび塩化ナトリウムを含有する緩衝液が挙げられる。リン酸二ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム、グリシンの濃度は、すべて０．０５〜０．１５Ｍが好ましく、さらには０．１０Ｍが好ましい。また、塩化ナトリウムの濃度は０．０５〜０．２０Ｍが好ましく、さらには０．１５Ｍが好ましい。具体的には、例えば、０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）が例示できる。平衡化したかどうかは、カラムを通過してきた緩衝液のｐＨと導電率が開始緩衝液と同じであることを確認すればよい。平衡化したカラムに、好ましくは平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液でｐＨを調整したヒト抗体とウシ等の抗体混合物をアプライする。この際、抗体混合物の抗体濃度等により、ｐＨ調整のために添加する緩衝液の容積や濃度を適宜決定すればよい。次いで平衡化に用いた緩衝液、例えばｐＨ７．５〜８．５、好ましくはｐＨ８．０の緩衝液でカラムを洗浄する。この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば５カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。その後、カラムに流す０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）を徐々に添加し、ｐＨを徐々に低下させる、グラージェント的な溶出すなわちｐＨグラージェント溶出を行うことによりヒト抗体とウシ抗体を分離することができる。この際の勾配容量は、２０から４０、好ましくは３０カラム容量である。ｐＨグラージェント溶出におけるｐＨの下限は、例えばｐＨ２．０〜３．０であり、好ましくはｐＨ２．５である。線速度はカラムサイズにより異なるが、５０〜１５０ｃｍ／ｈの範囲で選択すればよい。また、この際ｐＨ段階的な溶出を行ってもよい。
以上のクロマトグラフィー操作は、自動機器を用いて自動的に行うことができる。例えば、中高圧液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を適当なプログラム制御の下で用いて行うことができる。
以下、本発明の実施例を説明するが、本実施例の態様は本発明を限定するものではない。
実施例１ ヒトモノクローナル抗体の精製
デプスフィルターおよび０．２μｍのメンブランフィルターで清澄化したヒトモノクローナル抗体（ヒトＩｇＧ１）を含むＣＨＯ細胞無血清培養上清（ヒトモノクローナル抗体発現量：７００ｍｇ／Ｌ）２２０ｍｌを２０ｍＭリン酸ナトリウム−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ８ｍｍ ＩＤ ｘ ２０ｃｍ）に添加した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。培養上清添加後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。次に５カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。溶出液に１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を添加しｐＨ７．０とした。本操作は、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の替りに１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いることでも実施できた。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ溶出液を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）にてｐＨ８．０に調整後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ ７ｍｍ ＩＤ ｘ １５ｃｍ）に添加した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。添加終了後、３カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。カラム非吸着画分をヒトモノクローナル抗体溶出液としてプールした。
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬプール液を１Ｍ酢酸にてｐＨ５．０に調整後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ１０ｍｍ ＩＤ ｘ １０ｃｍ）に添加した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。次に５カラム容量の２０ｍＭ酢酸ナトリウム−０．３Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を通液し、ヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。
本方法によるヒトモノクローナル抗体の精製収率は約７０％であり、ゲルろ過ＨＰＬＣ分析の結果、純度は９８％であった。
また、抗体によってはカラムから抗体を溶出する前に洗浄工程を入れた。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの場合には、ヒトモノクローナル抗体をクエン酸ナトリウム緩衝液で溶出する前に５カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム−１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）又は／および１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）の洗浄工程を入れ、カラムに吸着した非特異的吸着物質を除去した。また、陽イオン交換クロマトグラフィーの場合には、ヒトモノクローナル抗体を２０ｍＭ酢酸ナトリウム−０．３Ｍ塩化ナトリウム緩衝液で溶出する前に５カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄し、不純物を除去した。
さらには、抗体によってはＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー→陰イオン交換クロマトグラフィー→陽イオン交換クロマトグラフィーの精製シークエンスの後に疎水性クロマトグラフィーの工程を入れる場合もある。
そのクロマトグラフィー条件の実施例を以下に示す。
上記で得られた、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦプール液に１Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加後、１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．０に調整した。その溶液を１Ｍ硫酸アンモニウム−１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した疎水性カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ １０ｍｍ ＩＤ ｘ １０ｃｍ）に添加した（線速度１６０ｃｍ／ｈ）。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度１６０ｃｍ／ｈ）。次に、１Ｍ硫酸アンモニウム−１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより（勾配容量：硫酸アンモニウム濃度１Ｍ→０Ｍとするのに１０カラム容量使用）によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度１６０ｃｍ／ｈ）。
疎水性クロマトグラフィー工程を加えることにより、ヒトモノクローナル抗体の純度が９９％以上に向上した（ゲルろ過ＨＰＬＣ分析）。
実施例２ ヒトポリクローナル抗体とウシポリクローナル抗体の分離精製
ヒトポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ４５０６、商品名：Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）およびウシポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ５５０６、商品名：Ｂｏｖｉｎｅ ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）各３ｍｇを０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）３ｍｌに溶解後、０．２μｍのフィルターに通したものをそれぞれヒトポリクローナル抗体溶液、ウシポリクローナル抗体溶液とした。
０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した３つのＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＰＯＲＯＳ Ａ／２０ ４．６ｍｍＩＤ ｘ ５ｃｍ）に次の３サンプルを別個に添加した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。１）ヒトポリクローナル抗体溶液１ｍｌ、２）ウシポリクローナル抗体溶液１ｍｌ、３）ヒトポリクローナル抗体、ウシポリクローナル抗体等量混合溶液２ｍｌを別個に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。次に０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液に０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）を徐々に添加し、ｐＨを徐々に低下させる、ｐＨグラージェント溶出（勾配容量：３０カラム容量の使用でｐＨ８．０→２．５とした）によりヒトポリクローナル抗体およびウシポリクローナル抗体を溶出した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。各クロマトグラフィーの溶出曲線を図１、２、３に示す。
