CN103619868A

CN103619868A - 单一单元色谱抗体纯化

Info

Publication number: CN103619868A
Application number: CN201280029638.7A
Authority: CN
Inventors: 亨德瑞克·E·温斯特拉; 迪德里克·R·克里玛; 玛利亚·佩拉斯卡·伊斯拉斯; 马克·K·道伊文
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DPx Holdings BV
Priority date: 2011-06-16
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2014-03-05
Also published as: EA201400024A1; WO2012171853A1; CL2013003596A1; KR20140033126A; CA2838476A1; MX2013014615A; EP2721052A1; JP2014529330A; US20140187749A1; AU2012269240A1; AU2012269240B2; BR112013031906A2; AR086938A1; IL229763A0

Abstract

本发明涉及一种从生物反应器中生产的蛋白质混合物中纯化抗体的方法，该方法至少包含中间纯化步骤和精提纯步骤，其中所述中间纯化步骤和精提纯步骤包括流过模式的顺次连接的阴离子交换色谱（AEX）处理和混合模式色谱（MiMo）处理。本发明还涉及一种单一操作单元，其包括串联连接的阴离子交换色谱部分和混合模式色谱部分二者，其中所述单元包括在所述阴离子交换色谱部分的上游端的入口和在所述混合模式色谱部分的下游端的出口，并且其中所述单元还包括位于所述阴离子交换色谱部分和所述混合模式色谱部分之间的入口。

Description

单一单元色谱抗体纯化

本发明涉及单一单元纯化抗体的方法以及可以用在该方法中的装置。

用于医药应用的由细胞培养物生产的单克隆抗体的纯化是包含大量步骤的过程。这种抗体必然要摆脱所有潜在有害的污染物，诸如源自生产这些抗体的细胞的蛋白质和DNA、例如胰岛素的培养基组分、PEG醚类和消泡剂以及任何可能的感染试剂如病毒和朊病毒（prion）。

从生产这些蛋白质的细胞的培养物中纯化抗体的典型过程在BioPharmInternational June1,2005,Downstream Processing of Monoclonal Antibodies:from High Dilution to High Purity中有所描述。

因为抗体由诸如为杂交瘤细胞或转化宿主细胞（如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤衍生的NS0细胞、幼年仓鼠肾细胞、人类视网膜衍生的细胞）的细胞生产，所以必须从细胞浆液中优选在纯化过程初期去除颗粒状细胞材料。该过程的这个部分在本文中被称为“澄清”。随后或者作为澄清步骤的一部分，抗体被粗略纯化至至少约80%，通常是通过“结合加洗脱”色谱步骤（在IgG的情况下通常使用固定的蛋白质A）。这个在本文中被称为“捕集“的步骤不仅导致抗体的初期大幅纯化，还可以导致体积大幅下降，因而产品浓缩。用于捕集的其他替代方法例如为膨胀床吸附（EBA）、2-相液体分离（利用例如聚乙二醇）或采用易溶盐（lyotropic salt，诸如硫酸铵）的分级沉淀。

澄清和捕集之后，对抗体进行进一步纯化。通常，为了充分地去除残余杂质，在捕集之后的至少两个色谱步骤是必需的。捕集之后的色谱步骤通常被称为中间纯化步骤，而最终的色谱步骤通常被称为精提纯（polishing）步骤。这些步骤中的每一个通常以间歇模式作为单一单元操作进行，并且这些步骤中的至少一个通常以“结合加洗脱”模式进行。此外，每一个色谱步骤都需要特定的负载条件，例如pH、传导率等等。因此，为了将负载调节至所需要的条件，在每个色谱步骤之前必须进行额外的处理。上述所有这些使得该过程是耗时耗力的。在这些步骤中通常被大体去除的杂质都是过程衍生污染物，诸如宿主细胞蛋白质、宿主细胞核酸、培养基组分（如果存在）、蛋白质A（如果存在）、内毒素（如果存在）和微生物（如果存在）。最近的专利出版物中已经描述了一些这样纯化抗体的方法。

WO2010/062244涉及用于分离和纯化蛋白（如单克隆抗体）的双水相萃取加强的沉淀方法。对于随后的进一步纯化抗体，描述了两种备选方案：（1）以结合和洗脱的方式的阳离子交换色谱，然后以流过模式的阴离子交换，或（2）首先是以流过模式的多模式色谱（或混合模式），然后是以流过模式的阴离子交换色谱。备选方案（2）的两个色谱单元不以一个单独的单元操作进行操作，并且都不用于精提纯目的。

