RU2686984C2

RU2686984C2 - Обработка яичного белка

Info

Publication number: RU2686984C2
Application number: RU2016145601A
Authority: RU
Inventors: Лян Чэнь; Маркли С. ЛИВИТ; Майкл ТИТУС
Original assignee: Алексион Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2014-04-23
Filing date: 2015-04-21
Publication date: 2019-05-06
Also published as: US9938319B2; US20180244716A1; US20230159585A1; CN106455621A; KR102409341B1; BR112016024586A8; JP6571684B2; JP2017513899A; CA2945964A1; MX2016013713A; EP3133932A1; RU2016145601A3; ES2893402T3; BR112016024586A2; WO2015164320A1; EP3133932A4; CN106455621B; RU2016145601A; KR20160145750A; AU2015249902A1

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Способ выделения рекомбинантного белка из яичного белка включает стадии: получения партии яичного белка объемом по меньшей мере около 10 литров; добавления кислого буфера к партии яичного белка в количестве от около 0,5 вес.% до около 5 вес.% в расчете на килограмм яичного белка; перемешивания кислого буфера и яичного белка для доведения рН от около 5 до около 6,5, при этом проводимость яичного белка с отрегулированным значением pH составляет от около 8 мСм/см до около 20 мСм/см; фильтрования яичного белка с получением раствора; и выделения рекомбинантного белка, содержащегося в яичном белке, колоночной хроматографией. Способ позволяет при добавлении небольшого количества кислого буфера значительно повысить эффективность подготовки белка к крупномасштабному промышленному производству. 24 з.п. ф-лы, 9 табл., 3 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной патентной заявки США № 61/983003, поданной 23 апреля 2014 г., полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Трансгенные птицы (например, трансгенные куры, перепелки или индейки) представляют собой подходящую систему экспрессии для получения экзогенных рекомбинантных белков, предназначенных для использования в фармацевтике или других коммерческих областях, где требуются большие количества белка. Курица может откладывать в год до 330 яиц, каждое из которых содержит 6,5 грамм белка. Около 3,5 грамм суммарного белка приходится на яичный белок, из которого 90% составляют семь разных белков; на один овальбумин приходится 2 грамма яичного белка (около 50% от всего яичного белка). Известно, что в настоящее время среднее количество продукта экзогенного гена, получаемое в результате специфичной для яйцевода экспрессии трансгена и извлекаемое из яичного белка, составляет около 5-10 мг на яйцо. Преимущества производства экзогенных белков в куриных яйцах включают короткое время продуцирования и обильное воспроизводство за счет искусственного оплодотворения. Различные белки были экспрессированы в яйцах трансгенных кур. Смотри, например, патент США № 6730822 и публикацию патента США № 2006/0015960.

Множество экзогенных терапевтических белков (например, рекомбинантные человеческие белки, такие как цитокины (например, эритропоэтин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GC-SF), интерфероны и гранулолцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF)), антитела и различные лизосомальные ферменты человека) представляют интерес для фармацевтической промышленности. Терапевтические белки можно легко получать в значительных количествах, например, из яичного белка трансгенных кур. Однако в основе традиционных методов выделения экзогенных белков из яичного белка часто лежит использование иммуноаффинных методов или других методов, подходящих лишь для мелкомасштабного производства (например, когда общий объем яичного белка не превышает 5 л). Для крупномасштабного производства белков такой метод непрактичен из-за стоимости, трудоемкости и временных затрат.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение основано на том неожиданном открытии, что добавление небольшого количества кислого буфера (например, в виде одной болюсной инжекции) к партии яичного белка (например, полученного из яиц, отложенных трансгенной птицей, такой как куры, перепелки и индейки) в промышленном объеме (например, объеме по меньшей мере 10 литров) может подготовить яичный белок к препаративной хроматографии для выделения рекомбинантных белков, таких как терапевтические белки человека, из яичного белка без необходимости разбавления яичного белка. Такой способ может значительно снижать количество материалов яичного белка, подвергаемых впоследствии процессам выделения/очистки (например, количество колонок, используемых при хроматографическом выделении), тем самым способствуя значительному уменьшению стоимости, трудоемкости и временных затрат на выделение рекомбинантных белков из яичного белка. Соответственно, способы, описанные в настоящем документе, способны значительно повышать эффективность подготовки яичного белка к крупномасштабному промышленному производству терапевтических белков.

В одном аспекте данное изобретение относится к способу подготовки яичного белка к препаративной хроматографической обработке, включающему стадии: (1) добавления кислого буфера, содержащего кислотное вещество, к партии яичного белка, при этом количество кислого буфера составляет от около 0,5 вес.% до около 5 вес.% в расчете на килограмм яичного белка; и (2) перемешивания кислого буфера и яичного белка, с получением перемешанного яичного белка, имеющего pH от около 5 до около 6,5.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу выделения рекомбинантного белка из яичного белка, включающему стадии: (1) получения партии яичного белка, содержащего рекомбинантный белок, при этом объем партии составляет по меньшей мере около 10 литров; (2) доведения pH яичного белка до значения от около 5 до около 6,5, при этом проводимость яичного белка с отрегулированным значением pH составляет от около 8 мСм/см до около 20 мСм/см; (3) фильтрования яичного белка, с получением раствора (то есть, прозрачного раствора); и (4) выделения рекомбинантного белка, содержащегося в яичном белке, колоночной хроматографией.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу фильтрования подкисленного яичного белка, включающему стадии: (1) пропускания буфера для предварительной обработки, имеющего проводимость от около 8 мСм/см до около 20 мСм/см, через фильтр; и (2) пропускания яичного белка, имеющего pH от около 5 до около 6,5, через данный фильтр, с получением фильтрованного яичного белка.

Варианты выполнения могут включать один или более из следующих признаков.

Кислотное вещество можно выбирать из группы, состоящей из уксусной кислоты, соляной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты, фтористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, хлорной кислоты, лимонной кислоты, борной кислоты, виннокаменной кислоты, молочной кислоты, муравьиной кислоты, щавелевой кислоты, мочевой кислоты и барбитуровой кислоты.

Кислый буфер может дополнительно содержать от около 5 M до около 6 M (например, около 5,7 M) ацетата натрия.

Кислый буфер может составлять от около 0,5 вес.% до около 2 вес.% (например, от около 0,7 вес.% до около 1,5 вес.%, от около 0,9 вес.% до около 1,4 вес.% или от около 1,2 вес.% до около 1,3 вес.%) в расчете на килограмм яичного белка.

Кислый буфер может иметь pH от около 4 до около 6,5 (например, около 4, около 4,5, около 5, около 5,5, около 6,0 или около 6,5).

После перемешивания кислого буфера с яичным белком pH перемешанного яичного белка может составлять от около 5 до около 6,5. В некоторых вариантах выполнения pH перемешанного яичного белка составляет от 5 до около 6,3 (например, от около 5,7 до около 6,3, от около 5,8 до около 6,2, от около 5,9 до около 6,1 или около 6). В некоторых вариантах выполнения pH перемешанного яичного белка является таким, что перемешанный яичный белок становится менее вязким.

Яичный белок можно перемешивать в течение по меньшей мере около 1 часа и/или при температуре от около 2°C до около 25°C.

Партия яичного белка может иметь объем по меньшей мере около 10 литров (например, по меньшей мере около 50 литров).

Кислый буфер можно добавлять к партии яичного белка одной болюсной инжекцией и/или со скоростью по меньшей мере около 1 л/минуту.

Добавление кислого буфера к яичному белку и перемешивание яичного белка можно выполнять одновременно.

Способ может дополнительно включать стадию отстаивания яичного белка, во время которой яичный белок разделяется на верхний, средний и нижний слои. В таких вариантах выполнения способ может дополнительно включать стадию выделения среднего слоя. В некоторых вариантах выполнения способ может дополнительно включать фильтрование среднего слоя после стадии выделения. Фильтрование может включать пропускание по меньшей мере части (например, всего) среднего слоя через фильтр, имеющий средний размер пор в диапазоне от около 0,1 мкм до около 100 мкм. В некоторых вариантах выполнения фильтрование может включать пропускание по меньшей мере части среднего слоя через несколько фильтров.

Способ может дополнительно включать фильтрование перемешанного яичного белка без отстаивания перемешанного яичного белка. В таких вариантах выполнения стадия фильтрования может включать фильтрование перемешанного яичного белка через фильтр, имеющий средний размер пор в диапазоне от около 0,1 мкм до около 100 мкм. В некоторых вариантах выполнения стадия фильтрования может включать одну или более последующих стадий фильтрования после первоначального фильтрования перемешанного яичного белка, при этом в одной или более последующих стадиях фильтрования используют один или более фильтров, имеющих средний размер пор в диапазоне от около 0,1 мкм до около 40 мкм.

