MX2013014615A - Purificacion de anticuerpos por cromatografia de unidad unica. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método de purificación de anticuerpos a partir de una mezcla de proteína producida en un biorreactor, que comprende al menos las etapas de purificación intermedia y pulido, en que la etapa intermedia y de pulido comprenden un tratamiento de cromatografía de intercambio aniónico (AEX) en línea y un tratamiento de cromatografía en modo mixto (MiMo) en modo de flujo de paso. La presente invención se refiere adicionalmente a una unidad operativa única que comprende una parte de cromatografía de intercambio aniónico y una parte de cromatografía en modo mixto que están conectadas en serie, en que la unidad comprende una entrada en el extremo aguas arriba de la parte de cromatografía de intercambio aniónico y una salida en el extremo aguas abajo de la parte de cromatografía en modo mixto y en que la unidad también comprende una entrada entre la parte de cromatografía de intercambio aniónico y la parte de cromatografía en modo mixto.

Description

PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS POR CROMATOGRAFÍA DE UNIDAD UNICA La presente invención se refiere a un método para la purificación de anticuerpos de unidad única y a un equipo que puede utilizarse en este método.

La purificación de anticuerpos monoclonales , producida por cultivo celular para su uso en aplicaciones armacéuticas, es un proceso que implica un gran número de etapas. Los anticuerpos se liberan esencialmente de cualquier contaminante potencialmente dañino, como proteínas y ADN originado en las células productoras de anticuerpos, componentes medio tales como insulina, éteres de PEG y antiespumante así como cualquier agente infeccioso potencialmente presente como virus y priones .

En BioPharm Internacional, 1 de junio de 2005 "Do nstream Processing of Monoclonal Antibodies: from High Dilution to High Purity"se describen procesos típicos para la purificación de anticuerpos a partir de un cultivo de células productoras de estas proteínas.

Dado que los anticuerpos se producen en las células, tales como células de hibridoma o células hospedadoras transformadas (como células de ovario de hámster chino (CHO, Chínese Hámster Ovary, por sus siglas en inglés), células NSO derivadas de mieloma de ratón, células renales de cría de hámster y células PER. C6®derivadas de la retina humana), el material celular particulado tendrá que extraerse del caldo celular, preferentemente en las etapas iniciales del proceso de purificación. En el presente documento, esta parte del proceso se denomina "clarificación". Posteriormente o como parte de la etapa de clarificación, los anticuerpos se purifican al menos aproximadamente el 80 %, generalmente con una etapa de cromatografía de unión más elución (en el caso de IgG a menudo usando Proteína'A inmovilizada) . Esta etapa, indicada en el presente documento como "captura", no solo da como resultado una primera purificación considerable del anticuerpo, sino que también puede dar como resultado una reducción considerable del volumen, y por tanto la concentración del producto. Métodos alternativos para la captura son, por ejemplo, la adsorción en lecho expandido (EBA, Expanded Bed Adsorption, por sus siglas en inglés), separación líquida de 2 fases (usando, por ejemplo polietilenglicol ) o precipitación fraccionada con sal liotrópica (como sulfato de amonio).

Después de la etapa de clarificación y captura, los anticuerpos se purifican adicionalmente . Generalmente, se requieren al menos 2 etapas cromatográficas después de la captura para eliminar suficientemente las impurezas residuales. La etapa cromatográfica después de la captura se denomina frecuentemente etapa de purificación intermedia y la etapa cromatográfica final generalmente se denomina etapa de pulido. Cada una de estas etapas se realiza generalmente como una unidad operativa única en modo por lotes y al menos una de estas etapas generalmente se realiza en el modo de unión más elución. Además, cada etapa cromatográfica requiere condiciones de carga específicas con respecto a, por ejemplo, el pH, la conductividad, etc. Por lo tanto, debe realizarse una manipulación adicional antes de cada etapa cromatográfica para ajusfar la carga a las condiciones necesarias. Todo lo que acaba de mencionarse hace que el proceso sea elaborado y requiera tiempo. Las impurezas generalmente eliminadas sustancialmente durante estas etapas son contaminantes derivados de procesos, tales como proteínas de células hospedadoras, ácidos nucleicos de células hospedadoras , componentes del medio de cultivo (si presentes), proteína A (si presente), endotoxina (si presente) y microorganismos (si presentes). En recientes publicaciones de patentes se han descrito diversos métodos de dicha purificación de anticuerpos .

El documento WO 2010/062244 se refiere a un proceso de precipitación aumentado de extracción de dos fases acuosas para aislar y purificar proteínas de tipo anticuerpos monoclonales . Para la purificación adicional posterior de anticuerpos se describen dos alternativas: (1) cromatografía de intercambio catiónico en modo unión y elución, seguido por intercambio aniónico en modo de flujo de paso o (2) cromatografía multimodal primaria (o en modo mixto) en modo de flujo de paso, seguido por intercambio aniónico en modo de flujo de paso. Las dos unidades cromatográficas de la alternativa (2) no actúan como una unidad operativa única y ninguna se usa para fines de pulido.

El documento WO 2005/044856 se refiere a la retirada de agregados de alto peso molecular de una preparación de anticuerpos, usando una resina de hidroxiapatita opcionalmente en combinación con una cromatografía de intercambio aniónico. Ambos tratamientos de cromatografía se describen entre otros como procesos de flujo de paso, sin embargo se describen para realizarse como operaciones independientes .

El documento WO 2011/017514 se refiere a la purificación de anticuerpos y otras proteínas que contienen Fe mediante etapas de cromatografía de intercambio aniónico y catiónico en línea posteriores. Ambos tratamientos cromatográficos se realizaron generalmente como separaciones de unión y elución, aunque la segunda etapa puede llevarse a cabo como un proceso de flujo de paso.