図１、２に示すように、ｐＨグラージェント溶出ではウシポリクローナル抗体の方がヒトポリクローナル抗体より早く溶出し、図３に示すように両者混合物のクロマトにおいて、ヒトポリクローナル抗体とウシポリクローナル抗体は分離された。
実施例３ ヒトモノクローナル抗体の精製その２
デプスフィルターおよび０．２μｍのメンブランフィルターで清澄化したヒトモノクローナル抗体（ヒトＩｇＧ１）を含むＣＨＯ細胞無血清培養上清（ヒトモノクローナル抗体発現量：７００ｍｇ／Ｌ）１５００ｍｌを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ２０ｍｍ ＩＤ ｘ ２０ｃｍ）に添加した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。培養上清添加後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。次に５カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．４）によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。ウイルス不活化の目的で、溶出液に１Ｍクエン酸を添加し、ｐＨ３．５に調整した。室温にて４５分間保持後、この溶液に等量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）を添加し中和した。
ウイルス不活化後溶液を１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにてｐＨ８．０に調整後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ １０ｍｍ ＩＤ ｘ １５ｃｍ）に添加した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。添加終了後、３カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。カラム非吸着画分をヒトモノクローナル抗体溶出液としてプールした。
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬプール液を１Ｍクエン酸にてｐＨ５．０に調整後、２０ｍＭリン酸ナトリウム−１０ｍＭクエン酸−０．０５Ｍ塩化ナトリウ緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ２６ｍｍ ＩＤ ｘ １５ｃｍ）に添加した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。次に５カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム−１０ｍＭクエン酸−０．３Ｍ塩化ナトリウ緩衝液（ｐＨ５．０）を通液し、ヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。
ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦプール液を１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム−２６２ｍＭ Ｄ−ソルビトール（ｐＨ５．５）にて平衡化した限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ｂｉｏｍａｘ ３０ ５０ｃｍ２）で１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、１０倍量以上の同緩衝液にてバッファー交換した。バッファー交換後、ヒトモノクローナル抗体溶液を２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、抗体溶液を回収した。
濃縮・バッファー交換抗体回収液を０．２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製デュラポア親水性マルチメディアフィルター）にて無菌ろ過し、最終精製品とした。
本方法によるヒトモノクローナル抗体の精製収率は約７０％であり、ゲルろ過ＨＰＬＣ分析の結果、純度は９８％であった。
必要に応じて、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦプール液をウイルス除去フィルター（旭化成社製プラノバ２０Ｎ）にてろ過した。ろ過液を限外ろ過膜に供して、濃縮・バッファー交換した。
また、抗体によってはカラムから抗体を溶出する前に洗浄工程を入れた。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの場合には、ヒトモノクローナル抗体をクエン酸ナトリウム緩衝液で溶出する前に５カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム−１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）又は／および１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）の洗浄工程を入れ、カラムに吸着した非特異的吸着物質を除去した。また、陽イオン交換クロマトグラフィーの場合には、ヒトモノクローナル抗体を２０ｍＭりん酸ナトリウム−１０ｍＭクエン酸−０．３Ｍ塩化ナトリウ緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出する前に５カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０，６．５または７．０）でカラムを洗浄し、不純物を除去した。
実施例４ ヒトポリクローナル抗体とヤギポリクローナル抗体の分離精製
ヒトポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ４５０６、商品名：Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）およびヤギポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ５２５６、商品名：Ｇｏａｔ ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）各３ｍｇを０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）３ｍｌに溶解後、０．２μｍのフィルターに通したものをそれぞれヒトポリクローナル抗体溶液、ヤギポリクローナル抗体溶液とした。
０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した３つのＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＰＯＲＯＳ Ａ／２０ ４．６ｍｍＩＤ ｘ ５ｃｍ）に次の３サンプルを別個に添加した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。１）ヒトポリクローナル抗体溶液１ｍｌ、２）ヤギポリクローナル抗体溶液１ｍｌ、３）ヒトポリクローナル抗体、ヤギポリクローナル抗体等量混合溶液２ｍｌを別個に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。次に０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液に０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）を徐々に添加し、ｐＨを徐々に低下させる、ｐＨグラージェント溶出（勾配容量：３０カラム容量の使用でｐＨ８．０→２．５とした）によりヒトポリクローナル抗体およびヤギポリクローナル抗体を溶出した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。各クロマトグラフィーの溶出曲線を図４、５に示す。
図４、５に示すように、ｐＨグラージェント溶出ではヤギポリクローナル抗体の方がヒトポリクローナル抗体より早く溶出し、図５に示すように両者混合物のクロマトにおいて、ヒトポリクローナル抗体とヤギポリクローナル抗体は分離された。
実施例５ ヒトポリクローナル抗体とヒツジポリクローナル抗体の分離精製
ヒトポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ４５０６、商品名：Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）およびヒツジポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ５１３１、商品名：Ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）各３ｍｇを０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）３ｍｌに溶解後、０．２μｍのフィルターに通したものをそれぞれヒトポリクローナル抗体溶液、ヒツジポリクローナル抗体溶液とした。
