EA013504B1 - Способ очистки белков - Google Patents

Abstract

В настоящем изобретении предложены способы очистки белков. В частности, в указанных способах используется процесс двухстадийной неаффинной хроматографии без использования стадии фильтрации с тангенциальным потоком в ходе процесса.

Description

Область, к которой относится изобретение

В целом, данное изобретение относится к области очистки белков при помощи процесса двухстадийной неаффинной хроматографии без использования в ходе процесса стадии фильтрации с тангенциальным потоком. В частности, данное изобретение относится к способу очистки полипептидов (таких как рекомбинантные белки, антитела, фрагменты антител, продукты на основе участков РаЬ и Ρν, одноцепочечные антитела, димерные антитела, линейные антитела, биспецифичные антитела, мультиспецифичные антитела, включая состоящие из фрагментов антител, слитые белки с Рс-подобными участками и молекулы, подобные антителам, например иммуноадгезины) в композициях, включающих полипептид и одну или несколько примесей.

Предпосылки создания изобретения

Крупномасштабная экономичная очистка белков становится все более важной проблемой в биофармацевтической промышленности. Белки для приготовления лекарственных препаратов обычно получают с помощью клеточных линий прокариот или эукариот, сконструированных для экспрессирования требуемого белка из рекомбинантной плазмиды, содержащей ген, который кодирует белок. Выделение очищаемого белка из смеси компонентов, вводимых для питания клеток, и побочных продуктов жизнедеятельности клеток до надлежащей чистоты, например, достаточной для использования в лекарственных препаратах для лечения людей, представляет значительные трудности для производителей биопрепаратов по ряду причин.

Производители фармацевтических продуктов на белковой основе должны соблюдать строгие нормы, в том числе чрезвычайно строгие требования в отношении чистоты. Для того чтобы гарантировать их безопасность, органы государственного регулирования, такие как Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (ΡΌΑ), требуют, чтобы фармацевтические продукты на белковой основе были практически очищены от примесей, включая как примеси, связанные с продуктом, такие как агрегаты, фрагменты и варианты рекомбинантного белка, так и примеси, связанные с проведением процесса, такие как белки клеток хозяина, компоненты среды, вирусы, ДНК и эндотоксины. Хотя существуют различные схемы очистки белков, широко применяемые в биофармацевтической промышленности, они обычно включают стадию аффинной очистки, такую как очистка с использованием белка А в случае антител, для достижения степени чистоты, приемлемой для фармацевтических целей.

Несмотря на появление новейших методов хроматографии и фильтрации, аффинная хроматография все еще часто используется как стадия связывания, чтобы удовлетворить требования по чистоте, выходу и производительности при очистке биофармацевтических антител для достижения степени чистоты, достаточной для применения в лекарственных средствах. Несмотря на высокую связывающую способность хроматографии с использованием белка А в отношении антител (около 10^-8 М для человеческого иммуноглобулина О) и ее способности удалять до 99,5% примесей, аффинная хроматография является дорогостоящей стадией при использовании для очистки лекарственных белков в промышленном масштабе. Помимо того, что белок А значительно дороже, чем неаффинные среды, проблемами данного метода являются нестабильность смолы, трудность очистки, потери лиганда, а также потенциальная иммуногенность белка А или родственных белку А веществ, загрязняющих очищенный продукт. Однако высокая стоимость и нестабильность аффинных сред повышают конечную стоимость лекарственных средств на белковой основе, особенно таких, которые принимаются в высоких дозах и/или требуют длительного применения. Стоимость самой хроматографии составляет 2/3 стоимости обработки продукта после его получения; что касается моноклональных антител, стоимость смолы в колонке для аффинной сорбции может превысить стоимость исходных материалов (см. РаЙюгс и др. Проблемы стоимости при производстве биофармацевтических продуктов (СоШпд Нкиек ίη Шс Ртобисйоп о£ Вюрйатшасеийсак), ВюРйатш 1п1сгпа1юпа1, 1 февраля 2004 г.).

Даже если используется аффинная хроматография с белком А, часто не удается достигнуть достаточной чистоты без применения нескольких стадий очистки, что еще более повышает стоимость и снижает выход продукта. Поскольку антитела все в большей степени используются в лечебных биологических препаратах, предлагаемых на рынке и находящихся в разработке для лечения рака, аутоиммунных болезней, инфекционных болезней, сердечно-сосудистых заболеваний и отторжения трансплантатов, существует потребность в процессе, с помощью которого можно было бы очищать белки за меньшее количество стадий и соответственно с меньшими затратами.

Патент США № 2003/0229212 описывает метод для очистки антител из смеси, содержащей белки клеток хозяина, и включающей стадии очистки путем неаффинной хроматографии с последующей стадией высокоэффективного фильтрования с тангенциальным потоком (НРТРР). Как установлено методом восстановления белков из клеток яичника китайского хомячка (СНОР), данный метод очистки позволил получить уровень загрязнения около 144780 млн^-1 белков СНОР после катионообменной очистки, уровень около 410 млн^-1 белков СНОР после анионообменной очистки и около 17-21 млн^-1 белков СНОР после очистки методом НРТРР (последняя стадия); таким образом, получается трехстадийный неаффинный процесс. Стадия очистки НРТРР, при которой используется заряженная мембрана для разделения примесей (без ограничений по относительному размеру), таких как белки, ДНК и эндотоксины, и для удаления белковых олигомеров и продуктов разложения из смеси, содержащей антитела, являлась суще

- 1 013504 ственной для достижения конечной степени чистоты.

Кроме того, метод НРТРР характеризуется следующими недостатками: (1) он составляет дополнительный этап при разработке, оптимизации и масштабировании производства лекарственных средств на белковой основе, требуя очистки мембран, проверки, наличия в продаже кассет для крупномасштабного производства в соответствии с правилами организации производства и контроля качества лекарственных средств (СМР) (которые еще не доступны для метода НРТРР), дополнительных буферных растворов, оборудования и большего времени обработки, и (2) он повышает стоимость, при этом представляя угрозу потенциальной потери продукта за счет возможности нарушения целостности антител (путем разложения, агрегации или других молекулярных изменений, которые влияют на молекулярную активность).

В связи с этим было бы желательно достигать высокой чистоты белка, предназначенного для лекарственных препаратов, в двухстадийном неаффинном процессе, не основанном на методе НРТРР, с более низкими затратами по сравнению с очисткой, основанной на аффинном методе, и другими многостадийными процессами очистки. Было бы полезно, чтобы неаффинный процесс очистки мог удалять белки клеток хозяина, нуклеиновые кислоты, эндотоксины, связанные с продуктом примеси, например агрегированные, окисленные, дезамидированные или разложившиеся формы белка, добавки из среды, например липиды, витамины, инсулин, метотрексат, аминокислоты, источники углерода типа глюкозы и т.д.

Разработка схемы очистки, применимой к различным белкам, масштабируемой, поддающейся управлению и использующей более дешевые многократно используемые смолы, позволит интегрировать ее в процесс разработки продукта на очень ранней стадии общего процесса разработки лекарственного средства. Данный подход к созданию схемы очистки может минимизировать дорогостоящие изменения производственных процессов, которые в противном случае могут понадобиться позже при разработке лекарственного препарата или, еще хуже, после его утверждения. По мере роста масштаба реализации процесса и его приближения к производственным условиям, соответствующим Правилам организации производства и контроля качества лекарственных средств (СМР), возникают дополнительные специфические сложности, включая такие, которые связаны с набивкой смолы и приготовлением буферных растворов. Процесс производства и его мощность могут быть увеличены путем упрощения схемы очистки за счет устранения некоторых стадий процесса и максимального повышения пропускной способности и производительности при сохранении целостности и чистоты очищаемого вещества. В связи с этим, было бы желательно и полезно начинать с простого и эффективного процесса, производящего лекарственное вещество высокого качества и высокой безопасности.

Сущность изобретения

Данное изобретение основано на неожиданном открытии, что полипептиды и белки, в частности рекомбинантные белки, такие как моноклональные антитела, могут быть выделены в чистом виде из смеси с примесями, содержащими требуемые молекулы и по крайней мере одну примесь, такую как белки молекулы хозяина, и другие вещества, такие как компоненты среды, посредством двухстадийного процесса очистки, не включающего стадию аффинной хроматографии или стадию обмена буфера в ходе процесса (например, с использованием методов ТРР или НРТРР). Вместо этого при переходе от первой стадии ко второй необходимы только операции по изменению рН. Поэтому двухстадийный процесс по настоящему изобретению существенно снижает стоимость очистки белков, которая обычно основана на аффинной хроматографии или на многостадийных методах для достижения аналогичной высокой степени чистоты белков.

В данном изобретении белки подвергаются очистке до высокой степени чистоты посредством стадий катионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом, которые проводятся в произвольном порядке и без применения аффинной хроматографии; в результате получают высокочистую композицию белков, содержащую пренебрежимо малое количество примесей [например, белки клеток хозяина, такие как белки СНОР, в количестве менее 100 частей на миллион (млн^-1)]. В некоторых конкретных реализациях данного изобретения, описанных в приведенном ниже примере, содержание белков клеток хозяина СНОР было снижено до уровня менее 20 млн^-1. Преимуществом метода по настоящему изобретению является то, что хроматографические стадии можно проводить в произвольном порядке, что позволяет при практической реализации метода адаптировать его в соответствии с потребностями. Кроме того, процесс очистки по настоящему изобретению позволяет удалять не только требуемые белки клеток хозяина, но и нуклеиновые кислоты, эндотоксины, связанные с продуктом примеси, например, агрегированные, окисленные, дезамидированные или разложившиеся формы белка, а также содержащиеся в среде добавки, например липиды, витамины, инсулин, метотрексат, аминокислоты, источники углерода типа глюкозы и т.д.

Настоящее изобретение обеспечивает способы для очистки рекомбинантных белков, включая, но не ограничиваясь этим, антитела, слитые белки с Рс-подобными участками и подобные антителам молекулы, например иммуноадгезины, для получения высокочистой белковой композиции, пригодной для приготовления лекарственных составов. В результате преимуществом метода по настоящему изобретению является то, что получаемая высокочистая белковая композиция пригодна для приготовления лекарственных составов и может непосредственно использоваться при лечении людей.

Так, в одной из реализаций способ по настоящему изобретению предназначен для очистки смеси,

- 2 013504 содержащей целевой белок и одну или несколько примесей, путем проведения следующих стадий: (а) ионообменная очистка и гидрофобная очистка с индуцированным зарядом без использования стадии фильтрации с тангенциальным потоком в ходе процесса, (Ь) выделение целевого белка.

В одной из конкретных реализаций способ предназначен для очистки смеси, содержащей целевой белок и одну или несколько примесей, таких как белки клеток хозяина (например, белки СНОР) и нуклеиновые кислоты, путем обработки смеси катионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом с последующим выделением целевого белка с содержанием примесей: 100 млн^-1 или менее белка клеток хозяина и 10 пг/мг или менее нуклеиновых кислот.

Краткое описание чертежа

Чертеж иллюстрирует технологическую схему двухстадийного процесса очистки по настоящему изобретению, причем секция А и секция В относятся к одним и тем же смолам, используемым в разной последовательности. Секция А представляет первую реализацию процесса очистки по настоящему изобретению, при которой катионообменная хроматография (СЕХС) является хроматографической стадией сорбции, за которой следует гидрофобная хроматография с индуцированием заряда (НС1С), причем между двумя данными хроматографическими стадиями требуются только операции по изменению рН. В секции В представлена вторая реализация, при которой метод НС1С используется как стадия хроматографической сорбции, за которой следует стадия СЕХС, причем между этими стадиями производится только операции по изменению рН. Приблизительные значения рН связывания на стадии сорбции составляют 6,2 для секции А и 7,0 для секции В.

Подробное описание изобретения

Определения.

Используемый в данном документе термин «белок» относится вообще к пептидам и белкам, как правило, имеющим не менее 5 аминокислот или более, связанных пептидными связями. Белок может представлять собой антитело, рецептор, лиганд, слитый белок (содержащий по крайней мере части двух или более полипептидов, не слитых в естественном состоянии) и т.д., например см. патенты США 2003022921 и 20030166869, в которых приведены списки различных белков, которые могут быть очищены с использованием способа по настоящему изобретению. Полипептиды могут быть получены из любого организма (прокариота или эукариота), в частности, млекопитающих. Кроме того, белок или полипептид, очищенный с помощью способа по настоящему изобретению, может являться антителом, фрагментом или их вариантом.

Термин «антитело» используется в наиболее широком смысле, охватывая моноклональные антитела (включая цельные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), иммуноадгезины и фрагменты антител, при условии, что они сохраняют лиганд-специфичную область связывания либо если они модифицированы так, чтобы содержать такую область. Антитело может быть направлено на требуемый «антиген», такой как полипептид, который может являться биологически важной терапевтической мишенью, или не полипептидный антиген (например, гликолипидные антигены, связанные с опухолью; см. патент США № 5091178). Предпочтительно антиген является биологически важным полипептидом, и назначение антитела млекопитающему, страдающему заболеванием, может дать лечебный эффект. Полипептидные антигены включают трансмембранные молекулы (например, рецепторы) и лиганды, такие как факторы роста. Примеры антигенов включают в себя обсуждавшиеся выше полипептиды. Подготовка антигенов для выработки антител и производства антител хорошо известны в данной отрасли. В качестве иммуногенов для выработки антител могут использоваться растворимые антигены либо их фрагменты, которые могут быть конъюгированы к другим молекулам. В случае трансмембранных молекул, таких как рецепторы, в качестве иммуногена могут быть использованы их фрагменты (например, внеклеточная часть рецептора). В качестве альтернативы, в качестве иммуногена могут быть использованы клетки, экспрессирующие трансмембранные молекулы. Такие клетки могут происходить из естественного источника (например, раковые клеточные линии) или могут являться клетками, преобразованными посредством рекомбинантных методов для экспрессирования трансмембранных молекул.