El documento WO2005/ 082483 se refiere a la purificación de anticuerpos mediante dos etapas de cromatografía en modo mixto posteriores en que el material de la cromatografía de la primera etapa es una resina de intercambio catiónico en modo mixto que tiene grupos de intercambio catiónicos y grupos aromáticos mediante los cuales los anticuerpos pueden unirse y el material de cromatografía de la segunda etapa es una resina de intercambio aniónico en modo mixto. La segunda etapa de cromatografía puede realizarse en modo de flujo de paso. Las dos etapas de cromatografía se describen como operaciones independientes.

Las desventajas de los métodos descritos anteriormente son que requieren mucho tiempo operativo, elevados costes variables y un elevado coste fijo (debido a costes de mano de obra ) .

De acuerdo con una realización de la presente invención, puede conseguirse una eliminación muy eficaz de impurezas residuales de los anticuerpos producidos por cultivo celular usando cromatografía de intercambio aniónico (AEX, Anión Exchange Chromatography, por sus siglas en inglés) en línea en serie y cromatografía en modo mixto (MiMo, Mixed-mode Chromatography, por sus siglas en inglés) ambas en modo de flujo de paso. El acondicionamiento en línea del flujo de paso de la etapa AEX (por ejemplo, mezclando un tampón adecuado) antes de la etapa cromatográfica MiMo se usa para ajustar el flujo de paso a las condiciones correctas con respecto al pH y conductividad para la cromatografía MiMo .

Las ventajas de este nuevo método son una reducción considerable del tiempo operativo y de la mano de obra y por tanto, un menor coste operacional. Además, se requieren unidades cromatográficas más pequeñas (y por tanto menos costosas), ya que todas las unidades operan en modo de flujo de paso que solo requiere capacidad de unión suficiente para las impurezas y no para el producto.

Por lo tanto, la presente invención puede definirse como un método para la purificación de anticuerpos a partir de un caldo celular producido en un biorreactor, comprendiendo al menos las etapas de purificación intermedia y pulido, en que la nueva etapa de purificación comprende cromatografía AEX en línea en serie y MiMo combinadas. Esto puede realizarse aplicando una etapa de cromatografía AEX en línea en serie que produce una mezcla de separación como una fracción de flujo de paso, seguido de una etapa de cromatografía MiMo que produce una preparación de anticuerpos purificada como una fracción de flujo de paso y en que la preparación de anticuerpos purificada se somete al menos a una etapa de purificación adicional.

Por tanto, en el contexto de la presente invención, la "mezcla de separación" es la solución resultante de la primera etapa de cromatografía de acuerdo con la invención, y la "preparación de anticuerpos purificados" es la solución resultante de la segunda etapa de cromatografía de acuerdo con la invención. Se pretende utilizar esta terminología a lo largo de la presente solicitud.

Antes de la primera etapa de cromatografía, el caldo celular producido en el biorreactor generalmente se aclarará (es decir, se liberará de cualquier material celular, como células enteras y restos celulares).

Además, antes de la primera etapa de cromatografía, puede añadirse una solución de acondicionamiento al caldo celular o a la solución que contiene los anticuerpos para garantizar las condiciones óptimas en cuanto a pH y conductividad para esta primera etapa.

En una realización particular, el método de acuerdo con la invención implica que la cromatografía combinada con AEX y MiMo se realice como una unidad operativa única.

En el contexto de la presente invención con "anticuerpo" y el plural "anticuerpos"' se hace referencia a cualquier proteína que tenga la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. En su forma natural' un anticuerpo (o inmunoglobulina ) es una proteína en forma de- Y sobre la superficie de linfocitos B que se segrega en la sangre o en la linfa en respuesta a un estímulo antigénico tal como una bacteria, virus, parásito u órgano trasplantado y que neutraliza el antigeno uniéndose específicamente al mismo. El término anticuerpo como se usa en el presente documento también comprende una parte de unión a antígeno de un anticuerpo natural o artificial. El término también comprende una proteína no natural (por tanto artificial) que tiene la capacidad de unirse específicamente a un antigeno basándose en mecanismos de interacción similares como un anticuerpo natural, y por lo tanto también comprende un anticuerpo quimérico que consiste por ejemplo en una parte de unión a antígeno derivado de una especie (por ejemplo un ratón) y una parte de no unión a antígeno o derivada de otra especie (por e emplo ser humano).

Con "cromatografía en modo mixto" (MiMo) se hace referencia al tipo de cromatografía que utiliza materiales en los que tienen lugar una o más interacciones para la adsorción y/o desorción de proteínas. Estas interacciones pueden ser de los siguientes tipos: aniónica, catiónica, hidrófoba, afinidad, p-p, tiófilica, exclusión por tamaño. Los ejemplos bien conocidos de materiales de modo mixto son hidroxiapatita (afinidad metálica, interacciones aniónicas y catiónicas), Capto™ adhere (interacciones aniónicas e hidrófobas) y MEP HyperCel™ (interacciones catiónicas e hidrófobas ) .

Con "AEX en linea en serie y MiMo" se hace referencia a que la AEX y MiMo se conectan en serie de tal manera que el flujo externo del dispositivo AEX se alimenta en el dispositivo MiMo, sin conservación intermedia.

Con "fracción de flujo de paso" se hace referencia en el presente documento a al menos parte de la fracción que contiene el anticuerpo cargado que abandona la columna cromatográfica a sustancialmente la misma velocidad que el fluido de elución. Esta fracción está sustancialmente no retenida en la columna durante la elución. Por tanto las condiciones se seleccionan de tal manera que no sean los anticuerpos sino las impurezas las que se unen a los respectivos materiales cromatográficos .