０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した３つのＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＰＯＲＯＳ Ａ／２０ ４．６ｍｍＩＤ ｘ ５ｃｍ）に次の３サンプルを別個に添加した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。１）ヒトポリクローナル抗体溶液１ｍｌ、２）ヒツジポリクローナル抗体溶液１ｍｌ、３）ヒトポリクローナル抗体、ヒツジポリクローナル抗体等量混合溶液２ｍｌを別個に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。次に０．１０Ｍリン酸二ナトリウム−０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液に０．１０Ｍ酢酸ナトリウム−０．１０Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）を徐々に添加し、ｐＨを徐々に低下させる、ｐＨグラージェント溶出（勾配容量：３０カラム容量の使用でｐＨ８．０→２．５とした）によりヒトポリクローナル抗体およびヒツジポリクローナル抗体を溶出した（線速度９０ｃｍ／ｈ）。各クロマトグラフィーの溶出曲線を図６、７に示す。
図６、７に示すように、ｐＨグラージェント溶出ではヒツジポリクローナル抗体の方がヒトポリクローナル抗体より早く溶出し、図７に示すように両者混合物のクロマトにおいて、ヒトポリクローナル抗体とヒツジポリクローナル抗体は分離された。
（１）本発明の「陰イオン交換クロマトグラフィー→陽イオン交換クロマトグラフィー」という精製シークエンスにより、従来の「陽イオン交換クロマトグラフィー→陰イオン交換クロマトグラフィー」の一連の精製シークエンスにおいて必須である希釈工程が大幅に簡略化され、▲１▼希釈溶液が必要となる、▲２▼希釈による容量増加の結果装置が大型化する、▲３▼作業が長時間化する、などの問題が解決された。（２）本発明により、これまで未解決であった偶蹄目の動物の抗体およびヒト抗体を含有するの混合物から該ヒト抗体を単離する方法が解決された。
また、実施例３に示すように、精製工程にウイルス不活化工程や、ウイルス除去工程を含ませることにより、医薬として安全に使用し得る精製抗体を得ることができる。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
また、実施例３に示すように、精製工程にウイルス不活化工程や、ウイルス除去工程を含ませることにより、医薬として安全に使用し得る精製抗体を得ることができる。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
Claims (98)
- 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および
（２）（１）に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程 - 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製する工程、および
（２）（１）に次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および
（３）（２）に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程 - 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製する工程、および
（２）（１）に次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および
（３）（２）に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および
（４）（３）に次いで、疎水性クロマトグラフィーで精製する工程 - 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）リン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、平衡化に用いた（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、クエン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液をリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ４．０〜８．５に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、平衡化に用いた（６）の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液を酢酸またはクエン酸でｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、酢酸ナトリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム：クエン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、平衡化に用いた（９）の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム：クエン酸緩衝液ならびに塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程 - さらに、
（１２） 請求項４記載の工程（１１）に次いで、請求項４記載の工程（１１）の溶出液に硫酸アンモニウムを添加し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整する工程、および
（１３） （１２）に次いで、硫酸アンモニウムおよびリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および
（１４） （１３）に次いで、平衡化に用いた（１３）の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１４）に次いで、（１３）の緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。 - さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルスを不活化する工程が、プロテインＡクロマトグラフィーで精製する工程の後に行われる、請求項６記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルスの不活化が、請求項４の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、請求項７記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルス除去フィルターを用いてのろ過によるウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法の最終工程で行われる、請求項６から８のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項４記載の工程（４）のリン酸ナトリウム緩衝液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた請求項４〜９のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項４記載の工程（４）および（５）を、下記の工程に代えた、請求項４〜９のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（３）に次いで、溶出液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程 - 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１） １０〜１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび０〜４．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、平衡化に用いた（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、１０〜１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液を１０〜２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ４．０〜８．５に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液を０．５〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、１０〜２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、平衡化に用いた（６）の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液を０．５〜１．５Ｍ酢酸またはクエン酸でｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、１０〜５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液または１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム：１０〜５０ｍＭクエン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、平衡化に用いた（９）の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、１０〜５０ｍＭ酢酸ナトリウムまたは１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム：１０〜５０ｍＭクエン酸緩衝液ならびに０．１〜１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程 - さらに、