Способ может дополнительно включать после стадии перемешивания стадию центрифугирования, во время которой перемешанный яичный белок центрифугируют для отделения преципитата, содержащего комплексы овомуцин-лизоцим, от супернатанта.

Яичный белок может содержать рекомбинантный терапевтический белок, экзогенный для яичного белка.

Кислый буфер может иметь проводимость от около 8 мСм/см до около 40 мСм/см.

Кислый буфер может составлять от около 0,5 вес.% до около 5 вес.% в расчете на килограмм яичного белка.

Буфер для предварительной обработки можно использовать для подготовки фильтров к пропусканию подкисленного яичного белка. Буфер для предварительной обработки может иметь практически аналогичное или такое же pH, как pH яичного белка, в диапазоне от около 5,0 до около 6,5. Например, буфер для предварительной обработки может иметь pH от около 5,9 до около 6,1 (например, около 6).

Буфер для предварительной обработки может содержать фосфат натрия и хлорид натрия.

Буфер для предварительной обработки может иметь проводимость от около 10 мСм/см до около 20 мСм/см.

Подкисленный яичный белок может иметь проводимость от около 8 мСм/см до около 20 мСм/см.

Этот фильтр может иметь площадь фильтрующего материала по меньшей мере около 8 м².

Фильтр может иметь средний размер пор от около 0,1 мкм до около 100 мкм.

Яичный белок можно пропускать через данный фильтр при дифференциальном давлении, не превышающем около 30 фунтов на кв. дюйм (например, не превышающем около 15 фунтов на кв. дюйм).

Варианты выполнения могут иметь следующие преимущества.

Как правило, хроматографические колонки, используемые для выделения/очистки экзогенного белка из яичного белка, являются очень дорогостоящими, что может быть одним из основных лимитирующих факторов при коммерческом и крупномасштабном промышленном производстве рекомбинантных белков из яичного белка. Поскольку лишь небольшое количество кислого буфера используют для получения подкисленного яичного белка, количество подкисленного яичного белка, используемое для получения очищенных терапевтических белков, значительно снижается (то есть, снижается по меньшей мере в 3-4 раза по сравнению с общепринятыми методами разбавления). В результате, затраты времени на нанесение подкисленного яичного белка на используемые впоследствии колонки значительно сокращаются, что позволяет ускорять получение белка в процессе промышленного производства. Кроме того, поскольку некоторые терапевтические белки чувствительны к условиям окружающей среды в процессе подготовки и выделения/очистки яичного белка, сокращение периода времени, затрачиваемого на процессы подготовки и выделения/очистки, за счет уменьшения объема образца имеет большие преимущества для коммерческого производства, в котором, как правило, используют яичный белок в объеме 500 л или более. В итоге, время обработки, материалы и затраты труда могут быть сведены к минимуму при использовании способов, описанных в настоящем документе.

Другие признаки, цели и преимущества станут очевидны из описания и чертежей, а также из формулы изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к эффективным способам подготовки яичного белка (например, полученного из яиц, отложенных трансгенными курами) к препаративной хроматографии для хроматографического выделения белков (например, рекомбинантных белков) из яичного белка, а также к способам выделения белков из яичного белка. Яичный белок, полученный способами, описанными в настоящем документе, как правило, находится в форме гомогенного раствора с низкой вязкостью, который подходит для препаративной хроматографической обработки.

В некоторых вариантах выполнения яичный белок, используемый в качестве исходного материала в способах, описанных в настоящем документе, может содержать рекомбинантный белок (например, рекомбинантный терапевтический белок), экзогенный для яичного белка. Иллюстративные рекомбинантные белки включают цитокины, такие как GC-SF, GM-CSF, эритропоэтин, и интерфероны, такие как интерферон-α или интерферон-β; лизосомальные ферменты человека; иммуноглобулины (например, антитела); а также структурные белки. Другие иллюстративные рекомбинантные белки, которые могут быть выделены путем препаративной хроматографической обработки, описаны, например, в публикации патентной заявки США № 2009/0299037.

Как правило, способы подготовки яичного белка, описанные в настоящем документе, включают (1) добавление соответствующего количества кислого буфера (например, от около 0,5 вес.% до около 5 вес.% в расчете на килограмм яичного белка), содержащего кислотное вещество, к партии яичного белка (например, имеющему объем по меньшей мере около 10 литров); и (2) перемешивание кислого буфера и яичного белка, с получением перемешанного яичного белка, имеющего соответствующий рН (например, pH в диапазоне от около 5 до около 6,5).

Как правило, партия яичного белка, используемая в способах, описанных в настоящем документе, обрабатывается в промышленных масштабах и имеет относительно большой объем. Например, партия яичного белка может иметь объем по меньшей мере около 10 литров (например, по меньшей мере около 50 литров, по меньшей мере около 100 литров, по меньшей мере около 200 литров, по меньшей мере около 300 литров, по меньшей мере около 400 литров, по меньшей мере около 500 литров, по меньшей мере около 600 литров, по меньшей мере около 700 литров, по меньшей мере около 800 литров, по меньшей мере около 900 литров, по меньшей мере около 1000 литров, по меньшей мере около 1500 литров, по меньшей мере около 2000 литров, по меньшей мере около 3000 литров, по меньшей мере около 4000 литров, по меньшей мере около 5000 литров, по меньшей мере около 10000 литров или по меньшей мере около 20000 литров). Способы подготовки яичного белка в качестве исходного материала, используемого в способах, описанных в настоящем документе, описаны, например, в публикации патентной заявки США № 2009/0299037.

Кислотное вещество в кислом буфере, как правило, может представлять собой любую подходящую кислоту (например, органическую кислоту или неорганическую кислоту). Иллюстративные кислотные вещества включают уксусную кислоту, соляную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту, фтористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, хлорную кислоту, лимонную кислоту, борную кислоту, виннокаменную кислоту, молочную кислоту, муравьиную кислоту, щавелевую кислоту, мочевую кислоту и барбитуровую кислоту. В некоторых вариантах выполнения в качестве кислотного вещества в кислом буфере можно использовать сочетание двух или более (например, трех или четырех) кислот.

В некоторых вариантах выполнения кислый буфер может содержать одну или более солей (например, щелочных солей). Примером такой соли может служить ацетат натрия. В некоторых вариантах выполнения соль, используемая в кислом буфере, может представлять собой соль кислотного вещества, используемого в кислом буфере. В других вариантах выполнения соль, используемая в кислом буфере, может представлять собой соль кислоты, отличной от кислотного вещества, используемого в кислом буфере. В некоторых вариантах выполнения кислый буфер может содержать от около 5 M до около 6 M (например, около 5,7 M) соли (например, ацетата натрия). Без привязки к конкретной теории, считается, что использование соли, имеющей такую концентрацию, позволяет получать кислый буфер, имеющий подходящую буферную емкость. Если буферная емкость слишком высока, кислый буфер может становиться огнеопасным и/или коррозийным, вследствие чего буфер становится небезопасным для использования, манипуляций и/или хранения. Если буферная емкость слишком низка, может потребоваться больший объем кислого буфера для доведения pH яичного белка до намеченного значения, что снижает эффективность процесса подготовки яичного белка, а также последующих процессов выделения/очистки белка.

Как правило, количества кислотного вещества и соли, используемые в кислом буфере, могут варьироваться в зависимости от нужного значения pH кислого буфера. В некоторых вариантах выполнения кислый буфер может иметь pH от около 4 до около 6,5 (например, от около 4 до около 5 или от около 4 до около 4,5). Например, кислый буфер может иметь pH около 4 или pH около 4,5.

Кислый буфер можно получать любыми подходящими методами, известными в данной области. Например, кислый буфер можно получать путем добавления кислотного вещества к раствору, содержащему основание, для доведения pH раствора до нужного значения. Например, раствор ледяной уксусной кислоты можно добавлять к соответствующему количеству NaOH, с получением кислого буфера, содержащего 5,7 M ацетата натрия.

Как правило, количество кислого буфера невелико относительно количества яичного белка. Например, кислый буфер может составлять от около 0,5 вес.% до около 5 вес.% (например, от около 0,5 вес.% до около 2 вес.%, от около 0,7 вес.% до 1,5 вес.%, от около 0,9 вес.% до около 1,4 вес.%, от около 1 вес.% до около 1,4% или от около 1,1 вес.% до около 1,3 вес.%) в расчете на килограмм яичного белка. Обычно, для получения гомогенного яичного белка с низкой вязкостью, подходящего для препаративной хроматографической обработки, необходимо добавлять кислый буфер в объеме, превышающем в 2-5 раз (то есть, от 200% до 500%) объем яичного белка, и нельзя было ожидать, что добавление небольшого количества кислого буфера будет эффективным для доведения pH яичного белка до намеченного значения. Такой способ непрактичен с экономической точки зрения или невыполним в крупномасштабном производстве из-за ограниченных размеров хроматографических колонок и другого производственного оборудования, используемого в процессе подготовки яичного белка. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что гомогенный яичный белок с низкой вязкостью, подходящий для препаративной хроматографической обработки, можно получать путем добавления небольшого количества кислого буфера (например, не более около 5 вес.% в расчете на килограмм яичного белка) относительно количества яичного белка, тем самым добиваясь сокращения количества колонок, используемых в процессе хроматографического выделения, размеров другого оборудования, используемого в данных процессах, а также стоимости и затрат времени на выделение рекомбинантных белков из яичного белка.