WO2005/044856涉及使用羟基磷灰石树脂（任选地结合阴离子交换色谱）从抗体制剂中去除高分子量聚集物。其中将两种色谱处理都描述为流过方法，但是将两种色谱处理描述为以分开的操作进行。

WO2011/017514涉及抗体和含有Fc的其他蛋白的纯化，其通过顺次连接的阳离子和阴离子交换色谱步骤来实现。两种色谱处理通常都以结合-洗脱分离来进行，但是第二个步骤可以流过方法来操作。

WO2005/082483涉及通过两个随后的混合模式色谱步骤来进行的抗体纯化，其中第一步中的色谱材料是混合模式阳离子交换树脂，所述混合模式阳离子交换树脂具有可结合抗体的阳离子交换基和芳基；第二步中的色谱材料是混合模式阴离子交换树脂。第二个色谱步骤可以流过模式进行。以分开的操作描述两个色谱步骤。

上述方法的缺点在于：操作时间长、可变成本高和固定成本高（由于劳动力成本）。

根据本发明的一种实施方式，可以通过使用串联的顺次连接(in-line)的阴离子交换色谱（AEX）和混合模式（MiMo）色谱二者以流过模式来实现从细胞培养物生产的抗体中非常有效地去除残余杂质。在MiMo色谱步骤之前的AEX步骤中的流过的在线调节（in-line conditioning）（例如，通过合适的缓冲液的混合）用来将流过调节至适于MiMo色谱的pH和传导率的恰当条件。

该新颖方法优点是：相当大程度地降低了操作时间以及劳动和因此的操作成本。此外，需要较小的（因而成本较低的）色谱单元，这是因为所有单元以流过模式操作，从而仅需要足够的结合杂质而非结合产物的能力。

因此，本发明可被定义为一种从生物反应器中生产的细胞浆液（cellbroth）中纯化抗体的方法，该方法至少包含中间纯化步骤和精提纯步骤，其中新颖的纯化步骤包括组合的串联的顺次连接的AEX和MiMo色谱处理。这可通过应用AEX色谱步骤和随后的MiMo色谱步骤来实现，所述AEX色谱步骤产生流过级分形式的分离混合物，所述MiMo色谱步骤产生流过级份形式的经纯化的抗体制剂，并且其中所述经纯化的抗体制剂进行至少一个进一步的纯化步骤。

因此，在本发明的上下文中，“分离混合物”是指从本发明的第一色谱步骤中得到的溶液，“经纯化的抗体制剂”是指从本发明的第二色谱步骤中得到的溶液。本申请通篇采用这个术语。

在第一色谱步骤之前，通常对在生物反应器中生产的细胞浆液进行澄清（即除去所有细胞材料，诸如全细胞和细胞碎片）。

而且，在第一色谱步骤之前，可以将调节溶液添加到细胞浆液中或含抗体的溶液中从而确保用于这个第一色谱步骤的最佳的pH和传导率条件。

在一种具体实施方式中，根据本发明的方法包括AEX与MiMo的组合色谱作为单一单元操作进行。

在上下文中，如果本发明中有“抗体”和复数形式的“抗体”，是指能特异性结合抗原的任何蛋白质。在其天然形式时，抗体（或免疫球蛋白）是被分泌进血液或淋巴中响应抗原刺激物（比如细菌、病毒、寄生虫或移植器官）并通过与抗原特异性结合而消灭抗原的在B细胞表面上的Y型蛋白。本文中使用的术语抗体还包括天然或人工抗体的结合抗原部分。术语抗体还包括非天然的（因此是人工的）蛋白质，其基于类似于天然抗体的相互作用机制而能与抗原特异性结合；并因而还包括嵌合抗体，其由例如源自一种物种（例如小鼠）的结合抗原部分和源自其他物种（例如人）的不结合抗原部分组成。

