ES2893402T3 - Procesamiento de clara de huevo - Google Patents
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Abstract
Un método para preparar clara de huevo para procedimiento cromatográfico en masa, comprendiendo el método las siguientes etapas: añadir un tampón ácido que comprenda un agente ácido a una combinación de clara de huevo, siendo el contenido de tampón ácido desde aproximadamente el 0.5 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso por kilogramo de clara de huevo, mezclar el tampón ácido y la clara de huevo para formar clara de huevo mezclada con un pH desde aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5 y permitir que la clara de huevo mezclada se sedimente de manera que la clara de huevo se separe en capas superior, media e inferior.
Description
DESCRIPCIÓN
Procesamiento de clara de huevo
Antecedentes
Las aves transgénicas (por ejemplo, pollos, codornices o pavos transgénicos) son un sistema de expresión deseable para obtener proteínas recombinantes exógenas para uso en aplicaciones farmacéuticas u otras aplicaciones comerciales que requieren grandes cantidades de suministro de proteínas. Una gallina puede poner hasta 330 huevos al año, conteniendo cada uno 6.5 gramos de proteína. Aproximadamente 3.5 gramos de la proteína total es de la clara de huevo, de los cuales el 90 % representa a siete proteínas diferentes; la ovoalbúmina sola representa 2 gramos de proteína de la clara de huevo (aproximadamente el 50 % de la proteína de la clara de huevo). En la actualidad, el producto génico exógeno promedio derivado de expresión específica de oviducto de un transgén y recuperado de la clara de huevo se sabe que es aproximadamente de 5 mg a 10 mg por huevo. Las ventajas de la producción de proteína exógena en huevos de gallina incluyen tiempos cortos de generación y tasas prolíficas de reproducción por inseminación artificial. Se han expresado varias proteínas en huevos de gallinas transgénicas. Véanse, por ejemplo, la Patente de EE. UU. número 6,730,822 y la Publicación de EE. UU. número 2006/0015960.
Muchas proteínas terapéuticas exógenas (por ejemplo, proteínas humanas recombinantes tales como las citocinas (por ejemplo, eritropoyetina, factor estimulador de colonias de granulocitos (GC-SF), interferones y factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF)), anticuerpos y varias enzimas lisosómicas humanas) son de interés para la industria farmacéutica. Las proteínas terapéuticas pueden obtenerse fácilmente en cantidades significativas a partir de, por ejemplo, la clara de huevo de gallinas transgénicas. Los métodos tradicionales para aislar proteínas exógenas de la clara de huevo, sin embargo, con frecuencia se basan en el uso de procedimientos de inmunoafinidad u otros procedimientos solo adecuados para producción a pequeña escala (por ejemplo, implicando el volumen total de clara de huevo de 5 l a lo sumo). Para una producción de proteínas a gran escala, dicho procedimiento no es práctico basándose en los costes, la mano de obra y el tiempo.
Sumario
Esta descripción se basa en el descubrimiento inesperado de que añadiendo una pequeña cantidad de un tampón ácido (por ejemplo, en un solo bolo intravenoso) a una combinación de clara de huevo (por ejemplo, obtenida de huevos puestos por aves transgénicas tales como gallinas, codornices y pavas transgénicas) de escala industrial (por ejemplo, con un volumen de al menos 10 litros) se puede preparar la clara de huevo para aislamiento cromatográfico en masa de proteínas recombinantes tales como proteínas terapéuticas humanas a partir de clara de huevo sin la necesidad de diluir la clara de huevo. Dicho método puede reducir significativamente la cantidad de materiales de la clara de huevo sometidos a procedimientos posteriores de aislamiento/purificación (por ejemplo, la cantidad de las columnas usadas en aislamiento cromatográfico), reduciéndose significativamente de ese modo los costes, la mano de obra y el tiempo para aislar proteínas recombinantes a partir de clara de huevo. Por consiguiente, los métodos descritos en la presente descripción pueden mejorar enormemente la eficacia de la preparación de clara de huevo para una escala industrial grande de producción de proteína terapéutica.
La presente invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona para fines de información solamente.
La invención se define por un método para preparar clara de huevo para tratamiento cromatográfico en masa que comprende las siguientes etapas: (1) añadir un tampón ácido que comprenda un agente ácido a una combinación de clara de huevo, siendo el tampón ácido desde aproximadamente el 0.5 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso por kilogramo de clara de huevo, (2) mezclar el tampón ácido y la clara de huevo para formar clara de huevo mezclada con un pH desde aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5 y permitir que la clara de huevo mezclada se sedimente de manera que la clara de huevo se separe en capas superior, media e inferior.
En otro aspecto, esta descripción caracteriza un método para aislar una proteína recombinante a partir de clara de huevo que incluye las siguientes etapas: (1) proporcionar una combinación de clara de huevo que contenga una proteína recombinante, teniendo la combinación un volumen de al menos aproximadamente 10 litros; (2) ajustar el pH de la clara de huevo a un valor de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5, en que la conductividad de la clara de huevo con pH ajustado es de aproximadamente 8 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm; (3) filtrar la clara de huevo para formar una disolución (es decir, una disolución clara); y (4) aislar la proteína recombinante en la clara de huevo por cromatografía de columna.
En otro aspecto más, esta descripción caracteriza un método para filtrar clara de huevo acidificada que incluye las siguientes etapas: (1) hacer pasar un tampón de pretratamiento con una conductividad entre aproximadamente 8 mS/cm y aproximadamente 20 mS/cm por un filtro; y (2) hacer pasar clara de huevo con un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5 por el filtro para obtener clara de huevo filtrada.