«Фрагмент антитела» включает по крайней мере часть цельного антитела и, как правило, также участок связывания антигена или его участок какой-либо длины. Примерами фрагментов антител являются фрагменты ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')₂ и Εν; одноцепочечные молекулы антител; димерные антитела; линейные антитела; мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Термин «моноклональное антитело» используется в общепринятом значении и обозначает антитело, полученное из популяции практически гомогенных антител, в которой отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны с точностью до возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в малых количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против единственного антигенного участка. Этим они отличается от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминантов (эпитопов) антигена, тогда как моноклональные антитела направлены против единственного детерминанта антигена. Термин «моноклональное» при описании антител указывает на характер антитела как полученного из практически гомогенной популяции антител, и не должен интерпретироваться как требо

- 3 013504 вание получения антител каким-либо определенным методом. Например, моноклональные антитела, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены при помощи общепринятой гибридомной технологии, которую впервые описали КоЫег и др., №1игс 256:495 (1975), либо посредством методов с использованием рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). Моноклональные антитела могут также быть выделены из фаговых библиотек антител, например, по методике, описанной С1асккоп и др., Ыа1иге 352:624-628 (1991); Магкк и др., 1. Мо1. Вю1. 222:581-597 (1991); а также в патентах США № 5223409; 5403484; 5571698; 5427908; 5580717; 5969108; 6172197; 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081.

Описываемые здесь моноклональные антитела включают «химерные» и «гуманизированные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из определенного биологического вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу, тогда как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу, а также фрагменты таких антител при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность (патент США № 4816567, а также Могпкоп и др., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 81:6851-6855 (1984)). «Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, мышиных) антител - это химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. В основном, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (акцепторное антитело), в которых остатки гипервариабельного участка акцептора замещены на остатки гипервариабельного участка нечеловеческого вида (донорское антитело), такого как мышь, крыса, кролик или нечеловеческий примат, имеющего требуемые специфичность, аффинность и связывающую способность. В некоторых случаях, остатки фрагмента Ρν каркасной области (РК) человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не встречающиеся ни в акцепторном, ни в донорском антителе. Эти изменения направлены на дальнейшее улучшение характеристик антител. В целом, гуманизированное антитело будет включать практически все из по крайней мере одного, а как правило двух вариабельных участков, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют таковым в нечеловеческой иммуноглобулине, а все или практически все ГК-участки соответствуют последовательности человеческого иммуноглобулина. Дополнительно, гуманизированное антитело может включать по крайней мере часть константного участка иммуноглобулина (Рс), обычно человеческого иммуноглобулина. Более подробно см. 1опек и др., №11иге 321:522-525 (1986); Ктесйтапп и др., №11иге 332:323-329 (1988); Ргек1а, Сигг. Ор. 81гис1. Вю1. 2:593-596 (1992).

Химерные или гуманизированные антитела могут быть получены на основе последовательности мышиных моноклональных антител, как описано выше. ДНК, кодирующие иммуноглобулины с тяжелыми и легкими цепями, могут быть получены из требуемой мышиной гибридомы и при помощи стандартных методов молекулярной биологии модифицированы так, чтобы они содержали немышиные (например, человеческие) иммуноглобулиновые последовательности. Например, чтобы создать химерное антитело, мышиные вариабельные области могут быть присоединены к человеческим константным участкам при помощи известных методов (см., например, патент США № 4816567 авторов СаЫ11у и др.). Чтобы создать гуманизированное антитело, мышиные СЭК-области могут быть встроены в каркас человеческого антитела при помощи известных методов (см., например, патент США № 5225539 автора ^М1п(ег, а также патенты США № 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, авторов Оиееп и др.).

К описываемым здесь моноклональным антителам также относятся «человеческие» антитела, которые могут быть выделены из разных источников, в том числе, например, из крови человека-пациента, или приготовлены рекомбинантным методом с использованием трансгенных животных. Примерами таких трансгенных животных являются КМ-Моике® (Мебагех, 1пс., РппсеЮп. N1), имеющая трансген с человеческой тяжелой цепью и трансхромосому с человеческой легкой цепью (см. патент АО 02/43478), Хепотоике (АЬдешх, 1пс., Ргетоп! СА; описывается, например, в патентах США 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963 авторов Кисйебараб и др.) и НиМАЬ-Моике® (Мебагех, 1пс.; описывается, например, в публикациях Тау1ог, Ь. и др. (1992) №.1с1е1с Ас1бк Кекеагсй 20:6287-6295; Сйеп, 1. и др. (1993) 1п1егпа1юпа1 1ттипо1оду 5: 647-656; ТиаШоп и др. (1993) Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А 90:3720-3724; С1ю1 и др. (1993) №11иге Оепебск 4:117-123; Сйеп, 1. и др. (1993) ЕМВО 1. 12: 821-830; ТиаШоп и др. (1994) 1. 1ттипо1. 152:2912-2920; Тау1ог, Ь. и др. (1994) 1п1ета1юпа1 1ттипо1оду 6: 579-591; Р1кйМ1б, Ό. и др. (1996) №11иге Вю1есйпо1оду 14: 845-851, патентах США № 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; 5770429; 5545807; а также в публикациях РСТ № АО 92/03918, АО 93/12227, АО 94/25585, АО 97/13852, АО 98/24884 и АО 99/45962, АО 01/14424 авторов Когтап и др.). Человеческие моноклональные антитела по настоящему изобретению также могут быть получены с использованием мышей с тяжёлым комбинированным иммунодефицитом (8СШ) со встроенными человеческими иммунными клетками для получения человеческого иммунного ответа при иммунизации. Такие мыши описаны, например, в патентах США № 5476996 и 5698767 авторов АПкоп и др.

Термин «гипервариабельный участок» используется для описания аминокислотных остатков анти

- 4 013504 тела, ответственных за связывание антигена. Гипервариабельный участок включает в себя аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность» или «СОК.» (т.е. остатки 24-34 (Ь1), 50-56 (Ъ2) и 89-97 (Ь3) в вариабельном участке легкой цепи и остатки 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном участке тяжелой цепи; см. КаЬа! и др., «Последовательности в белках, представляющих иммунологический интерес» (8ес.|иепсез о£ Рго1еш8 о£ 11штто1ощса1 1п1сгсз1). 5(Н ЕЕ. РиЬЕс НеаИЕ 8егу1се, №Шопа1 [пкШгЧек о£ НеаИЕ, ВеФекЕа, МЕ. (1991)) и/или аминокислотные остатки из «гипервариабельной петли» (т.е. остатки 26-32 (Ь1), 50-52 (Ь2) и 91-96 (Ь3) в вариабельном участке легкой цепи и остатки 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном участке тяжелой цепи; СЕо1Ыа и Бекк, 1. Мо1. Вю1. 196:901-917 (1987)). Остатки «каркаса» или «ГВ» - это остатки вариабельных участков, не относящиеся к остаткам гипервариабельных участков.

Для целей настоящего документа термин «иммуноадгезин» обозначает молекулы, подобные антителам, в которых сочетаются «связывающий участок» гетерологичного белка «адгезина» (например, рецептора, лиганда или фермента) с эффекторными функциями константного участка иммуноглобулина. Со структурной точки зрения, иммуноадгезин является результатом слияния аминокислотной последовательности адгезина с желаемой специфичностью связывания, отличающейся от участка узнавания и связывания антигена (комбинированного сайта антигена) на антителе (т.е. является «гетерологичной») и последовательности константного участка иммуноглобулина. Последовательность константного участка иммуноглобулина в иммуноадгезине предпочтительно является производным от тяжелых цепей γ1, γ2 или γ4, поскольку иммуноадгезины, включающие такие участки, могут быть очищены посредством хроматографии с использованием белка А (ЫпЕтагк и др., 1. 1ттипо1. Ме1Е. 62:1-13 (1983)). Иммуноадгезины могут быть очищены с использованием способов по настоящему изобретению.

Термин «участок связывания лиганда» относится к любому природному рецептору на поверхности клетки или любому его участку или производному, по меньшей мере, качественно все еще проявляющего свойство связывать лиганд, характерное для соответствующего природного рецептора. В одной из конкретных реализаций рецептор представляет собой полипептид на поверхности клетки, имеющий внеклеточный участок, который гомологичен какому-либо члену семейства супергенов иммуноглобулина. Другие рецепторы, не являющиеся членами семейства супергенов иммуноглобулина, но тем не менее специально охватываемые данным определением, - это рецепторы цитокинов, в частности рецепторы с тирозин-киназной активностью (рецепторные тирозин-киназы), члены суперсемейств рецепторов гематопоэтинов и факторов роста нервов, а также молекулы адгезии клеток, например (Е-, Ь- и Р-) селектины.

Термин «участок связывания рецептора» используется для обозначения любого природного лиганда для рецептора, включая молекулы адгезии клеток, или любого участка или производного такого природного лиганда, по меньшей мере, качественно все еще проявляющего свойство связывать рецептор, характерное для соответствующего природного лиганда. Данного определение, помимо прочего, специально включает в себя связывающие последовательности из лигандов для вышеупомянутых рецепторов.

«Химера антитела с иммуноадгезином» представляет собой молекулу, в которой сочетается по меньшей мере один связывающий участок антитела (согласно данному здесь определению) и по меньшей мере один иммуноадгезин (согласно данному в этом патенте определению). Примерами химер антитела с иммуноадгезином являются биспецифические химеры СП4-1дО, описанные авторами Вегд и др., ΡΝΑ8 (И8А) 88:4723-4727 (1991), а также СЕипои и др., 1. 1ттипо1. 153:4268 (1994).

Для целей настоящего изобретения под «смесью» понимается сочетание требуемого полипептида (того, который требуется очистить) и одного или нескольких загрязняющих веществ, т.е. примесей. Смесь может быть получена прямо из клетки хозяина или из организма, вырабатывающего полипептид. Без ограничения общности, примерами смесей, которые могут быть очищены по способу настоящего изобретения, являются клеточная жидкость после выращивания клеток, супернатант клеточной культуры и кондиционированный супернатант клеточной культуры. «Частично очищенная» смесь - это смесь, уже прошедшая стадию хроматографии, например неаффинной хроматографии, аффинной хроматографии и т.д. «Кондиционированная смесь» - это смесь, например, супернатант клеточной культуры, подготовленный к хроматографической стадии, используемой в способе по настоящему изобретению, обработкой посредством одной или нескольких следующих операций: замена буфера, разбавление, добавление солей, титрование до определенного рН или фильтрование с целью задания рН и/или проводимости и/или состава буфера для достижения требуемых характеристик хроматографии. «Кондиционированная смесь» может быть использована для стандартизации условий загрузки в первую хроматографическую колонку. Вообще говоря, смесь может быть получена различными методами разделения, хорошо известными в отрасли, например, путем физического отделения мертвых и жизнеспособных клеток от других компонентов питательной среды по окончании работы биореактора методами фильтрации или центрифугирования, либо путем концентрирования и/или диафильтрации супернатанта клеточной культуры в определенных диапазонах рН, проводимости и концентрации компонентов буфера.

Термины «примесь» и «загрязнение», а также различные их грамматические формы, используются как эквивалентные термины, обозначающие любой материал, отличный от очищаемого белка, который требуется удалить из смеси, содержащей очищаемый белок. К примесям относятся, в частности, любые

- 5 013504 биологические макромолекулы, такие как белки клеток хозяина (например, белки из клеток яичника китайского хомячка - СНОРк); полипептиды, отличные от очищаемого белка; нуклеиновые кислоты (например, ДНК и РНК), липиды, сахариды, эндотоксины, бактерии и другие микроорганизмы, такие как дрожжи, компоненты среды, а также любые молекулы, входящие в состав адсорбента, применяемого в хроматографии, которые могут попасть в образец во время процесса хроматографии, и т.п.

Термины «очищаемый белок» и «целевой белок» используются как эквивалентные термины для обозначения белка, как описано выше, например, антитела, которое требуется очистить из смеси с использованием способа по настоящему изобретению.

Термин «белок клеток хозяина» (БКХ) относится к любому белку, выработанному в результате метаболизма (внутри- и внешнеклеточного) клеток хозяина, вырабатывающих целевой белок, включая любые белки, экспрессируемые из генома клеток хозяина, а также рекомбинантные экспрессируемые белки, не рассматриваемые как целевой белок. Клеткой хозяина может быть любая клетка, способная к экспрессированию целевого белка, особенно клетки млекопитающих (например, клетки яичника китайского хомячка и клеточные линии миеломы мышей, такие как N80), клеточные линии насекомых, бактерий, растений и дрожжей. В одной из реализаций настоящего изобретения БКХ является «белками из клеток яичника китайского хомячка», или «СНОР», что обозначает любые белки клеток хозяина («БКХ»), полученные из клеточной культуры яичника китайского хомячка («СНО»). БКХ обычно присутствует как примесь в среде клеточной культуры или в лизате (например, в клеточной жидкости после выращивания клеток), содержащей очищаемый белок. Количество БКХ, присутствующих в смеси, содержащей очищаемый белок, является мерой чистоты требуемого белка. Как правило, количество БКХ в смеси белков выражают в частях на миллион относительно количества очищаемого белка в этой же смеси.

Термины часть на миллион и млн^-1 используются в этом документе как эквивалентные термины для обозначения меры чистоты очищаемого белка после его очистки с использованием способа по настоящему изобретению. Количество в единицах млн^-1 относится к количеству БКХ в нг/мл относительно очищаемого белка в мг/мл, где белки содержатся в растворе [т.е. как описано в примере ниже, БКХ млн^-1=(СНОР, нг/мл)/(очищаемый белок, мг/мл)]. В тех случаях, когда белки высушивают, например путем лиофилизации, количество млн^-1 соответствует (БКХ, нг)/(очищаемый белок, мг).