（１２） 請求項１２に記載の工程（１１）に次いで、請求項１２に記載の工程
（１１）の溶出液に０．８〜１．２Ｍ硫酸アンモニウム濃度になるように硫酸アンモニウムを添加し、１．０〜１０．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整する工程、および
（１３） （１２）に次いで、０．８〜１．２Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０ｍＭ〜１００ｍＭリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および
（１４） （１３）に次いで、平衡化に用いた（１３）の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１４）に次いで、（１３）の緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。 - さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、請求項１２または１３に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルスの不活化が、請求項１２の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、請求項１４記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、請求項１２の工程（１１）に次いで行われる、請求項１４または１５に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルス除去フィルターを用いてのろ過によるウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、請求項１３の工程（１５）に次いで行われる、請求項１４または１５に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項１２に記載の工程（４）のリン酸ナトリウム緩衝液を０．５〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項１２記載の工程（４）および（５）を、下記の工程に代えた、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（３）に次いで、溶出液を０．５〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程 - 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）１０〜２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、平衡化に用いた（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、１０〜２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液を１０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ４．０〜８．５に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液を１．０〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、平衡化に用いた（６）の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液を１Ｍ酢酸またはクエン酸でｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液または２０ｍＭリン酸ナトリウム：１０ｍＭクエン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、平衡化に用いた（９）の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウムまたは２０ｍＭリン酸ナトリウム：１０ｍＭクエン酸緩衝液ならびに０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程 - さらに、
（１２） 請求項２０に記載の工程（１１）に次いで、請求項２０に記載の工程（１１）の溶出液に１．０Ｍ硫酸アンモニウム濃度になるように硫酸アンモニウムを添加し、１０．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整する工程、および
（１３） （１２）に次いで、１．０Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および
（１４） （１３）に次いで、平衡化に用いた（１３）の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１４）に次いで、（１３）の緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。 - さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、請求項２０または２１に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルスの不活化が、請求項２０の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、請求項２２記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、請求項２０の工程（１１）に次いで行われる、請求項２２または２３に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、請求項２１の工程（１５）に次いで行われる、請求項２２または２３に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項２０に記載の工程（４）のリン酸ナトリウム緩衝液を１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項２０に記載の工程（４）および（５）を、下記の工程に代えた、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（３）に次いで、溶出液を１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ６．０〜８．５に調整する工程 - 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１）１０〜２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、平衡化に用いた（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、１０〜２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液を１０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ７．０に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液を１．０〜１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ８．０に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、平衡化に用いた（６）の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液を１．０Ｍ酢酸またはクエン酸でｐＨ５．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液または２０ｍＭリン酸ナトリウム：１０ｍＭクエン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、平衡化に用いた（９）の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、２０ｍＭ酢酸ナトリウムまたは２０ｍＭリン酸ナトリウム：１０ｍＭクエン酸緩衝液ならびに０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程 - さらに、
（１２） 請求項２８に記載の工程（１１）に次いで、請求項２８に記載の工程（１１）の溶出液に１．０Ｍ硫酸アンモニウム濃度になるように硫酸アンモニウムを添加し、１０．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整する工程、および
（１３） （１２）に次いで、１．０Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および