Las realizaciones pueden incluir una o más de las siguientes características.
El agente ácido puede seleccionarse del grupo que consiste en ácido acético, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido fluorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido cítrico, ácido bórico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido oxálico, ácido úrico y ácido barbitúrico.
El tampón ácido puede incluir además acetato de sodio de aproximadamente 5 M a aproximadamente 6 M (por ejemplo, aproximadamente 5.7 M).
El tampón ácido puede ser de aproximadamente el 0.5 % en peso a aproximadamente el 2 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente el 0.7 % en peso a aproximadamente el 1.5 % en peso, de aproximadamente el 0.9 % en peso a aproximadamente el 1.4 % en peso, o de aproximadamente el 1.2 % en peso a aproximadamente el 1.3 % en peso) por kilogramo de clara de huevo.
El tampón ácido puede tener un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6.5 (por ejemplo, aproximadamente 4, aproximadamente 4.5, aproximadamente 5, aproximadamente 5.5, aproximadamente 6.0 o aproximadamente 6.5).
Después de mezclar el tampón ácido con la clara de huevo, el pH de la clara de huevo mezclada puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5. En algunas realizaciones, el pH de la clara de huevo mezclada es de 5 a aproximadamente 6.3 (por ejemplo, de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.3, de aproximadamente 5.8 a aproximadamente 6.2, de aproximadamente 5.9 a aproximadamente 6.1, o aproximadamente 6). En algunas realizaciones, el pH de la clara de huevo mezclada es un valor de manera que la clara de huevo mezclada se haga menos viscosa.
La clara de huevo puede mezclarse durante al menos aproximadamente 1 hora y/o a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 25 °C.
La combinación de clara de huevo puede tener un volumen de al menos aproximadamente 10 litros (por ejemplo, al menos aproximadamente 50 litros).
El tampón ácido puede añadirse a la combinación de clara de huevo en un solo bolo intravenoso y/o a una velocidad de al menos aproximadamente 1 l/min.
La adición del tampón ácido a la clara de huevo y la combinación de la clara de huevo pueden llevarse a cabo simultáneamente.
El método según la invención incluye la etapa de permitir que la clara de huevo mezclada sedimente de manera que la clara de huevo se separe en capas superior, media e inferior. En tales realizaciones, el método puede incluir además una etapa de aislamiento de la capa media. En algunas realizaciones, el método puede incluir además filtrar la capa media después de la etapa de aislamiento. El filtrado puede incluir hacer pasar al menos una porción (por ejemplo, la totalidad) de la capa media por un filtro con un tamaño de poro promedio que se encuentre entre aproximadamente 0.1 pm y aproximadamente 100 pm. En algunas realizaciones, el filtrado puede incluir hacer pasar al menos una porción de la capa media por una pluralidad de filtros. También se describe en la presente memoria un método que puede incluir además filtrar la clara de huevo mezclada sin permitir que la clara de huevo mezclada sedimente. En tales realizaciones, la etapa de filtrado puede incluir filtrar la clara de huevo mezclada por un filtro con un tamaño de poro promedio que se encuentre entre aproximadamente 0.1 pm y aproximadamente 100 pm. En algunas realizaciones, la etapa de filtrado puede incluir una o más etapas de filtración posteriores siguiendo a una filtración inicial de la clara de huevo mezclada, usándose en una o más etapas de filtrado posteriores uno o más filtros con un tamaño de poro promedio de aproximadamente 0.1 pm a aproximadamente 40 pm.
El método puede incluir además una etapa de centrifugación después de la etapa de mezcla, en la que la clara de huevo mezclada se centrifuga para separar precipitados que contengan complejos ovomucina-lisozima de sobrenadante.
La clara de huevo puede incluir una proteína terapéutica recombinante exógena a la clara de huevo.
El tampón ácido puede tener una conductividad de aproximadamente 8 mS/cm a aproximadamente 40 mS/cm.
El tampón ácido puede representar de aproximadamente el 0.5 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso por kilogramo de clara de huevo.
Puede usarse un tampón de pretratamiento para preparar filtros para hacer pasar clara de huevo acidificada. El tampón de pretratamiento puede tener un pH sustancialmente similar al pH de la clara de huevo o igual que el pH de la clara de huevo, que se encuentra entre aproximadamente 5.0 y aproximadamente 6.5. Por ejemplo, el tampón de pretratamiento puede tener un pH de aproximadamente 5.9 a aproximadamente 6.1 (por ejemplo, aproximadamente 6).
El tampón de pretratamiento puede incluir fosfato de sodio y cloruro de sodio. El tampón de pretratamiento puede tener una conductividad de aproximadamente 10 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm.
La clara de huevo acidificada puede tener una conductividad de aproximadamente 8 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm.
El filtro puede tener un área del medio de filtración de al menos aproximadamente 8 m2.
El filtro puede tener un tamaño de poro promedio de aproximadamente 0.1 pm a aproximadamente 100 pm.
Se puede hacer pasar la clara de huevo por el filtro a una presión diferencial menor que aproximadamente 207 kPa
(30 psi) (por ejemplo, menor que aproximadamente 103 kPa (15 psi).
Las realizaciones pueden tener las siguientes ventajas.