Без привязки к конкретной теории, считается, что дополнительные преимущества добавления меньшего количества кислого буфера относительно количества яичного белка включают (1) крайне незначительное разбавление яичного белка, (2) по существу отсутствие изменений в проводимости, это позволяет осаждать комплексы овомуцин-лизоцим из яичного белка, что, в свою очередь, приводит к уменьшению вязкости яичного белка в диапазоне более низких значений pH (например, pH 5-6,5) и облегчает отделение нежелательных материалов от яичного белка в процессе фильтрования и хроматографии, и (3) сведение к минимуму образования «карманов» с низким значением pH в вязком яичном белке, что потенциально может приводить к повреждению рекомбинантных белков или созданию неравномерного значения pH материалов яичного белка.

Как правило, кислый буфер может иметь проводимость в диапазоне от около 8 мСм/см до около 40 мСм/см. Например, кислый буфер может иметь проводимость по меньшей мере около 8 мСм/см (например, по меньшей мере около 9 мСм/см, по меньшей мере около 10 мСм/см, по меньшей мере около 11 мСм/см, по меньшей мере около 12 мСм/см, по меньшей мере около 13 мСм/см, по меньшей мере около 14 мСм/см, по меньшей мере около 15 мСм/см, по меньшей мере около 16 мСм/см, по меньшей мере около 17 мСм/см, по меньшей мере около 18 мСм/см, по меньшей мере около 19 мСм/см, по меньшей мере около 20 мСм/см, по меньшей мере около 21 мСм/см, по меньшей мере около 22 мСм/см, по меньшей мере около 23 мСм/см, по меньшей мере около 24 мСм/см, по меньшей мере около 25 мСм/см) и/или не более около 40 мСм/см (например, не более около 39 мСм/см, не более около 38 мСм/см, не более около 37 мСм/см, не более около 36 мСм/см, не более около 35 мСм/см, не более около 34 мСм/см, не более около 33 мСм/см, не более около 32 мСм/см, не более около 31 мСм/см, не более около 30 мСм/см, не более около 29 мСм/см, не более около 28 мСм/см, не более около 27 мСм/см, не более около 26 мСм/см или не более около 25 мСм/см). Например, кислый буфер может иметь проводимость любой величины от около 8 мСм/см до около 40 мСм/см. Без привязки к конкретной теории, считается, что использование кислого буфера, имеющего проводимость от около 8 мСм/см до около 40 мСм/см, будет сводить к минимуму изменения в проводимости перемешанного яичного белка, так что процесс можно осуществлять и оптимизировать за счет выполнения последующей стадии выделения белка без изменения условий выделения методом колоночной хроматографии, используемых на стадии выделения, и без инициирования дальнейшего осаждения или агрегации.

В некоторых вариантах выполнения кислый буфер можно добавлять к партии яичного белка одной болюсной инжекцией. В некоторых вариантах выполнения одну болюсную инжекцию выполняют с соответствующей скоростью инжекции (например, по меньшей мере около 1 л/минуту), чтобы гарантировать добавление кислого буфера в пределах соответствующего количества времени (например, не более около 5 минут). Без привязки к конкретной теории, считается, что преимущества использования однократной болюсной инжекции включают (1) образование относительно крупных хлопьев, которые легко осаждаются под действием силы тяжести, за счет чего уменьшается необходимость в больших фильтрах, и (2) отсутствие необходимости в непрерывном титровании вязкого яичного белка, что может приводить к получению ложных показателей pH, являющихся причиной повторного добавления кислоты или основания, что, в свою очередь, потенциально может вызывать повреждение рекомбинантных белков в яичном белке и увеличивать мутность полученного раствора яичного белка.

В некоторых вариантах выполнения, после добавления кислого буфера к партии яичного белка, яичный белок перемешивают при соответствующей температуре (например, от около 2°C до около 25°C) в течение соответствующего периода времени (например, по меньшей мере около 1 час) для получения перемешанного яичного белка, имеющего соответствующий рН. В некоторых вариантах выполнения добавление кислого буфера и перемешивание яичного белка осуществляют одновременно.

Как правило, добавление кислого буфера и перемешивание кислого буфера с яичным белком приводит к образованию большого количества преципитатов (например, комплексов овомуцин-лизоцим). Образование преципитатов, как правило, снижает вязкость яичного белка, остающегося в растворе.

В некоторых вариантах выполнения pH перемешанного яичного белка является таким, что перемешанный яичный белок становится менее вязким. Например, перемешанный яичный белок может иметь pH по меньшей мере около 5 (например, по меньшей мере около 5,2, по меньшей мере около 5,4, по меньшей мере около 5,6, по меньшей мере около 5,7, по меньшей мере около 5,8 или по меньшей мере около 5,9) и/или не более около 6,5 (например, не более около 6,3, не более около 6,2 или не более около 6,1). В некоторых вариантах выполнения перемешанный яичный белок может иметь pH около 6. Без привязки к конкретной теории, считается, что такое pH (например, около 6) может способствовать образованию большего количества преципитатов из яичного белка, которые осаждаются под действием силы тяжести, это уменьшает необходимость в фильтровании и способствует образованию гомогенного раствора яичного белка с низкой вязкостью.

Как правило, перемешанный яичный белок (то есть, подкисленный или с отрегулированным значением pH яичный белок) имеет относительно низкую проводимость (например, сходную с проводимостью яичного белка, не обработанного кислым буфером). Например, перемешанный яичный белок может иметь проводимость по меньшей мере около 8 мСм/см (например, по меньшей мере около 8,2 мСм/см, по меньшей мере около 8,4 мСм/см, по меньшей мере около 8,6 мСм/см, по меньшей мере около 8,8 мСм/см, по меньшей мере около 9 мСм/см, по меньшей мере около 9,2 мСм/см, по меньшей мере около 9,4 мСм/см, по меньшей мере около 9,6 мСм/см, по меньшей мере около 9,8 мСм/см, по меньшей мере около 10 мСм/см, по меньшей мере около 11 мСм/см, по меньшей мере около 12 мСм/см, по меньшей мере около 13 мСм/см или по меньшей мере около 14 мСм/см) и/или не более около 20 мСм/см (например, не более около 19 мСм/см, не более около 18 мСм/см, не более около 17 мСм/см, не более около 16 мСм/см, не более около 15 мСм/см, не более около 14 мСм/см, не более около 13 мСм/см, не более около 12 мСм/см, не более около 11,8 мСм/см, не более около 11,6 мСм/см, не более около 11,4 мСм/см, не более около 11,2 мСм/см, не более около 11 мСм/см, не более около 10,8 мСм/см, не более около 10,6 мСм/см, не более около 10,4 мСм/см, не более около 10,2 мСм/см или не более около 10 мСм/см). Например, перемешанный яичный белок может иметь проводимость любой величины от около 8 мСм/см до около 20 мСм/см. Без привязки к конкретной теории, считается, что поддержание проводимости перемешанного яичного белка на уровне от около 8 мСм/см до около 20 мСм/см способствует тому, что перемешанный яичный белок удовлетворяет условиям, используемым в последующей стадии выделения белка, так что перемешанный яичный белок можно последовательно использовать в стадии выделения без изменения условий выделения методом хроматографии на колонке, используемых в данной стадии.

Способы, описанные в настоящем документе, после завершения перемешивания могут включать дополнительную стадию, позволяющую перемешанному яичному белку отстаиваться в течение соответствующего периода времени (например, по меньшей мере около 6 часов) таким образом, что яичный белок разделяется на верхний, средний и нижний слои. Как правило, верхний слой содержит некоторые нежелательные материалы (например, денатурированный белок и пенистые липиды, включая фосфолипиды, триглицерид и холестерин), имеющие низкую плотность, нижний слой содержит преципитаты, образовавшиеся из белков яичного белка (например, комплексы овомуцин-лизоцим), и средний слой содержит относительно прозрачный раствор яичного белка.

В некоторых вариантах выполнения, если во время стадии отстаивания pH перемешанного яичного белка выходит за пределы нужного показателя (например, 5,7 ± 0,1, 6,0 ± 0,1 или 6,3 ± 0,1), его можно корректировать, доводя до нужного значения при помощи кислоты (например, кислого буфера, описанного выше) или основания (например, 5,7 M раствора ацетата натрия или 1 Н раствора гидроксида натрия). В таких вариантах выполнения корректировка pH может сопровождаться дополнительным перемешиванием (например, в течение по меньшей мере около 1 часа) и отстаиванием (например, в течение по меньшей мере около 3 часов) при комнатной температуре. Как правило, общее время перемешивания и отстаивания не превышает 24 часов, с тем, чтобы свести к минимуму время, в течение которого экзогенные белки в яичном белке подвергаются воздействию условий обработки, и тем самым сохранить биологическую активность этих белков.

