JP2014529330A - 単一ユニットクロマトグラフィー抗体精製 - Google Patents

Abstract

本発明は、中間精製およびポリッシングの工程を少なくとも含む、バイオリアクターにおいて生成されるタンパク質混合物からの抗体の精製方法であって、当該中間およびポリッシング工程は、フロースルー様式での、インラインのアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）処理および混合様式クロマトグラフィー（ＭｉＭｏ）処理を含む、方法に関する。本発明はさらに、アニオン交換クロマトグラフィー部分および混合様式クロマトグラフィー部分の両方を連続的に連結して含む単一操作ユニットであって、当該ユニットは、アニオン交換クロマトグラフィー部分の上流端において入口を含みかつ混合様式クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含み、当該ユニットはまた、アニオン交換クロマトグラフィー部分と混合様式クロマトグラフィー部分との間にも入口を含む、単一操作ユニットに関する。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、抗体の単一ユニット精製のための方法およびこの方法において使用され得る装置に関する。

薬学的用途における使用のための、細胞培養によって産生されるモノクローナル抗体の精製は、多数の工程を要するプロセスである。こうした抗体は、基本的に、あらゆる潜在的に有害な汚染物質（例えば、抗体を産生する細胞に由来するタンパク質およびＤＮＡ）、培地成分（例えば、インスリン、ＰＥＧエーテルおよび消泡剤）ならびに存在する可能性のあるあらゆる感染因子（例えば、ウイルスおよびプリオン）から分離されるべきものである。

抗体をこれらのタンパク質を産生する細胞の培養物から精製するための典型的なプロセスは、ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｕｎｅ １，２００５，“Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｆｒｏｍ Ｈｉｇｈ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｉｔｙ”に記載されている。

抗体は細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞または形質転換宿主細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、マウス骨髄腫由来ＮＳ０細胞、ベビーハムスター腎臓細胞およびヒト網膜由来ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞など））により産生されるので、粒状細胞物質が、精製プロセスの好ましくは初期に、細胞ブロスから除去されなければならないであろう。プロセスのこの部分は、本明細書において、「清澄化」として示される。その後にまたは清澄化工程の一部として、抗体は、およそ少なくとも約８０％まで、通常は結合と溶出のクロマトグラフィー工程（ＩｇＧの場合はしばしば固定化プロテインＡを使用）を用いて、精製される。本明細書において「捕捉」として示されるこの工程は、抗体の最初のかなりの精製をもたらすだけでなく、体積のかなりの減少、したがって生成物の濃縮ももたらし得る。代替的な捕捉方法は、例えば、膨張床吸着（Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｂｅｄ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ：ＥＢＡ）、二液相分離（２−ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）（例えばポリエチレングリコールを使用）またはリオトロピック塩（例えば、硫酸アンモニウム）による分画沈殿である。

清澄化および捕捉に続いて、抗体は、さらに精製される。一般的に、少なくとも２つのクロマトグラフィー工程が、残留不純物を十分に除去するために、捕捉後に必要とされる。捕捉に続くクロマトグラフィー工程は、しばしば中間精製工程と呼ばれ、最後のクロマトグラフィー工程は、一般にポリッシング工程と呼ばれる。一般的に、これらの工程は、各々、バッチ方式で単一ユニット操作として行われ、一般的に、これらの工程のうちの少なくとも１つは、結合と溶出の様式で実施される。さらに、それぞれのクロマトグラフィー工程は、例えばｐＨ、導電率などに関して、特異的な負荷条件を必要とする。したがって、負荷物（ｌｏａｄ）を要求条件に合うように調整するために、追加の処理が、それぞれのクロマトグラフィー工程に先立って行われなければならない。この上述の全てにより、プロセスが複雑かつ時間のかかるものとなっている。これらの工程の間に一般に実質的に除去される不純物は、プロセス由来の汚染物質（例えば、宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、培地成分（存在する場合）、プロテインＡ（存在する場合）、菌体内毒素（存在する場合）、および微生物（存在する場合））である。抗体のそのような精製のための種々の方法が、最近の特許文献に記載されている。

国際公開第２０１０／０６２２４４号パンフレットは、モノクローナル抗体などのタンパク質の単離および精製のための水性二相抽出強化沈殿法（ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）に関するものである。その後の抗体のさらなる精製については、２つの選択肢、すなわち（１）結合および溶出の様式でのカチオン交換クロマトグラフィーと、それに続くフロースルー様式でのアニオン交換、または（２）最初のフロースルー様式でのマルチモード（または混合様式）クロマトグラフィーと、それに続くフロースルー様式でのアニオン交換が記載されている。選択肢（２）の２つのクロマトグラフィーユニットは１つの単一ユニット操作として動作せず、いずれもポリッシング目的では用いられない。

国際公開第２００５／０４４８５６号パンフレットは、ヒドロキシアパタイト樹脂を任意選択でアニオン交換クロマトグラフィーと組み合わせて用いる、抗体調製物からの高分子量凝集体の除去に関するものである。両方のクロマトグラフィー処理とも、とりわけフロースループロセスとして記載されたが、しかしそれらは、別個の操作として実施されると記載された。