En general, las columnas cromatográficas usadas en aislamiento/purificación de proteína exógena de clara de huevo
son muy costosas, lo que puede ser uno de los factores limitantes clave en la producción a escala comercial e industrial
de proteínas recombinantes de clara de huevo. Debido a que solo se usa una cantidad pequeña de un tampón ácido
para obtener clara de huevo acidificada, la cantidad de la clara de huevo acidificada usada para obtener proteínas
terapéuticas purificadas se reduce significativamente (es decir, al menos 3 a 4 veces menor que los métodos de
dilución convencionales). Como resultado, el tiempo consumido para cargar la clara de huevo acidificada en las
columnas posteriores también se ve significativamente reducido, lo que permite la producción rápida de proteína en
un procedimiento industrial. Además, debido a que algunas proteínas terapéuticas son sensibles a la exposición al
entorno durante la preparación de la clara de huevo y los procedimientos de aislamiento/purificación, minimizar el
tiempo empleado en la preparación y los procedimientos de aislamiento/purificación reduciendo el volumen de muestra
es muy ventajoso para la producción comercial que implica típicamente un volumen de clara de huevo de 500 litros o
más. En resumen, el tiempo de procesamiento, los materiales y la mano de obra pueden minimizarse enormemente
usando los métodos descritos en la presente memoria.
Otras características, objetos y ventajas serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las
reivindicaciones.
Descripción detallada
Esta descripción se refiere a métodos eficaces para preparar clara de huevo (por ejemplo, obtenida de huevos puestos
por gallinas transgénicas) para el aislamiento cromatográfico en masa de proteínas (por ejemplo, proteínas
recombinantes) de la clara de huevo, así como métodos para aislamiento de proteínas de la clara de huevo. La clara
de huevo preparada por los métodos descritos en la presente memoria está generalmente en la forma de disolución
homogénea de baja viscosidad que es adecuada para procesamiento cromatográfico en masa.
En algunas realizaciones, la clara de huevo usada como material de partida de los métodos descritos en la presente
memoria puede incluir una proteína recombinante (por ejemplo, una proteína terapéutica recombinante) exógena a la
clara de huevo. Las proteínas recombinantes ejemplares incluyen citocinas tales como GC-SF, GM-CSF,
eritropoyetina e interferones tales como interferón-a o interferón-p; enzimas lisosómicas humanas; inmunoglobulinas
(por ejemplo, anticuerpos); y proteínas estructurales. Otras proteínas recombinantes ejemplares que pueden aislarse
a partir de procesamiento cromatográfico en masa se han descrito, por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de
EE. UU. número 2009/0299037.
En general, los métodos para preparar clara de huevo descritos en la presente memoria incluyen: (1) añadir una
cantidad adecuada de un tampón ácido (por ejemplo, de aproximadamente el 0.5 % en peso a aproximadamente el
5 % en peso por kilogramo de clara de huevo) que contenga un agente ácido a una combinación de clara de huevo
(por ejemplo, con un volumen de al menos aproximadamente 10 litros); y (2) mezclar el tampón ácido y la clara de
huevo para formar una clara de huevo mezclada con un pH adecuado (por ejemplo, un pH que se encuentre entre
aproximadamente 5 y aproximadamente 6.5).
En general, la combinación de clara de huevo usada en los métodos descritos en la presente memoria es a escala
industrial y tiene un volumen relativamente grande. Por ejemplo, la combinación de clara de huevo puede tener un
0 litros 0 litros 
0 litros
al menos aproximadamente 10 000 litros, o al menos aproximadamente 20 000 litros). Los métodos para preparar
clara de huevo como material de partida para usarse en los métodos descritos en la presente memoria se han descrito,
por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de EE. UU. número 2009/0299037.
El agente ácido en el tampón ácido puede ser generalmente cualquier ácido adecuado (por ejemplo, un ácido orgánico
o un ácido inorgánico). Los agentes ácidos ejemplares incluyen ácido acético, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido
nítrico, ácido fosfórico, ácido fluorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido cítrico, ácido bórico, ácido tartárico,
ácido láctico, ácido fórmico, ácido oxálico, ácido úrico y ácido barbitúrico. En algunas realizaciones, puede usarse una
asociación de dos o más ácidos (por ejemplo, tres o cuatro) como agente ácido en el tampón ácido.
En algunas realizaciones, el tampón ácido puede incluir una o más sales (por ejemplo, sales alcalinas). Un ejemplo de dicha sal puede ser acetato de sodio. En algunas realizaciones, la sal usada en el tampón ácido puede ser una sal del agente ácido usado en el tampón ácido. En otras realizaciones, la sal usada en el tampón ácido puede ser una sal de un ácido diferente del agente ácido usado en el tampón ácido. En algunas realizaciones, el tampón ácido puede incluir una sal (por ejemplo, acetato de sodio) en una concentración de aproximadamente 5 M a aproximadamente 6 M (por ejemplo, aproximadamente 5.7 M). Sin ánimo de apoyar ninguna teoría, se cree que usar una sal que tenga dicha concentración puede dar como resultado un tampón ácido que tenga una cantidad adecuada de contenido tamponante. Si el contenido tamponante es demasiado alto, el tampón ácido puede llegar a ser inflamable y/o corrosivo, haciendo que el tampón sea inseguro de mantener, manipular y/o almacenar. Si el contenido tamponante es demasiado bajo, se puede necesitar un volumen mayor del tampón ácido para ajustar el pH de la clara de huevo al valor objetivo, reduciéndose de ese modo la eficacia del procedimiento de preparación de clara de huevo, así como los procedimientos de aislamiento/purificación de proteína posteriores.