Термин «очищать», а также различные его грамматические формы, используется для обозначения удаления как частичного, так и полного, по меньшей мере одной примеси из смеси, содержащей полипептид и одну или несколько примесей, что тем самым повышает степень чистоты полипептида в смеси (т.е. уменьшается количество (млн^-1) примеси(ей) в смеси). Согласно настоящему изобретению очистка выполняется посредством двух стадий неаффинной хроматографии при отсутствии стадий фильтрации с тангенфиальным потоком в ходе процесса. Способ по настоящему изобретению позволяет проводить очистку целевого белка с получением смеси, содержащей менее 100 млн^-1 БКХ, предпочтительно менее 90, менее 80, менее 70, менее 60, менее 50, менее 40, менее 30, менее 20, менее 10 или менее 5 млн^-1 БКХ согласно данным твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8Л).

Для целей настоящего изобретения термин «выделять» и различные его грамматические формы относятся к отделению очищенного целевого белка от дополнительных веществ, например, из колонки или смолы, используемой для очистки целевого белка, для получения однородной композиции, содержащей очищаемый белок, практически освобожденный от примесей, загрязнителей и других веществ.

Термин «хроматография» относится к процессу, с помощью которого нужное растворимое вещество, например очищаемый белок, содержащийся в смеси, отделяется от других растворенных веществ в смеси путем фильтрации смеси через адсорбент, который адсорбирует или удерживает растворенное вещество сильнее или слабее благодаря свойствам растворенного вещества, таким как р1, гидрофобность, размер и структура, при определенных буферных условиях процесса.

«Адсорбент» - это любое твердое стационарное вещество, способное к адсорбции другого вещества на свою поверхность за счет адгезии либо при прямом взаимодействии с нужной молекулой либо с веществами, связанными с адсорбентом. Адсорбенты, которые могут применяться в хроматографии разных типов, хорошо известны в данной области и легко доступны из коммерческих источников.

Термины «аффинная хроматография» и «аффинная хроматография белков» используются как эквивалентные термины для обозначения способа разделения белков, в котором очищаемый белок обратимо и специфично связывается с биоспецифичным лигандом, обычно за счет сочетания комплементарности и одного или нескольких типов химического взаимодействия, например, электростатических сил, водородных связей, гидрофобных сил и/или ван-дер-ваальсовых сил на участке связывания. Эти взаимодействия являются следствием не общих свойств молекулы, таких как изоэлектрическая точка, ее гидрофобность или размеры, а результатом специфических взаимодействий между нужной молекулой и лигандом, например, гидрофобных, а также взаимодействий между участком точного соответствия между белком А и антителом. Белок А является примером адсорбента, который может быть закреплен на твердой матрице, например на сефарозе, для связывания молекул, содержащих Ес-участок. См. ОЧгоус (1990) в документе Ошбе 1о Рто1еш РитШсайоп (Руководство по очистке белков), Ме1йоб§ о£ Епхуто1оду 182: 357-379, который целиком включен в настоящее изобретение в виде ссылки.

Любой лиганд может быть использован для очистки соответствующего ему специфично связываю

- 6 013504 щегося белка. Предпочтительно биоспецифичный лиганд ковалентно связывается с хроматографическим твердофазным материалом и очищаемый белок (например, антитело, фермент или белок рецептора) имеет к нему доступ из раствора, когда раствор контактирует с хроматографическим твердофазным материалом. Очищаемый белок сохраняет свою специфическую способность к связыванию с биоспецифическим лигандом (например, антигеном, субстратом, кофактором или гормоном) во время хроматографических стадий, в то время как другие растворенные вещества и/или белки в смеси в значительной степени или специфично с лигандом не связываются. Связывание очищаемого белка с иммобилизованным лигандом позволяет белкам, являющимся примесями или загрязнениями, пройти через хроматографическую среду, тогда как очищаемый белок остается специфически связанным с иммобилизованным лигандом на твердофазном материале. Затем специфически связанный белок удаляется с иммобилизованного лиганда действием низкого либо высокого рН, солевым раствором пониженной или повышенной концентрации, конкурирующего лиганда и т.п. и проходит через хроматографическую колонку с элюирующим буфером. При этом могут также присутствовать загрязняющие белки с более низкой концентрацией относительно очищаемого белка, а также примеси других типов, такие как нуклеиновые кислоты и эндотоксины, которые были пропущены через колонку ранее.

Термины «специфическое связывание» и «специфичность связывания», также как их различные грамматические формы, описывают в целом специфичные и обратимые взаимодействия между очищаемым белком и лигандом, требующие комбинированных эффектов пространственной комплементарности структур белка и лиганда на участке связывания, где они связаны за счет одного или нескольких видов взаимодействий, в том числе электростатических сил, водородных связей, гидрофобных сил и/или вандер-ваальсовских сил. Лиганд должен иметь химически модифицируемые группы, позволяющие связывать их с матрицей без нарушения их связывающей способности. В идеале, лиганд должен иметь константу связывания к связываемому компоненту в диапазоне от 10^-4 до 10^-8 М в свободном растворе. Чем выше пространственная комплементарность и чем сильнее другие силы на участке связывания, тем выше специфичность связывания белка с соответствующим ему лигандом. Примерами специфического связывания, не ограничивающими область изобретения, являются связывание антитела с антигеном, фермента с субстратом, фермента с кофактором, хелатирование иона металла, связывание ДНК-связывающего белка с ДНК, связывание регуляторного белка с белком и т.д.

Термины «неаффинная хроматография» и «неаффинная очистка» относятся к стадии очистки, при которой не используется аффинная хроматография, но требуется неспецифическое связывающее взаимодействие между растворенным веществом (например, очищаемым белком) и матрицей адсорбента.

Термин «неспецифическое связывание» в настоящем документе относится к взаимодействиям между очищаемым белком и лигандом или другим веществом, связанным с твердофазной матрице за счет неспецифических взаимодействий, например, электростатических сил, водородных связей и/или ван-дерваальсовых сил на участке взаимодействия, при отсутствии структурной комплементарности, усиливающей эффекты неструктурных сил, действующих при аффинном (специфическом) связывании. Примерами хроматографических процессов, основанных на неспецифическом связывании, а не на аффинности, являются ионообменная хроматография (например, анионо- и катионообменная) и гидрофобная хроматография с индуцированием заряда.

Термин «гидрофобная хроматография с индуцированием заряда» (или «НС1С») обозначает хроматографический процесс в смешанном режиме, при котором очищаемый белок в смеси связывается с ионизующимся лигандом, работающим в двух режимах (т. е. существует один режим для связывания и другой - для элюирования) [см. ВохсйеШ и др., 2000, Сеиейс Епдшеегшд №\\ъ 20(13)], за счет слабых гидрофобных взаимодействий в отсутствии добавленных солей (например, лиотропных солей). «Смола для хроматографии с индуцированием заряда» представляет собой твердую фазу, содержащую лиганд, проявляющий одновременно тиофильный эффект (т.е. свойство, используемое в тиофильной хроматографии), гидрофобность и имеющий ионизируемую группу для обеспечения разделяющей способности. Таким образом, смола для НС1С, используемая в способе по данному изобретению, содержит лиганд, который является ионизируемым и умеренно гидрофобным при нейтральных (физиологических) или слабокислых значениях рН, например при значениях рН в диапазоне от 5 до 10, предпочтительно при значениях рН в диапазоне от 6 до 9,5. В этом диапазоне рН лиганд преимущественно находится в незаряженной форме и связывает очищаемый белок за счет слабых неспецифических взаимодействий. При снижении рН лиганд получает заряд и гидрофобное связывание нарушается за счет электростатического отталкивания растворенного вещества.

Примерами подходящих лигандов для использования в методе гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом являются любые ионизируемые ароматические или гетероциклические структуры (например, имеющие пиридиновую структуру, такие как 2-аминометилпиридин, 3аминометилпиридин или 4-аминометилпиридин, 2-меркаптопиридин, 4-меркаптопиридин или 4меркаптоэтилпиридин, меркаптокислоты, меркаптоспирты, имидазолильные производные, меркаптометилимидазол, 2-меркаптобензимидазол, аминометилбензимидазол, гистамин, меркаптобензимидазол, диэтиламинопропиламин, аминопропилморфолин, аминопропилимидазол, аминокапроновая кислота, нитрогидроксибензойная кислота, нитротирозин/этаноламин, дихлорсалициловая кислота, дибромтира

- 7 013504 мин, хлоргидроксифенилуксусная кислота, гидроксифенилуксусная кислота, тирамин, тиофенол, глутатион, бисульфат, красители, включая их производные; см. ΒιιγΙοπ и Нагбшд, 1оита1 οί Сйгота!одгарйу А 814. 81-81 (1998), а также ВозсйеШ, 1оита1 οί Вюсйет1са1 аиб Вюрйу81са1 Ме!йобз 49: 361-389 (2001), которые включены сюда целиком в виде ссылок), обладающие алифатической цепью и по меньшей мере одним атомом серы в сшивающей цепи и/или в структуре лиганда. Примером смолы для метода НС1С является смола марки МЕР НУРЕВСЕЬ (Ра11 Согрогайоп; Еаз! Н111з, ΝΥ).

Термины «ионный обмен» и «ионообменная хроматография» относятся к хроматографическому процессу, при котором очищаемое ионизируемое растворенное вещество (например, очищаемый белок в составе смеси) взаимодействует с противоположно заряженным лигандом, связанным (например, за счет ковалентного связывания) с твердофазным ионообменным материалом при подходящих значениях рН и проводимости - таких, что очищаемое растворенное вещество неспецифически взаимодействует с заряженным веществом сильнее либо слабее, чем примеси к растворенному веществу, присутствующие в смеси. Загрязняющие растворенные вещества, присутствующие в смеси, могут вымываться из колонки с ионообменным материалом либо связываться с ним, либо удаляться из смолы быстрее или медленнее, чем нужное растворенное вещество. «Ионообменная хроматография» включает катионообменную, анионообменную, а также смешанную хроматографию.

Фраза «ионообменный материал» относится к твердой фазе, которая заряжена отрицательно (катионообменная смола) или положительно (анионообменная смола). В одной из реализаций заряд может обеспечиваться путем присоединения одного или нескольких заряженных лигандов (или адсорбентов) к твердой фазе, например, за счет ковалентного связывания. Как альтернатива, или в дополнение к этому, заряд может являться свойством, присущим твердой фазе (например, как это имеет место в случае диоксида кремния, который в целом заряжен отрицательно).

Термин «катионообменная смола» относится к твердой фазе, которая заряжена отрицательно и которая имеет свободные катионы, которые могут обмениваться с катионами из раствора, протекающего над твердой фазой или через нее. Может быть использован любой отрицательно заряженный лиганд, связанный с твердой фазой, которая пригодна для формирования катионообменной смолы, например, карбоксилат, сульфонат и другие, как описано ниже. Имеющиеся в продаже катионообменные смолы включают, без ограничения, например, смолы, содержащие сульфонатную группу (например, Мопо8, Μίηίδ, 8оигсе 158 и 308, 8Р 8ерйагозе Раз! Иоте™, 8Р 8ерйагозе Н1дй Ребогтапсе производства СЕ Неа1!йсаге, Тоуореаг1 8Р-6508 и 8Р-650М производства Тозой, Масго-Ргер Н1дй 8 производства ВюКаб, Сегатю НурегИ 8, Тйзасгу1 М и Ь8 8Р и 8рйегобех Ь8 8Р производства Ра11 Тесйпо1од1ез); содержащие сульфоэтильную группу (например, Ргас!оде1 8Е производства ЕМИ, Рогоз 8-10 и 8-20 производства Аррйеб Вюзуз!етз); сульфопропильную группу (например, Т8К Се1 8Р 5Р\У и 8Р-5Р\У-НВ производства Тозой, Рогоз Н8-20 и Н8 50 производства Аррйеб Вюзуз!етз); сульфоизобутильную группу (например, Ргас!оде1 ЕМИ 8О₃ ^- производства ЕМИ); сульфоксиэтильную группу (например, 8Е52, 8Е53 и Ехргезз-1оп 8 производства ^йа!тап), карбоксиметильную группу (например, СМ 8ерйагозе Раз! Ε1ο\ν производства СЕ Неаййсаге, Нубгосей СМ производства Вюсйгот Ьайз 1пс., Масго-Ргер СМ производства ВюКаб, Сегатю НурегИ СМ, Тйзасгу1 М См, Тйзасгу1 Ь8 СМ, производства Ра11 Тесйпо1од1ез, Ма!гх СеПиПпе С500 и С200 производства Мййроге, СМ52, СМ32, СМ23 и Ехргезз-1оп С производства ^йа!тап, Тоуореаг1 СМ6508, СМ-650М и СМ-650С производства Тозой); сульфонатную и карбоксилатную группы (например, ВАКЕΚВΟN^ СагЬоху-8ийоп производства 1.Т. Вакег); карбоксилатную группу (например, XVР СВХ производства 1.Т Вакег, ΌΟνΒΧ МАС-3 производства Οο\ν Ек|шб 8ерагайопз, АтЬегШе Vеак Сайоп Ехсйапдегз, слабокислотные катионообменники и дианионные слабокислотные катионообменники ΌΟνΒΧ производства 81дта-А1бпсй и Ргас!оде1 ЕМИ СОО- производства ЕМИ); сульфонатную группу (например, Нубгосей 8Р производства Вюсйгот ЬаЬз 1пс., ΟΟνΞΧ Рте Мезй 81гопд Ас1б Сайоп Кезт производства Οο\ν йк|шб 8ерагайопз, ГООзрйеге 8, V 8ийошс производства 1. Т. Вакег, мембрана 8аг!оЬшб 8 производства 8аг!огшз, АтЬегШе 81гопд Сайоп Ехсйапдегз, ^ΟVЕX 81гопд Сайоп производства И1аюп 8!гопд Сайоп Ехсйапдег производства 81дта-А1бйсй); ортофосфатную группу (например, Р11 производства Vйа!таη).