В некоторых вариантах выполнения способы, описанные в настоящем документе, могут включать стадию выделения среднего слоя из перемешанного яичного белка после стадии отстаивания. Как правило, средний слой можно выделять с использованием методов, известных в данной области. Например, средний слой можно сливать через сифон из емкости, содержащей перемешанный яичный белок, вставляя трубку (например, металлическую или поликарбонатную трубку) в средний слой (предпочтительно в середину среднего слоя) таким образом, что содержимое среднего слоя можно откачивать в принимающую емкость, не нарушая верхний и нижний слои.

Как правило, после выделения среднего слоя по меньшей мере часть среднего слоя (например, весь средний слой) можно фильтровать для удаления любых частиц, суспендированных в среднем слое, с получением гомогенного прозрачного раствора яичного белка с низкой вязкостью. Эта стадия также известна как стадия осветления яичного белка. В некоторых вариантах выполнения средний слой можно фильтровать через один или более фильтров, имеющих средний размер пор не более около 100 мкм (например, не более около 90 мкм, не более около 80 мкм, не более около 70 мкм, не более около 60 мкм, не более около 50 мкм, не более около 40 мкм, не более около 30 мкм, не более около 20 мкм, не более около 10 мкм, не более около 9 мкм, не более около 8 мкм, не более около 7 мкм, не более около 6 мкм, не более около 5 мкм, не более около 4 мкм, не более около 3 мкм, не более около 2 мкм или не более около 1 мкм) и/или по меньшей мере около 0,1 мкм (например, по меньшей мере около 0,2 мкм, по меньшей мере около 0,3 мкм, по меньшей мере около 0,4 мкм, по меньшей мере около 0,5 мкм, по меньшей мере около 0,6 мкм, по меньшей мере около 0,7 мкм, по меньшей мере около 0,8 мкм, по меньшей мере около 0,9 мкм, по меньшей мере около 1 мкм, по меньшей мере около 2 мкм или по меньшей мере около 3 мкм). Например, фильтр может иметь средний размер пор в диапазоне от около 0,1 мкм до около 100 мкм (например, от около 0,1 мкм до около 40 мкм, от около 40 мкм до около 100 мкм, от около 3 мкм до около 6 мкм или от около 0,1 мкм до около 0,3 мкм).

В некоторых вариантах выполнения средний слой можно фильтровать через несколько фильтров, последовательно соединенных друг с другом, при этом средний размер пор фильтров последовательно уменьшается. Например, средний слой можно фильтровать через систему фильтрации, включающую три последовательно соединенных фильтра, при этом первый фильтр может иметь средний размер пор около 40 мкм, второй фильтр может иметь средний размер пор от около 3 мкм до около 6 мкм и третий фильтр может иметь средний размер пор от около 0,1 мкм до около 0,3 мкм. Примером такой системы фильтрации является система, включающая последовательно соединенные глубинные фильтры, коммерчески доступные от компании Pall Corporation (например, включающая глубинные фильтры T2600, K200P и Bio10). Необязательно, система фильтрации может дополнительно включать четвертый фильтр (например, имеющий средний размер пор около 0,2 мкм), следующий за третьим фильтром. Примером четвертого фильтра является фильтр Sartobran P, поставляемый компанией Sartorius Corporation.

В некоторых вариантах выполнения фильтры, используемые для фильтрования среднего слоя, могут иметь большую площадь фильтрующего материала. Например, фильтры могут иметь площадь фильтрующего материала по меньшей мере около 1 м² (например, по меньшей мере около 2 м², по меньшей мере около 4 м², по меньшей мере около 6 м² или по меньшей мере около 8 м²).

В некоторых вариантах выполнения после перемешивания кислого буфера и яичного белка, с получением перемешанного яичного белка, перемешанный яичный белок может быть отфильтрован без необходимости в оседании преципитатов в перемешанном яичном белке. В таких вариантах выполнения перемешанный яичный белок (включая преципитаты, образовавшиеся во время стадий добавления/перемешивания, и остальной раствор яичного белка) можно фильтровать без предварительного отделения преципитатов от перемешанного яичного белка. Например, после перемешивания кислого буфера и яичного белка перемешанный яичный белок можно фильтровать без отстаивания, используя один или более фильтров, описанных в настоящем документе (например, систему фильтрации, включающую три последовательно соединенных фильтра, имеющих уменьшающиеся размеры пор). Без привязки к конкретной теории, считается, что за счет исключения стадии отстаивания такой способ может позволить значительно сокращать время и затраты на подготовку яичного белка к препаративной хроматографической обработке и для выделения белков из яичного белка.

В некоторых вариантах выполнения после перемешивания кислого буфера и яичного белка, с получением перемешанного яичного белка, перемешанный яичный белок можно центрифугировать для отделения преципитатов (например, комплексов овомуцин-лизоцим) от супернатанта. Полученный таким образом супернатант затем можно фильтровать, используя один или более фильтров, описанных в настоящем документе.

Как правило, фильтрованный раствор яичного белка можно использовать для выделения рекомбинантных белков методом хроматографии на колонке, таким как ионообменная хроматография или хроматография на основе гидрофобного взаимодействия. Примеры таких хроматографических методов описаны, например, в публикации патентной заявки США № 2009/0299037.

В некоторых вариантах выполнения данное изобретение относится к способам выделения рекомбинантного белка из яичного белка. Например, такие способы могут включать стадии: (1) получения партии яичного белка, содержащего рекомбинантный белок, при этом партия имеет объем по меньшей мере около 10 литров; (2) доведения pH яичного белка до значения от около 5 до около 6,5, при этом проводимость яичного белка с отрегулированным значением pH составляет от около 8 мСм/см до около 20 мСм/см; (3) фильтрования яичного белка, с получением раствора, и (4) выделения рекомбинантного белка, присутствующего в яичном белке, колоночной хроматографией. Стадию доведения pH можно выполнять путем добавления небольшого количества кислого буфера (например, от около 0,5 вес.% до около 5 вес.% в расчете на килограмм яичного белка) к яичному белку таким образом, как описано выше. Стадии фильтрования и выделения можно выполнять способами, описанными в настоящем документе, или способами, известными в данной области.

В некоторых вариантах выполнения данное изобретение относится к способам фильтрования подкисленного яичного белка (например, яичного белка, подкисленного с помощью кислого буфера, описанного выше). Например, такие способы могут включать стадии: (1) пропускания буфера для предварительной обработки, имеющего проводимость от около 8 мСм/см до около 20 мСм/см, через фильтр и (2) пропускания яичного белка (например, имеющего объем по меньшей мере около 50 л), который имеет pH от около 5 до около 6,5, через данный фильтр, с получением фильтрованного яичного белка. Фильтрованный яичный белок затем можно использовать для выделения рекомбинантных белков методом хроматографии на колонке. В некоторых вариантах выполнения фильтр, используемый в таких способах, может быть аналогичным или тем же самым, что и фильтры, описанные выше. Например, фильтр может иметь такой же средний размер пор (например, от около 0,1 мкм до около 100 мкм) или площадь фильтрующего материала, как фильтры, описанные выше (например, по меньшей мере около 8 м²).

В некоторых вариантах выполнения буфер для предварительной обработки можно использовать для смачивания фильтра перед пропусканием яичного белка (например, подкисленного яичного белка). Буфер для предварительной обработки может содержать одну или более солей (например, щелочных солей). Иллюстративные соли включают фосфат натрия и хлорид натрия. В некоторых вариантах выполнения буфер для предварительной обработки может содержать сочетание фосфата натрия и хлорида натрия.

Как правило, буфер для предварительной обработки может содержать кислоту. Иллюстративные кислоты включают уксусную кислоту, соляную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту, фтористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, хлорную кислоту, лимонную кислоту, борную кислоту, виннокаменную кислоту, молочную кислоту, муравьиную кислоту, щавелевую кислоту, мочевую кислоту и барбитуровую кислоту. В некоторых вариантах выполнения в буфере для предварительной обработки можно использовать сочетание двух или более (например, трех или четырех) кислот.