En general, las cantidades del agente ácido y la sal usadas en el tampón ácido pueden variar dependiendo del pH deseado del tampón ácido. En algunas realizaciones, el tampón ácido puede tener un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6.5 (por ejemplo, de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 4 a aproximadamente 4.5). Por ejemplo, el tampón ácido puede tener un pH de aproximadamente 4 o un pH de aproximadamente 4.5.
El tampón ácido puede formarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, el tampón ácido puede formarse añadiendo un agente ácido a una disolución que contenga una base para ajustar el pH de la disolución a un valor deseado. Por ejemplo, puede añadirse disolución de ácido acético glacial a una cantidad apropiada de NaOH para obtener un tampón ácido que contenga acetato de sodio 5.7 M.
En general, la cantidad de tampón ácido respecto a la de clara de huevo es pequeña. Por ejemplo, el tampón ácido puede tener de aproximadamente el 0.5 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente el 0.5 % en peso a aproximadamente el 2 % en peso, de aproximadamente el 0.7 % en peso al 1.5 % en peso, de aproximadamente el 0.9 % en peso a aproximadamente el 1.4 % en peso, de aproximadamente el I % en peso a aproximadamente el 1.4 %, o de aproximadamente el 1.1 % en peso a aproximadamente el 1.3 % en peso) por kilogramo de clara de huevo. Convencionalmente, los esfuerzos para crear una clara de huevo de baja viscosidad homogénea adecuada para procedimientos cromatográficos en masa requieren añadir un tampón ácido que tenga un volumen de 2 a 5 veces (es decir, del 200 % al 500 %) del volumen de la clara de huevo ya que no se esperaba que añadir una cantidad pequeña de un tampón ácido fuera eficaz para ajustar el pH de la clara de huevo al valor objetivo. Dicho procedimiento no es económicamente práctico o factible a una escala de elaboración grande debido a la restricciones de tamaño de las columnas cromatográficas y otro equipo de elaboración usado en el procedimiento de preparación de clara de huevo. Inesperadamente, los presentes autores descubrieron que una clara de huevo de baja viscosidad y homogénea adecuada para procedimiento cromatográfico en masa puede obtenerse añadiendo una pequeña cantidad de un tampón ácido (por ejemplo, a lo sumo aproximadamente el 5 % en peso por kilogramo de clara de huevo) respecto a la cantidad de clara de huevo, reduciéndose significativamente de ese modo la cantidad de las columnas usadas en los procedimientos cromatográficos de aislamiento, los tamaños de otro equipo usado en estos procedimientos y el coste y el tiempo de aislar proteínas recombinantes de clara de huevo.
Sin ánimo de apoyar ninguna teoría, se cree que las ventajas adicionales de añadir una cantidad relativamente más pequeña de un tampón ácido respecto a la cantidad de clara de huevo incluyen: (1) dilución insignificante de clara de huevo, (2) esencialmente sin cambio en la conductividad, lo que permite la precipitación de complejos de ovomucinalisozima de clara de huevo, que a su vez reduce la viscosidad de la clara de huevo a un intervalo de pH menor (por ejemplo, pH 5-6.5) y facilita la separación de materiales no deseados de la clara de huevo durante la filtración y los procedimientos cromatográficos, y (3) minimizar la formación de bolsas de pH bajo en la clara de huevo viscosa que puedan dañar potencialmente las proteínas recombinantes o dan como resultado un pH desigual de los materiales de la clara de huevo.
En general, el tampón ácido puede tener una conductividad de aproximadamente 8 mS/cm a aproximadamente 40 mS/cm. Por ejemplo, el tampón ácido puede tener una conductividad de al menos aproximadamente 8 mS/cm (por ejemplo, al menos aproximadamente 9 mS/cm, al menos aproximadamente 10 mS/cm, al menos aproximadamente I I mS/cm, al menos aproximadamente 12 mS/cm, al menos aproximadamente 13 mS/cm, al menos aproximadamente 14 mS/cm, al menos aproximadamente 15 mS/cm, al menos aproximadamente 16 mS/cm, al menos aproximadamente 17 mS/cm, al menos aproximadamente 18 mS/cm, al menos aproximadamente 19 mS/cm, al menos aproximadamente 20 mS/cm, al menos aproximadamente 21 mS/cm, al menos aproximadamente 22 mS/cm, al menos aproximadamente 23 mS/cm, al menos aproximadamente 24 mS/cm, al menos aproximadamente 25 mS/cm) y/o a lo sumo aproximadamente 40 mS/cm (por ejemplo, a lo sumo aproximadamente 39 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 38 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 37 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 36 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 35 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 34 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 33 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 32 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 31 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 30 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 29 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 28 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 27 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 26 mS/cm, o a lo sumo aproximadamente 25 mS/cm). Por ejemplo, el tampón ácido puede tener una conductividad de aproximadamente 8 mS/cm a aproximadamente 40 mS/cm. Sin ánimo de apoyar ninguna teoría, se cree que usar un tampón ácido que tenga una conductividad de aproximadamente 8 mS/cm
a aproximadamente 40 mS/cm minimizaría los cambios en la conductividad de la clara de huevo mezclada de manera que el procedimiento pueda implementarse y simplificarse con la etapa de aislamiento de proteína posterior sin cambiar las condiciones de aislamiento de la cromatografía de columna usada en la etapa de aislamiento y sin ocasionar precipitación o agregación adicional.