“混合模式色谱（MiMo）”是指下述色谱类型，其利用其中针对蛋白的吸附和/或解吸附发生超过一种相互作用的材料。这些相互作用可以是下述类型：阴离子的、阳离子的、疏水性的、亲和性的、π-π、嗜硫的、尺寸排阻。混合模式材料的熟知的例子是羟基磷灰石（金属亲和性、阴离子和阳离子相互作用）、Capto^TM粘附（阴离子和疏水性相互作用）和MEPHyperCel^TM（阳离子和疏水性相互作用）。

“串联顺次连接的AEX和MiMo”是指，AEX和MiMo以AEX装置的流出物不经中间存储而进料到MiMo装置的方式串联连接。

“流过级份”在本文中是指，被加载的含抗体级份的至少一部分，其以与洗脱流体基本上相同的速度离开色谱柱。这个级份在洗脱期间基本上未保留在柱上。因此，选择条件，结果使得杂质而非抗体被结合到各自的色谱材料上。

我们已经发现，为了大规模生产的目的，本发明的方法（采用流过模式）与采用结合并洗脱所需抗体的现有公开方法相比提供远远更快的分离。

根据本发明，在线调节含有抗体的分离混合物。为此，分离混合物可用适当量的合适的调节溶液来补充，以改变其组成和/或性质，比如pH和/或传导率和/或具体离子组分的存在性和量，用于在根据本发明第二色谱步骤中优化性能。

上文引用的现有技术文献都没用应用或建议两个色谱步骤之间的在线调节，并且令人吃惊地发现，根据本发明在开始第二色谱步骤之前，可用在线调节液体（分离混合物）来实现非常好的分离结果。

因此，本发明涉及用于从生物反应器中生产的蛋白质混合物中纯化抗体的方法，该方法至少包含中间纯化步骤和精提纯步骤，其中所述中间纯化步骤和精提纯步骤包括：串联的顺次连接的阴离子交换色谱（AEX）处理和随后的混合模式色谱（MiMo）步骤，所述阴离子交换色谱处理产生流过级分形式的分离混合物，所述混合模式色谱步骤产生流过级份形式的经纯化的抗体制剂，并且，其中对经纯化的抗体制剂进行至少一个纯化步骤，其中在混合模式色谱之前用适当量的合适的调节性溶液补充分离混合物，以调节pH和/或传导率和/或具体离子组分的浓度或类型，用于在混合色谱步骤中从抗体中去除杂质。

术语“调节溶液（conditioning solution）”或“调节性溶液（adjustingsolution）”互换使用，并且在本文中表示，在将分离混合物进料到根据本发明的第二（MiMo）色谱步骤之前，添加到分离混合物中的溶液。

本文中“适当量的合适的调节性溶液”，表示当与分离混合物混合时会使得大多数相关杂质吸附到MiMo材料上而不会促使产物大量结合的任何酸性、中性或碱性溶液，所述溶液任选地含有一种或多种盐或任何其他添加剂。对于每一纯化方法，必须确定调节性溶液中的最优pH、优选的盐体系类型和最优量。

优选地，所述溶液的pH将与含有抗体的分离混合物的pH相同，并且最优传导率值将是添加适当量的一种或多种盐或稀释在分离混合物中存在的盐的结果。该盐的阴离子可以优选选自由磷酸根离子、硫酸根离子、乙酸根离子、氯离子、溴离子、硝酸根离子、氯酸根离子、碘离子和硫代氰酸根离子组成的组。该盐的阳离子可以优选选自由铵离子、铷离子、钾离子、钠离子、锂离子、镁离子、钙离子和钡离子组成的组。优选的盐是硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾、氯化钾和氯化钠。可使用的其他添加剂是乙醇、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇或本领域中已知的用来优化MiMo色谱步骤的任何其他化合物。

酸性调节性溶液的酸性组分可以是选自下述化合物的组分，所述化合物比如柠檬酸（或其单钠或单钾盐或二钠或二钾盐）、磷酸（或其单钠或单钾盐或二钠或二钾盐）、乙酸、盐酸、硫酸。

用于碱性调节性溶液的碱性组分可以是选自下述化合物的组分，所述化合物比如氢氧化钠或氢氧化钾（或其单取代或二取代的钠盐或钾盐）、三(羟甲基)氨基甲烷，但也可使用本领域中已知的任何其他碱性组分。