国際公開第２０１１／０１７５１４号パンフレットは、連続するインラインのカチオン交換クロマトグラフィー工程およびアニオン交換クロマトグラフィー工程による抗体および他のＦｃ含有タンパク質の精製に関するものである。両方のクロマトグラフィー処理とも、一般的には結合および溶出の分離として実施されたが、第２の工程は、フロースループロセスとして操作され得る。

国際公開第２００５／０８２４８３号パンフレットは、２つの連続する混合様式クロマトグラフィー工程による抗体の精製に関するものであり、この精製において、第１の工程のクロマトグラフィー材料は、カチオン交換基および芳香族基の両方を有する混合様式カチオン交換樹脂であり、これらの結合基（ｂｉｎｄ）により抗体が結合され得、第２の工程のクロマトグラフィー材料は、混合様式アニオン交換樹脂である。第２のクロマトグラフィー工程は、フロースルー様式で行われ得る。この２つのクロマトグラフィー工程は、別個の操作として記載されている。

上記の方法の欠点は、長い操作時間、高い変動費および高い固定費（人件費による）である。

アニオン交換クロマトグラフィー部分およびカチオン交換クロマトグラフィー部分の両方を含む単一操作ユニットを示す。

本発明の一実施形態によれば、細胞培養産生抗体からの残留不純物の非常に効率的な除去が、共にフロースルー様式である連続的なインラインのアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）および混合様式（ＭｉＭｏ）クロマトグラフィーを使用することによって達成され得る。ＭｉＭｏクロマトグラフィー工程前のＡＥＸ工程からのフロースルー物の（例えば、好適な緩衝液の混合による）インラインコンディショニングが、ｐＨおよび導電率に関してＭｉＭｏクロマトグラフィーに適した条件にフロースルー物を調整するために使用される。

この新規方法の利点は、操作時間および人件費の大きな削減、したがってより低い操作費用である。また、十分な結合容量を不純物に対してのみ必要とし生成物に対しては必要としないフロースルー様式で全てのユニットを操作するので、より小さい（したがってより費用がかさまない）クロマトグラフィーユニットが必要とされる。

したがって、本発明は、中間精製およびポリッシングの工程を少なくとも含む、バイオリアクターにおいて生成された細胞ブロスからの抗体の精製方法であって、その新規精製工程が、合わせた連続的なインラインのＡＥＸおよびＭｉＭｏクロマトグラフィーを含む、方法として規定され得る。これは、分離混合物をフロースルー画分として生成するＡＥＸクロマトグラフィー工程と、連続的インラインで、それに続く、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成するＭｉＭｏクロマトグラフィー工程とを適用することにより実施され得、その精製抗体調製物は、少なくとも１つのさらなる精製工程に供される。

したがって、本発明の文脈において、「分離混合物」は、本発明に従う第１のクロマトグラフィー工程の結果として生じる溶液であり、「精製抗体調製物」は、本発明に従う第２のクロマトグラフィー工程の結果として生じる溶液である。本出願の全体にわたってこの用語法に従うことが意図される。

概してバイオリアクターにおいて生成された細胞ブロスは、第１のクロマトグラフィー工程に先立って、清澄化される（すなわち、あらゆる細胞物質（例えば、全細胞および細胞破片）から分離される）であろう。

また、第１のクロマトグラフィー工程に先立って、ｐＨおよび導電率についてこの第１の工程に最適な条件を確保するために、コンディショニング溶液が、細胞ブロスまたは抗体含有溶液に添加され得る。

特定の実施形態において、本発明に従う方法は、ＡＥＸおよびＭｉＭｏによる合わせたクロマトグラフィーを、単一ユニット操作として行うことを含む。

本発明の場合の文脈において、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および複数形「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」により、抗原を特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質が意味される。抗体（または免疫グロブリン）はその天然形態において、抗原刺激（例えば、細菌、ウイルス、寄生生物、または移植臓器）に応答して血液またはリンパ中に分泌され、抗原をそれに特異的に結合することによって中和する、Ｂ細胞の表面にあるＹ字形のタンパク質である。本明細書において使用される場合の用語抗体はまた、天然または人工抗体の抗原結合部分をも含む。用語抗体はまた、天然抗体と同様の相互作用機構に基づき抗原と特異的に結合する能力を有する非天然の（したがって人工の）タンパク質をも含み、したがって、例えばある種（例えばマウス）に由来する抗原結合部分と別の種（例えばヒト）に由来する非抗原結合部分とからなる、キメラ抗体をも含む。

「混合様式クロマトグラフィー（ＭｉＭｏ）」により、タンパク質の吸着および／または脱着のために２種以上の相互作用が生じる材料を利用する種類のクロマトグラフィーが意味される。これらの相互作用は、以下の種類、すなわち、アニオン、カチオン、疎水性、アフィニティ、π−π、好硫黄性、サイズ排除のものであり得る。混合様式材料の周知の例は、ヒドロキシアパタイト（金属アフィニティ、アニオン相互作用およびカチオン相互作用）、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ（アニオン相互作用および疎水性相互作用）およびＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）（カチオン相互作用および疎水性相互作用）である。