Термин «анионообменная смола» относится к твердой фазе, которая заряжена положительно и с которой за счет этого связан(ы) один или несколько положительно заряженных лигандов. Может быть использован любой положительно заряженный лиганд, связанный с твердой фазе, которая пригодна для формирования катионообменной смолы, например четвертичные аммониевые группы. Имеющиеся в продаже анионообменные смолы включают целлюлозу ИЕАЕ, Рогоз Р1 20, Р1 50, Нр 10, Нр 20, Нр 50, Ό 50 производства Аррйеб Вюзуз!етз, 8аг!оЬтб Р производства 8аг!огшз, Мопор, Μίπίρ, 8оигсе 15Р и 30р, р, ИЕАЕ и АNX 8ерйагозе Раз! Р1оте, Р 8ерйагозе Ыдй Рейогтапсе, РАЕ 8ЕРНАИЕХ™ и РА8Т Р 8ЕРНАРО8Е™ (СЕ Неа1!йсаге),№Р РЕ1, VI’ ХЕЛМ, VI’ СЕАТ производства 1.Т. Вакег, Нубгосей ХЕАЕ и Нубгосей РА производства Вюсйгот ЬаЬз 1пс., υNΟзрйе^е р, Масго-Ргер ОЕАЕ и Масго-Ргер Н1дй р производства Вюгаб, Сегатю НуреЮ р, сегатю НуреЮ ОЕАЕ, Тг1засгу1 М и Ь8 ОЕАЕ, 8рйегобех Ь8 ОЕАЕ, рМА 8рйегозй Ь8, рМА 8рйегозй М и Миз!апд р производства Ра11 Тесйпо1од1ез, ^ΟVЕX Рте Мезй 8!гопд Вазе Туре I и Туре II Ашоп Кезтз и ^ΟVЕX ΜΟNΟ8РНЕΚ Е 77, слабоосновная анионообменная смола производства Οο\ν Ыдшб 8ерагайопз, 1п!егсер! Р тетЬгапе, Ма!гех Сейийпе А200, А500,

- 8 013504

0500 и 0800 производства М1Шроте, Етас!оде1 ΕΜΌ ТМАЕ, Етас!оде1 ΕΜΌ ΌΕΆΕ и Етас!оде1 ΕΜΌ ΌΜΆΕ производства ΕΜΌ, слабо- и сильнокислотные анионообменные смолы АтЬетШе типов I и II, слабо- и сильнокислотные анионообменные смолы ΌΟ\νΕΧ типов I и II, слабо- и сильнокислотные анионообменные смолы О1аюп типов I и II, ЭноШе производства 8фша-А16пс11. Т8К де1 О и ΌΕΆΕ 5Ρν и 5Ρν-ΗΚ, Тоуореаг1 8ирегО-6508, 650Μ и 650С, ΟΆΕ-550Ο и 6508, ΌΕΆΕ-650Μ и 650С производства Тоюк ΟΆ52, ΌΕ23, ΌΕ32, ΌΕ51, ΌΕ52, ΌΕ53, Εxр^е88-Iоη Ό и Εxр^е88-Iоп О производства Vйаίтаη.

Термин «ионообменная смола смешанного типа» обозначает твердую фазу, ковалентно модифицированную катионными, анионными и/или гидрофобными фрагментами. Примерами ионообменных смол смешанного типа являются ΒΆΚΕΚΒΟΝΏ ΆΒΧ™ (Т.Т. Вакег; РЫШрзЬигд, N1), керамический гидроксиапатит типов I и II фторированный гидроксиапатит (ВюВаб; Нетси1е8, СА); МЕР и ΜΒI НурегСе1 (Ра11 Сотротайоп; Εа8ΐ Ηί11β, ΝΥ).

Термин «тиофильный» относится к селективности, которую имеют белки по отношению к сульфоновым группам, находящимся вблизи от тиоэфирных групп (Рота!й и др., 1985). «Тиофильная хроматография», также известная как «тиофильная адсорбционная хроматография», представляет собой один из типов неаффинной хроматографии, при котором очищаемый белок, содержащий тиофильные участки и остатки ароматических аминокислот, связывают с серосодержащим лигандом с целью отделения данного белка. Тиофильный гель может быть приготовлен путем восстановления дивинилсульфона (нанесенного на Сефарозу 4В) под действием β-меркаптоэтанола. Тиофильная адсорбционная хроматография основана на электронных донорно-акцепторных свойствах и отличается от хроматографии, основанной на гидрофобности. Гидрофобная ассоциация и ионные взаимодействия не происходят в случае тиофильных сорбентов, поскольку тиоэтилсульфоновые структуры не обладают выраженной гидрофобностью или ионными зарядами. Примерами коммерчески доступных смол для тиофильной хроматографии являются смолы Етас!оде1 ΕΜΌ ТА ^етск; ВаИ^ау, N1), ИшПоте и 8ирегПо\у (С1оп1есй) и Т-0е1 (Р1егсе).

Термин «твердая фаза» используется для обозначения любой неводной матрицы, с которой могут связываться один или несколько лигандов, или, как альтернатива, в случае эксклюзионной хроматографии, он может относиться к гелевой структуре смолы. Твердой фазой может быть любая матрица, с которой возможно такое связывание лигандов, например, колонка для очистки, дисперсная фаза из дискретных частиц, мембрана, фильтр, гель и т. д. Примерами материалов, которые могут использоваться для формирования твердой фазы, являются полисахариды (такие как агароза и целлюлоза) и другие механически стабильные матрицы, какие как диоксид кремния (например, стекло с контролируемой пористостью), поли(стиролдивинил)бензол, полиакриламид, частицы керамики и производные любых указанных материалов. Настоящее изобретение не ограничено использованием какого-либо конкретного твердофазного материала на стадии хроматографии, и все, обладающие обычной квалификацией в данной области, смогут выбрать твердофазный материал, подходящий для использования в настоящем изобретении.

Термин «поверхностно-активное вещество» относится к ионным, цвиттер-ионным и неионным поверхностно-активным веществам, которые пригодны для предотвращения агрегации белков и для предотвращения неспецифического взаимодействия или связывания примесей с очищаемым белком; они могут входить в состав различных буферов, используемых в настоящем изобретении, в том числе в буферах для дезинфекции, уравновешивания, загрузки, промывки после загрузки, элюирования и десорбции. В некоторых конкретных реализациях поверхностно-активное вещество добавляется к промывочному буферу. Примерами поверхностно-активных веществ, которые могут использоваться в настоящем изобретении, являются, без ограничения указанными материалами: полисорбаты (например, полисорбаты 20 или 80); полиоксамеры (например, полиоксамер 188); Ттйоп; додецилсульфат натрия (8Ό8); лаурилсульфат натрия; октилгликозид натрия; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарилсульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарилсаркозин; линолеил-, миристил- или цетилбетаин; лауроамидопропил-, кокоамидопропил-, линолеамидопропил-, миристоамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропилбетаин (например, лауроамидопропил); миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропил-диметиламин; метилкокоил натрия или метилолеилтаурат динатрия; серия ΜΟNА^υАТ™ ^опа Шбивйтев, Шс., Ра1егвоп, Ν.Ι.); (дера1 СА-630, Р1итошс, Ттйоп, ВВП, ΆΐΕΐδ 02127, 0епаро1, ΗΕСΆΜΕ0, 1.ЫИЮ1. РХ, ΜΕ0Ά, №, ТΗΕ8IТ, Т0РР8, СΗАΡ8, СΗΆΡ8Ο, ΌΌΜΆυ, ΕΜΡI0ΕN ВВ, АVIТТΕВ0ΕNТ и ί.Ί2Ε8. Поверхностно-активное вещество может быть добавлено в любой рабочий буфер, а также в исходный материал, содержащий молекулы очищаемого вещества. Поверхностноактивные вещества могут присутствовать в любом количестве, пригодном для использования в процессе очистки белков, например, от ~0,001 до ~20%, предпочтительно от ~0,01 до ~1%. В одной из конкретных реализаций, в промывочном буфере для катионообменной хроматографии используется ро1увотЬа1е 80.

«Буфер», используемый в настоящем изобретении, представляет собой раствор, который за счет действия своих сопряженных кислотно-основных компонентов противодействует изменению рН при добавлении кислоты или основания. В способе по данному изобретению могут использоваться различные буферы в зависимости от требуемого рН и от того, на какой стадии процесса очистки он используется [см. ВиГГегА Ά Ошбе Гог 1Пе РтератаНоп апб иве о! ВиГГегв ίη Вю1офса1 8у81етв (Буферы. Руководство

- 9 013504 по подготовке и использованию буферов в биологических системах), под ред. СисГГгоу. Ό., 0а1Ьюс11ст СогрогаЕои (1975)]. Без ограничения общности настоящего изобретения примерами компонентов буферов, которые могут быть использованы для контроля диапазона рН, требуемого для применения способа по настоящему изобретению, являются ацетат, цитрат, гистидин, фосфат, аммониевые буферы (например, ацетат аммония), сукцинат, МЕ8, СНЛР8, МОР8, МОР8О, НЕРЕ8, Тгк и т.п., а также их комбинации, ТК18-яблочная кислота-ЫаОН, малеат, хлорацетат, формиат, бензоат, пропионат, пиридин, пиперазин, ΆΌΆ, Р1РЕ8, ЛСЕ8, ВЕ8, ТЕ8, трицин, бицин, ТЛР8, этаноламин, СНЕ8, СЛР8, метиламин, пиперидин, ортоборная кислота, угольная кислота, молочная кислота, бутанандиовая кислота, диэтилмалоновая кислота, глицилглицин, НЕРР8, НЕРР8О, имидазол, фенол, РОР8О, сукцинат, ТЛР8, амины, бензиламин, триметил-, диметил-, этил- и фениламины, этилендиамин и морфолин. При необходимости в состав буфера могут входить дополнительные компоненты (добавки), например, для регулировки ионной силы буфера могут вводиться соли, например хлорид натрия, сульфат натрия и хлорид калия; а также другие добавки, такие как аминокислоты (например, глицин и гистидин), хаотропные агенты (например, мочевина), спирты (например, этанол, маннитол, глицерин и бензиловый спирт), поверхностно-активные вещества (см. выше) и сахара (например, сахароза, маннитол, мальтоза, трегалоза, глюкоза и фруктоза). Компоненты буфера и добавки, как и их концентрации, могут варьироваться в зависимости от типа хроматографии, используемой в рамках настоящего изобретения.

Значения рН и проводимости буферов могут варьироваться в зависимости от стадии процесса очистки, в которой используется буфер. При катионообменной хроматографии рН буфера может находиться в пределах от 3 до 10, предпочтительно рН от 4,0 до 8,0; удельная электропроводность может варьироваться от 0,1 до 40 мСм/см, предпочтительно от 0,5 до 15 мСм/см в зависимости от стадии очистки и от используемого буфера. При гидрофобной хроматографии с индуцированием заряда рН буферов может находиться в пределах от 3 до 10, предпочтительно рН от 4,0 до 9,0; удельная электропроводность может варьироваться от 0,0 (вода для нанесения) до 90,0 мСм/см, предпочтительно от 0,1 до 9,0 мСм/см в зависимости от стадии очистки и от используемого буфера. Буферы, используемые на протяжении процесса очистки, описываются более подробно ниже для каждой из хроматографических стадий.

«Дезинфицирующий» раствор обычно используется для очистки смолы путем удаления связанных с ней загрязняющих компонентов, например органической природы, до проведения процесса очистки. Для этой цели может использоваться любой желаемый буфер при условии, что он совместим с данной конкретной колонкой и смолой, которые выбраны в соответствии со способом по данному изобретению.

Предпочтительно рН дезинфицирующего раствора имеет высокое значение, например рН 10 или выше, предпочтительно рН 11 или выше, более предпочтительно рН 12 или выше; в качестве альтернативы, рН дезинфицирующего раствора может быть низким, например рН 4 или ниже, предпочтительно рН 3 или ниже. В одной из конкретных реализаций колонки для гидрофобной хроматографии с индуцированием заряда и катионообменной хроматографии очищают при помощи дезинфицирующего раствора, включающего 1н. ЫаОН, рН >12.

«Уравновешивающий буфер» используется для регулировки рН и удельной электропроводности хроматографической колонки перед загрузкой в нее смеси, содержащей очищаемый белок, с целью ее очистки. Подходящие буферы, которые могут использоваться для этой цели, хорошо известны в данной области, например буферы, описанные выше; к ним относятся любой буфер при рН, совместимым с выбранной смолой, используемой на хроматографической стадии для очистки целевого белка. Этот буфер используется для загрузки смеси, содержащей очищаемый полипептид. Уравновешивающий буфер имеет такие значения удельной электропроводности и/или рН, чтобы очищаемый полипептид связывался со смолой, либо такие, чтобы очищаемый полипептид проходил через колонку, тогда как одна или несколько примесей связывались на колонке. В предпочтительной реализации уравновешивание хроматографической колонки завершается, когда значения рН электропроводности находятся в пределах ±0,2 и ±0,4 мСм/см от значений для уравновешивающего буфера соответственно, предпочтительно в пределах ±0,1 и ±0,2 мСм/см от значений для уравновешивающего буфера соответственно. В предпочтительных реализациях уравновешивающий буфер для гидрофобной хроматографии с индуцированием заряда и катионообменной хроматографии основан на фосфате натрия. При катионообменной хроматографии рН уравновешивающего буфера находится в пределах от ~3 до 9, предпочтительно от ~4,0 до 8,0, а электропроводность - от ~0,1 до 40 мСм/см, предпочтительно от ~0,5 до 10,0 мСм/см. При гидрофобной хроматографии с индуцированием заряда рН уравновешивающего буфера находится в пределах от ~5 до 10, предпочтительно от ~6 до 9, а электропроводность - от ~0,0 (вода для нанесения) до 90 мСм/см, предпочтительно от ~2,0 до 9 мСм/см.