（１４） （１３）に次いで、平衡化に用いた（１３）の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１４）に次いで、（１３）の緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。 - さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、請求項２８または２９に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルスの不活化が、請求項２８の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、請求項３０記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、請求項２８の工程（１１）に次いで行われる、請求項３０または３１に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、請求項２９の工程（１５）に次いで行われる、請求項３０または３１に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項２８に記載の工程（４）のリン酸ナトリウム緩衝液を１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項２８記載の工程（４）および（５）を、下記の工程に代えた、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（３）に次いで、溶出液を１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ８．０に調整する工程 - 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１） ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、
（２） （１）に次いで、ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、ｐＨ２．７〜４．０の緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および
（４） （３）に次いで、溶出液をｐＨ４．０〜８．５に調整する工程、および
（５） （４）に次いで、（４）の溶出液をｐＨ６．０〜８．５に調整する工程、および
（６） （５）に次いで、ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（５）の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（７） （６）に次いで、ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（８） （７）に次いで、（７）の溶出液をｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（９） （８）に次いで、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（８）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（１０） （９）に次いで、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（１１） （１０）に次いで、０．１〜１．０Ｍの塩を含有するｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程 - さらに、
（１２） 請求項３６に記載の工程（１１）の溶出液に０．８〜１．２Ｍの濃度となるように塩を添加し、さらにｐＨ６．０〜８．０に調整する工程、
（１３） （１２）の塩を０．８〜１．２Ｍの濃度で含有するｐＨ６．０〜８．０の緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（１２）の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、
（１４） （１２）の塩を０．８〜１．２Ｍの濃度で含有する、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および
（１５） （１３）の該緩衝液中の塩濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、
を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。 - さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、請求項３６または３７に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルスの不活化が、請求項３６の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、請求項３８記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、請求項３６の工程（１１）に次いで行われる、請求項３８または３９に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、請求項３７の工程（１５）に次いで行われる、請求項３８または３９に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項３６に記載の工程（２）のｐＨ６．０〜８．５の緩衝液が工程（１）の緩衝液と同一であり、請求項３６に記載の工程（７）のｐＨ６．０〜８．５の緩衝液が工程（６）の緩衝液と同一であり、かつ請求項３６に記載の工程（１０）のｐＨ４．０〜７．０の緩衝液が工程（９）の緩衝液と同一である、請求項３６記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項３７に記載の工程（１４）の（１２）の塩を０．８〜１．２Ｍの濃度で含有する、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液が工程（１３）の緩衝液と同一である、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項３６に記載の工程（１１）の塩が塩化ナトリウムである請求項３６〜４３のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項３７に記載の工程（１２）の塩が硫酸アンモニウムである請求項３６〜４５のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項３６記載の工程（１）の緩衝液が、４．０Ｍ以下の塩を含有する請求項３６〜４５のいずれか１項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 塩が塩化ナトリウムである請求項４６記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
- 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。
（１） ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、ｐＨ６．０〜８．５の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および
（３） （２）に次いで、（２）の溶出液をｐＨ４．０〜７．０に調整する工程、および
（４） （３）に次いで、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（３）の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および
（５） （４）に次いで、ｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および
（６） （５）に次いで、０．１〜１．０Ｍの塩を含有するｐＨ４．０〜７．０の緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程 - さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、請求項４８記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルスの不活化が、請求項４８の工程（１）の前に、抗体含有溶液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、請求項４９記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
- ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、請求項４８の工程（６）に次いで行われる、請求項４９または５０に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項４８に記載の工程（２）のｐＨ６．０〜８．５の緩衝液が工程（１）の緩衝液と同一であり、かつ請求項４８に記載の工程（５）のｐＨ４．０〜７．０の緩衝液が工程（４）の緩衝液と同一である請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
- 請求項４８に記載の工程（６）の塩が塩化ナトリウムである請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
- 抗体がヒト抗体である請求項１〜５３のいずれか１項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項１〜５４のいずれか１項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
- 抗体がＩｇＧである請求項１〜５５のいずれか１項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
- 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である請求項５６記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
- 抗体が、抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列において、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が欠失し、または天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換し、または天然に存在する重鎖定常領域に少なくとも一つのアミノ酸が付加した抗体である、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