「連続的なインラインのＡＥＸおよびＭｉＭｏ」により、ＡＥＸおよびＭｉＭｏが、ＡＥＸデバイスの流出物が中間的な保存なしにＭｉＭｏデバイス中に供給されるように連続的に連結されていることが意味される。

本明細書において、「フロースルー画分」により、実質的に溶出流体と同じ速度でクロマトグラフィーカラムから出て行く、負荷された抗体含有画分の少なくとも一部が意味される。この画分は、溶出の間、カラムには実質的に保持されない。したがって、条件は、抗体ではなく不純物がそれぞれのクロマトグラフィー材料に結合されるように選択される。

大規模生産目的のために、本発明に従う（フロースルー様式を用いた）方法は、結合および溶出を用いた先行開示された方法よりもはるかに速い、所望の抗体の分離を提供することが見出された。

本発明によれば、抗体を含有する分離混合物は、インラインでコンディショニングされる。この目的のために、分離混合物に、本発明に従う第２のクロマトグラフィー工程における最適な性能が得られるようにその組成および／または特性（例えば、ｐＨおよび／もしくは導電率ならびに／または特定のイオン成分の存在および量）を変更するために適量の好適なコンディショニング溶液が補充される。

上で引用した先行技術文献のいずれにおいても、２つのクロマトグラフィー工程の間におけるインラインコンディショニングは適用も示唆もされなかったのであるが、驚くべきことに、非常に良好な分離結果が、本発明に従う第２のクロマトグラフィー工程に入る前の流体（分離混合物）のインラインコンディショニングを用いて達成され得ることが見出された。

したがって、本発明は、中間精製およびポリッシングの工程を少なくとも含む、バイオリアクターにおいて生成されるタンパク質混合物からの抗体の精製方法であって、当該中間精製およびポリッシング工程は、連続的なインラインの、分離混合物をフロースルー画分として生成するアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）と、それに続く、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成する混合様式クロマトグラフィー（ＭｉＭｏ）とを含み、当該精製抗体調製物は、少なくとも１つのさらなる精製工程に供され、ここで、混合様式クロマトグラフィー前の分離混合物には、混合様式クロマトグラフィー工程における抗体からの不純物の除去のためにｐＨおよび／もしくは導電率ならびに／または特定のイオン成分の濃度もしくは種類を調整するために、適量の好適な調整溶液が補充される、方法に関する。

本明細書において、用語「コンディショニング溶液」および「調整溶液」は相互交換可能に使用され、本発明に従う第２の（ＭｉＭｏ）クロマトグラフィー工程に分離混合物を供給するのに先立って分離混合物に添加される溶液を意味する。

本明細書において、「適量の好適な調整溶液」により、分離混合物と混合された場合にＭｉＭｏ材料への関連不純物の大部分の吸着をもたらすが生成物の実質的な結合を促進しない、任意選択で１種または複数種の塩または任意の他の添加剤を含有する任意の酸性、中性またはアルカリ性溶液が意味される。それぞれの精製プロセスについて、調整溶液中の最適なｐＨ、塩系の好ましい種類および最適な量が確立されなければならない。

好ましくは、上述の溶液のｐＨは、抗体を含有する分離混合物のものと同じであり、最適な導電率値は、適量の１種または複数種の塩の添加または分離混合物中に存在する塩の希釈の結果であろう。塩のアニオンは、好ましくは、リン酸イオン、硫酸イオン、酢酸イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ化物イオンおよびチオシアン酸イオンからなる群から選択され得る。塩のカチオンは、好ましくは、アンモニウムイオン、ルビジウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、リチウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンおよびバリウムイオンからなる群から選択され得る。好ましい塩は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウムおよび塩化ナトリウムである。使用され得る他の添加剤は、ＭｉＭｏクロマトグラフィー工程を最適化されるのに役立つ、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、または当該技術分野において知られている任意の他の化合物である。

酸性調整溶液のための酸性成分は、クエン酸（またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）、リン酸（またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）、酢酸、塩酸、硫酸などの化合物から選択され得る。

アルカリ性調整溶液のためのアルカリ性成分は、水酸化ナトリウムまたはカリウム、（またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどの化合物から選択され得るが、当該技術分野において知られている任意の他のアルカリ性成分がこの目的のために使用され得る。

好ましくは、必要とされる調整溶液は、生成物の最小限の希釈をもたらすように、少量で補充されるものである。

好ましくは、この場合の分離混合物への適量の適切な調整溶液の補充は、単一ユニット操作の一部であり、例えば、ＭｉＭｏクロマトグラフィー工程前のプロセス流れへの（例えば、混合チャンバーへの）上述の調整溶液のインライン混合による。