В некоторых вариантах выполнения буфер для предварительной обработки может иметь pH практически такое же, что и pH яичного белка. Например, буфер для предварительной обработки может иметь pH по меньшей мере около 5 (например, по меньшей мере около 5,2, по меньшей мере около 5,4, по меньшей мере около 5,6, по меньшей мере около 5,7, по меньшей мере около 5,8 или по меньшей мере около 5,9) и/или не более около 6,5 (например, не более около 6,4, не более около 6,3, не более около 6,2 или не более около 6,1). В некоторых вариантах выполнения буфер для предварительной обработки может иметь pH около 6. Без привязки к конкретной теории, считается, что использование буфера для предварительной обработки, имеющего практически такое же pH, что и pH яичного белка, для обработки фильтра позволяет доводить pH поверхности фильтра до значения, аналогичного значению pH яичного белка, тем самым сводя к минимуму преципитацию яичного белка во время фильтрования, которая может приводить к засорению фильтра или препятствовать потоку образцов, создавая напряжение сдвига на фильтре и тем самым серьезно сокращая срок эксплуатации фильтра.

Как правило, буфер для предварительной обработки может иметь проводимость, сопоставимую с проводимостью яичного белка, так что фильтрованный подкисленный яичный белок удовлетворяет характеристикам колоночной хроматографии (например, ионообменной хроматографии), используемой в последующих процессах выделения/очистки. Например, буфер для предварительной обработки может иметь проводимость по меньшей мере около 8 мСм/см (например, по меньшей мере около 9 мСм/см, по меньшей мере около 10 мСм/см, по меньшей мере около 11 мСм/см, по меньшей мере около 12 мСм/см, по меньшей мере около 13 мСм/см, по меньшей мере около 14 мСм/см, по меньшей мере около 15 мСм/см, по меньшей мере около 16 мСм/см, по меньшей мере около 17 мСм/см, по меньшей мере около 18 мСм/см) и/или не более около 20 мСм/см (например, не более около 19 мСм/см, не более около 18 мСм/см, не более около 17 мСм/см, не более около 16 мСм/см, не более около 15 мСм/см, не более около 14 мСм/см, не более около 13 мСм/см, не более около 12 мСм/см или не более около 11 мСм/см). Например, буфер для предварительной обработки может иметь проводимость любой величины от около 8 мСм/см до около 20 мСм/см. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что использование фильтра, предварительно не обработанного вышеуказанным буфером для предварительной обработки, при фильтровании раствора яичного белка вызывает быстрое засорение фильтра преципитатами, образовавшимися в процессе фильтрования. С другой стороны, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что использование буфера для предварительной обработки, имеющего вышеуказанную проводимость, для обработки фильтра способно корректировать проводимость поверхности фильтра таким образом, что она становится аналогичной проводимости яичного белка, тем самым сводится к минимуму преципитация яичного белка во время фильтрования и значительно продлевается срок эксплуатации фильтра.

В некоторых вариантах выполнения яичный белок можно пропускать через фильтр при относительно небольшом дифференциальном давлении (например, менее около 30 фунтов на кв. дюйм, менее около 25 фунтов на кв. дюйм, менее около 20 фунтов на кв. дюйм, менее около 15 фунтов на кв. дюйм, менее около 12 фунтов на кв. дюйм, менее около 10 фунтов на кв. дюйм или менее около 5 фунтов на кв. дюйм). Без привязки к конкретной теории, считается, что пропускание яичного белка через фильтр при относительно небольшом дифференциальном давлении может сводить к минимуму повреждения и/или засорение фильтра, тем самым снижая производственные затраты, поскольку фильтр может быть очень дорогостоящим.

Полное содержание всех публикаций, цитированных в настоящем документе (например, патентов, публикаций патентных заявок и статей), включено в настоящий документ посредством ссылки.

Следующие далее примеры являются иллюстративными и не предназначены для ограничения изобретения.

Пример 1: Способ подготовки яичного белка к препаративной хроматографической обработке, включающий стадию отстаивания

От пятидесяти до четырехсот килограмм замороженного яичного белка, хранящегося при температуре -20°C в 4-л бутылях Nalgene, размораживали при комнатной температуре в водяной бане, установленной на 21 ± 1°C, в течение около 5-7 часов. Один раз в час каждую бутыль извлекали из водяной бани, визуально осматривали для определения степени размораживания, несколько раз переворачивали и вновь помещали в водяную баню до завершения размораживания. После размораживания бутыли извлекали из водяной бани и хранили при температуре 2-8°C. После того, как была разморожена последняя бутыль с яичным белком, яичный белок из бутылей объединяли в смесительном резервуаре с открытым верхом. Кислый буфер, содержащий 5,7 M ацетата натрия, с pH 4,0 (около 1,3% по массе относительно массы яичного белка) при температуре 2-8°C добавляли к партии размороженного яичного белка в количестве 1 килограмм в минуту, следя за тем, чтобы продолжительность времени добавления кислого буфера не превышала 5 минут, для достижения целевого значения pH 6,0 ± 0,1. Смесь с яичным белком перемешивали непрерывно в течение 1 часа в смесительном резервуаре с открытым верхом без контроля температуры, а затем декантировали в закрытый миксер одноразового использования, охлажденный до температуры 2-8°C, и перемешивали в течение 6 часов. После прекращения перемешивания преципитату давали возможность отстаиваться в течение 6 часов. При необходимости, pH дополнительно доводили до значения 6,0 ± 0,1 при температуре 2-8°C с использованием либо 5,7 M ацетата натрия, либо 1 Н гидроксида натрия, с последующим перемешиванием в течение 1 часа и отстаиванием в течение 3 часов при комнатной температуре (общее время перемешивания и отстаивания не превышало 24 часа). После завершения отстаивания в перемешанном яичном белке образовались три слоя, то есть, верхний, средний и нижний слои. Затем в средний слой помещали трубку и средний слой сливали через сифон или откачивали через трубку, не нарушая верхний и нижний слои. Фильтры (последовательно расположенные глубинные фильтры от компании Pall Corporation с размером пор 40 микрон, 3-6 микрон, 0,1-0,3 микрон, соответственно) предварительно промывали 80 литрами очищенной воды на квадратный метр площади фильтра для полного удаления органического углерода, вымываемых и экстрагируемых веществ, а затем осушали. Предварительно промытые фильтры затем обрабатывали раствором буфера для предварительной обработки, содержащим 20 мМ фосфата натрия и 140 мМ хлорида натрия, при pH 6,0 в количестве 1 объема удерживания фильтра, а затем осушали. Раствор яичного белка декантировали, избегая отстоявшихся, осажденных и агрегированных частиц яичного белка, фильтровали методом тупикового фильтрования со скоростью потока 1 литр на квадратный метр для фильтра каждого типа или при дифференциальном давлении менее 30 фунтов на кв. дюйм для удаления любого не отстоявшегося преципитированного материала и собирали в стерильный миксер одноразового использования. После завершения фильтрования яичного белка оставшийся в системе фильтрации яичный белок смывали раствором буфера для предварительной обработки, содержащим 20 мМ фосфата натрия и 140 мМ хлорида натрия, при pH 6,0 в количестве одного объема удерживания системы фильтров для извлечения продукта и собирали в стерильный миксер одноразового использования. Отбирали образец фильтрованного раствора яичного белка для измерения ферментативной активности и поглощения в ультрафиолетовой области (УФ), и раствор хранили при температуре 2-8°C до 24 часов перед его использованием для выделения рекомбинантных белков, присутствующих в яичном белке, методом хроматографии на колонке. В таблице 1 приведены результаты подкисления яичного белка с использованием кислого буфера, описанного выше (то есть, 5,7 M NaOAc, pH 4,0, и 1,3% по массе).

Таблица 1

		Среднее
Общая масса (кг) перемешанного яичного белка		83,52 ± 2,03
Естественное pH		8,41 ± 0,06
Естественная проводимость (мСм/см)		8,47 ± 0,25
5,7 M NaOAc, pH: 4,0 (мл)		1 ± 0,02
% добавленного 5,7 M NaOAc (по массе)		1,30%
% добавленного 5,7 M NaOAc (об/масс)		1,20%

Время после болюсного добавления (мин)	pH	Проводимость (мСм/см)
10	5,79 ± 0,03	9,52 ± 0,08
30	5,92 ± 0,02	9,45 ± 0,08
90	5,93 ± 0	9,48 ± 0,09
180	6,01 ± 0,01	9,48 ± 0,06
1080	6,09 ± 0,01	9,49 ± 0,09

Пример 2: Способ подготовки яичного белка к препаративной хроматографической обработке без стадии отстаивания.