«Загрузочный буфер» используется для загрузки смеси, содержащей очищаемый белок, в колонку. В качестве загрузочного буфера может быть использован любой подходящий раствор. Значения электропроводности и рН загрузочного буфера в данном процессе подбираются такими, чтобы очищаемый белок связывался со смолой, а примеси могли проходить через колонку. Предпочтительно, чтобы загрузочный буфер можно было подвергнуть обмену буфера. Загрузочный буфер может также приготовляться из буферной смеси, полученной на предыдущий стадии очистки, например, из буфера для элюирования.

- 10 013504

Подходящие буферы для использования в качестве загрузочного буфера для выбранной смолы хорошо известны в отрасли; например, могут использоваться буферы, описанные выше. Все, обладающие обычной квалификацией в данной области, должны понимать, что загрузочные буферы для катионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии с индуцированием заряда могут использоваться при сравнимых (если не одинаковых) значениях рН и электропроводности, как описано выше, для уравновешивающих буферов для методов катионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии с индуцированием заряда.

Термины «промывочный буфер» и «промывка после загрузки», используемые в настоящем документе, обозначают буфер, используемый для элюирования одной или нескольких примесей из ионообменной смолы до элюирования очищаемого белка. Термин «промывка» и его различные грамматические формы используются для описания пропускания подходящего промывочного буфера через хроматографическую смолу или над ней. Удобно то, что промывочный, уравновешивающий и загрузочный буферы могут совпадать, хотя это и не обязательно. Значения рН и электропроводности буфера таковы, что одна или несколько примесей элюируются из смолы, тогда как очищаемый полипептид удерживается на смоле. При необходимости промывочный буфер может содержать поверхностно-активное вещество, как описано выше, например полисорбат. Для очистки очищаемого белка может использоваться любой подходящий буфер со значением рН, совместимым с выбранной смолой, например, описанные выше буферы. Выбор значений рН и электропроводности промывочного буфера важны для удаления БКХ и других примесей без существенного элюирования очищаемого белка. Как электропроводность, так и рН могут быть снижены, сохранены либо повышены в промывочных буферах, используемых на последующих стадиях промывки для катионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии с индуцированием заряда после загрузки смеси с целью удаления более гидрофильных, более кислотных или более основных примесей по сравнению с очищаемым белком и для снижения электропроводности системы до проведения стадии элюирования. В одной из конкретных реализаций в случае гидрофобной хроматографии с индуцированием заряда снижают только электропроводность, а промывки после загрузки для катионообменнной хроматографии не включают изменения ни рН, ни электропроводности буферов, используемых для уравновешивания, загрузки и промывки после загрузки.

В одной из конкретных реализаций промывочный буфер, используемый для катионообменной хроматографии, представляет собой фосфат натрия. Значение рН промывочного буфера, используемого в катионообменной хроматографии, может быть от ~3 до ~9, предпочтительно от ~4,0 до ~8,0; электропроводность - от ~0,1 до ~40 мСм/см, предпочтительно от ~0,5 до ~10 мСм/см.

В качестве промывочного буфера для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом может использоваться любой подходящий буфер для достижения желаемого рН и электропроводности, который может быть выбран из описанных выше буферов. В одной из конкретных реализаций в качестве промывочного буфера для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом используется фосфат натрия. Значение рН промывочного буфера, используемого в гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом, может быть от ~5 до ~10, предпочтительно от ~6 до ~9; электропроводности - от ~0,0 (вода для нанесения) до ~90 мСм/см, предпочтительно от ~0,1 до ~9 мСм/см.

Термин «элюирующий буфер», используемый в настоящем документе, относится к буферу, используемому для элюирования очищаемого белка из твердой фазы (т. е. хроматографической смолы). Термин «элюировать», а также его различные грамматические формы, относится к удалению молекулы, например, очищаемого полипептида, из хроматографического материала путем создания надлежащих условий, например, изменением ионной силы или рН буфера, окружающего хроматографический материал, путем добавления конкурирующего с лигандом вещества, путем изменения гидрофобности молекулы или путем изменения химической природы лиганда (например, его заряда), так что очищаемый белок становится неспособен связываться со смолой и поэтому элюируется из хроматографической колонки. Термин «элюат» относится к раствору, выходящему из колонки и содержащему очищаемый полипептид в результате элюирования колонки. После элюирования очищаемого полипептида колонка может быть при необходимости регенерирована, дезинфицирована и отправлена на хранение.

Значения рН и электропроводности элюирующего буфера выбирают таким образом, чтобы очищаемый белок элюировался из конкретной смолы для катионообменной хроматографии или гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом, использованной в процессе. Буферы, пригодные для использования в качестве элюирующих буферов, описаны выше. В одной из конкретных реализаций элюирующий буфер, используемый в катионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом, представляет собой фосфат натрия и ацетат натрия соответственно.

Значение рН элюирующего буфера, используемого в катионообменной хроматографии, может быть от ~3 до ~10, предпочтительно от ~4 до ~8, а электропроводности - от ~0,1 до ~40 мСм/см, предпочтительно от ~5 до ~15 мСм/см.

Значение рН элюирующего буфера, используемого в гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом, может быть от ~3,0 до ~7,0, предпочтительно от ~4,0 до ~6,0, а электропроводности - от ~0,0 (вода для нанесения) до ~20 мСм/см, предпочтительно от ~0,1 до ~2 мСм/см.

При необходимости можно использовать дополнительные растворы для подготовки колонки к по

- 11 013504 вторному использованию. Например, для «десорбции» или удаления прочно связанных примесей из колонки, использованной в процессе очистки, может использоваться «регенерационный раствор». Как правило, регенерационный раствор имеет электропроводность и рН, достаточные для удаления из смолы практически любых оставшихся загрязнений и очищаемого белка.

Используемый в настоящем документе термин «электропроводность» относится к способности водного раствора проводить электрический ток между двумя электродами при определенной температуре. Ток протекает через раствор по механизму ионного транспорта. В связи с этим, при увеличении количества ионов, присутствующих в водном растворе, электропроводность раствора повышается. В способе по настоящему изобретению температура, при которой обычно выполняется очистка, обычно составляет от ~4 до ~37°С, предпочтительно от ~15 до ~25°С в указанном диапазоне рН.

Электропроводность выражается в миллисименсах на сантиметр (мСм/см) и может быть измерена при помощи стандартного кондуктометра. Электропроводность раствора можно изменять, изменяя концентрацию ионов в нем. Например, для достижения желаемой электропроводности можно изменить концентрацию буферирующего агента и/или концентрацию соли (например, ИаС1 или КС1) в растворе. Предпочтительно для достижения желаемой электропроводности изменяют концентрацию соли, как описано ниже в примере.

Величина «р1» или «изоэлектрическая точка» полипептида обозначает рН, при котором положительный заряд на полипептиде уравновешивает его отрицательный заряд. Величина р1 может быть рассчитана с помощью разных типовых методов, например исходя из суммарного заряда остатков аминокислот и/или сиаловых кислот на полипептиде, либо методом изоэлектрофокусировки.

Используемый в настоящем документе термин «выдержка при низком рН» описывает снижение рН элюата, содержащего очищаемый белок, причем рН снижают ниже 5,0, предпочтительно ниже ~4,0, предпочтительно ниже ~3,7, наиболее предпочтительно до рН 3,4-3,6 для достижения инактивации вирусов (т.е. уменьшение логарифма вирусного титра по крайней мере на 2, предпочтительно по меньшей мере на 3), с последующим повышением рН для подготовки элюата для второй хроматографической стадии или для нанесения продукта на матрицу, обеспечивающую стабильную молекулярную целостность очищаемого продукта. Снижение рН для выдержки при низком рН может быть достигнуто обработкой элюата, содержащего очищаемый белок, любой подходящей кислотой, например 1н. НС1 или ледяной уксусной кислотой. Для возвращения рН элюата к более нейтральным значениям можно использовать любое подходящее основание, например 1н. ЫаОН или 1н. Тпу Выдержка при низком рН обычно приводит к увеличению электропроводности по меньшей мере на 0,5 мСм/см. Если выдержка при низком рН выполняется после первой хроматографической стадии и вторая хроматографическая стадия является катионообменной хроматографией, вероятно, что рН будет повышено до приемлемого диапазона рН, т.е. от ~3,0 до ~9,0, предпочтительно ~4,0-8,0. Если выдержка при низком рН выполняется после первой хроматографической стадии и вторая хроматографическая стадия - гидрофобная хроматография с индуцированным зарядом, то рН, вероятно, будет повышено до значений, пригодных для проведения гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом, т.е. рН от ~5 до ~10, предпочтительно от ~6 до ~9. Выдержка при низком рН может также выполняться после второй хроматографической стадии, однако в способе по настоящему изобретению решено проводить ее между хроматографическими стадиями для удобства проведения экспериментов. Все, обладающие обычной квалификацией в данной области, согласятся, что стадия выдержки при низком рН не является существенной для достижения уровня чистоты, который обеспечивает способ по настоящему изобретению.

«Фильтрация с тангенциальным потоком» («сго55По\\· ййтайоп») описывает процесс фильтрования, при котором смесь с образцом циркулирует сверху от мембраны, а накладываемое давление заставляет некоторые из растворенных веществ и маленьких молекул проходить сквозь мембрану. В методе фильтрации с тангенциальным потоком, как правило, раствор протекает параллельно фильтрующей мембране. Перепад давлений на мембране заставляет жидкость и фильтрующиеся растворенные вещества (т. е. молекулярная масса которых меньше молекулярной массы мембраны или ведущие себя подобным образом, например, глобулярные белки) проходить через фильтр. Этот процесс может проводиться как непрерывный, поскольку раствор многократно пропускается над мембраной, в то время как жидкость, проходящая сквозь фильтр, непрерывно отводится в отдельный контур. В методе НРТРР (высокоэффективная фильтрация с тангенциальным потоком) мембрана является заряженной, и тем самым для отделения примесей используется как размер, так и заряд молекул (см. патентную публикацию США № 2003/0229212). Если требуется, фильтрация с тангенциальным потоком может использоваться для замены буфера, в котором очищаемый белок растворялся, на другой буфер, который является более подходящим для связывания с хроматографической смолой перед использованием способа по настоящему изобретению. Другими словами, фильтрация с тангенциальным потоком может использоваться перед первой хроматографической стадией, однако стадия фильтрации с тангенциальным потоком в ходе процесса (т. е. фильтрация с тангенциальным потоком между двумя хроматографическими стадиями) не является необходимой, поскольку буферы и смолы, используемые в настоящем способе, обеспечивают возможность непосредственного перехода с одной смолы на другую.

Используемый в настоящем документе термин «в ходе процесса» относится к любой методологии,

- 12 013504 стадии, операции и т.д., выполняемым после начала стадии загрузки в первую хроматографическую колонку, но до сбора пика элюирования из второй хроматографической колонки в способе по настоящему изобретению. Методология, используемая в ходе процесса, может непосредственно приводить к изменению степени чистоты (например, при фильтрации с тангенциальным потоком в ходе процесса) или не приводить к этому (например, при регулировке рН и/или электропроводности, если непосредственным результатом этой регулировки не является изменение степени чистоты).

Может быть желательно добиться степени чистоты белка, пригодной для применения в лекарственных средствах, используя способ по настоящему изобретению; в этом случае могут быть использованы дополнительные стадии, хорошо известные в отрасли, для достижения очистки от вирусов, как адвентивных, так и эндогенных, например, методы инактивации при низком рН и фильтрации вирусов, в том числе специфические методы фильтрации через заряженные мембраны для вирусов, такие как УК ΟϋΝΘ (СиЫО) или ЭУ20 (Ра11 Тсс11по1ощс5). описанные ниже.

Используемый в настоящем документе термин «объемная фильтрация» обозначает метод фильтрации, в котором используются объемные фильтры, которые обычно характеризуются своей конструкцией, позволяющей удерживать частицы в объеме матрицы фильтра. Емкость объемного фильтра обычно определяется его глубиной, т.е. параметрами основы (10 или 20) и соответственно удерживающей способностью по отношению к твердым частицам. В способе по настоящему изобретению объемный фильтр может использоваться для повышения степени очистки от вирусов при данной схеме очистки, однако это необязательная стадия, не являющаяся необходимой для достижения степени очистки, достигаемой способом по настоящему изобретению. Объемный фильтр для удаления вирусов может быть использован в любой точке схемы очистки, однако предпочтительно его использовать после первой хроматографической стадии с низкими обрабатываемыми объемами ввиду высокой стоимости фильтра.

Описание процесса.

В способе по настоящему изобретению для очистки очищаемого белка до чистоты 100 млн^-1 БКХ и менее, а также до чистоты мономера 99% и выше могут использоваться катионообменная хроматография и гидрофобная хроматография с индуцированным зарядом, проводимые в произвольном порядке. Для достижения такой высокой степени очистки не требуются дополнительные хроматографические стадии.