本発明に従うＡＥＸクロマトグラフィーは、樹脂を含有する典型的な充填床カラム、モノリス材料を含有するカラム、適切なクロマトグラフィー媒体を含有するラジアルカラム、吸着膜ユニット、または、アニオン交換体として機能するのに適切な媒体およびリガンドを用いる当該技術分野において知られている任意の他のアニオン交換クロマトグラフィーデバイスによって具現化され得るＡＥＸユニットにおいて行われ得る。ＡＥＸカラムにおいて、クロマトグラフィー材料は、強カチオン性または弱カチオン性リガンドが結合した粒状保持体として存在し得る。膜型アニオン交換体は、強カチオン性または弱カチオン性リガンドが結合した１枚または複数枚のシートの形態の保持体からなる。保持体は、有機材料もしくは無機材料または有機および無機材料の混合物からなり得る。好適な有機材料は、アガロースベースの媒体およびメタクリレートである。好適な無機材料は、シリカ、セラミックおよび金属である。膜形のアニオン交換体は、親水性ポリエーテルスルホン含有ＡＥＸリガンドからなり得る。好適な強ＡＥＸリガンドは、例えば第四級アミン基に基づく。好適な弱ＡＥＸリガンドは、例えば第一級、第二級もしくは第三級アミン基に基づくか、または当該技術分野において知られている任意の他の好適なリガンドである。

本発明に従うＭｉＭｏクロマトグラフィーは、樹脂を含有する典型的なカラム、モノリス材料に基づくカラム、適切なクロマトグラフィー媒体を含有するラジアルカラム、吸着膜ユニット、または、混合様式材料として機能するのに適切なリガンドを用いる当該技術分野において知られている任意の他の混合様式クロマトグラフィーデバイスによって具現化され得るＭｉＭｏユニットにおいて行われ得る。ＭｉＭｏカラムにおいて、クロマトグラフィー材料は、ＭｉＭｏリガンドが結合した粒状保持体として存在し得る。膜様のクロマトグラフィーデバイスは、ＭｉＭｏリガンドが結合した１枚または複数枚のシートの形態の保持体からなる。保持体は、有機材料もしくは無機材料または有機および無機材料の混合物からなり得る。好適な有機保持体は、例えば親水性炭水化物（例えば、架橋アガロース、セルロースまたはデキストラン）または合成コポリマー材料（例えば、ポリ（アルキルアスパルトアミド）（ｐｏｌｙ（ａｌｋｙｌａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ））、２−ヒドロキシエチルメタクリレートおよびエチレンジメタクリレートのコポリマー、またはアシル化ポリアミン）からなる。好適な無機保持体は、例えばシリカ、セラミックおよび金属である。膜形ＭｉＭｏは、親水性ポリエーテルスルホン含有ＭｉＭｏリガンドからなり得る。ＭｉＭｏリガンドの好適な例は、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、４−メルカプトエチルピリジン、ヘキシルアミノ、フェニルプロピルアミノ、２−メルカプト−５−ベンズアミダゾール（ｂｅｎｚａｍｉｄａｚｏｌｅ）スルホン酸、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン、または、マルチモード機能性を有する当該技術分野において知られている任意の他のリガンドである。

本発明の方法に従って精製され得る抗体は、６．０以上、好ましくは７．０以上、より好ましくは７．５以上の等電点ｐＨを有する抗体である。これらの抗体は、Ｇクラス、ＡクラスまたはＭクラスの免疫グロブリンであり得る。抗体は、ヒトもしくは非ヒト（例えば、齧歯類）またはキメラ（例えば、「ヒト化」）抗体であり得るか、上述の免疫グロブリンのサブユニットであり得るか、免疫グロブリン部分と別の（非免疫グロブリン）タンパク質に由来するまたはそのような別のタンパク質と同一の部分とからなるハイブリッドタンパク質であり得る。

驚くべきことに、合わせたＡＥＸおよびＭｉＭｏクロマトグラフィーの結果としてもたらされる抗体材料は、概して少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．９％、なおさらに好ましくは少なくとも９９．９９％という、非常に高い純度（タンパク質含有量をいう）を有するであろう。

本発明に従うＡＥＸクロマトグラフィー工程は、好ましくは、中性または僅かにアルカリ性のｐＨで実施される。この工程は、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、プロテインＡ（存在する場合）、ウイルス（存在する場合）、タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｏｕｓ）培地成分（例えば、インスリンおよびインスリン様成長因子）（存在する場合）などの、負に帯電した不純物を除去するであろう。

ＭｉＭｏクロマトグラフィー工程の間に、主要な残りの大分子不純物（ｌａｒｇｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ）（主として生成物凝集体）が、適切なｐＨ条件および導電率条件を適用すればそれらは生成物が貫流する間にクロマトグラフィーデバイスに結合するという性質を利用して、除去されるであろう。

続いて、あらゆる残留低分子量不純物を除去し、緩衝液を最終製剤緩衝液（ｆｉｎａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）と交換し、所望の最終生成物濃度を調整するために、その（高度に）精製された抗体調製物は、概して、限外濾過およびダイアフィルトレーションによって処理されなければならないであろう。

さらに、その精製された抗体調製物は、概して、存在する可能性のある感染因子（例えば、ウイルスおよび／またはプリオン）の完全な除去を確実なものにするためにも処理されなければならないであろう。

本発明はまた、アニオン交換クロマトグラフィー部分（ＡＥＸ）および混合様式クロマトグラフィー部分（ＭｉＭｏ）の両方を連続的に連結して含む単一操作ユニットに関する。この単一操作ユニットはさらに、第１のイオン交換クロマトグラフィー部分の上流端において入口を含み、かつ第２のイオン交換クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含む。この単一操作ユニットはまた、第１のイオン交換クロマトグラフィー部分と第２のイオン交換クロマトグラフィー部分との間に連結部も含み、これが、分離混合物へのコンディショニング溶液の供給のための入口をさらに含む。