Четыреста килограмм замороженного яичного белка (+/- 10%) (-20°C) размораживали при температуре 2-8°C (в холодной комнате) в течение около 24-72 часов. Размороженный яичный белок объединяли в закрытом смесительном резервуаре одноразового использования, снабженным рубашкой, и поддерживали при температуре 2-8°C. Кислый буфер, содержащий 5,7 M ацетата натрия, с pH 4,0 (1,08% по массе) добавляли к размороженному яичному белку в количестве 1 килограмм в минуту, следя за тем, чтобы продолжительность времени добавления кислого буфера не превышала 5 минут, для достижения целевого значения pH 6,0 ± 0,5. Подкисленный раствор яичного белка перемешивали непрерывно в течение 3 часов при температуре 2-8°C. Затем подкисленный яичный белок нагревали до температуры 21 ± 3°C в резервуаре с рубашкой перед фильтрованием. Фильтры (последовательно расположенные глубинные фильтры от компании Pall Corporation с размером пор 40 микрон, 3-6 микрон, 0,1-0,3 микрон, соответственно) предварительно промывали 80 литрами очищенной воды на квадратный метр площади фильтра для полного удаления органического углерода, вымываемых и экстрагируемых веществ. Очищенную воду в системе фильтров заменяли раствором буфера для предварительной обработки, содержащим 20 мМ фосфата натрия и 140 мМ хлорида натрия, при pH 6,0 до тех пор, пока проводимость фильтрата не достигала приемлемого диапазона проводимости буфера для предварительной обработки (например, 1-15 мСм/см). Перемешанный до гомогенного состояния подкисленный яичный белок фильтровали методом тупикового фильтрования со скоростью потока 1 литр/мин/м² для фильтра каждого типа или при дифференциальном давлении ≤10 фунтов на кв. дюйм для удаления любого преципитированного или агрегированного материала. Объем первоначального фильтрата, равный 80% объема удерживания системы фильтров, использовали для замещения буфера для предварительной обработки и отбрасывали перед началом сбора продукта. Оставшийся фильтрованный буфер для предварительной обработки и яичный белок собирали в стерильный миксер одноразового использования. После завершения фильтрования яичного белка оставшийся в системе фильтрации яичный белок смывали раствором буфера для предварительной обработки, содержащим 20 мМ фосфата натрия и 140 мМ хлорида натрия, при pH 6,0 в количестве 1,5 объемов удерживания системы фильтров (0,5 объема удерживания собирали, в то время как 1 объем удерживания оставался в системе фильтров) для извлечения продукта и собирали в стерильный смесительный резервуар одноразового использования. Отбирали образец фильтрованного раствора яичного белка для измерения ферментативной активности и поглощения, и раствор хранили при температуре 2-8°C до 24 часов перед его использованием для выделения рекомбинантных белков, присутствующих в яичном белке, методом хроматографии на колонке.

Пример 3: Уменьшение масштаба производственного процесса для яичного белка с целью оценки влияния прямого нагружения на характеристики глубинной фильтрации и робастности способа подкисления яичного белка

Материалы

Все химические реагенты, используемые в исследованиях осветления, были категории USP/MC. Исходные материалы для яичного белка приведены в таблице 2. Все исходные материалы хранили при температуре -20°C и размораживали при температуре 2-8°C в течение 48-72 часов перед использованием. Исходные материалы объединяли и поддерживали при температуре 2-8°C на протяжении стадии подкисления.

Таблица 2. Исходные материалы для яичного белка

Прогон	Аликвота яичного белка (л)	Титр (г/л)*	Зиготность
1	20	0,77	гомо
2	20	1,02	гомо
3	20	0,79	гомо

* На основании ферментативной активности.

Для всех буферных препаратов измерение проводимости выполняли с использованием приборов для измерения pH/проводимости при температуре, поддерживаемой на уровне 25°C. pH буферов измеряли при температуре 20°C. Состав компонентов, используемых для получения буферов, приведен в таблице 3, ниже.

Таблица 3. Состав буферов

	Буфер	Исходный материал	г/л	Спецификации
				pH	Проводимость (мСм/см)
Подкисление яичного белка	5,7 М ацетат натрия, pH 4,0	Тригидрат ацетата натрия	136,1	4,0 ± 0,1	36,0 ± 5,0
		Ледяная уксусная кислота	285,0
Промывание/Уравновешивание фильтра	20 мМ фосфат натрия, 140 мМ NaCl, pH 6,0	NaH₂PO₄·H₂O	2,24	6,0 ± 0,1	16,0 ± 2,0
		Na₂HPO₄·7H₂O	1,02
		NaCl	8,18
Промывание 1	5 мМ фосфат натрия, pH 6,0	NaH₂PO₄·H₂O	2,24	6,0 ± 0,1	0,45 ± 0,15
		Na₂HPO₄·7H₂O	1,02
Промывание 2	5 мМ трис, 1 M NaCl, pH 7,2	Основание трис	0,61	7,2 ± 0,1	88,0 ± 5,0
		NaCl	58,44
Промывание 3	5 мМ трис, 0,25 M NaCl, pH 7,2	Основание трис	0,61	7,2 ± 0,1	23,0 ± 3,0
		NaCl	14,61
Элюция	5 мМ трис, 17% IPA, pH 7,2	Основание трис	0,61	7,2 ± 0,1	<2,0
		Изопропиловый спирт	133,0
Кислотная очистка	0,85% фосфорная кислота	Фосфорная кислота	16,9	н/п	н/п

Производственное оборудование

Производственные блоки (AKTA Explorers) обслуживала (профилактическое техническое обслуживание) компания GE healthcare. Производственное оборудование (монтажную панель Pall Stax и AKTA Explorers) обслуживал ответственный за разработку технологий персонал компании Synageva на протяжении всего периода определения характеристик. В таблице 4, ниже, приведен список всего оборудования, используемого в данном примере.

Таблица 4. Список оборудования

Стадия	Описание оборудования	Производитель	Номер по каталогу
Общего назначения	Измеритель pH/проводимости Accumet XL550	Fisher Scientific	X13-12005
	3,2-кг настольные весы	Mettler Toledo	ML3002E
	50-кг напольные весы	Ohaus	CD-33
	Насос Masterflex L/S (10-600 об/мин)	Cole-Parmer	7523-60
	Masterflex I/P 73 C-flex	Cole Parmer	06427-73
	Masterflex L/S 24 Bioprene	Cole Parmer	06508-24
Осветление	Монтажная панель системы Stax Pilot	Pall	SXLSC02W
	Монтажная панель системы Stax Pilot	Pall	SXLSC02W
	Насос Masterflex I/P (33-600 об/мин)	Cole-Parmer	77410-10
	Ячейка напорного потока	SciLog	080-696-PSX-5
	Монитор давления SciPres	SciLog	080-690
	250-кг напольные весы	Ohaus	CD-33
PHIC SDM	AKTA Explorer	GE Healthcare	29001622
PHIC SDM	Колонка XK16	GE Healthcare	н/п
A280	Nanodrop 2000	Thermo Scientific	н/п
SDS-ПААГ	Mini-PROTEAN TGX 4%-20%	Bio-Rad	456-1096 (L/N: 400091244)
	Двойные цветные стандарты Precision Plus	Bio-Rad	161-0374 (L/N: 35001785)
	Ячейка Mini PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000

Монтажную панель системы Stax от компании Pall (PN# SXLSC02W) устанавливали с использованием глубинных фильтров STAX, перечисленных в таблице 5, в следующей конфигурации (40 мкм, 3-6 мкм и 0,1-0,3 мкм) и дополнительного 0,2-мкм фильтра Sartobran P.

Монтажная панель №1: (низ) коллектор → T2600 → вентиляционная пластина (верх)

Монтажная панель №2: (низ) коллектор → K200P → вентиляционная пластина → коллектор → Bio10 → вентиляционная пластина (верх).

Каждый фильтр был зажат между 1,5ʺ входным/выходным коллектором (P/N: 7008225) и верхней вентиляционной пластиной. Объем удерживания для каждого отдельного фильтра определяли эмпирически во время первого промывания водой.

Таблица 5. Оборудование для глубинной фильтрации

Прогон	Фильтр	Коэффициент нагрузки (л/м ² )	Размер пор (мкм)	Фильтры Stax (ППС, м ² )	Объем удерживания (л)
1	T2600	20	40	1,0	6,5
	K200P	20	3-6	1,0	6,0
	BIO10	20	0,1-0,3	1,0	5,5
	Sartobran P	160	0,22	1,8	1,35
2	T2600	20	40	1,0	6,5
	K200P	20	3-6	1,0	6,0
	BIO10	40	0,1-0,3	0,5	3,8
	Sartobran P	160	0,22	1,8	1,35
3	T2600	20	40	1,0	6,5
	K200P	20	3-6	1,0	6,0
	BIO10	40	0,1-0,3	0,5	4,0
	Sartobran P	160	0,22	1,8	1,35

Колонки XK 16/20 (GE Healthcare) использовали в качестве заполняемых колонок во всех случаях хроматографии гидрофобного взаимодействия (PHIC). Все хроматографическое разделение выполняли на приборе AKTA Explorer с программным обеспечением Unicorn версии 5.31 (GE Healthcare).