Se ha observado que para los propósitos de producción a gran escala el método de acuerdo con la presente invención (con modo de flujo de paso) proporciona una separación mucho más rápida que el método^ anterior desvelado con una unión y elución de los anticuerpos deseados.

De acuerdo con la presente invención, la mezcla de separación que contiene el anticuerpo está acondicionada en linea. Para esta finalidad, la mezcla de separación se complementa con una cantidad adecuada de una solución de acondicionamiento adecuada para modificar su composición y/o propiedades, tales como el pH y/o la conductividad y/o la presencia y cantidades de componentes iónicos específicos para un rendimiento óptimo en la segunda etapa cromatográfica de acuerdo con la presente invención.

En ninguno de los documentos de la técnica anterior citados anteriormente se aplica ni se sugiere el acondicionamiento en línea entre dos etapas cromatográficas y, sorprendentemente, se ha encontrado que pueden conseguirse muy buenos resultados de separación con un acondicionamiento en línea del fluido (mezcla de separación) antes de introducirse en la segunda etapa cromatográfica de acuerdo con la invención..

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para la purificación de anticuerpos a partir de una mezcla de proteínas producida en un biorreactor, comprendiendo al menos las etapas de purificación intermedia y pulido, en que las etapas de purificación intermedia y pulido comprenden cromatografía de intercambio aniónico (AEX) en línea en serie, que produce una mezcla de separación como una fracción de flujo de paso, seguido, por una cromatografía en modo mixto (MiMo) que produce una preparación de anticuerpo purificada como una fracción de flujo de paso y en que la preparación de anticuerpos purificada se somete a al menos una etapa de purificación adicional, en que la mezcla de separación antes de la cromatografía en modo mixto se complementa con una cantidad adecuada de una solución de ajuste adecuado para ajustar el pH y/o la conductividad y/o la concentración o tipo de componentes iónicos específicos para la retirada de impurezas de los anticuerpos en la etapa de cromatografía en modo mixto.

Las expresiones "solución de acondicionamiento" y "solución de ajuste" se usan de manera indistinta y se refieren en el presente documento a la solución que se añade a la mezcla de separación antes de alimentar la mezcla de separación en la segunda etapa cromatográfica (MiMo) de acuerdo con la invención.

Con "una cantidad adecuada de una solución de ajuste adecuada" se hace referencia en el presente documento a cualquier solución ácida, neutra o alcalina que contiene opcionalmente una o más sales u otros aditivos que al mezclarlos con la mezcla de separación producirán la adsorción de la mayoría de las impurezas relevantes en el material MiMo, pero no promoverán una unión sustancial del producto. Para cada proceso de purificación, el. pH óptimo, el tipo de sistema salino preferido y las cantidades óptimas en la solución de ajuste tienen que establecerse.

Preferentemente, el pH de la solución mencionada será el mismo que el de la mezcla de separación que contiene el anticuerpo y el .valor de conductividad óptimo será el resultado de la adición de una cantidad adecuada de una o más sales o de la dilución de la sal (o sales) presentes en la mezcla de separación. El anión de la sal puede seleccionarse preferentemente del grupo que consiste en fosfato, sulfato, acetato, cloruro, bromuro, nitrato, clorato, yoduro e iones tiocianato. El catión de la sal puede seleccionarse preferentemente del grupo que consiste en amonio, rubidio, potasio, sodio, litio, magnesio, calcio e iones de bario. Las sales preferidas son las sales de sulfato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fosfato de amonio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, cloruro de potasio y cloruro de sodio. Otros aditivos que pueden usarse son etanol, etilenglicol , propilenglicol , polietilenglicol y. cualquier otro compuesto conocido en la técnica que sirva para optimizar la etapa de cromatografía MiMo.

Los componentes ácidos para una solución de ajuste ácido pueden seleccionarse de compuestos tales como ácido cítrico (o sus sales mono o dibásicas de sodio o potasio), ácido fosfórico (o sus sales mono o dibásicas de sodio o potasio), ácido acético, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico.

Los componentes alcalinos para una solución de ajuste alcalino pueden seleccionarse de compuestos tales como hidróxido de sodio o potasio, (o sus sales mono o dibásicas de sodio o potasio) o tris (hidroximetil ) aminometano, pero para este fin también puede usarse cualquier otro componente alcalino conocido en la técnica.

Preferentemente, la solución de ajuste necesaria se completará en una cantidad pequeña para tener una dilución mínima del producto.

Preferentemente, la complementación de la mezcla de separación en este caso con una cantidad adecuada de una solución de ajuste adecuada, es parte de la unidad operativa única, por ejemplo mezclando en línea la solución de ajuste mencionada en la corriente del proceso (por ejemplo, en una cámara de mezcla) antes de la etapa de cromatografía MiMo.

La cromatografía AEX de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo en una unidad AEX que puede realizarse en una columna de lecho de relleno clásica que contiene una resina, una columna que contiene material monolítico, una columna radial que contiene el medio cromatográfico adecuado, una unidad de membrana de adsorción o cualquier otro dispositivo de cromatografía de intercambio aniónico conocido en la técnica con el medio y ligandos apropiados para actuar como un intercambiador aniónico. En la columna AEX el material cromatográfico puede estar presente como un material de soporte particulado en el cual están unidos ligandos catiónicos fuertes o débiles. El intercambiador aniónico de tipo membrana consta de un material de soporte en forma de una o más láminas a las cuales se unen los ligandos catiónicos fuertes o débiles. El material soporte puede estar compuesto de material orgánico o material inorgánico o de una mezcla de material orgánico e inorgánico. Como materiales orgánicos adecuados se encuentran medios basados en agarosa o metacrilato. Materiales inorgánicos adecuados son sílice, cerámica y metales. Un intercambiador aniónico en forma de membrana puede estar compuesto de polietersul fona hidrófila que contiene ligandos AEX. Los ligandos AEX fuertes adecuados están basados por e emplo en grupos amina cuaternaria. Los ligandos AEX débiles adecuados se basan por ejemplo en grupos amina primaria, secundaria o terciaria o en cualquier otro ligando adecuado conocido en la técnica.