En algunas realizaciones, el tampón ácido puede añadirse a la combinación de clara de huevo en un solo bolo intravenoso. En alguna realización, se realiza el único bolo intravenoso a una velocidad de inyección adecuada (por ejemplo, al menos aproximadamente 1 l/min) para asegurar que la adición del tampón ácido se añada en una cantidad adecuada de tiempo (por ejemplo, a lo sumo aproximadamente 5 minutos). Sin ánimo de apoyar ninguna teoría, se cree que las ventajas de usar un solo bolo intravenoso incluyen (1) formar flóculos relativamente grandes que sedimenten fácilmente con la gravedad, reduciéndose de ese modo la necesidad de grandes filtros y (2) evitar la necesidad de una valoración continua de una combinación de clara de huevo viscosa, que puede ocasionar falsas lecturas de pH que acarreen la adición repetida de un ácido o una base, que a su vez pueden dañar potencialmente las proteínas recombinantes en la clara de huevo e incrementar la turbidez de la disolución de clara de huevo producida.
En algunas realizaciones, después de añadir el tampón ácido a la combinación de clara de huevo, la clara de huevo se mezcla a una temperatura adecuada (por ejemplo, de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 25 °C) durante un periodo de tiempo adecuado (por ejemplo, al menos aproximadamente 1 hora) para formar una clara de huevo mezclada que tenga un pH adecuado. En algunas realizaciones, la adición del tampón ácido y la mezcla de la clara de huevo se realizan simultáneamente.
En general, la adición del tampón ácido y la mezcla del tampón ácido con la clara de huevo dan como resultado la formación de una gran cantidad de precipitados (por ejemplo, complejos de ovomucina-lisozima). Los precipitados generalmente reducen la viscosidad de la clara de huevo que queda en la disolución.
En algunas realizaciones, el pH de la clara de huevo mezclada es un valor de manera que la clara de huevo mezclada se haga menos viscosa. Por ejemplo, la clara de huevo mezclada puede tener un pH de al menos aproximadamente 5 (por ejemplo, al menos aproximadamente 5.2, al menos aproximadamente 5.4, al menos aproximadamente 5.6, al menos aproximadamente 5.7, al menos aproximadamente 5.8 o al menos aproximadamente 5.9) y/o a lo sumo aproximadamente 6.5 (por ejemplo, a lo sumo aproximadamente 6.3, a lo sumo aproximadamente 6.2 o a lo sumo aproximadamente 6.1). En algunas realizaciones, la clara de huevo mezclada puede tener un pH de aproximadamente 6. Sin ánimo de apoyar ninguna teoría, se cree que dicho pH (por ejemplo, aproximadamente 6) puede permitir la formación de la mayor cantidad de precipitados de clara de huevo que sedimenten con la gravedad, reduciéndose de ese modo la necesidad de filtración y facilitándose la formación de una disolución de clara de huevo de baja viscosidad homogénea.
En general, la clara de huevo mezclada (es decir, la clara de huevo acidificada o con pH ajustado) tiene una conductividad relativamente baja (por ejemplo, similar a la conductividad de una clara de huevo no tratada con tampón ácido). Por ejemplo, la clara de huevo mezclada puede tener una conductividad de al menos aproximadamente 8 mS/cm (por ejemplo, al menos aproximadamente 8.2 mS/cm, al menos aproximadamente 8.4 mS/cm, al menos aproximadamente 8.6 mS/cm, al menos aproximadamente 8.8 mS/cm, al menos aproximadamente 9 mS/cm, al menos aproximadamente 9.2 mS/cm, al menos aproximadamente 9.4 mS/cm, al menos aproximadamente 9.6 mS/cm, al menos aproximadamente 9.8 mS/cm, al menos aproximadamente 10 mS/cm, al menos aproximadamente 11 mS/cm, al menos aproximadamente 12 mS/cm, al menos aproximadamente 13 mS/cm, o al menos aproximadamente 14 mS/cm) y/o a lo sumo aproximadamente 20 mS/cm (por ejemplo, a lo sumo aproximadamente 19 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 18 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 17 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 16 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 15 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 14 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 13 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 12 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 11.8 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 11.6 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 11.4 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 11.2 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 11 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 10.8 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 10.6 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 10.4 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 10.2 mS/cm, o a lo sumo aproximadamente 10 mS/cm). Por ejemplo, la clara de huevo mezclada puede tener una conductividad con un valor entre aproximadamente 8 mS/cm y aproximadamente 20 mS/cm. Sin ánimo de apoyar ninguna teoría, se cree que mantener la clara de huevo mezclada a una conductividad de aproximadamente 8 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm permitiría que la clara de huevo mezclada cumpliera las condiciones usadas en la etapa de aislamiento de proteína posterior de manera que la clara de huevo mezclada pueda usarse de manera consistente en la etapa de aislamiento sin cambiar las condiciones de aislamiento de la columna cromatográfica usada en esta etapa.
Una vez completada la mezcla, los métodos descritos en la presente memoria incluyen la etapa de permitir que la clara de huevo mezclada sedimente durante un periodo de tiempo adecuado (por ejemplo, al menos aproximadamente 6 horas) de manera que la clara de huevo se separe en capas superior, media e inferior. Típicamente, la capa superior incluye ciertos materiales no deseados (por ejemplo, proteína desnaturalizada y lípidos espumosos incluidos fosfolípidos, triglicéridos y colesterol) con una densidad baja, la capa inferior incluye los precipitados formados de las proteínas de clara de huevo (por ejemplo, los complejos ovomucina-lisozima), y la capa media incluye una disolución de clara de huevo relativamente clara.