优选地，所需的调节性溶液将以小的量来进行补充，以得到最小稀释度的产物。

优选地，用适当量的适当的调节性溶液补充分离混合物是单一单元操作的一部分，例如在MiMo色谱步骤之前在工艺流中（例如在混合室中）例如在线混合所提到的调节溶液。

根据本发明的AEX色谱可以在AEX单元中进行，这可以通过经典的含有树脂的填充床柱子、含有整体材料的柱子、含有适当色谱介质的径向柱子、吸附膜单元、或者本领域已知的具有起阴离子交换剂作用的适当介质和配体的任何其他阴离子交换色谱装置来实现。在AEX柱中，色谱材料可以是其上附有或强或弱的阳离子配体的颗粒支撑材料形式。膜形式的阴离子交换剂由其上附有或强或弱的阳离子配体的一个或多个片材形式的支撑材料组成。支撑材料可以包括有机材料、或无极材料、或有机和无机材料的混合物。适当的有机材料是琼脂糖基介质和甲基丙烯酸酯。适当的无极材料是硅石、陶瓷和金属。膜形式阴离子交换剂可由含有AEX配体的亲水聚醚砜构成。适当的强AEX配体例如基于季胺基团。适当的弱AEX配体例如基于伯、仲或叔胺基团或本领域已知的任意其他适当配体。

根据本发明的MiMo色谱可以在MiMo单元中进行，这可以通过经典的含有树脂的柱子、基于整体材料的柱子、含有适当色谱介质的径向柱子、吸附膜单元、或者本领域已知的具有适当起混合模式材料作用的配体的任何其他混合模式色谱装置来实现。在MiMo柱中，色谱材料可以是其上附有MiMo配体的颗粒支撑材料形式。膜状色谱装置由其上附有MiMo配体的一个或多个片材形式的支撑材料组成。支撑材料可以包括有机材料、或无极材料、或有机和无机材料的混合物。适当的有机材料包括例如亲水性碳水化合物（例如交联的琼脂糖、纤维素或右旋糖苷）或合成共聚物材料（诸如聚(烷基天冬酰胺)、甲基丙烯酸2-羟基乙酯和亚乙基二甲基丙烯酸酯的共聚物、或酰基化聚胺）。适当的无机支撑材料例如为硅石、硅石、陶瓷、和金属。膜形式MiMo可由含有MiMo配体的亲水聚醚砜构成。MiMo配体的适当例子是羟基磷灰石、氟磷灰石、4-巯基乙烷基吡啶、正己胺、苯丙胺、2-巯基-5-苯并咪唑磺酸、N-苄基-N-甲基乙醇胺或本领中已知的具有多模态功能的其他配体。

可以根据本发明的方法纯化的抗体是等电pH为6.0或更高、优选7.0或更高、更有选7.5或更高的抗体。这些抗体可以是G类、A类或M类的免疫球蛋白。所述抗体可以是人类的或非人类的（诸如啮齿动物）或嵌合（例如人类化的）抗体，或者可以是上述免疫球蛋白的亚基，或者可以是由免疫球蛋白部分和衍生自或等同于另一蛋白质（非免疫球蛋白）的部分组成的杂交蛋白质。

令人惊讶地，由组合的AEX和MiMo色谱得到的抗体材料通常具有至少98%、优选至少99%、更有选至少99.9%、甚至更有选至少99.99%的非常高的纯度（指蛋白质含量）。

根据本发明的AEX色谱步骤优选在中性或弱碱性pH下实施。其将去除带负电荷的杂质，如DNA、宿主细胞蛋白质、蛋白质A（如果存在）、病毒（如果存在）、蛋白质类培养基组分诸如胰岛素和胰岛素类生长因子（如果存在）。

在MiMo色谱步骤中，将去除大部分剩余的大分子杂质（主要是产物聚集物），该步骤利用下述性质：应用恰当的pH和传导率条件时，它们结合到色谱装置上，与此同时产物流过。

随后，该（高度）纯化的抗体制剂通常不得不通过超滤和渗滤（diafiltration）进行处理，从而除去所有残余的低分子量杂质，用最终的制剂缓冲液替代该缓冲液，并且调节所需要的最终产物浓度。