La cromatografía MiMo de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo en una unidad MiMo que puede realizarse mediante una columna clásica que contiene una resina, una columna basada en un material monolítico, una columna radial que contiene un medio cromatográfico adecuado, una unidad de membrana de adsorción o cualquier otro dispositivo de cromatografía en modo mixto conocido en la técnica con los ligandos apropiados para actuar como un material en modo mixto. En la columna MiMo el material cromatográ fico puede estar presente como un material de soporte particulado al cual se unen los ligandos MiMo. El dispositivo cromatográfico de tipo membrana consiste en un material soporte en forma de una o más láminas a las cuales se unen los ligandos MiMo . El material soporte puede estar formado por un material orgánico o un material inorgánico o una mezcla de material orgánico e inorgánico. Los materiales de soporte orgánicos adecuados están compuestos por ejemplo de hidratos de carbono hidrófilos (tales como azarosa, celulosa o dextrano reticulado) o materiales copoliméricos sintéticos (tales como poli ( alquilaspartamida ) , copolímeros de 2-hidroxietil metacrilato y etilen dimetacrilato o poliamina acilada) . Los materiales de soporte inorgánicos adecuados son, por e emplo sílice, cerámicas y metales. Un MiMo de membrana puede componerse de polietersulfona hidrófila gue contiene ligandos MiMo. Algunos ejemplos de ligandos MiMo adecuados son hidroxiapatita, fluorapatita, 4-mercapto etil piridina, hexilamino, fenilpropilamino, ácido 2-mercapto-5-benzamidazol sulfónico, N-bencil-N-metil-etanolamina y cualquier otro ligando conocido en la técnica con funcionalidad multimodal.

Los anticuerpos que pueden purificarse de acuerdo con el método de la presente invención son anticuerpos que tienen un pH isoeléctrico de 6,0 o mayor, preferentemente de 7,0 o mayor, más preferentemente de 7,5 o mayor. Estos anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas de la clase G, A o M. Los anticuerpos pueden ser humanos o no humanos (tales como roedores) o quiméricos (por ejemplo, "humanizados") o pueden ser subunidades de las inmunoglobulinas anteriormente mencionadas, o pueden ser proteínas híbridas que consisten en una parte de inmunoglobulina y una parte derivada de o idéntica a otra proteína (no inmunoglobulina).

Sorprendentemente, el material de anticuerpo resultante de la cromatografía AEX y MiMo combinadas generalmente tendrá un alto nivel de pureza (en referencia al contenido de proteína) de al menos 98 %, preferentemente al menos 99 %, más preferentemente al menos 99,9 %, incluso más preferentemente al menos 99,99 %.

La etapa de cromatografía AEX de acuerdo con la presente invención se realiza preferentemente a pH neutro o ligeramente alcalino. Este pH eliminará las impurezas cargadas negativamente como el ADN, proteínas de células hospedadoras, proteína A (si presente), virus (si presentes), componentes proteináceos del medio tales como insulina y factor de crecimiento similar a insulina (si presente).

Durante la etapa de cromatografía MiMo las impurezas moleculares grandes principalmente restantes (principalmente productos agregados) se retirarán, usando la propiedad de que, aplicando las condiciones correctas de pH y conductividad, se unen al dispositivo cromatográfico mientras el producto circula.

Posteriormente, la preparación de anticuerpos ( altamente ) purificada, tendrá que tratarse por ultrafiltración y diafiltración para eliminar todas las impurezas residuales de bajo peso molecular, para reemplazar el tampón por el tampón de formulación final y ajustar la concentración del producto final deseado.

Además, la preparación de anticuerpo purificada tendrá finalmente ' que tratarse también para qarantizar la eliminación completa de agentes infecciosos posiblemente presentes tales como virus y/o priones.

La presente invención, también se refiere a una unidad operativa única que comprende tanto una parte de cromatografía de intercambio aniónico (AEX) y una parte de cromatografía en modo mixto (MiMo), que se conectan en serie. Esta unidad operativa única comprende adicionalmente una entrada en el extremo aguas arriba de la primera parte de cromatografía de intercambio iónico y una salida en el extremo aguas abajo de la segunda parte de cromatografía de intercambio iónico. Esta unidad operativa única también comprende una conexión entre la primera parte de la cromatografía de intercambio iónico y la segunda parte de la cromatografía de intercambio iónico que comprende además una entrada para proporcionar una solución de acondicionamiento a la mezcla de separación.

El flujo líquido durante el proceso de acuerdo con la presente invención puede establecerse mediante cualquier sistema cromatográfico con bomba dual disponible en el Nmercado, por ejemplo, un ÁKTA explorer (GE), un BIOPROCESS (GE), cualquier sistema HPLC de bomba dual o cualquier dispositivo preparado a medida que cumpla con el diagrama de la Figura 1. La mayoría de estos dispositivos cromatográficos se diseñan para hacer funcionar una sola unidad cromatográfica (es decir, una columna o membrana) . Con una simple adaptación, puede hacerse una conexión adicional para colocar la primera unidad de intercambio iónico después de la bomba A y antes de la cámara de mezcla.