En algunas realizaciones, durante la etapa de sedimentación, si el pH de la clara de huevo mezclada llega a encontrarse fuera del valor deseado (por ejemplo, 5.7 ± 0.1, 6.0 ± 0.1 o 6.3 ± 0.1) puede ajustarse para alcanzar el valor deseado usando un ácido (por ejemplo, el tampón ácido descrito anteriormente) o una base (por ejemplo, una disolución de acetato de sodio 5.7 M o de hidróxido de sodio 1 N). En tales realizaciones, el ajuste del pH puede seguirse por mezcla adicional (por ejemplo, durante al menos aproximadamente 1 hora) y sedimentación (por ejemplo, durante al menos aproximadamente 3 horas) a temperatura ambiente. En general, el tiempo de mezcla y de sedimentación total no excede de 24 horas para minimizar el tiempo que las proteínas exógenas en la clara de huevo se exponen al entorno de procesamiento, manteniéndose de ese modo las actividades biológicas de estas proteínas.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir una etapa de aislamiento de la capa media de la clara de huevo mezclada después de la etapa de sedimentación. En general, la capa media puede aislarse usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la capa media puede extraerse con sifón del recipiente que contiene la clara de huevo mezclada insertando un tubo (por ejemplo, un tubo de metal o de policarbonato) en la capa media (preferiblemente en el centro de la capa media) de manera que el contenido de la capa media pueda bombearse a un recipiente receptor sin alterar las capas superior e inferior.
En general, una vez que se aísla la capa media, al menos una porción de la capa media (por ejemplo, toda la capa media) puede filtrarse para eliminar partículas suspendidas en la capa media para obtener una disolución de clara de huevo clara, de baja viscosidad y homogénea. Esta etapa es también conocida como clarificación de la clara de huevo. En algunas realizaciones, la capa media puede filtrarse por uno o más filtros con un tamaño de poro promedio de a lo sumo aproximadamente 100 gm (por ejemplo, a lo sumo aproximadamente 90 gm, a lo sumo aproximadamente 80 gm, a lo sumo aproximadamente 70 gm, a lo sumo aproximadamente 60 gm, a lo sumo aproximadamente 50 gm, a lo sumo aproximadamente 40 gm, a lo sumo aproximadamente 30 gm, a lo sumo aproximadamente 20 gm, a lo sumo aproximadamente 10 gm, a lo sumo aproximadamente 9 gm, a lo sumo aproximadamente 8 gm, a lo sumo aproximadamente 7 gm, a lo sumo aproximadamente 6 gm, a lo sumo aproximadamente 5 gm, a lo sumo aproximadamente 4 gm, a lo sumo aproximadamente 3 gm, a lo sumo aproximadamente 2 gm, o a lo sumo aproximadamente 1 gm) y/o al menos aproximadamente 0.1 gm (por ejemplo, al menos aproximadamente 0.2 gm, al menos aproximadamente 0.3 gm, al menos aproximadamente 0.4 gm, al menos aproximadamente 0.5 gm, al menos aproximadamente 0.6 gm, al menos aproximadamente 0.7 gm, al menos aproximadamente 0.8 gm, al menos aproximadamente 0.9 gm, al menos aproximadamente 1 gm, al menos aproximadamente 2 gm, o al menos aproximadamente 3 gm). Por ejemplo, el filtro puede tener un tamaño de poro promedio de aproximadamente 0.1 gm a aproximadamente 100 gm (por ejemplo, de aproximadamente 0.1 gm a aproximadamente 40 gm, de aproximadamente 40 gm a aproximadamente 100 gm, de aproximadamente 3 gm a aproximadamente 6 gm, o de aproximadamente 0.1 gm a aproximadamente 0.3 gm).
En algunas realizaciones, la capa media puede filtrarse por una pluralidad de filtros conectados en serie entre sí, en los que el tamaño de poro promedio de los filtros disminuye secuencialmente. Por ejemplo, la capa media puede filtrarse por un sistema de filtración que contenga tres filtros conectados en serie, en los que el primer filtro puede tener un tamaño de poro promedio de aproximadamente 40 gm, el segundo filtro puede tener un tamaño de poro promedio de aproximadamente 3 gm a aproximadamente 6 gm, y el tercer filtro puede tener un tamaño de poro promedio de aproximadamente 0.1 gm a aproximadamente 0.3 gm. Un ejemplo de dicho sistema de filtración es un sistema que contiene filtros de profundidad secuencial comercialmente disponibles de Pall Corporation (por ejemplo, conteniendo filtros de profundidad T2600, K200P y Bio10). Opcionalmente, el sistema de filtración puede incluir además un cuarto filtro (por ejemplo, con un tamaño de poro promedio de aproximadamente 0.2 gm) posterior al tercer filtro. Un ejemplo de cuarto filtro es un filtro Sartobran P disponible de Sartorius Corporation.