Очищаемый белок может вырабатываться живыми клетками хозяина, созданными методами генной инженерии для выработки данного белка. Методы генной инженерии для создания клеток, вырабатывающих нужные белки, хорошо известны в отрасли. См., например, СитгеШ Рто1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду [Современные методы в молекулярной биологии] (№11еу, Νο\ν Уотк) под ред. АикаЬе1 и др. (1990) и патенты США № 5534615 и 4816567, которые включены сюда целиком в виде ссылок. К таким методам относятся введение нуклеиновых кислот, кодирующих и разрешающих экспрессирование белка в живую клетку. Эти клетки хозяина могут быть бактериальными клетками, грибными клетками или, предпочтительно, животными клетками, выращенными в культуре. К бактериальным клеткам хозяина относятся, без ограничения, клетки Е. со11. Примеры подходящих штаммов Е. сой: НВ101, ΌΗ5α, СМ2929, 1М109, К№251, ΝΜ538, ΝΜ539, а также любой штамм Е. со11, не расщепляющий чужеродные ДНК. К грибным клеткам, которые могут быть использованы, относятся, без ограничения, клетки 8ассйатотусек сетеуШае, РюЫа раЧопк и АкретдШик. Несколько примеров животных клеток, которые могут быть использованы: СНО, УЕКО, ΌΧΒ11, ВНК, НеЬа, Сок, МЭСК, 293, 3Т3, N80 и №1138. С использованием методов, известных квалифицированным в данной области специалистам, могут быть созданы новые линии животных клеток (например, путем трансформации, заражения вирусом и/или отбора). В некоторых конкретных реализациях очищаемый белок вырабатывается клетками яичника китайского хомячка (СНО) (см., например, патент №0 94/11026). Известны различные типы клеток СНО, например, СНО-К1, СНОΌ644, СНО-ЭХВ11, СНО/бЫт и СНО-8.

Приготовление смеси для очистки белка от продуктов распада клеток прежде всего зависит от способа выработки белка. Некоторые белки выделяются из клетки прямо в окружающую питательную среду, тогда как другие белки остаются внутри клетки. В случае таких белков, вырабатываемых внутриклеточно, клетка может быть разрушена при помощи любого из различных методов, таких как механический сдвиг, осмотический шок и обработка ферментами. При разрушении все содержимое клетки высвобождается в гомогенат; кроме того, образуются субклеточные фрагменты, которые могут быть удалены центрифугированием или фильтрацией. Аналогичная проблема возникает, хотя и в меньшей степени, при выделении белков прямо в питательную среду ввиду естественной гибели клеток и высвобождения внутриклеточных белков хозяина в ходе процесса выработки белка.

При использовании рекомбинантных методов очищаемый белок может вырабатываться либо внутриклеточно, в периплазматическом пространстве, либо прямо выделяться в среду. Способ по настоящему изобретению не опирается на какую-то конкретную методологию удаления продуктов распада клеток. Для достижения этой цели опытный практик может использовать любой из этих методов. Если белок вырабатывается внутриклеточно, в качестве первой стадии приготовления смеси для очистки можно удалить дисперсные частицы, будь то клетки хозяина или разрушенные фрагменты, например, путем центрифугирования или фильтрования. Если белок выделяется в среду, смесь для очистки может быть приготовлена путем отделения рекомбинантных клетки хозяина от среды для выращивания клеток, напри

- 13 013504 мер, методами фильтрации с тангенциальным потоком или объемной фильтрации.

Согласно настоящему изобретению, как только получена смесь, содержащая очищаемый белок, ее отделение от загрязнений в смеси производится комбинацией методов гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом и катионообменной хроматографии в произвольном желаемом порядке (см. чертеж) при подходящих условиях, как описано выше в настоящем документе. Никаких других стадий в ходе процесса очистки, например фильтрации с тангенциальным потоком или НРТЕЕ, не требуется для достижения степени очистки, обеспечиваемой способом по настоящему изобретению. При необходимости выполняются лишь операции по регулировке рН между обеими хроматографическими стадиями с целью подготовки смеси к очистке на втором этапе хроматографии.

В одной из конкретных реализаций для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом используется смола МЕР НурегСе1 (Ра11 Согр.), а для катионообменной хроматографии используется смола Рогоз 50НЗ (Аррбеб В1озуз1етз). Эти хроматографические методы позволяют разделять смеси белков на основе их различных свойств, в том числе заряда и гидрофобности. По существу, эти методы разделения заставляют белки и другие молекулы двигаться с разными скоростями вниз по длинной колонке для достижения физического разделения по мере движения вещества вниз по колонке. При подходящих условиях, как описано выше в настоящем документе, хроматографические стадии позволяют очищаемому белку удержаться в колонке, при том что остальные вещества проходят через колонку. Очищаемый белок затем подвергается дифференциальному элюированию подходящим буфером. В качестве альтернативы, при подходящих условиях очищаемый белок может быть отделен от примесей за счет закрепления примесей на колонке, в то время как очищаемый белок проходит через колонку, т. е. очищаемый белок находится в протекающем через колонку растворе.

Все, обладающие обычной квалификацией в рассматриваемой области, поймут то, что при желании в данный способ может быть добавлена стадия выдержки при низком рН. Ввиду требований по содержанию вирусов, предъявляемых органами государственного регулирования к производству белков для применения в лекарственных средствах, должно быть не менее 2 отдельных стадий инактивации вирусов и очистки от них, основанных на различных химических принципах, - обычно это стадии выдержки при низком рН и стадия фильтрации вирусов. Выдержка при низком рН обычно включает в себя сдвиг рН образца, подвергаемого очистке (например, см. пример ниже) и может быть объединена с операциями по регулировке рН, необходимыми для подготовки ко второй хроматографической стадии. Все, обладающие обычной квалификацией в рассматриваемой области, поймут, что выдержка при низком рН между двумя хроматографическими стадиями может быть выполнена при помощи любой методологии, известной в данной области для очистки от вирусов, обычно проводимой путем выдержки при низком рН, при условии, что смесь с очищаемым белком должным образом буферирована до ее введения во вторую колонку.

Например, без намерения ограничить область настоящего изобретения, выдержка при низком рН вслед за гидрофобной хроматографией с индуцированным зарядом может быть выполнена с использованием 1н. НС1 или ледяной уксусной кислоты для снижения рН элюата гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом до диапазона от ~3,4 до 3,6 с последующим введением 2 М Тпз с рН 9,0 для повышения рН элюата до ~6,2; в качестве альтернативы, вслед за катионообменной хроматографией 1н. НС1 или ледяная уксусная кислота могут быть использованы для снижения рН элюата катионообменной хроматографии до рН в диапазоне от 3,4 до 3,6 и 2 М Тпз с рН 9,0 - для повышения рН элюата до ~7,0. Выдержка при низком рН, как правило, приведет к возрастанию электропроводности по меньшей мере на 0,5 мСм/см.

Все, обладающие обычной квалификацией в рассматриваемой области, поймут выбор длительности стадии выдержки при низком рН, используемой в способе по настоящему изобретению. Обычно выдержка при низком рН выполняется в течение не менее 30 мин, предпочтительно ~45 мин, предпочтительно до ~60 мин и наиболее предпочтительно до ~90 мин. В некоторых схемах очистки может быть желательно выполнить выдержку при низком рН в течение до 5 ч, в зависимости от очищаемого белка.

Если требуется получить белок чистоты, пригодной для изготовления лекарственных средств, может быть проведена вторая стадия очистки от вирусов, например стадия фильтрации вирусов, которая, однако, не является необходимой для достижения степени очистки, обеспечиваемой настоящим изобретением. Устройства для фильтрации, которые могут быть использованы в способе по настоящему изобретению, хорошо известны в данной области (например, ИШрог® УЕ Сгабе ЭУ20 или ЭУ50 и ИНгоп® ТЕЕ (Ра11 Согрогайоп, Еаз! Н111з, ΝΥ); УйезоАе (Мййроге, ВШейса, МА); УК СИИО (СИИО; Мейбеп, СТ); Р1аηоνа® (АзаЫ Казе1 Рйагта, Р1апоνа ОМзюп, ВиГГа1о Сго\^ге. 1Ь)), для удаления вирусов и других биологических материалов, предпочтительно с размером пор менее 20 нм, пригодные для удаления полиовирусов.

Хроматографические стадии настоящего изобретения могут выполняться с применением любых механических средств. Хроматография может выполняться в колонке. Колонка может эксплуатироваться под давлением или без него, а также в направлении сверху вниз либо снизу вверх. В течение хроматографического процесса направление протекания жидкости в колонке может изменяться на противопо

- 14 013504 ложное. Хроматография может также выполняться в периодическом режиме, при котором твердофазный носитель отделяют от жидкости, использованной для загрузки, промывки и элюирования образца, любыми подходящими средствами, включая использование гравитации, центрифугирование или фильтрацию. Хроматография может также выполняться путем приведения образца в контакт с заряженным фильтром, который абсорбирует или удерживает некоторые молекулы из образца сильнее, чем другие, за счет тех же химических принципов, как и те, которые описаны для хроматографической смолы. Хотя стадии подготовки колонок, используемых в настоящем изобретении, могут быть модифицированы в соответствии с индивидуальными потребностями практика, последующее описание приводится в качестве руководства; те, кто имеет обычную квалификацию в данной области, легко поймут, какие изменения они могут сделать, не отходя от духа изобретения. Колонки подготавливают согласно инструкциям производителя. Перед проведением очистки колонки, как правило, дезинфицируют при помощи дезинфицирующего раствора, затем заряжают с помощью лиотропной соли, например, 1 М ЫаС1, и уравновешивают с помощью уравновешивающего буфера. Во время стадии дезинфекции, как правило, колонку выдерживают, например, в течение ~30 мин, предпочтительно ~1 ч, после введения в колонку дезинфицирующего раствора, чтобы очистить смолу, имеющую какие-либо связанные примеси, включая примеси биологической природы. На стадии зарядки происходит нейтрализация смолы путем вытеснения дезинфицирующего раствора, например, в катионообменной хроматографии для вытеснения ΝαΟΗ из колонки и сохранения контакта лиганда смолы с положительно заряженными ионами можно использовать №С1. После того как колонка заряжена, используется уравновешивающий буфер для приведения колонки в равновесие с целью подготовки рН и электропроводности смолы к связыванию очищаемого белка. Например, колонка может считаться уравновешенной, когда ее рН и электропроводность находятся в пределах ±0,1 и ±0,2 мСм/см относительно рН и электропроводности уравновешивающего буфера соответственно.

Готовят смесь для загрузки, которая по сути представляет собой супернатант клеточной культуры, который концентрируют и заменяют в нем буфер при помощи подходящей буферной соли (т.е. загрузочный буфер). Смесь для загрузки (т.е. содержащая очищаемый белок, который требуется очистить), полученную из рекомбинантных клеток хозяина, загружают в уравновешенную колонку (либо для катионообменной хроматографии, либо для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом) при помощи буфера для загрузки, который может быть тем же, что и уравновешивающий буфер. По мере того как смесь протекает через твердую фазу в колонке, очищаемый белок и другие примеси (например, белки клеток хозяина, если белок вырабатывается в клетках яичника китайского хомячка) по-разному связываются с твердой фазой, что позволяет провести разделение, по мере того как белок и примеси проходят через хроматографическую колонку.

После того как смесь загружена в колонку и связалась со смолой, выполняются описанные стадии промывки с помощью промывочного буфера для очистки колонки от загрязнений. При желании, первую стадию промывки можно провести при более низкой скорости потока, чем для остальных стадий промывки и элюирования (однако это не является необходимым), например, используя такую скорость потока, которая соответствует продолжительности пребывания в несколько минут (например, 5-10 минут). Более подробное обсуждение вопроса о скорости потока см. ниже. Во время первой промывки важное значение имеют рН и электропроводность промывочного буфера, особенно для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом, с целью максимального удаления БКХ. В настоящем способе на стадии промывки в катионообменной хроматографии удаляются нуклеиновые кислоты и оставшиеся БКХ, а очищаемый белок остается. На первой стадии промывки в гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом удаляются БКХ, а на второй стадии промывки удаляются более гидрофильные примеси, например БКХ. Гидрофобная хроматография с индуцированным зарядом очень эффективна для удаления нуклеиновых кислот, поскольку оно в основном протекает в несвязанной части раствора. Если в качестве первой колонки используется гидрофобная хроматография с индуцированным зарядом, можно провести третью стадию промывки для дальнейшего уменьшения количества гидрофильных загрязнений.

Для элюирования нужного белок из колонки используют подходящий элюирующий буфер, как описано выше, для того, чтобы обратить связывание очищаемого белка на колонке. Тип и концентрация буфера, соли и/или других компонентов в составе буфера таковы, что буфер элюирует примесь(и) поразному по сравнению с очищаемым белком, тогда как очищаемый белок удерживается по сравнению с примесями. Подходящие диапазоны рН и электропроводности для загрузочных, промывочных и элюирующих буферов могут быть легко определены всеми, кто имеет обыкновенную квалификацию в данной области, используя приведенный в качестве руководства пример, так чтобы обеспечить извлечение очищаемого белка во время элюирования. Чтобы минимизировать содержание БКХ в элюате, содержащем очищаемый белок, можно использовать пониженную скорость потока, как описано ниже, например такую, чтобы соответствующее время пребывания было не более 2 мин, предпочтительно не более 3 мин, более предпочтительно не более 10 мин. По мере того как очищаемый белок удаляется из колонки, он собирается на основе величины пика поглощения между точкой подъема А₂₈₀ и снижения А₂₈₀ между 5 и 25% выше базовой линии. Базовая линия может быть легко определена всеми, имеющими обычную квалификацию в данной области, путем измерения поглощения уравновешивающего буфера при 250-280 нм

- 15 013504 во время прохождения буфера через колонку. Чтобы уменьшить сбор БКХ для получения очищенной смеси, содержащей очищаемый белок, предпочтительно собирать элюат, содержащий очищаемый белок, до 25% от максимальной высоты пика, поскольку БКХ имеют тенденцию элюироваться позже или более низких значениях рН в случае смолы для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом.