La Figura 1 presenta la configuración básica. La conexión en línea en serie de dos dispositivos cromatográficos más un prefiltro opcional en la posición que se muestra en la Figura 1, puede llevar ocasionalmente a una constitución de presión no deseable. Por tanto, bajo algunas condiciones, las adaptaciones técnicas adicionales (por ejemplo, una bomba adicional después de la unidad AEX y un dispositivo reductor de presión antes de la unidad AEX) también pueden incluirse en este diagrama.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Una unidad operativa única que comprende tanto una parte de cromatografía de intercambio aniónico como una parte de cromatografía de intercambio catiónico. El tampón A es un tampón de acondicionado y lavado adecuado para la operación óptima de la etapa AEX. El tampón B contiene una solución ácida y se mezcla en una proporción con respecto a la carga/tampón A necesaria para obtener condiciones óptimas para la operación de la etapa MiMo . La proporción de mezcla puede ejecutarse usando un flujo de mezcla volumétrico fijo o puede controlarse automáticamente mediante un bucle de retroalimentación basado, por ejemplo, en un rendimiento de pH. CM es una cámara de mezcla opcional, que puede contener cualquier tipo de mezcla estática.

C = Carga BA = Bomba A BB = Bomba B AEX = unidad de intercambio aniónico MiMo = unidad de intercambio catiónico pH = sensor de pH s = sensor de conductividad PF = prefiltro opcional EJEMPLOS Materiales y métodos: Todos los experimentos se realizaron usando una IgG producida por una línea celular CHO. El cultivo se realizó en modo XD®, (véase Genetic Engineering & Biotechnology news, 1 de abril 2001, N° 7) usando un medio químicamente definido.

La clarificación y captura de la extracción de XD® crudo se realizó como una sola etapa usando tecnología Rhobust® EBA con Proteína A (véase Innovations in Pharmaceutical Technology, marzo 2011) . El producto se eluyó con NaCl 35 mM, acetato 0,1 M, tampón de elución pH 3,0. El eluato contenía IgG 5 g/1 y se conservó a 2-8 °C.

Con el material así obtenido, se realizaron 6 experimentos: 1. Establecer las condiciones de la unión preferencial de agregados en una cromatografía MiMo usando una resina de hidroxiapatita (Experimento 1). 2. Desarrollar una cromatografía MiMo usando una resina de hidroxiapatita en modo de flujo de paso con una mezcla en línea (Experimento 2) . 3. Combinar cromatografía AEX y MiMo usando una resina de hidroxiapatita como una unidad operativa única (Ejemplo 1) . 4. Establecer condiciones óptimas en la cromatografía MiMo usando una resina HIC aniónica en modo de flujo de paso (Experimento 3) . 5. Desarrollar una cromatografía MiMo usando una resina HIC aniónica en modo de flujo de paso con mezcla en línea (Experimento 4) . 6. Combinar cromatografía AEX y MiMo usando una resina HIC aniónica como una operación de unidad única (Ejemplo 2) .

Las condiciones óptimas para la cromatografía AEX en modo de flujo de paso se determinaron previamente y se aplicaron en los experimentos del Ejemplo 1 y Ejemplo 2.

La concentración de proteína (producto) se determinó con espectroscopia UV/Vis midiendo la absorbancia a 280 nm (A280) y un coeficiente de extinción de 1,63.

Se determinaron las concentraciones de agregados e IgG monoméricos por cromatografía de exclusión de tamaño (HP-SEC) de acuerdo con procedimientos convencionales.

La HCP se midió con el ensayo ELISA CHO HCP, 3G (Cygnus Technologies) Experimento 1.

Establecimiento de las condiciones para la unión preferencial de agregados en una cromatografía MiMo usando una resina de hidroxiapatita Para este experimento, la IgG prepuri ficada se diluyó con agua desmineralizada hasta alcanzar una conductividad de = 5 mS/cm y se ajustó a pH 6,5 usando Tris 2 M pH 9,0. La cromatografía MiMo en el modo de unión-elución se llevó a cabo. Una columna VL11 (Millipore) cargada con una longitud de lecho de 4 cm de HA Ultrogel® Hidroxyapatite Chromatography Sorbent (Pall, Life Sciences) se utilizó en un Á TA explorer. La columna se equilibró y se lavó con fosfato de sodiolO mM, pH 7,0 y a un caudal de 3 ml/min. El producto se cargó a un caudal de 2 ml/min. La carga inicial contenía 2,6 g/1 de IgG y una cantidad inicial de agregados de 2,2 %.

Después de la carga, el producto se eluyó en un gradiente lineal de 0 a 100 % con fosfato de sodiolO mM, pH 7,0 (tampón A) y fosfato de sodiolO mM, NaCl 1 M, pH 7,0 (tampón B) .

Las fracciones durante la etapa de elución se recogieron y se analizaron para determinar la presencia de agregados y contenido de proteína (producto) en función de la conductividad .

Tabla 1. Elución de agregado en una resina de hidroxiapatita con un tampón de fosfato de sodio/ cloruro de sodio a diferentes conductividades Conductiv Agregados [IgG] Fracción idad mS/cm % g/i Al 7,3 0 0, 15 A2 12,5 0 0, 28 A3 17, 5 0 0,42 A4 22,3 0 0, 60 A5 26, 9 0,10 0, 69 A6 32, 6 0,77 0,59 A7 36, 2 1, 58 0,43 A8 40,6 2, 82 0,26 Los resultados analíticos de las muestras (mostrados en la Tabla 1) indican claramente que hasta un valor de conductividad de 26,9 mS/cm, el eluado no contiene o contiene cantidades insignificantes de agregados.

Experimento 2.