Процедуры

Перед началом стадии осветления аликвоты замороженного яичного белка (всего 20 л) размораживали при температуре 2-8°C в течение 48-72 часов. Размороженный яичный белок собирали в полипропиленовый бак соответствующего размера (25 л) со стерильным покрытием (Thermo Scientific/Hyclone P/N 343050-0005). Партию яичного белка перемешивали до гомогенного состояния с использованием верхнеприводной мешалки (330 об/мин) при температуре 2-8°C. Затем pH партии яичного белка доводили до целевого значения путем добавления 5,7 M ацетата натрия с pH 4,0. В таблице 6 приведены объемы 5,7 M ацетата натрия, добавляемые в случае каждого эксперимента с осветлением для достижения целевого значения pH. PH контролировали в течение более 2 часов для гарантии достижения целевого значения pH.

Таблица 6. Подкисление партии яичного белка

Прогон	Объем партии (л)	Целевое pH	Объем 5,7 M ацетата (мл)	5,7 M ацетат (% по массе)	5,7 M ацетат (% по объему)	Исходное pH	Конечное pH	Время подкисления (ч)
1	20	6,0	180	0,94	0,90	н/п	5,94	18
2	20	5,7	245	1,27	1,22	8,11	5,67	24
3	20	6,3	164	0,83	0,80	8,21	6,25	6

Перед фильтрованием фильтры индивидуально промывали фильтрованной очищенной ОО/ДИ (RO/DI) водой в количестве 80 л/м². Во время промывания водой эмпирически определяли объем удерживания для каждого фильтра. После завершения промывания водой фильтры объединяли в непрерывную систему и промывали уравновешивающим буфером для PHIC (20 мМ фосфата натрия, 140 мМ хлорида натрия, pH 6,0) в количестве 16 л/м². Промывание буфером прекращали, когда pH и проводимость фильтрата соответствовали спецификациям промывающего буфера (например, pH 6,0 ± 0,1, проводимость 16,0 ± 2,0). Партию яичного белка нагружали на систему фильтров с использованием a 3/8ʺ погружной трубы (I/P 73 tubing Cole) со скоростью 1,0 л/мин при непрерывном перемешивании (верхнеприводная мешалка, 300 об/мин). 80% измеренного кумулятивного объема удерживания (~13,2 л) собирали и отбрасывали. Затем собирали фильтрат в отдельный контейнер соответствующего размера до тех пор, пока сгустившийся преципитат низкой плотности не начинал поступать в погружную трубу. Затем систему фильтрации промывали уравновешивающим буфером в количестве 1,5 объемов удерживания (~25 л). Конечный фильтрат тщательно перемешивали с использованием чистой лопастной мешалки для гарантии гомогенности перед отбором образцов. Фильтрат хранили при температуре 2-8°C в течение ночи перед разделением методом PHIC.

Перед разделением методом PHIC фильтрат, хранившийся при температуре 2-8°C, нагревали на водяной бане комнатной температуры. Фильтрат вторично фильтровали через картридж Sartobran 150 (0,45 мкм/0,22 мкм, P/N 5231307H4-00), получая раствор для нагружения на колонку PHIC. В таблице 7 приведены используемые буферы и параметры процесса.

Таблица 7. Стадии типового процесса хроматографии PHIC

Стадия	Буфер	ОК	Линейная скорость (см/ч)	Скорость потока (мл/мин)
Уравновешивание	20 мМ фосфат натрия, 140 мМ NaCl, pH 6,0	5	120 см/ч	4,02
Нагружение			60 см/ч	2,01
Промывание 1	5 мМ фосфат натрия, pH 6,0	8	120 см/ч	2,01 (1 ОК) 4,02 (7 ОК)
Промывание 2	5 мМ Трис, 1 M NaCl, pH 7,2	8	120 см/ч	4,02
Промывание 3	5 мМ Трис, 0,25 M NaCl, pH 7,2	4	120 см/ч	4,02
Пре-элюция	5 мМ Трис, 17% IPA, pH 7,2	УФ → 40 mAU	120 см/ч	4,02
Фракция 1	5 мМ Трис, 17% IPA, pH 7,2	УФ → 800 mAU	120 см/ч	4,02
Элюция	5 мМ Трис, 17% IPA, pH 7,2	1,9	120 см/ч	4,02
Пост-элюция	5 мМ Трис, 17% IPA, pH 7,2	2,0	120 см/ч	4,02
Десорбция	ОО/ДИ	5	60 см/ч восходящий поток	2,01
Кислотная очистка	0,85% фосфорная кислота	3	60 см/ч восходящий поток	2,01
Промывание водой	ОО/ДИ	5	60 см/ч восходящий поток	2,01
Безразборная чистка (CIP)	0,5 Н NaOH	3	60 см/ч восходящий поток (удерживание 1 час)	2,01
Промывание водой	ОО/ДИ	5	60 см/ч восходящий поток	2,01
Хранение	20% этанол	3	60 см/ч восходящий поток	2,01

Результаты и обсуждение

(1) Прямое нагружение подкисленного яичного белка (то есть, без стадии отстаивания)

Первоначально проводили один центральный эксперимент («прогон 1»; масштаб 1:20; 20 л подкисленного яичного белка при pH около 6) для оценки влияния прямого нагружения (без отстаивания, скорость нагружения 20 л/м²) на характеристики глубинной фильтрации с целью создания репрезентативной экспериментальной масштабированной модели. В случае каждого фильтра (то есть, T2600, K200P, Bio10), хотя давление подачи на входе в фильтр возрастало линейно в процессе нагружения подкисленного яичного белка, дифференциальное давление не превышало 10 фунтов на кв. дюйм. Кроме того, давление подачи дополнительно не возрастало во время промывания буфером и резко снижалось на фильтре T2600. Эти результаты свидетельствуют о том, что прямое нагружение подкисленного яичного белка на фильтры не приводило к существенному засорению фильтров во время данного эксперимента.

Результаты по выходу белка обобщены в таблице 8, ниже. Как видно из таблицы 8, выход белка после стадии осветления соответствовал целевым ожиданиям (>70%).

Таблица 8. Выход белка после осветления

Прогон 1	Сред. коррект. результаты (Ед/мл)	Объем (мл)	Выход белка (мг)
Партия яичного белка	199,5	20000	15344,6
Партия подкисленного яичного белка	253,4	20000	19493,6
Партия осветленного яичного белка	122,8	32700	15438,2
Выход стадии осветления* (размороженный яичный белок)			100,6%
Выход стадии осветления* (подкисленный яичный белок)			79,2%

* На основании ферментативной активности.

Показатели эффективности работы колонки PHIC при прогоне 1 были сопоставимы с результатами, полученными в экспериментах, включающих стадию отстаивания подкисленного яичного белка. Кроме того, определяли чистоту белка методом SDS-ПААГ с использованием 4-20% геля в трис-глициновом буфере. Фракции элюента с колонки PHIC в прогоне 1 не отличались по характерной картине полос при сравнении с результатами эксперимента, включающего стадию отстаивания. Эти данные свидетельствовали о том, что прямое нагружение подкисленного яичного белка в процессе осветления (то есть, фильтрования) не влияет на выход белка или результаты PHIC хроматографии с точки зрения выхода и чистоты.

Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что подкисленный яичный белок можно напрямую нагружать на фильтры во время стадии осветления без стадии отстаивания. Данный способ затем применяли в экспериментах по изучению робастности способа (то есть, прогонах 2 и 3), описанных в следующем разделе.

(2) Робастность способа подкисления яичного белка

Использовали 2-факторный, 2-уровневый дизайн эксперимента (высокие/низкие, низкие/высокие) для оценки робастности стадии подкисления яичного белка. Условия эксперимента приведены в таблице 6. В прогоне 2 подкисление выполняли в течение 24 часов для достижения конечного значения pH 5,67 (то есть, около 5,7). В прогоне 3 подкисление выполняли в течение 6 часов для достижения конечного значения pH 6,25 (то есть, около 6,3). Результаты показали, что при обоих прогонах имело место сопоставимое линейное возрастание давления подачи и максимальное давление подачи вследствие повышенного засорения T2600. Более низкое максимальное давление подачи наблюдали при прогоне 2, что предположительно являлось следствием корреляции между значением pH яичного белка и вязкостью яичного белка (то есть, более низкое pH яичного белка приводило к более низкой вязкости яичного белка). Ни в одном случае давление подачи не превышало 10 фунтов на кв. дюйм, демонстрируя результаты, сопоставимые с результатами прогона 1.

После стадии осветления выход белка в прогонах 2 и 3, соответственно, составлял 71% и 83%, что соответствовало целевым ожиданиям (то есть, ≥70%) и было сравнимо с результатами прогона 1 (то есть, 79%). После разделения методом PHIC выход белка в прогонах 2 и 3, соответственно, составлял 59% и 68%, что было сопоставимо с результатами, полученными в прогонах, включающих стадию отстаивания. Наложение хроматограмм при сравнении результатов обоих прогонов 2 и 3 с прогоном 1 подтвердило сопоставимые показатели эффективности работы колонки.

Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что вариации в значении pH и времени подкисления не приводят к каким-либо существенным отрицательным последствиям с точки зрения ферментативной активности или выхода продукта. Таким образом, стадия осветления была робастной при выполнении ее в двух режимах тестирования (то есть, pH подкисления 5,7-6,3 и время подкисления 6-24 часов).

(3) Стабильность яичного белка в ходе процесса

Проводили исследования допустимого времени хранения продукта для определения максимально допустимых периодов хранения продукта в следующих трех технологических состояниях: (1) размороженный яичный белок (2-8°C), (2) подкисленный яичный белок (2-8°C и температура окружающей среды) и (3) осветленный яичный белок (2-8°C и температура окружающей среды). Оценивали стабильность продукта (в отношении ферментативной активности) на протяжении периода времени 72-96 часов. Проводили два отдельных исследования стабильности для оценки влияния вариаций параметров осветления на допустимое время хранения продукта на стадиях подкисления и осветления яичного белка. Аликвоты по шестьдесят мл (по две для каждого из подкисленного и осветленного яичного белка) отбирали при каждом из двух экспериментов исследования робастности, описанных выше (то есть, прогонов 2 и 3) и хранили либо при температуре 2-8°C, либо при температуре окружающей среды. 1,5-мл образцы отбирали каждые 24 часа до истечения либо 72 часов (pH 5,7/24 часа), либо 96 часов (pH 6,3/6 часов). Из-за нехватки времени исследование стабильности не проводили для прогона 1 (центральный эксперимент). Параметры для исследования стабильности приведены в таблице 9, ниже.

Таблица 9. Дизайн исследования стабильности в ходе процесса

Этап процесса	Целевой показатель для коммерческого процесса (ч)	Темп. этапа при коммерческом процессе (°C)	Параметры исследования
			Темп. в исследовании (°C)	pH	Время подкисления (ч)	Время хранения (ч)
Размороженный яичный белок	72-96	2-8	2-8	н/п	н/п	0-168*
			2-8	н/п	н/п
Подкисленный яичный белок	6 ч (диапазон 6-24 ч)	2-8	2-8	5,7-6,3	6-24	0-72 (24 ч)
			RT*			0-96 (6 ч)
Осветленный яичный белок	≤6 ч (без повторного фильтрования)	RT или 2-8	2-8	5,7-6,3	6-24	0-72 (24 ч)
	≤24 ч (повторное фильтрование)		RT**			0-96 (6 ч)

* T=0 соответствует началу размораживания (дополнительное время хранения, включая время размораживания)

** RT=18-25°C (средняя: 22°C).

Результаты показывают, что ферментативная активность в случае всех трех этапов процесса (размороженный, подкисленный и осветленный яичный белок) была стабильной на всем протяжении исследования (вплоть до 96 часов) при температуре 2-8°C. Кроме того, вариации как значения pH подкисления, так и времени подкисления, как правило, не оказывали отрицательного влияния на ферментативную активность. При одном наборе параметров тестирования (pH 5,7, комнатная температура) на стадии подкисленного яичного белка наблюдали ~20% снижение ферментативной активности. Однако целевая температура хранения в современном коммерческом производственном процессе для подкисленного яичного белка составляет 2-8°C и, таким образом, данное наблюдение не представляет риск для коммерческого процесса. Исходя из полученных данных, размороженный/объединенный яичный белок был стабилен вплоть до 168 часов (включая первоначальные 72 часа периода размораживания) при температуре 2-8°C, подкисленный яичный белок был стабилен вплоть до 96 часов при температуре 2-8°C и осветленный яичный белок был стабилен вплоть до 96 часов при температуре 2-8°C или комнатной температуре.

(4) Дополнительное исследование очистки от ДНК

Хотя яичный белок сам по себе не содержит ДНК, процесс сбора яичного белка может приводить к присутствию геномной ДНК хозяина при попадании незначительных количеств яичного желтка в партию яичного белка. Подкисленный и осветленный яичный белок, полученный в прогонах 1-3 исследования, описанных выше, анализировали на наличие геномной ДНК хозяина. Анализы выявили следующее:

1. ДНК была обнаружена в объединенном и подкисленном яичном белке

2. Была отмечена существенная очистка от ДНК во время стадии осветления.

Эти данные свидетельствуют о том, что в дополнение к очистке яичного белка от белка хозяина, стадия осветления является способом удаления геномной ДНК хозяина из партии продукта.

Другие варианты выполнения входят в объем следующей далее формулы изобретения.

Claims

1. Способ выделения рекомбинантного белка из яичного белка, включающий стадии:

получения партии яичного белка, содержащего рекомбинантный белок, при этом объем партии составляет по меньшей мере около 10 литров;

добавления кислого буфера, содержащего кислотное вещество, к партии яичного белка, при этом количество кислого буфера составляет от около 0,5 вес.% до около 5 вес.% в расчете на килограмм яичного белка; и

перемешивания кислого буфера и яичного белка для доведения рН яичного белка до значения от около 5 до около 6,5, при этом проводимость яичного белка с отрегулированным значением pH составляет от около 8 мСм/см до около 20 мСм/см;

фильтрования яичного белка с получением раствора; и

выделения рекомбинантного белка, содержащегося в яичном белке, колоночной хроматографией.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап доведения pH включает перемешивание яичного белка с кислым буфером.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что кислый буфер имеет проводимость от около 8 мСм/см до около 40 мСм/см или составляет от около 0,5 вес.% до около 5 вес.% в расчете на килограмм яичного белка.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что кислотное вещество выбирают из группы, состоящей из уксусной кислоты, соляной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты, фтористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, хлорной кислоты, лимонной кислоты, борной кислоты, виннокаменной кислоты, молочной кислоты, муравьиной кислоты, щавелевой кислоты, мочевой кислоты и барбитуровой кислоты.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что кислый буфер дополнительно содержит от около 5 M до около 6 M ацетата натрия.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что кислый буфер составляет от около 0,5 вес.% до около 2 вес.% в расчете на килограмм яичного белка.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что кислый буфер имеет pH от около 4 до около 6,5.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что pH перемешанного яичного белка составляет от около 5 до около 6,3.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что pH перемешанного яичного белка является таким, что перемешанный яичный белок становится менее вязким.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что яичный белок перемешивают в течение по меньшей мере около 1 часа или при температуре от около 2°C до около 25°C.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что партия яичного белка имеет объем по меньшей мере около 10 литров.

12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что кислый буфер добавляют к партии яичного белка одной болюсной инжекцией.

13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что добавление кислого буфера и перемешивание яичного белка выполняют одновременно.

14. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию, позволяющую перемешанному яичному белку отстаиваться таким образом, что яичный белок разделяется на верхний, средний и нижний слои, стадию выделения среднего слоя и стадию фильтрования среднего слоя после стадии выделения.

15. Способ по п. 1, дополнительно включающий фильтрование перемешанного яичного белка без отстаивания перемешанного яичного белка,

при этом стадия фильтрования включает фильтрование перемешанного яичного белка через фильтр, имеющий средний размер пор в диапазоне от около 0,1 мкм до около 100 мкм, и стадия фильтрования включает одну или более последующих стадий фильтрования после первоначального фильтрования перемешанного яичного белка, при этом в одной или более последующих стадиях фильтрования используют один или более фильтров, имеющих средний размер пор в диапазоне от около 0,1 мкм до около 40 мкм.

16. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию центрифугирования после стадии перемешивания, при этом перемешанный яичный белок центрифугируют для отделения преципитатов, содержащих комплексы овомуцин-лизоцим, от супернатанта.

17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что яичный белок содержит рекомбинантный терапевтический белок, экзогенный для яичного белка.

18. Способ по п.1, в котором стадия фильтрования яичного белка включает стадии:

пропускания буфера для предварительной обработки, имеющего проводимость от около 8 мСм/см до около 20 мСм/см, через фильтр; и

пропускания яичного белка, имеющего pH от около 5 до около 6,5, через данный фильтр с получением фильтрованного яичного белка.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что буфер для предварительной обработки имеет pH, практически такое же, как pH яичного белка.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что буфер для предварительной обработки имеет pH от около 5,9 до около 6,1.

21. Способ по п. 18, отличающийся тем, что буфер для предварительной обработки содержит фосфат натрия и хлорид натрия.

22. Способ по п. 18, отличающийся тем, что буфер для предварительной обработки имеет проводимость от около 10 мСм/см до около 18 мСм/см.

23. Способ по п. 18, отличающийся тем, что яичный белок имеет проводимость от около 8 мСм/см до около 20 мСм/см.

24. Способ по п. 18, отличающийся тем, что фильтр имеет площадь фильтрующего материала по меньшей мере около 8 м² или имеет средний размер пор от около 0,1 мкм до около 100 мкм.

25. Способ по п. 18, отличающийся тем, что яичный белок пропускают через данный фильтр при дифференциальном давлении менее около 30 фунтов на кв. дюйм.