本発明に従うプロセスの間の液体流れは、任意の市販のデュアルポンプクロマトグラフィーシステム（例えば、ÅＫＴＡエクスプローラー（ＧＥ）、ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳ（ＧＥ）の任意のデュアルポンプＨＰＬＣシステム）または図１の図に従う任意の特製のデバイスによって確立され得る。こうしたクロマトグラフィーデバイスの多くは、単一のクロマトグラフィーユニット（すなわち、カラムまたは膜）を操作するように設計されている。簡単な改造により、追加の連結が、ポンプＡ後かつ混合チャンバー前に第１のイオン交換ユニットを設けるために行われ得る。

図１は、基本構成を示すものである。図１に示されるような位置の任意選択のプレフィルターを加えた２つのクロマトグラフィーデバイスの連続的なインライン連結は、場合によっては望ましくない圧力増大に繋がり得る。したがって、状況によっては、追加の技術的改良（例えば、ＡＥＸユニット後の追加のポンプおよびＡＥＸユニット前の減圧デバイス）が、この図に含まれなければならないことがあり得る。

［図面の説明］
図１．アニオン交換クロマトグラフィー部分およびカチオン交換クロマトグラフィー部分の両方を含む単一操作ユニット。緩衝液Ａは、ＡＥＸ工程の最適な操作に適したコンディショニングおよび洗浄用緩衝液である。緩衝液Ｂは、酸性溶液を含有しており、ＭｉＭｏ工程の操作に最適な条件を得るために必要とされる、負荷物／緩衝液Ａに対する比で混合される。この混合比は、一定の体積混合流量（ｆｉｘｅｄ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｍｉｘｉｎｇ ｆｌｏｗ）を用いて達成され得る、またはフィードバックループによって例えばｐＨ出力に基づき自動制御され得る。ＭＣは、任意の種類の静的混合機を含有し得る、任意選択の混合チャンバーである。
Ｌ＝負荷物
ＰＡ＝ポンプＡ
ＰＢ＝ポンプＢ
ＡＥＸ＝アニオン交換ユニット
ＭｉＭｏ＝カチオン交換ユニット
ｐＨ＝ｐＨセンサー
σ＝導電率センサー
ＰＦ＝任意選択のプレフィルター

［実施例］
［材料および方法］
全ての実験を、ＣＨＯ細胞株によって産生されたＩｇＧを用いて実施した。化学的に規定された培地を用い、ＸＤ（登録商標）様式（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｎｅｗｓ，Ａｐｒ １ ２０１０，Ｎｏ．７参照）で、培養を実施した。

プロテインＡを用いるＲｈｏｂｕｓｔ（登録商標）ＥＢＡ技術（Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｈ ２０１１参照）を用いて、粗ＸＤ（登録商標）採取物の清澄化および捕捉を単一工程として実施した。その生成物を、３５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１Ｍ アセテート（ｐＨ３．０）の溶出緩衝液を用いて溶出させた。その溶出液は、５ｇ／ＬのＩｇＧを含有するものであり、２〜８℃で保存した。

こうして得られた材料を用いて、次の６つの実験をそれぞれ実施した。１．ヒドロキシアパタイト樹脂を用いたＭｉＭｏクロマトグラフィーにおける凝集体の選択的結合（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）のための条件を確立する（実験１）。２．ヒドロキシアパタイト樹脂を用いたＭｉＭｏクロマトグラフィーを、インライン混合を用いてフロースルー様式で行う（実験２）。３．ＡＥＸとヒドロキシアパタイト樹脂を用いたＭｉＭｏクロマトグラフィーとを１つの単一ユニット操作として組み合わせる（実施例１）。４．フロースルー様式でのアニオン−ＨＩＣ樹脂を用いたＭｉＭｏクロマトグラフィーにおける最適条件を確立する（実験３）。５．アニオン−ＨＩＣ樹脂を用いたＭｉＭｏクロマトグラフィーを、インライン混合を用いてフロースルー様式で行う（実験４）。６．ＡＥＸとアニオン−ＨＩＣ樹脂を用いたＭｉＭｏクロマトグラフィーとを１つの単一ユニット操作として組み合わせる（実施例２）。

フロースルー様式でのＡＥＸクロマトグラフィーの最適条件は、以前に決定されており、それを実施例１および実施例２の実験において適用した。

タンパク質（生成物）濃度は、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法を用い、２８０ｎｍ（Ａ^２８０）および１．６３の吸光係数で吸光度を測定することによって求めた。

単量体ＩｇＧおよび凝集体の濃度は、標準的な手順に従って、サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）によって測定した。

ＨＣＰは、ＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ Ａｓｓａｙ，３Ｇ（Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した。