Eliminación de agregados en la cromatografía MiMo usando una resina de hidroxiapatita en modo de flujo de paso con una mezcla en línea Para este experimento, se diluyó la IgG prepurificada con agua desmineralizada hasta alcanzar una conductividad de 2,4 mS/cm y se ajustó a un pH 7,4 usando un tampón Tris 2 M pH 9,0. Una columna VL11 (Millipore) cargada con una longitud de lecho de 4 cm de HA Ultrogel® Hidroxyapatite Chromatography Sorbent (Pall, Life Sciences) se usó sobre un ÁKTA explorer. La columna se equilibró con agua desmineralizada y fosfato de sodiolO mM, NaCl 0,8 M, pH 7,4 (tampón B) . El agua desmineralizada y el tampón B se mezclaron en línea a una proporción de volumen fija del tampón B del 30 %, a un caudal de 5 ml/min. Después del equilibrado, el producto se cargó. Durante la carga el flujo del producto se mezcló en línea con el tampón B para ajustar la conductividad a un valor de 25 mS/cm. El flujo del producto y el tampón B se mezclaron a una proporción de volumen fija del tampón B del 30 %, a un caudal de 1 ml/min. La carga inicial contenía 0,78 g/1 de IgG y una cantidad inicial de agregados de 2,97 % Las fracciones de flujo de paso se recogieron y analizaron para determinar la presencia de agregados y contenido de proteína (producto).

Tabla 2. Eliminación de agregados en una resina de hidroxiapatita en modo de flujo de paso con una mezcla en línea de un tampón de fosfato de sodio/cloruro de sodio Agregados Total [IgG] Fracción % g/i Al 0, 00 0, 00 A2 0, 00 0, 11 A3 0, 32 0, 32 A4 0,42 0, 47 A5 0, 50 0, 58 A6 0, 55 0, 65 A7 0, 64 0, 69 A8 0, 69 0,71 A9 0,79 0,713 A10 0, 85 0,73 All 0, 82 0,74 Al2 0, 95 0, 737 Los resultados analíticos de estas muestras (mostradas en la Tabla 2) indican claramente la eliminación de agregados a = 1 % usando una resina de hidroxiapatita en modo de flujo de paso con una mezcla en línea de la carga que contenía el producto con fosfato de sodiolO mM, NaCl 0,8 M, pH 7,4 a una proporción de volumen fija del 30 %.

Ejemplo 1.

Purificación de IgG con cromatografía AEX y MiMo usando una resina de hidroxiapatita como una unidad operativa única Una unidad AEX y una unidad MiMo se acoplaron en serie como se representa en el diagrama de la Figura 1 usando un ÁKTA explorer. Para la AEX, se utilizó una cápsula Sartobind Q ( 1 mi ) y para la MiMo se usó una columna VL11 (Millipore) con una longitud de lecho de 4 cm de HA Ultrogel® Hydroxyapatite Chromatography Sorbent (Pall, Life Sciences). Para acondicionar antes de cargar el producto y¦ antes de conectar la unidad AEX, la unidad MiMo se equilibró con agua desmineralizada (bombeada con la bomba A) y fosfato de sodiolO mM, NaCl 0,8 M, pH 7,4 (tampón B). El agua desmineralizada y el tampón B se mezclaron en línea a una proporción de volumen fijo del 30 % del tampón B, a un caudal de 5 ml/min. La unidad AEX se lavó con agua abundante y se equilibró antes de conectarla al sistema con 100 mi tampón Tris 0,05 M, pH 7,4. Puede llevarse a cabo un experimento en el que el equilibrado de cada unidad no se realice por separado .

Para este experimento, la IgG prepuri ficada se diluyó coa agua desmineralizada hasta alcanzar una conductividad de 2,4 mS/cm. El pH se ajustó a 7,4 usando un tampón Tris 2 M pH 9,0 y se filtró sobre 0,22 µ??. La carga de la IgG prepuri ficada se inició por bombeo a una velocidad de 1 ml/min. El tampón B se bombeó al mismo caudal a una proporción de volumen del 30 % . Se cargó una cantidad de 240 mi que. contenía 0,6 g/1 de IgG. Después de completar la carga, la unidad AEX se retiró para comenzar el lavado. Puede realizarse un experimento en el que la unidad AEX no requiera ser retirada para el lavado. La unidad MiMo se lavó con un gradiente lineal del 0 al 30 % de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4 (tampón A) y tampón B y se separó con un fosfato de sodio 0,5 M, NaCl 1,5 y tampón a pH 6,8. La carga, el flujo de paso y el lavado se analizaron para detectarla presencia de agregados, contenido de HCP y. proteína (producto). La carga tenía una concentración HCP de 2179 ng/mg de IgG. El flujo de paso más las fracciones de lavado tenían una concentración de HCP de 447 ng/mg de IgG. La cantidad de agregados en la carga fue de 2,93 % y fue de 0,76 % en el flujo de paso más lavado. El separado contenía 54,97 % de agregados. La recuperación total del producto en el flujo de paso más el lavado fue 88,2 % y 90 % en el flujo de paso más lavado más separado.

Este experimento mostró que una pureza final ¦ del material -de anticuerpo del 99,2 % se consigue mediante el uso de una cromatografía de intercambio aniónico en línea en serie seguido por cromatografía MiMo ( hidroxiapatita ) que actúa como una operación de unidad única cuando la mezcla de separación se complementa en línea con una cantidad adecuada de una solución de ajuste adecuada. La pureza inicial de la carga fue del 97 %.

Experimento 3.