此外，该纯化的抗体制剂通常还不得不进行处理以确保可能存在的感染性试剂（诸如病毒和/或朊病毒）的完全去除。

本发明还涉及含有阴离子交换色谱部分（AEX）和混合模式色谱部分（MiMo）二者的单一操作单元，这两个部分串联连接。这个单一操作单元还包括在第一离子交换色谱部分的上游端的入口和在第二离子交换色谱部分的下游端的出口。这个单一操作单元还包括位于第一离子交换色谱部分和第二离子交换色谱部分之间的连接部，该连接部进一步包括用于将调节溶液供应到分离混合物的入口。

在根据本发明的工艺过程中，液体流可以通过任何商用双泵色谱系统例如explorer(GE)、BIOPROCESS(GE)、任意双泵HPLC系统、或者任何符合图1的定制的装置（符合图1）来确定。这些色谱装置中的大部分被设计成操作单一色谱单元（即柱或膜）。采用简单适配，可以进行额外连接以将第一离子交换器放置在泵A之后、混合室之前。

图1表示基本结构。以图1所标明的位置进行的两个色谱装置加上可选预过滤器的串联顺次连接可能偶尔导致不希望的压力累积。因此，在一些条件下，额外的技术适配（例如在AEX单元之后的额外的泵和在AEX单元之前的减压装置）可能必须包含在该图中。

附图说明

图1：包含阴离子交换色谱部分和阳离子交换色谱部分二者的单一操作单元。缓冲液A是适用于AEX步骤的最佳操作的调节和冲洗缓冲液。缓冲液B包含酸性溶液，并且以为了获得操作MiMo步骤的最佳条件所必需的比率与负载/缓冲液A混合。该混合比可以利用固定的体积混合流来实现或者可以基于例如pH输出结果通过物料反馈回路自动控制。MC是可选的混合室，其可以包含任何类型的静态混合器。

L=负载

PA=泵A

PB=泵B

AEX=阴离子交换单元

MiMo=阳离子交换色谱单元

pH=pH传感器

σ=传导率传感器

PF=可选的预过滤器

实施例

材料和方法

所有试验都利用由CHO细胞系生产的IgG进行。利用化学上确定的培养基以模式（见，Genetic Engineering & Biotechnology news,Apr 12010,No.7)进行培养。

使用

EBA技术用蛋白A以单一步骤进行粗制

收获物的澄清和捕获（见，Innovations in Pharmaceutical Technology,March2011）。用35mM NaCl、0.1M乙酸盐、pH3.0的洗脱缓冲液洗脱产物。洗脱液中含有5g/L IgG并在2-8℃下存储，

用因此获得的材料，各自进行下述6个实验：1.确定在使用羟基磷灰石树脂的MiMo色谱中的用于聚集物优先结合的条件（实验1）；2.以具有在线混合的流过模式运行使用羟基磷灰石树脂的MiMo色谱（实验2）；3.以单一单元操作的形式将AEX和使用羟基磷灰石树脂的MiMo色谱组合（实施例1）；4.确定在流过模式中使用阴离子-HIC树脂的MiMo色谱的最优条件（实验3）；5.以具有在线混合的流过模式运行使用阴离子-HIC树脂的MiMo色谱（实验4）；6.以单一单元操作的形式将AEX和使用阴离子-HIC树脂的MiMo色谱组合（实施例2）。

先前已测定了以流过模式运行的AEX色谱的最优条件，并且在实施例1和实施例2的实验中应用所述条件。

用UV/可见光分光镜，在280nm和1.63的消光系数下测量吸光值(A²⁸⁰)，测定蛋白质（产物）浓度。

根据标准程序，通过尺寸排阻色谱（HP-SEC）测定单体IgG和聚集物浓度。

用CHO HCP ELISA检测仪，3G（Cygnus Technologies）测量HCP。

实验1

确定用于在使用羟基磷灰石树脂的MiMo色谱中优先结合聚集物的条件。

就该实验而言，将预先纯化的IgG用去矿物质水稀释至≤5mS/cm的传导率并使用pH9.0的2M Tris调节至pH6.5。以结合-洗脱模式进行MiMo色谱。在

探测仪上使用装填有4cm床长度（bed length）的HA

羟基磷灰石色谱吸附剂（Pall,Life Sciences）的VL11（Millipore）柱。并用pH7.0，流速为3mL/min的10mM磷酸钠使柱平衡并洗涤。将产物以2mL/min的流速装载。初始装载物含有2.6g/L的IgG且聚集物的初始量为2.2%。装载之后，用pH7.0的10mM磷酸钠（缓冲液A）和pH7.0的10mM磷酸钠1M NaCl（缓冲液B）以从0到100%的线性梯度洗脱产物。