［実験１］
［ヒドロキシアパタイト樹脂を用いたＭｉＭｏクロマトグラフィーにおける凝集体の選択的結合のための条件の確立］
この実験のために、予備精製したＩｇＧを、脱塩水で導電率が≦５ｍＳ／ｃｍとなるように希釈し、２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０を用いてｐＨ６．５に調整した。結合−溶出様式でのＭｉＭｏクロマトグラフィーを実施した。４ｃｍの床長さのＨＡ Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（登録商標）Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｏｒｂｅｎｔ（Ｐａｌｌ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填したＶＬ１１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムを、ÅＫＴＡエクスプローラーで使用した。カラムを、１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を３ｍＬ／分の流量で用いて平衡させ、洗浄した。生成物を、２ｍＬ／分の流量で負荷した。初期負荷物は、２．６ｇ／ＬのＩｇＧおよび２．２％の初期量の凝集体を含有していた。負荷後、生成物を、１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）（緩衝液Ａ）および１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）（緩衝液Ｂ）を用いて０％から１００％までの直線勾配で溶出させた。

溶出工程中の各画分を回収し、凝集体の存在およびタンパク質（生成物）含有量について、導電率の関数として分析した。

各試料についての分析結果（表１に示す）は、２６．９ｍＳ／ｃｍの導電率値までは、溶出液は、凝集体を含有していないか、ほんの僅かな量の凝集体しか含有していないことを明確に示した。

［実験２］
［インライン混合を用いてのフロースルー様式でのヒドロキシアパタイト樹脂を用いたＭｉＭｏクロマトグラフィーにおける凝集体除去］
この実験のために、予備精製したＩｇＧを、脱塩水で導電率が２．４ｍＳ／ｃｍとなるように希釈し、２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０緩衝液を用いてｐＨ７．４に調整した。４ｃｍの床長さのＨＡ Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（登録商標）Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｏｒｂｅｎｔ（Ｐａｌｌ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填したＶＬ１１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムを、ÅＫＴＡエクスプローラーで使用した。カラムを、脱塩水および１０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．８Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｂ）で平衡させた。脱塩水と緩衝液Ｂとを、３０％の緩衝液Ｂの一定体積比で、５ｍＬ／分の流量でインライン混合した。平衡後、生成物を負荷した。導電率を２５ｍＳ／ｃｍの値に調整するために、負荷の間中、生成物流れを緩衝液Ｂとインライン混合した。生成物流れと緩衝液Ｂとは、３０％の緩衝液Ｂの一定体積比で、１ｍＬ／分の流量で混合した。初期負荷物は、０．７８ｇ／ＬのＩｇＧおよび２．９７％の初期量の凝集体を含有していた。

フロースルー物の各画分を回収し、凝集体の存在およびタンパク質（生成物）含有量について分析した。

これらの試料の分析結果（表２に示す）は、生成物含有負荷物と３０％の一定体積比での１０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．８Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）とのインライン混合を用いてフロースルー様式でヒドロキシアパタイト樹脂を用いての≦１％に至るまでの凝集体の除去を明確に示した。

［実施例１］
［ＡＥＸとヒドロキシアパタイト樹脂を用いたＭｉＭｏクロマトグラフィーとを１つの単一ユニット操作として用いてのＩｇＧの精製］
ÅＫＴＡエクスプローラーを使用して、ＡＥＸユニットおよびＭｉＭｏユニットを、図１の図に示されているように連続的に連結した。ＡＥＸには、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑカプセル（１ｍＬ）を使用し、ＭｉＭｏには、４ｃｍの床長さのＨＡ Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（登録商標）Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｏｒｂｅｎｔ（Ｐａｌｌ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填したＶＬ１１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムを使用した。生成物負荷前のＡＥＸユニットの連結に先立つコンディショニングについては、ＭｉＭｏユニットを、脱塩水（ポンプＡによりポンプ輸送される）および１０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．８Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｂ）で平衡させた。脱塩水と緩衝液Ｂとは、３０％の緩衝液Ｂの一定体積比で、５ｍＬ／分の流量でインライン混合した。ＡＥＸユニットを、それをシステムに連結する前に、１００ｍＬの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）緩衝液でフラッシュし、平衡させた。各ユニットの平衡を別個に行わない実験が行われ得る。

この実験のために、予備精製したＩｇＧを、脱塩水で導電率が２．４ｍＳ／ｃｍとなるように希釈し、２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０緩衝液を用いてｐＨをｐＨ７．４に調整し、そして０．２２μｍで濾過した。予備精製したＩｇＧの負荷を、１ｍＬ／分の速度でポンプ輸送することによって開始した。緩衝液Ｂを、３０％の体積比で、同じ流量でポンプ輸送した。０．６ｇ／ＬのＩｇＧを含有する２４０ｍＬの量を負荷した。負荷を終えた後、洗浄を開始するために、ＡＥＸユニットを取り外した。ＡＥＸユニットを洗浄のために取り外す必要がない実験が行われ得る。ＭｉＭｏユニットを、１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）（緩衝液Ａ）および緩衝液Ｂの０％から３０％までの直線勾配を用いて洗浄し、０．５Ｍ リン酸ナトリウム、１．５ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）の緩衝液でストリッピングした。負荷物、フロースルー物および洗液を、凝集体の存在、ＨＣＰ含有量およびタンパク質（生成物）含有量について分析した。負荷物は、２１７９ｎｇ／ｍｇ ＩｇＧのＨＣＰ濃度を有していた。フロースルー物と洗液との画分は、４４７ｎｇ／ｍｇ ＩｇＧのＨＣＰ濃度を有していた。負荷物中の凝集体の量は２．９３％であり、フロースルー物と洗液とにおいては０．７６％であった。ストリッピング物（ｓｔｒｉｐ）は、５４．９７％の凝集体を含有していた。フロースルー物と洗液とにおける全生成物回収率は８８．２％であり、フロースルー物と洗液とストリッピング物とでは９０％であった。