Establecimiento de las condiciones óptimas en la cromatografía MiMo usando una resina aniónica HIC en el modo de flujo de paso Para este conjunto de experimentos la IgG prepuri ficada se diluyó con agua desmineralizada hasta alcanzar una conductividad de 2,29 mS/cm. El pH se ajustó a pH 7,4 usando un tampón Tris 2 M pH 9,0. Se usó una columna VL11 (Millipore) cargada con una longitud de lecho de 6,3 Capto™ adhere (GE Healthcare) en un ÁKTA explorer. La columna se equilibró y se lavó con fosfato de sodio25 mM, pH 7,4, (tampón A) y fosfato de sodiolOO mM, pH 7,4 (tampón B) . El tampón A y el tampón B se mezclaron en línea a 0, 5, 15 y 25 % de proporción de volumen a un caudal de 5 ml/min como desarrollos independientes. Después del equilibrado, el producto se cargó. Durante la carga el caudal del producto se mezcló en linea con el tampón B. El flujo del producto y el tampón B se mezclaron en línea a una proporción de volumen de 0, 5, 15 y 25 % de tampón B a un caudal de 3 ml/min como desarrollos independientes. La carga inicial contenía 1,09 g/l de IgG antes de la dilución debido a una mezcla en línea con el tampón B y una cantidad inicial de agregados de 3,13 %. La columna se separó con un tampón pH 3,0 de fosfato de sodiolOO mM.

Las fracciones de flujo de paso a diferentes proporciones del tampón B se recogieron y analizaron para detectar la presencia de agregados y el contenido de proteína ( producto ) .

Tabla 3. Depuración de agregados en una resina aniónica HIC MiMo en el modo de flujo de paso usando un tampón fosfato de sodio a diferentes proporciones Agregados en Total [IgG] Tampón B FP % % mg/Ml 0 1,15 1,04 5 0, 23 0, 88 15 0, 18 0, 82 25 0, 17 0,76 Los resultados analíticos de las muestras (mostrados en la Tabla 3) indican claramente la retirada de agregados a < 1 % en una resina aniónica-HIC MiMo cuando el producto gue contiene una carga se mezcla en línea con un tampón de ajuste de sal fosfato.

Experimento 4.

Eliminación de agregados en cromatografía MiMo usando una resina aniónica HIC en modo de flujo de paso con mezcla en línea Para este experimento, la IgG prepurificada se diluyó con agua desmineralizada hasta alcanzar una conductividad de 2,4 mS/cm y se ajustó a un pH 7,4 usando un tampón Tris 2 M pH 9,0. Se usó una columna VL11 (Millipore) cargada con una longitud de lecho de 6,3 Capto™ adhere (GE Healthcare) en un ÁKTA explorer. La columna se equilibró y se lavó con fosfato de sodio25 mM, pH 7,4, (tampón A) y fosfato de sodio 100 mM, pH 7,4 (tampón B) . El tampón A y el tampón B se mezclaron en línea a una proporción de volumen fija de tampón B de 15 %, a un caudal de 5 ml/min. Después del equilibrado, el producto se cargó. Durante la carga el flujo del producto se mezcló en línea con el tampón B. El flujo del producto y el tampón B se mezclaron en línea a una proporción de volumen fija de 15 % de tampón B a un caudal de 3 ml/min. La carga inicial contenía 0,93 g/1 de IgG y una cantidad inicial de agregados de 3,15 %. La columna se separó con un tampón de fosfato de sodiolOO mM, pH 3,0.

Tabla 4. Depuración de agregados en una resina MiMo aniónica HIC en modo de flujo de paso con mezcla en linea de un tampón fosfato de sodio Agregados en Fracciones Total [IgG] FP A2 0, 00 0, 011 A3 0, 00 0, 054 A4 0, 23 0,204 A5 0,19 0, 456 A6 0,16 0, 659 B7 0, 16 0,761 B6 0, 15 0, 829 B5 0, 17 0, 853 B4 0, 16 0,852 B3 0, 17 0, 859 B2 0, 16 0,865 Bl 0, 19 0, 861 Cl 0,18 0, 853 C2 0, 22 0,856 C3 0,20 0, 855 Los resultados analíticos de estas muestras (mostrados en la Tabla 4 ) indican claramente la eliminación de agregados a = 1 % en el flujo de paso a través del desarrollo en una resina MiMo HIC aniónica en modo de flujo de paso con la mezcla en línea de un fosfato de sodiolOO mM pH 7,0a una proporción de volumen fija del 30 %. El porcentaje de agregados es el flujo de paso en bruto del 0,18 %.

Ejemplo 2.

Purificación de IgG con cromatografía AEX y MiMo usando una resina HIC aniónica como una unidad operativa única Una unidad AEX y una unidad MiMo se acoplaron en serie como se representa en el diagrama de la Figura 1 usando un ÁKTA explorer. Para AEX, se usó una cápsula Sar.tobind Q (1 mi) y para la MiMo se usó una columna VL11 (Millipore) cargada con una longitud de lecho de 6,3 de Capto™ adhere (GE Healthcare) . Para acondicionar antes de cargar el producto y antes de conectarla unidad AEX, la unidad MiMo se equilibró con fosfato de sodio25 mM, pH 7,4 (tampón A) y fosfato de sodiolOO mM, pH 7,4 (tampón B) . El tampón A y el tampón B se mezclaron en línea a una proporción de volumen fija de 15 % de tampón B a un caudal de 5 ml/min. La unidad AEX se lavó con abundante agua y se equilibró antes de conectarla al sistema con 100 mi de Tris 0,05 M, tampón pH 7,4. Se puede realizar un experimento en el que el equilibro de cada unidad no se realiza por separado.