En algunas realizaciones, los filtros usados para filtrar la capa media pueden tener un área del medio de filtración grande. Por ejemplo, los filtros pueden tener un área del medio de filtración de al menos aproximadamente 1 m2 (por ejemplo, al menos aproximadamente 2 m2, al menos aproximadamente 4 m2, al menos aproximadamente 6 m2, o al menos aproximadamente 8 m2). También se describe en la presente memoria que después de que se mezclen el tampón ácido y la clara de huevo para formar una clara de huevo mezclada, la clara de huevo mezclada puede filtrarse sin necesidad de permitir que sedimenten los precipitados en la clara de huevo mezclada. En tales realizaciones, la clara de huevo mezclada (incluidos los precipitados formados durante las etapas de adición/mezcla y la disolución de clara de huevo restante) puede filtrarse sin separación previa de los precipitados de la clara de huevo mezclada. Por ejemplo, tras la mezcla del tampón ácido y la clara de huevo, puede filtrarse la clara de huevo mezclada sin sedimentación usando uno o más filtros descritos en la presente memoria (por ejemplo, un sistema de filtración que contiene tres filtros conectados en serie con tamaños de poro disminuidos). Sin ánimo de apoyar ninguna teoría, se cree que, eliminando una etapa de sedimentación, con dicho método se puede reducir significativamente el tiempo y los costes de preparación de clara de huevo por procedimiento cromatográfico en masa y aislando proteínas de la clara de huevo.
En algunas realizaciones, una vez que se mezcla el tampón ácido y la clara de huevo para formar una clara de huevo mezclada, la clara de huevo mezclada puede centrifugarse para separar precipitados (por ejemplo, complejos ovomucina-lisozima) del sobrenadante. El sobrenadante así obtenido puede filtrarse después usando uno o más filtros descritos en la presente memoria.
En general, la disolución de clara de huevo filtrada puede usarse para aislar proteínas recombinantes usando cromatografía de columna, tal como cromatografía de intercambio iónico o cromatografía basada en interacción hidrófoba. Ejemplos de tales métodos cromatográficos se han descrito, por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de EE. UU. número 2009/0299037.
En algunas realizaciones, en esta descripción se caracterizan métodos para aislar una proteína recombinante de clara de huevo. Por ejemplo, tales métodos pueden incluir las etapas siguientes: (1) proporcionar una combinación de clara de huevo que contenga una proteína recombinante, teniendo la combinación un volumen de al menos aproximadamente 10 litros; (2) ajustar el pH de la clara de huevo a un valor de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5, en donde la conductividad de la clara de huevo con el pH ajustado es de aproximadamente 8 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm; (3) filtrar la clara de huevo para formar una disolución; y (4) aislar la proteína recombinante en la clara de huevo por cromatografía de columna. La etapa de ajuste puede realizarse añadiendo una pequeña cantidad de un tampón ácido (por ejemplo, de aproximadamente el 0.5 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso por kilogramo de clara de huevo) a la clara de huevo de la misma manera que se describió anteriormente. Las etapas de filtración y aislamiento pueden realizarse por los métodos descritos en la presente memoria o los métodos conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, con esta descripción se caracterizan métodos para filtrar clara de huevo acidificada (por ejemplo, clara de huevo acidificada mediante un tampón ácido descrito anteriormente). Por ejemplo, tales métodos pueden incluir las siguientes etapas: (1) hacer pasar un tampón de pretratamiento con una conductividad entre aproximadamente 8 mS/cm y aproximadamente 20 mS/cm a través de un filtro; y (2) hacer pasar la clara de huevo (por ejemplo, con un volumen de al menos aproximadamente 50 l) con un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5 a través del filtro para obtener una clara de huevo filtrada. La clara de huevo filtrada puede usarse después para aislar proteínas recombinantes usando cromatografía de columna. En algunas realizaciones, el filtro usado en tales métodos puede ser similar al de los descritos anteriormente o iguales a ellos. Por ejemplo, el filtro puede tener el mismo tamaño de poro promedio (por ejemplo, de aproximadamente 0.1 gm a aproximadamente 100 gm) o un área del medio de filtración como las descritas anteriormente (por ejemplo, al menos aproximadamente 8 m2).
En algunas realizaciones, el tampón de pretratamiento puede usarse para humedecer el filtro previamente a hacer pasar la clara de huevo (por ejemplo, clara de huevo acidificada). El tampón de pretratamiento puede incluir una o más sales (por ejemplo, sales alcalinas). Las sales ejemplares incluyen fosfato de sodio y cloruro de sodio. En algunas realizaciones, el tampón de pretratamiento puede incluir una asociación de fosfato de sodio y cloruro de sodio.
En general, el tampón de pretratamiento puede incluir un ácido. Los ácidos ejemplares incluyen ácido acético, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido fluorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido cítrico, ácido bórico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido oxálico, ácido úrico y ácido barbitúrico. En algunas realizaciones, puede usarse una asociación de dos o más ácidos (por ejemplo, tres o cuatro) en el tampón de pretratamiento.
En algunas realizaciones, el tampón de pretratamiento puede tener un pH sustancialmente igual al pH de la clara de huevo. Por ejemplo, el tampón de pretratamiento puede tener un pH de al menos aproximadamente 5 (por ejemplo, al menos aproximadamente 5.2, al menos aproximadamente 5.4, al menos aproximadamente 5.6, al menos aproximadamente 5.7, al menos aproximadamente 5.8 o al menos aproximadamente 5.9) y/o a lo sumo aproximadamente 6.5 (por ejemplo, a lo sumo aproximadamente 6.4, a lo sumo aproximadamente 6.3, a lo sumo aproximadamente 6.2 o a lo sumo aproximadamente 6.1). En algunas realizaciones, el tampón de pretratamiento puede tener un pH de aproximadamente 6. Sin ánimo de apoyar ninguna teoría, se cree que usando un tampón de pretratamiento con un pH sustancialmente igual al pH de la clara de huevo para tratar un filtro puede ajustarse el pH de la superficie del filtro para que sea similar al pH de la clara de huevo, minimizándose de ese modo la precipitación de la clara de huevo durante la filtración, lo que puede ocasionar el bloqueo en el filtro o la obstrucción del flujo de las muestras que ocasiona tensiones de cizallamiento en el filtro, acortándose seriamente de ese modo la vida útil del filtro.