この実験は、分離混合物に適量の適切な調整溶液をインライン補充した場合に、１つの単一ユニット操作として動作する連続的なインラインのアニオン交換クロマトグラフィーとそれに続くＭｉＭｏ（ヒドロキシアパタイト）クロマトグラフィーとの使用によって、９９．２％という抗体材料の最終純度が達成されるということを示している。負荷物の初期純度は９７％であった。

［実験３］
［フロースルー様式でのアニオン−ＨＩＣ樹脂を用いたＭｉＭｏクロマトグラフィーにおける最適条件の確立］
この一連の実験ために、予備精製したＩｇＧを、脱塩水で導電率が２．２９ｍＳ／ｃｍとなるように希釈し、２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０緩衝液を用いてｐＨをｐＨ７．４に調整した。６．３の床長さのＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したＶＬ１１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムを、ÅＫＴＡエクスプローラーで使用した使用した。カラムを、２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）（緩衝液Ａ）および１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｂ）で平衡させ、洗浄した。緩衝液Ａと緩衝液Ｂとは、別個の実験として０％、５％、１５％および２５％の体積比で、５ｍＬ／分の流量でインライン混合した。平衡後、生成物を負荷した。負荷の間中、生成物流れを緩衝液Ｂとインライン混合した。生成物流れと緩衝液Ｂとは、別個の実験として０％、５％、１５％および２５％の緩衝液Ｂの体積比で、３ｍＬ／分の流量でインライン混合した。初期負荷物は、緩衝液Ｂとのインライン混合による希釈前において１．０９ｇ／ＬのＩｇＧを含有し、３．１３％の初期量の凝集体を含有していた。カラムを、１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）緩衝液でストリッピングした。

異なる緩衝液Ｂ比におけるフロースルー物の画分を回収し、凝集体の存在およびタンパク質（生成物）含有量について分析した。

試料の分析結果（表３に示す）は、生成物含有負荷物をリン酸塩調整緩衝液とインライン混合した場合の、アニオン−ＨＩＣのＭｉＭｏ樹脂における＜１％に至るまでの凝集体の除去を明確に示した。

［実験４］
［インライン混合を用いてのフロースルー様式でのアニオン−ＨＩＣ樹脂を用いたＭｉＭｏクロマトグラフィーにおける凝集体除去］
この実験のために、予備精製したＩｇＧを、脱塩水で導電率が２．４ｍＳ／ｃｍとなるように希釈し、２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０緩衝液を用いてｐＨ７．４に調整した。６．３の床長さのＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したＶＬ１１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムを、ÅＫＴＡエクスプローラーで使用した。カラムを、２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）（緩衝液Ａ）および１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｂ）で平衡させ、洗浄した。緩衝液Ａと緩衝液Ｂとは、１５％の緩衝液Ｂの一定体積比で、５ｍＬ／分の流量でインライン混合した。平衡後、生成物を負荷した。負荷の間中、生成物流れを緩衝液Ｂとインライン混合した。生成物流れと緩衝液Ｂとは、１５％の緩衝液Ｂの一定体積比で、３ｍＬ／分の流量でインライン混合した。初期負荷物は、０．９３ｇ／ＬのＩｇＧおよび３．１５％の初期量の凝集体を含有していた。カラムを、１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）緩衝液でストリッピングした。

これらの試料の分析結果（表４に示す）は、３０％の一定体積比での１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７）のインライン混合を用いてのフロースルー様式でのアニオン−ＨＩＣのＭｉＭｏ樹脂における実験全体にわたる、フロースルー物中≦１％に至るまでの凝集体の除去を明確に示した。凝集体の割合はフロースルー物のバルクであり、０．１８％であった。

［実施例２］
［ＡＥＸとアニオン−ＨＩＣ樹脂を用いたＭｉＭｏクロマトグラフィーとを１つの単一ユニット操作として用いてのＩｇＧの精製］
ÅＫＴＡエクスプローラーを使用して、ＡＥＸユニットおよびＭｉＭｏユニットを、図１の図に示されているように連続的に連結した。ＡＥＸには、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑカプセル（１ｍＬ）を使用し、ＭｉＭｏには、６．３の床長さのＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したＶＬ１１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムを使用した。生成物負荷前のＡＥＸユニットの連結に先立つコンディショニングについては、ＭｉＭｏユニットを、２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）（緩衝液Ａ）および１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｂ）で平衡させた。緩衝液Ａと緩衝液Ｂとは、１５％の緩衝液Ｂの一定体積比で、５ｍＬ／分の流量でインライン混合した。ＡＥＸユニットを、それをシステムに連結する前に、１００ｍＬの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）緩衝液でフラッシュし、平衡させた。各ユニットの平衡を別個に行わない実験が行われ得る。