По существу, методы разделения, используемые в настоящем изобретении, вынуждают примеси двигаться с разными скоростями по длинной колонке, что приводит к физическому разделению, увеличивающемуся по мере их дальнейшего продвижения по колонке, тогда как очищаемый белок связывается с хроматографической средой и затем подвергается дифференциальному элюированию в зависимости от буфера. В данном способе очистки максимальная скорость движения смеси вниз по колонке (гидрофобная хроматография с индуцированным зарядом или катионообменная хроматография) такова, что время пребывания составляет не более 30 мин, предпочтительно не более 10 мин, более предпочтительно не более 6 мин, еще более предпочтительно не более 3 мин, наиболее предпочтительно не более 2 мин. В одной из конкретных реализаций настоящего изобретения скорость потока на стадии катионообменной хроматографии соответствует времени пребывания не более 2 мин; на стадии гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом оно составляет не более 3 мин. Хотя скорость потока не является существенной для получения степени чистоты, которую обеспечивает способ по настоящему изобретению, эти скорости приводятся для сведения. Все, обладающие обычным уровнем квалификации в данной области, могут изменять скорость потока по необходимости.

Предпочтительной мерой степени очистки белка с помощью процесса по данному изобретению является степень удаления белка клеток хозяина. Очищенный белок предпочтительно является гомогенной смесью, как определено выше. Концентрация белка в образце на любой стадии очистки может быть определена любым подходящим методом. Такие методы хорошо известны в данной области; к ним относятся: 1) колориметрические методы, такие как анализ по Лоури, анализ по Бредфорду, анализ по Смитсу, анализ с использованием коллоидного золота; 2) методы, использующие поглощение белков в УФспектре; 3) визуальная оценка по окрашенным полосам белков с их сравнением со стандартными белками, взятыми в известном количестве, на том же геле. См., например, 81озсНек (1990), ОиапШаРоп о£ Рго1ешз, в СшЕе 1о РгсЯет РипйсаЕоп, Ме11юЕз ίη Епгуток 182: 50-68. Степень загрязнения белка в гомогенной композиции, содержащей очищаемый белок, может быть определена различными методами, известными в данной области, например методом иммуноферментного твердофазного анализа (ЕБ18А; см., например, Вееп (1994), Епхуте-ЫпкеЕ 1ттипозогЬеп1 Аззау (ЕЫ8А), в Вазк Рго1ет апЕ Рер11Ее Рго1осо1з, МеЛюЕз Мо1. Вю1. 32: 461-466; указанный документ включен сюда целиком в виде ссылки).

Количество ДНК, которое может присутствовать в гомогенной смеси, содержащей очищаемый белок, может быть определено любым подходящим методом. Например, может быть использован анализ, основанный на цепной полимеразной реакции. Количество ДНК может быть снижено до величин меньше 10 пг/мг.

Белок, полученный указанными методами, может быть введен в биофармацевтически приемлемую композицию и использоваться для различных диагностических, терапевтических и других применений, известных для таких молекул.

После сбора элюата, содержащего очищаемый белок, все белки, которые могли остаться связанными в колонке, могут быть высвобождены путем их десорбции из хроматографической среды раствором, содержащим буфер или соль, которая использовалась для хроматографии, но при более высокой молярности или при другом значении рН. Колонка может быть регенерирована с помощью раствора (например, раствора для регенерации), результатом действия которого явится высвобождение основной части или всех белков из хроматографической среды, а также уменьшение или ликвидация микробных загрязнений, которые содержались в хроматографической среде. После этого колонку можно промыть и хранить ее в растворе, препятствующем росту микробов. Такой раствор может содержать гидроксид натрия, однако могут быть использованы и другие реагенты, такие как этанол, азид натрия, бензиловый спирт или лиотропные соли в высокой концентрации.

Нижеследующий пример приведен с целью иллюстрации настоящего изобретения и не предполагает ограничения рамок изобретения.

Пример.

Данный пример описывает очистку антител с использованием способа очистки по настоящему изобретению. Были приготовлены полностью человеческие антитела против антигена, ассоциированного с активированными Т-клетками (СТЬА-4), и опухолеассоциированный антиген (0Ό30) на основе мышей МеЕагех'з НиМАЬ Моизе®. Трансфектомы были приготовлены из клеток СНО Ό644. Клеточная культура была приготовлена с использованием синтетической, свободной от сыворотки среде с четко определенным составом, с нейтральным рН (7-8) и электропроводностью 10-16 мСм/см. Клетки ЭС44 СНО были выращены до плотности 3-10х10⁶ клеток/мл. Клеточную культуру осветляли фильтрованием через фильтр 60МО2 ОАО (МепЕеп, СТ). Полученный в результате супернатант клеточной культуры концентрировали и подвергали диафильтрации в 35 или 70 мМ растворе фосфата натрия, рН 6,2. Для экспериментов, где в качестве связывающей смолы используется МЕР Нурегсе1, подаваемый в колонку раствор

- 16 013504 был доведен до рН 7 путем титрования концентрированного супернатанта клеточной культуры, подвергнутого диафильтрации, 1 М раствором ЫаОН. Очистка смесей, содержащих одно из двух упомянутых антител, выполнялось по каждому из направлений, описанных ниже.

В табл. 1 и 2 приведены примеры двух стадий процесса очистки по настоящему изобретению для производства белковых материалов, пригодных для приготовления лекарственных средств. В данном процессе (А) в качестве первой стадии неаффинной хроматографии была использована катионообменная хроматография (табл. 1) на смоле Рогоз 50Н8 для связывания, с последующей выдержкой при низком рН с использованием 1н. НС1 или ледяной уксусной кислоты для снижения рН элюата до 3,4-3,6 и 2 М Тпз с рН 9,0 для увеличения рН фракции до 7,0. В качестве второй неаффинной стадии использовали гидрофобную хроматографию с индуцированным зарядом (табл. 2) и смолу МЕР НурегСе1 для связывания. Выдержка при низком рН, как правило, приводила к возрастанию электропроводности на 2 мСм/см. Процесс проводился с использованием уравновешивающего, загрузочного, промывочного и элюирующего буферов для соответствующих смол, как указано в табл. 1 и 2. Ни на одной из стадий очистки не использовалась смена буфера, т.е. образец после одной хроматографической стадии, подаваемый на следующую, подвергается только изменениям рН на стадии выдержки при низком рН.

Проводили также другой процесс (В) для получения белкового материала, пригодного для использования в лекарственных средствах, в котором стадии катионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом проводились в обратном порядке, т. е. вначале проводились стадии, указанные в табл. 2, а затем - стадии, указанные в табл. 1. Первой неаффинной хроматографической стадией была гидрофобная хроматография с индуцированным зарядом на смоле МЕР НурегСе1 для связывания, как описано в табл. 2. Выдержку при низком рН с использованием 1н. НС1 или ледяной уксусной кислоты проводили путем снижения рН элюата после МЕР до 3,4-3,6 с последующим введением 2 М раствора Тпз, имеющего рН 9,0, для повышения рН фракции до 6,2. Выдержка при низком рН обычно приводила к повышению электропроводности на ~2 мСм/см. Второй хроматографической стадией являлась катионообменная хроматография с использованием смолы Рогоз 50Н8 для доочистки, как описано в табл. 1. Процесс проводили с использованием уравновешивающего, загрузочного, промывочного и элюирующего буферов для соответствующих смол, как указано в таблицах. Ни на одной из стадий очистки не использовалась смена буфера, т.е. образец после одной хроматографической стадии, подаваемый на следующую, подвергается только изменениям рН на стадии выдержки при низком рН.

- 17 013504

Таблица 1

Катионообменная хроматография для связывания или доочистки антител: краткое изложение основных деталей процесса. Связывающая способность была постоянна и равной 15 мг/мл смолы. Скорости потока выражаются в виде соответствующих времен пребывания для обеспечения большей гибкости эксперимента. Рабочая температура варьировалась в пределах 15-25°С. №1Р - фосфат натрия.

Стадия

Т-мствпр 'Элсюгй&^'Я; Макс.

⁴--->к* 1 -¹-»· А::,,;

РЧ ................................

- \ проводппсть ! ЦК .'|и -1

- (мС'С*1) .·· ООЪС’ -I .^!,- мах г Г -•КОИОН*· !, К11) · рит ерии.процщъкншя обработки Л·>

Я- .......

.|Ί·

-Дезинфек- . ция ·.,?	1н.Ч.СН-1	12 ,	- · “	2 3;.		.. Обмчпо еидержка-еосравляй 1 чгйфнайинм с момента •Λοϋ*1/ раствора' ·Α·βτ - ' кЬлонку/'^гДанная -стадия . Предназначена .ДЛЯ? ^Чистки- СЦОЛЫ'ДОТ -связанных - -дер^ейн]!!·' ’включгйу'/затризненк!» ^;ёполсп{Ческо15 природы: .: Λ;ίййн’ГЙ??:-' > <ЬЭ:· ; . '
							МаС1 вытесняет ИаОН из колонки, при этом
Зарядка	1 М ЫаС1	-	90	> 3		2	происходит централизация, а лиганд смолы остается в контакте с ионами натрия.
							Клпочкя.·. ·-· урЯВНЛВСТПСНЯ,·'Λ-Г КЛТ-Д^: :ϊ:<’:;ΐίΗ . . и ;^л^ктрюпроводйость -равны ±0.1. и £ Ο.-2'.мСсм от.
			’ 7:- =/ :·:=· ..· Σ. ? :	= ^ ;		·. ·' г ’ · ;
''.-У···..'·,			~ .З.... ДЛЯ .				шсогяветйгвуюпщх?;;' значенийав /.ураенеиешивающсго
нУраьновс- .·	Ας НШ1		ЗЗмМНаР				: 0уферй::С'а0дюде1Гйе;дна11ааон6'вч>дейропр^^шости:И
,:пшвакиг	70 мМ На?	6.2	~ 5.3 для	>3		2 . .	’ ]>Ηί·является важным ..-для :=связыван1й^шй1й№йаи:при одновременной:· 7^м1Ш11м']{защиглЗ<:евяз^ёан11я и: белков
			70 мМ ЫаР				клеток- хозяина.1!’ '·'- Необходимо-'^ЧтбпрльзрватБ
							маг^Шальн^оГрошйп^аци^сЬгЙйй .?5Йкй®· еще. не происходит снижения спям,1ва1кЖ&Г'сгютйбпосга. . ..
			’ 1 для	?й..·	ш
			элюата МЕР
			- 3 для	Я	ш		В случае СВЯЗЫВАНИЯ загружается супернатант ι.κ-точной культуры, подвергнутый концентрированию
			35 мМ КаР для анти- СОЗО АЬ	и			и замене буфера в 35 или 70 мМ растворе фосфата натрия, рН 6.2, в соответствии с уравновешивающим
Загрузка	Продукт	6.2			2	буфером. Перед проведением стерильной фильтрации продукт может быть профильтрован через мембрану
					ж		СиКО. В случае ДООЧИСТКИ загружается элюат
			загрузки 70 мМ №Р	в	и в		МЕР НурегСе!, подвергнутый стадии выдержки при низком рН.
			для анти-	,>-и
			СТ1А4 АЬ	-Да.·?.-.....*.
Г1ромы[ву^:.:1., после-·:· <?*,=«:' загрузки'	35 мМ ΝηΡ				·=;·:.· -С:ч.. .=:,^	.. , ·. . ,.1] ,· :)5--- ,=·'
з'Сх:д0бйВКОЙ':· Ίπνβαίδό'·' ’	6.2	- 3 для· г. 35 мМ ЫаР	'> 3--		•зЖ	Ί ίο лее низкие скорости;?! потоки: ^буфера ^^содержащего, <1-о1уз0гЬа^е: ЭД·· С1^х0&Ствуют··^ ^^-Д^д.конечном^чнщенном^о^кге?' !···-5==--^'
							Колонка уравновешена, когда рН к электропроводность равны +0.1 и + 0.2 мС/см от
Промывка 2	35μΜΝ3Ρ						соответствующих значения уравновешивающего
после	6.2	3-5.8	>7		2	буфера. Соблюдение диапазонов электропроводности и
загрузки							рН является важным для связывания антитела при одновременной минимизации связывания белков
							клеток хозяина .
:;·.: - г;	. Λ·', : · ' '	2! Г;:. ;	~.7 для 35 мМ				' ; чм:,·. '
	:· 4/ =': :ΰ «;:=βί:_ ;		МаР, 40 мМ				. ·'?<-'·' .: -:· . .
	::=.< Я··.		Ы»С1 для				. , ·. \ ,,- , ’ ; ;£.
. .· ’ ·,··' ’Έ	-:/=:«ЙЕ**?../ - '		. анти-СОЗО			·ί--:ί=Ν = ’= . ·	>Леобхэдиыо . собрать /пики элюирования^••на'пшаяз/фй?
Элюирова-· ·	?5 ιόί ΝπΓ :	*;·..'	АЬ			-; ·.- ’.	точки педьемь поглощения -ΐρΰθ% выше фой£·
НИс -,: з	40-75 «Μ	6.2		-5·		2 ’	до точки снижения. АЬв;1с'токке:'21)%: НЕ СЛЕДУЕТ
	КаС1		- 10.5 /1.14:-5				собирал, -/хвос-л.г» ..тща, --чтобы опёспеййг.' .Мпее
' Я'?,			мМ ΝβΡ; ··75-				низюй! уровень,белков СЯОР-Кзлюата.о ,. - ···*-«:··-
	/		мМ ' Р1аС1		- =	:1=!уй:’;=г ;·.	' . . < 1 - ·
	;.Τ·:· ::;:/:·: ί;'/;		для анти-			' ·' £ ' .. . .	' .. ’ ’·. «-=:--=^¾ · . :. ·.--'·.. ·’
			СПА4 АЬ				' ' ' · '· ......- -· '=·;.:.
Десорбция	1 Μ МаС1		69.1 -95.9	£5	2	Удаляе! сильно связанные загрязнения.
'Фчистка ·:: .на*: месте |С1Р.) '	-1 η. МзОК	£12		> 3 _	П - ' ' '	• Сталлу, аналогичная дезинфекции, '5 ’ ’ ” г.. = . .' ·
							Ιι (срочность данного раствора препятствует росту
Хранение		>12				Ί	микробов, но при этом поддерживает смолу в пригодном для работы состоянии.