收集洗脱步骤期间的级份并分析作为传导率函数的存在的聚集物和蛋白质（产物）含量。

表1.用不同传导率的磷酸钠/氯化钠缓冲液在羟基磷灰石树脂中的聚集物洗脱量

（表1所示的）对样品的分析结果清楚地显示高至26.9mS/cm的传导率值，洗脱液不含有聚集物或含有非显著量的聚集物，

实验2

以具有在线混合的流过模式在使用羟基磷灰石树脂的MiMo色谱中去除聚集物。

就该实验而言，将预先纯化的IgG用去矿物质水稀释至2.4mS/cm的传导率并使用pH9.0的2M Tris将pH调节至pH7.4。在探测仪上使用装填有4cm床长度的HA羟基磷灰石色谱吸附剂（Pall,LifeSciences）的VL11（Millipore）柱。用去矿物质水和pH7.4的10mM磷酸钠0.8M NaCl（缓冲液B）平衡柱。以5mL/min的流速、30%缓冲液B的固定体积速率在线混合去矿物质水和缓冲液B。平衡之后，装载产物。装载期间，在线混合产物流和缓冲液B，以将传导率调节至值为25mS/cm。产物流和缓冲液B以1mL/min流速、30%缓冲液B的固定体积比率混合。初始负载物含有0.78g/L的IgG且聚集物的初始量为2.97%。

收集流过级份并分析存在的聚集物和蛋白质（产物）含量。

表2.以具有磷酸钠/氯化钠缓冲液的在线混合的流过模式在羟基磷灰石树脂中的聚集物清除率

（表2中所示的）这些样品的分析结果清楚地显示聚集物的去除达到了≤1%的程度，所述聚集物的去除以将含有产物的负载物与固定体积比率为30%的pH7.4的10mM磷酸钠0.8M NaCl进行在线混合，使用流过模式的羟基磷灰石树脂来进行。

实施例1

用作为单一单元操作的AEX和使用羟基磷灰石树脂的MiMo色谱对IgG进行纯化

使用

探测仪如图1图表所描绘的串联连接AEX单元和MiMo单元。对于AEX而言，使用Sartobind Q胶囊（1mL），对于MiMo而言，使用装填有4cm床长度的HA羟基磷灰石色谱吸附剂（Pall,Life Sciences）的VL11（Millipore）柱。对于在产物装载和连接AEX单元之前的调节而言，用（泵A抽吸的）去矿物质水和pH7.4的10mM磷酸钠0.8M NaCl（缓冲液B）平衡柱。以5mL/min的流速、30%缓冲液B的固定体积比率在线混合去矿质物质水和缓冲液B。在将AEX单元与系统连接之前，将其用100mL的0.05M Tris pH7.4缓冲液冲洗并平衡AEX单元。也可进行其中每一单元的平衡不分开进行的试验。

对于该实验而言，用去矿物质水将预先纯化的IgG稀释至传导率为2.4mS/cm，使用2M Tris pH9.0缓冲液将pH调节至pH7.4并在0.22μm上过滤。通过以1mL/min的速率抽吸，启动预先纯化的IgG的负载。以相同的流速以30%体积比率抽吸缓冲液B。240mL量的含有0.6g/L的IgG被负载。完成负载之后，去除AEX单元以开始洗涤。也可进行其中不需要为洗涤目的而去除AEX单元的实验。用从0到30%的pH7.4的10mM磷酸钠（缓冲液A）和缓冲液B以线性梯度洗涤MiMo单元并用pH6.8的0.5M磷酸钠1.5NaCl缓冲液剥离（strip）。对负载物、流过物和洗涤物分析存在的聚集物、HCP含量和蛋白（产物）含量。负载物具有2179ng/mg IgG的HCP浓度。流过级份加洗涤级份具有447ng/mg IgG的HCP浓度。负载物中的聚集物量为2.93%，流过物加洗涤物中的聚集物量为0.76%。剥离物中的聚集物量为54.97%。在流过物加洗涤物中的总产物回收量为88.2%，在流过物加洗涤物加剥离物中的总产物回收量为90%。