この実験のために、予備精製したＩｇＧを、脱塩水で導電率が２．２９ｍＳ／ｃｍとなるように希釈し、２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０緩衝液を用いてｐＨをｐＨ７．４に調整し、そして０．２２μｍで濾過した。予備精製したＩｇＧの負荷を、３ｍＬ／分の速度でポンプ輸送することによって開始した。緩衝液Ｂを、１５％の体積比で、同じ流量でポンプ輸送した。０．９１ｇ／ＬのＩｇＧを含有する４７９ｍＬの量を負荷した。負荷を終えた後、洗浄を開始するために、ＡＥＸユニットを取り外し、流れを緩衝液Ａに戻してラインに注入（ｐｒｉｍｅ）した。ＡＥＸユニットを洗浄のために取り外す必要がない実験が行われ得る。洗浄後、ポンプＡにより１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）緩衝液を添加することによってＭｉＭｏユニットをストリッピングし、ポンプＢを停止した。負荷物、フロースルー物および洗液を、凝集体の存在、ＨＣＰ含有量およびタンパク質（生成物）含有量について分析した。負荷物は、１７１１ｎｇ／ｍｇ ＩｇＧのＨＣＰ濃度を有していた。フロースルー物と洗液との画分は、２０６ｎｇ／ｍｇ ＩｇＧのＨＣＰ濃度を有していた。負荷物中の凝集体の量は３．１３％であり、フロースルー物と洗液とにおいては０．１８％であった。ストリッピング物は、１４．２３％の凝集体を含有していた。フロースルー物と洗液とにおける全生成物回収率は８２．９％であり、フロースルー物と洗液とストリッピング物とでは９９．９％であった。

この実験は、分離混合物に適量の適切な調整溶液をインライン補充した場合に、１つの単一ユニット操作として動作する連続的なインラインのアニオン交換クロマトグラフィーとそれに続くＭｉＭｏ（アニオン−ＨＩＣ）クロマトグラフィーとの使用によって、９９．７２％という抗体材料の最終純度が達成されるということを示している。負荷物の初期純度は９６．８％であった。

［使用した略語］
Ａ^２８０ ２８０ｎｍでの（光）吸収
ＡＥＸ アニオン交換
ＢＨＫ細胞 ベビーハムスター腎臓細胞
ＣＨＯ細胞 チャイニーズハムスター卵巣細胞
ＥＢＡ 膨張床吸着
ＨＣＰ 宿主細胞タンパク質
ＨＩＣ 疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ 高圧液体クロマトグラフィー
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ
ＭｉＭｏ 混合様式
ＴＦＦ 接線流濾過
Ｔｒｉｓ トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン

Claims (10)

1. 中間精製およびポリッシングの工程を少なくとも含む、バイオリアクターにおいて生成されるタンパク質混合物からの抗体の精製方法であって、前記中間精製およびポリッシング工程は、連続的なインラインの、分離混合物をフロースルー画分として生成するアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）と、それに続く、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成する混合様式クロマトグラフィー（ＭｉＭｏ）とを含み、前記精製抗体調製物は、少なくとも１つのさらなる精製工程に供され、ここで、混合様式クロマトグラフィー前の前記分離混合物には、前記混合様式クロマトグラフィー工程における前記抗体からの不純物の除去のためにｐＨおよび／もしくは導電率ならびに／または特定のイオン成分の濃度もしくは種類を調整するために、適量の好適な調整溶液が補充される、方法。
2. アニオン交換クロマトグラフィーおよび混合様式クロマトグラフィーが、連続的に連結された２つの別個のデバイスにおいて行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記連続的なインラインのＡＥＸおよびＭｉＭｏが、単一ユニット操作として行われる、請求項１に記載の方法。
4. ＭｉＭｏ前の前記分離混合物に、適量の塩または塩の組み合わせが補充される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. ＭｉＭｏ前の前記分離混合物に、適量の硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウムおよび塩化ナトリウムが補充される、請求項４に記載の方法。
6. ＭｉＭｏクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、適量の酸性溶液が補充される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
7. ＭｉＭｏクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、クエン酸（またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）、リン酸（またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）、酢酸、塩酸または硫酸を含有する適量の溶液が補充される、請求項６に記載の方法。
8. 混合様式クロマトグラフィー前の前記分離混合物に、適量のアルカリ性溶液が補充される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
9. ＭｉＭｏクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、水酸化ナトリウムもしくはカリウム、（またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含有する適量の溶液が補充される、請求項８に記載の方法。
10. アニオン交換クロマトグラフィー部分および混合様式クロマトグラフィー部分の両方を連続的に連結して含む請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法において使用され得る単一操作ユニットであって、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の出口は、前記混合様式クロマトグラフィー部分の入口に連結されており、前記ユニットは、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の上流端に入口を含みかつ前記混合様式クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含み、前記ユニットはまた、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分と前記混合様式クロマトグラフィー部分との間にも入口を含む、単一操作ユニット。

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