- 抗体が他の化合物と共有あるいは配位結合した請求項５４〜５８のいずれか１項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。
- ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより該ヒト抗体と該有蹄動物の抗体を分離する方法。
- 有蹄動物が、ウシ、ヤギおよびヒツジからなる群から選択される請求項６０記載の該ヒト抗体と該有蹄動物の抗体を分離する方法。
- 分離が、ｐＨグラージェント溶出である請求項６０または６１記載の方法。
- 分離が、ｐＨ段階溶出である請求項６０または６１記載の方法。
- 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
（１） リン酸二ナトリウム、酢酸ナトリウム、グリシンおよび塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、
および
（２） （１）についで、（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）についで、（１）の緩衝液中のｐＨを低下させることにより該プロテインＡカラムから該ヒト抗体を溶出する工程 - 有蹄動物がウシ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される請求項６４記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、請求項６４または６５に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ウイルスの不活化が、請求項６４の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、請求項６６記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、請求項６６または６７記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ｐＨの低下が、グラージェント的である請求項６４〜６８のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ｐＨの低下が、段階的である請求項６４〜６８のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
（１） ０．０５〜０．１５Ｍリン酸二ナトリウム、０．０５〜０．１５Ｍ酢酸ナトリウム、０．０５〜０．１５Ｍグリシンおよび０．０５〜０．２０Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）についで、（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）についで、（１）の緩衝液中のｐＨを低下させることにより該プロテインＡカラムから該ヒト抗体を溶出する工程 - 有蹄動物がウシ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される請求項７１記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、請求項７１または７２に記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ウイルスの不活化が、請求項７１の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、請求項７３記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、請求項７３または７４に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ｐＨの低下が、グラージェント的である請求項７１〜７５のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。。
- ｐＨの低下が、段階的である請求項７１〜７５のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。。
- 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
（１） ０．１０Ｍリン酸二ナトリウム、０．１０Ｍ酢酸ナトリウム、０．１０Ｍグリシンおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、および
（２） （１）に次いで、（１）の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、および
（３） （２）に次いで、（１）の緩衝液中のｐＨを低下させることにより該プロテインＡカラムから該ヒト抗体を溶出する工程 - 有蹄動物がウシ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される請求項７８記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、請求項７８または７９に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ウイルスの不活化が、請求項７８の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、請求項８０記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、請求項８０または８１に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ｐＨの低下が、グラージェント的である請求項７８〜８２のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ｐＨの低下が、段階的である請求項７８〜８２のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
（１） ｐＨ７．５〜８．５の緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテインＡカラムに接触させる工程、
（２） ｐＨ７．５〜８．５の緩衝液で該プロテインＡカラムを洗浄する工程、
（３） （２）の緩衝液のｐＨを低下させることにより該プロテインＡカラムから該ヒト抗体を溶出する工程 - 有蹄動物がウシ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される請求項８５記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウイルスを不活化する工程、ウイルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウイルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の１工程、２工程または３工程を含む、請求項８５または８６に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ウイルスの不活化が、請求項８５の工程（３）に次いで、工程（３）で得られた溶出液をｐＨ４以下に調整し、３０分間以上放置することにより行われる、請求項８７記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ウイルス除去フィルターを用いたろ過によりウイルスを除去する工程および／または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、請求項８７または８８に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ｐＨの低下が、グラージェント的である請求項８５〜８９のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ｐＨの低下が、段階的である請求項８５〜８９のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- 請求項８５記載の工程（２）のｐＨ７．５〜８．５の緩衝液が、工程（１）の緩衝液と同一である、請求項８５〜９１のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- 請求項８５記載の工程（１）のｐＨ７．５〜８．５の緩衝液が、０．０５〜０．２０Ｍの濃度で塩を含有する、請求項８５〜９２のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- 塩が塩化ナトリウムである、請求項９３記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ヒト抗体がヒトポリクローナル抗体である請求項６０〜９４のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- 有蹄動物の抗体がウシポリクローナル抗体、ヤギポリクローナル抗体およびヒツジポリクローナル抗体からなる群から選択される請求項６０〜９５のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ヒト抗体がＩｇＧである請求項６０〜９６のいずれか１項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
- ヒト抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である、請求項９７記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。
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