该实验显示，当将分离混合物用适当量的适当的调节性溶液在线补充时，通过使用作为单一单元操作的串联的顺次连接的阴离子交换色谱和MiMo（羟基磷灰石）色谱，实现了99.2%的总抗体材料纯度。负载物的初始纯度为97%。

实验3

确定以流过模式的使用阴离子-HIC树脂的MiMo色谱的最优条件。

对于该组实验而言，用去矿物质水将预先纯化的IgG稀释至2.29mS/cm的传导率，使用pH9.0的2M Tris将pH调节至pH7.4。在

探测仪上使用装填有6.3cm床长度的Capto^TM填料（adhere）（GEHealthcare）的VL11（Millipore）柱。用pH7.4的25mM磷酸钠（缓冲液A）和pH7.4的100mM磷酸钠（缓冲液B）平衡并洗涤柱。将缓冲液A和缓冲液B在各个实验中分别以0、5、15和25%的体积比率，以5mL/min的流速在线混合。平衡之后，装载产物。装载期间，在线混合产物流和缓冲液B。将产物流和缓冲液B在各个实验中分别以0、5、15和25%的体积比率，3mL/min的流速在线混合。由于与缓冲液B进行在线混合，洗脱之前，初始负载物含有1.09g/L的IgG且聚集物的初始量为3.13%。将柱用pH3.0的100mM磷酸钠剥离。

收集不同比率的缓冲液B的流经物级份并分析存在的聚集物和蛋白（产物）含量。

表3.使用不同比率的磷酸钠缓冲液的流过模式在阴离子-HIC MiMo柱中的聚集物清除率

（如表3中所示的）样品的分析结果显示，当将含有产物的负载物与磷酸盐调节性缓冲液混合时，在阴离子-HIC MiMo树脂中聚集物的去除达到<1%的程度。

实验4

以具有在线混合的流过模式在使用阴离子-HIC树脂的MiMo色谱中的聚集物去除

对于该实验而言，用去矿物质水将预先纯化的IgG稀释至2.4mS/cm的传导率，使用pH9.0的2M Tris将pH调节至pH7.4。在

探测仪上使用装填有6.3cm床长度的Capto^TM填料（GE Healthcare）的VL11（Millipore）柱。用pH7.4的25mM磷酸钠（缓冲液A）和pH7.4的100mM磷酸钠（缓冲液B）平衡并洗涤柱。将缓冲液A和缓冲液B以15%缓冲液B的固定体积比率、以5mL/min的流速在线混合。平衡之后，装载产物。装载期间，在线混合产物流和缓冲液B。将产物流和缓冲液B以15%缓冲液B的固定体积比率、3mL/min的流速在线混合。初始负载物含有0.93g/L的IgG且聚集物的初始量为3.15%。将柱用pH3.0的100mM磷酸钠缓冲液剥离。

表4.以具有磷酸钠缓冲液的在线混合的流过模式在阴离子-HIC MiMo 树脂中的聚集物清除率

（如表4中所示的）这些样品的分析结果清楚地显示聚集物的去除达到≤1%的程度，所述聚集物的去除以用固定体积比率为30%的pH7的100mM磷酸钠在线混合，在流过模式的阴离子-HIC MiMo树脂中来进行。

实施例2

用作为单一单元操作的AEX和使用阴离子-HIC树脂的MiMo色谱对IgG进行纯化

使用

探测仪如图1图表所描绘的串联连接AEX单元和MiMo单元。对于AEX而言，使用Sartobind Q胶囊（1mL），对于MiMo而言，使用装填有6.3cm床长度的HA

填料（GE Healthcare）的VL11（Millipore）柱。对于在产物装载和连接AEX单元之前的调节而言，用pH7.4的25mM磷酸钠（缓冲液A）和pH7.4的100mM磷酸钠（缓冲液B）平衡MiMo单元。以5mL/min的流速、15%缓冲液B的固定体积比率在线混合缓冲液A和缓冲液B。在将AEX单元与系统连接之前，将其用100mL的0.05M Tris pH7.4缓冲液冲洗并平衡AEX单元。也可进行其中每一单元的平衡不分开进行的试验。