- 18 013504

Таблица 2 Хроматография на смоле МЕР НурегСе1 для связывания или доочистки антител: краткое изложение основных деталей процесса. Связывающая способность была постоянной и равной 15 мг/мл смолы. Скорости потока выражаются в виде соответствующих времен пребывания для обеспечения большей гибкости эксперимента. Рабочая температура варьировалась в пределах 15-25°С. ЫаР - фосфат натрия.__

ЛЕгКЧХЭЗ )СМЯ - <|\рИТ’СрМНТ1рОДОЛЖ1ТОШ обработки

Пребывания .·ς / (йшку1'Н; .Α. ........· . •.Е'А ........ · -

Дезинфекция .·:::	ί и. ЬаОН	ТО β’	- 1 · ϊίΓ ·. ?	' '=?*	•2 '.	^Эоычно выдержка1 час-починая. с’ ’/момента.. вво^.-рай^ора. в колонку. Данная: Стадия лИреднэзадчей^ЙЙгя- -эчисткинр^йолы <от; ^связанных; :ЭагрязнёяиЦ<7<вк.тючая; ^загрязнения биоловичлкбйприроды. ’ '•Ц:·
Зарядка	1 М МаС1	-	-90	>3	2	№С1 вытесняет Ν&ΟΗ из колонки, при этом происходит нейтрализация, в лиганд смолы 1 остается в контакте с ионами натрия.
Ураькове-.. ’ ’ ;щш&НИе'-;	7Ц мМ№Р		~ 4 (_'> м.\: Ν.ιΓ> )).-..1.-, -Ϊ (’70 мМ ЫаР)	-<'-3		Колонка- уравновешена, -κ., .-кргда ' - рН.· ‘н* :эпёк1^пр0водноств7рмта''^] ;=и ± 0^2 мС{ем от соответствующих знэчений.уравновешивдющего буферу -< , ъ·. ·Γ·:ί.;ζ; -Ί
Загрузка	Продукт	7.0	~ 4 для 35 мМ ΝαΡ для связывания анти-СОЗО АЬ - 8 для 70 мМ МаР для связывания анн1-СТ1_А4 АЬ ~ 10 для элюата после катионообменной хроматографии, подвергаемого доочистке		3	В случае СВЯЗЫВАНИЯ загружается супернатант клеточной культуры, подвергнутый концентрированию и замене буфера в 35 или 70 мМ растворе фосфата натрия, рН 6.2, после чего | рН корректируется до 7.0. Перед проведением ί стерильной фильтрации продукт может быть ί профильтрован через мембрану СШО. В случае 1 ДООЧИСТКИ загружается элюат после ;| катионообменной хроматография, подвергнутый | стадии выдержки при низком рН.
Промывка 1 После загрузки - ·	,.Τό.^.ϊίϊΡ	7.0 '.	-	|5:: '	4 7/-,	Необязательная стадия. |
Промывка 2 после загрузки	35мМ Иа?	7.0	~4	>5	3	рН и электропроводность этих буферов крайне | важны для удаления примесей (белков СНОР). I
Прюмыйка · 3	5 мК1 На?	7.0 ι	. ’ '	>5 : '	3 . .)	/Более нмкщ^эЛеБЭТОпрозолн-эстт. этого буфера' | ' прт1воДит.:;'жУ:;удаленИю’.::;боЛее гидрофильных | примесей /иу,;-ошикает ‘эйёкгррпр’рйрдцость системы'до .^оведен'ня’эйюировагИы. .
ί Элюирование	10 мМ ацетат натрия	5.2	< 1	~ от 3 до 5	От 3 до 6	Необходимо собрать пики элюирования, начиная от точки подъема поглощения АЪзгад на 20% выше фона до точки снижен ия АЪз^ад ниже 20%. НЕ СЛЕДУЕТ собирать «хвосты» пика, чтобы обеспечить более низкий уровень белков СНОР в элюате. Низкая скорость потока обеспечивает минимальное содержание белков клеток хозяина в элюате.
Десорбция--	100 .мМ? цитрат- ’ : ’натрня	3-°:,.	:4 .-.Г	>5 ' ’	3 .... )	^Удаляет сильно связанные загрязнеЕЩЯ;. и
ί Очистка - :л«а месте 1С1Р)	1 Н№ОН	£12	-	>3	3	Стадия, аналогичная дезинфекции. а
| Хранение	' 0..1 - и. ЬаОН '	>12		>3		^Щелоч«ос^<!;7.ланног£>ь:-.-раствора·; препятствует | зростуижикробсв, /но / при ...этом;·, 'поддерживает | : смолу.в··пригодном для работы состоянии/;... .и:;?; < |

Согласно результатам стандартного твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А) для определения содержания белков СНОР, метода полимеразной цепной реакции (РСК) для определения содержания ДНК и метода эксклюзионной ВЭЖХ размеров (НРЬС-8ЕС) для определения мономерной чистоты антител, обе процедуры очистки А и В обеспечили получение гомогенных композиций, содержащих менее 100 млн^-1 белков клеток хозяина (см. ниже табл. 3), менее 10 пг ДНК/мг антител и более 99% мономера, что позволяет проводить дальнейшую обработку и введение очищенного материала в лекарственные продукты. Концентрация примесей после первой стадии варьировалась от 200 до 1500 нг/мг для белков СНОР, а содержание мономера - от 95 до 100%. Результаты процессов А и В для двух разных полностью человеческих моноклональных антител приведены в табл. 3.

- 19 013504

Таблица 3 Сводка результатов удаления примесей по предложенным схемам очистки

Процесс	Параметр	(анти-СТЬА-4 АЬ)	(анти-СПЗО АЬ)
Катионообменная хроматография·^ гидрофобная хроматография с индуцированным зарядом	% извлечения	74	68
Содержание белков СНОР после очистки (нг/мг)	30.8	44.2
Содержание ДНК после очистки (пг/мг)	<10.00	<10.00
Степень чистоты (% мономера согласно методу НРЕС-5ЕС)	100.00	99.55
Гидрофобная хроматография с индуцированным зарядом—»· катионообменная хроматография	извлечения	84.8	74.5
Содержание белков СНОР после очистки (нг/мг)	69.9	42.6
Содержание ДНК после очистки (пг/мг)	< 10.00	< 10.00
Степень чистоты (% мономера согласно методу НРЬС-5ЕС)	100.00	99.82

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (29)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ очистки смеси, содержащей целевой белок и одну или несколько примесей, содержащих белки клетки-хозяина, включающий: (а) стадию катионообменной очистки смеси и стадию ее гидрофобной очистки с индуцированным зарядом без использования стадии фильтрации с тангенциальным потоком в ходе процесса и с использованием на стадии гидрофобной очистки элюента, который отделяет белки клетки-хозяина от целевого белка, и (Ь) выделение целевого белка с содержанием белков клеткихозяина 100 ррт или меньше.
2. 2. Способ очистки смеси по п.1, в котором на стадии катионообменной очистки смеси используют элюент, который отделяет белки клетки-хозяина от целевого белка.
3. 3. Способ очистки смеси по п.1 или 2, при котором примеси содержат нуклеиновые кислоты и выделяют целевой белок с содержанием нуклеиновых кислот приблизительно 10 пг/мг или менее.
4. 4. Способ по пп.1-3, дополнительно включающий стадию инактивации вирусов.
5. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что стадия инактивации вирусов является составной частью процесса.
6. 6. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что указанную смесь получают из супернатанта клеточной культуры.
7. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что катионообменную хроматографию проводят в диапазоне рН 3-10 или 4-8.
8. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что целевой белок связывается в катионообменной хроматографической колонке в диапазоне рН 3-9 и в диапазоне электропроводности 0,1-40 мСм/см или в диапазоне рН 4-8 и в диапазоне электропроводности 0,5-10 мСм/см.
9. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что целевой белок связывается в катионообменной хроматографической колонке и колонка промывается промывочным буфером в диапазоне рН 3-9 и в диапазоне электропроводности 0,1-40 мСм/см или в диапазоне рН 4-8 и в диапазоне электропроводности 0,5-10 мСм/см.
10. 10. Способ по пп.1, 2 или 4, отличающийся тем, что целевой белок элюируется из катионообменной хроматографической колонки в диапазоне рН 3-10 и в диапазоне электропроводности 0,1-40 мСм/см или в диапазоне рН 4-8 и в диапазоне электропроводности 5-15 мСм/см.
11. 11. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что на стадии катионообменной хроматографии используется катионообменный лиганд, выбираемый из следующего ряда: сульфонат, карбоксилат, карбоксиметилсульфоновая кислота, сульфоизобутил, сульфоэтил, карбоксил, сульфопропил, сульфонил, сульфоксиэтил и ортофосфат.
12. 12. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия катионообменной хроматографии выполняется на катионообменной смоле, выбираемой из следующей группы: мембрана, Рогоз Н8, Рогоз 8, карбоксиметилцеллюлоза, ВАКЕКВОИИ АВХ™; сульфопропил, иммобилизованный на агарозе; сульфонил, иммобилизованный на агарозе; Мопо8, М1ш8, 8оигсе 158, 308, сефароза 8Р, сефароза СМ, ВАКЕКВОИБ СагЬоху-8и1Гоп, XV Р СВХ, XVР 8и1Гошс, Нубгосе11 СМ, Нубгосе! 8Р,

    - 20 013504 иЫОкрйеге 8, Масго-Ргер Нщ11 8, Масго-Ргер СМ, Сетатк НурегЭ 8, Сетатк НурегЭ СМ, Сегашк НурсгЭ Ζ, Тгкасгу1 М СМ, Тгкасгу1 Ь8 СМ, Тгкасгу1 М 8Р, Тгкасгу1 Ь8 8Р, 8рйетобех Ь8 8Р, мелкопористая сильнокислотная катионообменная смола ЭОХУЕХ. ЭОХХЕХ МАС-3, Ма1тех Се11и£ше С500, Майех Се11и£1ие С200, Егас1оде1 ЕМО 8О3-, Егас1оде1 ЕМО 8Е, Егас1оде1 ЕМО СОО-, слабо- и сильнокислотные катионообменные смолы АтЬетШе, слабо- и сильнокислотные катионообменные смолы П1аюи, Т8К Се1 8Р-5Р№-НК, Т8К Се1 8Р-5Р№, Тоуореаг1 СМ (6508, 650М, 650С), Тоуореаг1 8Р (6508, 650М, 650С), СМ (23, 32, 52), 8Е (52, 53), Р11, Ехрге88-1ои С и Ехрге88-1ои 8.
13. 13. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что гидрофобную хроматографию с индуцированием заряда проводят в диапазоне рН 3-10 или 4-9.
14. 14. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что целевой белок связывается в колонке для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом в диапазоне рН 5-10 и в диапазоне электропроводности 0-90 мСм/см или в диапазоне рН 6-9 и в диапазоне электропроводности 2-9 мСм/см.
15. 15. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что целевой белок связывается в колонке для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом и колонка промывается промывочным буфером в диапазоне рН 6-9 и в диапазоне электропроводности 0,1-9 мСм/см.
16. 16. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что колонка для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом промывается промывочным буфером, в качестве которого используется фосфат натрия.
17. 17. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что целевой белок элюируется из хроматографической колонки для гидрофобной обменной хроматографии с индуцированным зарядом в диапазоне рН 4-6 и в диапазоне электропроводности 0,1-2,0 мСм/см.
18. 18. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что выделение целевого белка из колонки для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом проводят при величине пика поглощения между точкой подъема А₂₈₀ до 25% от максимальной высоты пика.
19. 19. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что на стадии гидрофобной обменной хроматографии с индуцированным зарядом используется гидрофобный хроматографический лиганд с индуцированным зарядом, в состав которого входит ионизируемая ароматическая или гетероциклическая структура, имеющая алифатическую цепь и не менее одного атома серы в сшивающей цепи и/или в структуре лиганда.
20. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что гидрофобный хроматографический лиганд с индуцированным зарядом содержит группу, выбранную из следующего ряда: 2-аминометилпиридин, 3аминометилпиридин или 4-аминометилпиридин, 2-меркаптопиридин, 4-меркаптопиридин или 4меркаптоэтилпиридин, меркаптокислоты, меркаптоспирты, имидазолильные производные, меркаптометилимидазол, 2-меркаптобензимидазол, аминометилбензимидазол, гистамин, меркаптобензимидазол, диэтиламинопропиламин, аминопропилморфолин, аминопропилимидазол, аминокапроновая кислота, нитрогидроксибензойная кислота, нитротирозин/этаноламин, дихлорсалициловая кислота, дибромтирамин, хлоргидроксифенилуксусная кислота, гидроксифенилуксусная кислота, тирамин, тиофенол, глутатион, бисульфат, красители или их производные.
21. 21. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что гидрофобную хроматографию проводят на гидрофобной смоле с индуцированным зарядом, выбираемой из ряда МЕР НурегСе1.
22. 22. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что целевой белок представляет собой антитело или фрагмент антитела.
23. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что антитело является моноклональным антителом.
24. 24. Способ по п.22, отличающийся тем, что антитело является полностью человеческим антителом.
25. 25. Способ по пп.22-24, отличающийся тем, что антитело выбрано из анти-СТЬА4 или анти-СЭ30.
26. 26. Способ по пп.22-24, отличающийся тем, что антитело относится к одному из следующих типов: антитела в виде одноцепочечных молекул, димерные антитела, линейные антитела, биспецифичные антитела, мультиспецифичные антитела.
27. 27. Способ по пп.22-25, отличающийся тем, что фрагмент антитела выбирается из серии ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')₂ и Εν.
28. 28. Способ по п.21, отличающийся тем, что целевой белок представляет собой иммуноадгезин.
29. 29. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий стадию введения выделенного белка в фармацевтический состав.