Para este experimento la IgG prepurificada se diluyó con agua desmineralizada hasta alcanzar una conductividad de 2,29 mS/cm. El pH se ajustó a un pH 7,4 usando un tampón Tris 2 M pH 9,0 y se filtró sobre 0,22 µp?. La carga de la IgG prepurificada se inició por bombeo a un caudal de 3 ml/min. El tampón B se bombeó al mismo caudal a una proporción de volumen de 15 %. Se cargó una cantidad de 479 mi que contenia 0,91 g/1 de IgG. Después de completar la carga, la unidad AEX se retiró y el flujo se cambió de nuevo al tampón A y la linea se cebó para comenzar el lavado. Se puede realizar un experimento en el que la unidad AEX no necesita retirarse para el lavado. Después del lavado, la unidad MiMo se separó añadiendo un tampón de fosfato de sodio 100 mM, pH 3,0 mediante la bomba A y se detuvo la bomba B. La carga, el flujo de paso y el lavado se analizaron para detectar la presencia de agregados, contenido de HCP y contenido de proteina (producto). La carga tenia una concentración HCP de 1711 ng/mg de IgG. El flujo de paso más las fracciones de lavado obtuvieron una concentración HCP de 206 ng/mg de IgG. La cantidad de agregados en la carga fue 3,13% y 0,18 % en el flujo ce paso más el lavado. El separado contenia 14,23 % de agregados. La recuperación total de producto en el flujo de paso más el lavado fue 82,9 % y 99,9 % en el flujo de paso más lavado más separado. Este experimento muestra que una pureza final del material del anticuerpo del 99,72 % se consigue mediante el uso de una cromatografía de intercambio aniónico en línea en serie seguida por una cromatografía MiMo (HIC aniónica) que actúa como una unidad de operación única cuando la mezcla de separación se complementa en línea con una cantidad adecuada de solución de ajuste adecuada. La pureza inicial de la carga fue de 96,8 %.

Abreviaturas usadas A280 absorción (luz) a 280 nm AEX intercambio aniónico Células BHK células renales de cría de hámster Células CHO células de ovario de hámster chino EBA adsorción de perlas expandidas HCP proteina de células hospedadoras HIC cromatografía de interacción hidrófoba HPLC cromatografía líquida a alta presión IgG inmunoglobulina G MiMo modo mixto TFF filtración de flujo tangencial Tris tris ( hidroximeti 1 ) metilamina

Claims (10)

NOVEDAD DE IA INVENCOÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes. REIVINDICACIONES

1.- Método de purificación de anticuerpos de una mezcla de proteínas producida en un biorreactor, comprendiendo al menos las etapas de purificación intermedia y pulido, caracterizado por que las etapas de purificación intermedia y pulido comprenden cromatografía de intercambio aniónico (AEX) en línea en serie y cromatografía en modo mixto (MiMo) en serie ambas en modo de flujo de paso, caracterizado por que la etapa AEX produciendo una mezcla de separación que contiene anticuerpos como una fracción de flujo de paso, caracterizado por que la mezcla de separación está sometida a una etapa MiMo sin almacenamiento intermedio, produciendo una preparación de anticuerpos purificada como una fracción de flujo de paso y caracterizado por que la preparación de anticuerpos purificada se somete a. al menos una etapa de purificación adicional, caracterizado por que la mezcla de separación antes de la etapa MiMo se complementa con una cantidad adecuada de una solución de ajuste adecuada para ajusfar el pH y/o conductividad y/o concentración o tipo de componentes iónicos específicos para la retirada de impurezas de los anticuerpos en la etapa MiMo.

2. - Método según la reivindicación 1 caracterizado por que la cromatografía de intercambio aniónico y la cromatografía en modo mixto se producen en dos dispositivos independientes que están conectados en serie.

3. - Método según la reivindicación 1 caracterizado por que la AEX en línea en serie y la MiMo se realizan como una unidad operativa única.

4.- Método según una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado por que la mezcla de separación antes de la MiMo se complementa con una cantidad adecuada de sal o una combinación de sales.

5. - Método según la reivindicación 4 caracterizado por que la mezcla de separación antes de MiMo se complementa con una cantidad adecuada de sulfato de amonio, sulfato de sodio, sulfato¦ de potasio, fosfato de amonio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, fluoruro de potasio y cloruro de sodio.

6. - Método según la reivindicación 1 a 3 caracterizado por que la mezcla de separación antes de la cromatografía MiMo se complementa con una cantidad adecuada de una solución ácida .

7. - Método según la reivindicación 6 caracterizado por que la mezcla de separación antes de la cromatografía MiMo se complementa con una cantidad adecuada de una solución que contiene ácido cítrico (o sus sales monobásicas o dibásicas de sodio o potasio), ácido fosfórico (o sus sales monobásicas o dibásicas de sodio o potasio) , ácido acético, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico.

8. - Método según una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado por que la mezcla de separación antes de la cromatografía en modo mixto se complementa con una cantidad adecuada de una solución alcalina.

9. - Método según la reivindicación 8 caracterizado por que la mezcla de separación antes de la cromatografía MiMo se complementa con una cantidad adecuada de una solución que contiene hidróxido de sodio o de potasio (o sus sales mono o dibásicas de sodio o potasio) o tris ( hidroximeti 1 ) aminometano.

10. - Una unidad operativa única que puede usarse en un método según una de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende tanto una parte de la cromatografía de intercambio aniónico como una parte de la cromatografía en modo mixto, que están conectadas en serie, caracterizado por que la salida de la parte de la cromatografía de intercambio aniónico está conectada a la entrada de la parte de la cromatografía en modo mixto, caracterizado por que la unidad comprende una entrada en el extremo aguas arriba de la parte de cromatografía de intercambio aniónico y una salida en el extremo aguas abajo de la parte de cromatografía en modo mixto y caracterizado por que la unidad también comprende una entrada entre la parte de cromatografía de intercambio aniónico y la parte de cromatografía en modo mixto.