对于该实验而言，用去矿物质水将预先纯化的IgG稀释至传导率为2.29mS/cm，使用2M Tris pH9.0缓冲液将pH调节至pH7.4并在0.22μm上过滤。通过以3mL/min的速率抽吸，启动预先纯化的IgG的负载。以相同的流速以15%体积比率抽吸缓冲液B。479mL量的含有0.91g/L的IgG的被负载。完成负载之后，去除AEX单元，将流体转换回缓冲液A，做好准备工作，以开始洗涤。也可进行其中不需要为洗涤目的而去除AEX单元的实验。洗涤之后，经由泵A添加pH3.0的100mM磷酸钠，来剥离MiMo单元，并将泵B停止。对负载物、流过物和洗涤物分析存在的聚集物、HCP含量和蛋白（产物）含量。负载物具有1711ng/mg IgG的HCP浓度。流过级份加洗涤级份具有206ng/mg IgG的HCP浓度。负载物中的聚集物量为3.13%，流过物加洗涤物中的聚集物量为0.18%。剥离物中的聚集物量为14.23%。在流过物加洗涤物中的总产物回收量为82.9%，在流过物加洗涤物加剥离物中的总产物回收量为99.9%。

该实验显示，当将分离混合物用适当量的适当的调节性溶液在线补充时，通过使用作为单一单元操作的串联的顺次连接的阴离子交换色谱和MiMo（阴离子-HIC）色谱，实现了99.72%的总抗体材料纯度。负载物的初始纯度为96.8%。

使用的缩写：

A²⁸⁰ 280nm下的(光)吸收率

AEX 阴离子交换色谱

BHK细胞幼年仓鼠肾细胞

CHO细胞中国仓鼠卵巢细胞

EBA 膨胀床吸附

HCP 宿主细胞蛋白质

HIC 疏水作用色谱

HPLC 高压液相色谱

IgG 免疫球蛋白G

MiMo 混合模式

TFF 切向流过滤

Tris 三(羟甲基)甲胺

Claims

1.一种从生物反应器中生产的蛋白质混合物中纯化抗体的方法，该方法至少包含中间纯化步骤和精提纯步骤，其中所述中间纯化步骤和精提纯步骤包括串联顺次连接的阴离子交换色谱（AEX）和混合模式色谱（MiMo），所述阴离子交换色谱产生流过级份形式的分离混合物，所述混合模式色谱产生流过级份形式的经纯化的抗体制剂，并且其中所述经纯化的抗体制剂进行至少一个进一步的纯化步骤，其中，所述分离混合物在混合模式色谱之前被适当量的合适的调节性溶液补充，以调节pH和/或传导率和/或具体的离子组分的浓度或类型，用于在所述混合模式色谱步骤中从抗体中去除杂质。

2.如权利要求1所述的方法，其中阴离子交换色谱和混合模式色谱在两个串联连接的分开的装置中进行。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述串联顺次连接的AEX和MiMo以单一单元操作方式进行。

4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中，所述分离混合物在MiMo之前被适当量的盐或盐组合物补充。

5.如权利要求4中所述的方法，其中，所述分离混合物在MiMo之前被适当量的硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾、氯化钾和氯化钠补充。

6.根据权利要求1至3所述的方法，其中，所述分离混合物在MiMo之前被适当量的酸溶液补充。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述分离混合物在MiMo色谱之前被适当量的含有柠檬酸（或其单钠或单钾盐或二钠或二钾盐）、磷酸（或其单钠或单钾盐或二钠或二钾盐）、乙酸、盐酸或硫酸的溶液补充。

8.根据权利要求1至3所述的方法，其中，所述分离混合物在混合模式色谱之前被适当量的碱性溶液补充。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述分离混合物在MiMo色谱之前被适当量的含有氢氧化钠或氢氧化钾（或其单取代或二取代的钠盐或钾盐）或三(羟甲基)氨基甲烷的溶液补充。

10.一种可用在权利要求1至9中任意一项的方法中的单一操作单元，其包括串联连接的阴离子交换色谱部分和混合模式色谱部分二者，其中，所述阴离子交换色谱部分的出口与所述混合模式色谱部分的入口相连，其中所述单元包括在所述阴离子交换色谱部分的上游端的入口和在所述混合模式色谱部分的下游端的出口，并且其中所述单元还包括位于所述阴离子交换色谱部分和所述混合模式色谱部分之间的入口。