Generalmente, el tampón de pretratamiento puede tener una conductividad compatible con la conductividad de la clara de huevo de manera que la clara de huevo acidificada y filtrada sea compatible con las características de la cromatografía de columna (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico) usada en los procedimientos de aislamiento/purificación posteriores. Por ejemplo, el tampón de pretratamiento puede tener una conductividad de al menos aproximadamente 8 mS/cm (por ejemplo, al menos aproximadamente 9 mS/cm, al menos aproximadamente 10 mS/cm, al menos aproximadamente 11 mS/cm, al menos aproximadamente 12 mS/cm, al menos aproximadamente 13 mS/cm, al menos aproximadamente 14 mS/cm, al menos aproximadamente 15 mS/cm, al menos aproximadamente 16 mS/cm, al menos aproximadamente 17 mS/cm, al menos aproximadamente 18 mS/cm) y/o a lo sumo aproximadamente 20 mS/cm (por ejemplo, a lo sumo aproximadamente 19 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 18 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 17 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 16 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 15 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 14 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 13 mS/cm, a lo sumo aproximadamente 12 mS/cm, o a lo sumo aproximadamente 11 mS/cm). Por ejemplo, el tampón de pretratamiento puede tener una conductividad entre aproximadamente 8 mS/cm y aproximadamente 20 mS/cm. Los presentes autores encontraron que usar un filtro sin que sea tratado con el tampón de pretratamiento anterior para filtrar una disolución de clara de huevo ocasionaría que se taponara el filtro rápidamente por los precipitados formados durante el procedimiento de filtración. Por otra parte, los presentes autores encontraron inesperadamente que usar un
tampón de pretratamiento con la conductividad anterior para tratar un filtro puede ajustar la conductividad de la superficie del filtro para que sea similar a la de la clara de huevo, minimizándose de ese modo la precipitación de la clara de huevo durante la filtración y aumentando significativamente el tiempo de vida del filtro.
En algunas realizaciones, la clara de huevo puede hacerse pasar por un filtro bajo una presión diferencial relativamente pequeña (por ejemplo, menor que aproximadamente 207 kPa (30 psi), menor que aproximadamente 172 kPa (25 psi), menor que aproximadamente 138 kPa (20 psi), menor que aproximadamente 103 kPa (15 psi), menor que aproximadamente 83 kPa (12 psi), menor que aproximadamente 69 kPa (10 psi), o menor que aproximadamente 34 kPa (5 psi). Sin ánimo de apoyar ninguna teoría, se cree que hacer pasar la clara de huevo por un filtro bajo una presión diferencial relativamente pequeña puede minimizar los daños y/o el bloqueo al filtro, reduciéndose de ese modo los costes del producto ya que el filtro puede ser muy caro.
Ejemplo 1: Método para preparar clara de huevo para procedimiento cromatográfico en masa con una etapa de sedimentación
Se descongelaron de cincuenta a cuatrocientos kilogramos de clara de huevo congelada almacenada a -20 °C en frascos Nalgene de 4 l a temperatura ambiente en baños de agua fijados a 21 °C ± 1 °C durante aproximadamente 5 a 7 horas. Cada hora se retiró una vez cada frasco del baño de agua, se inspeccionó visualmente para determinar el grado de descongelación, se invirtió repetidamente y se devolvió al baño de agua hasta que se completó la descongelación. Se retiraron los frascos descongelados de los baños de agua y se almacenaron a una temperatura de 2 °C a 8 °C. Después de que se descongeló el último frasco de clara de huevo, la clara de huevo en los frascos se combinó en un recipiente de mezcla superior abierto. Un tampón ácido que contenía acetato de sodio 5.7 M a pH 4.0 (aproximadamente el 1.3 % peso/peso con respecto al peso de la clara de huevo) se añadió a la combinación de clara de huevo descongelada a 1 kilogramo por minuto, asegurando que la duración de la adición del tampón ácido no excediera de 5 minutos para obtener un pH objetivo final de 6.0 ± 0.1 a una temperatura de 2 °C a 8 °C. La mezcla de clara de huevo se agitó de manera continua durante 1 hora en el recipiente de mezcla superior abierto sin control de temperatura y después se decantó en un mezclador de un solo uso cerrado, se refrigeró a una temperatura de 2 °C a 8 °C y se mezcló durante 6 horas. Después de que se detuviera la mezcla, se dejó que el precipitado sedimentara durante 6 horas. Si se requirió, el pH se ajustó además a 6.0 ± 0.1 a una temperatura de 2 °C a 8 °C usando acetato de sodio 5.7 M o hidróxido de sodio 1 N, seguido por mezcla adicional durante 1 hora y sedimentación durante 3 horas a temperatura ambiente (mezcla total y tiempo de sedimentación no excediendo de 24 horas). Después de que se completara la sedimentación, la clara de huevo mezclada formó tres capas, es decir, capas superior, media e inferior. Después se puso un tubo en la capa media y la capa media se extrajo con sifón o se bombeó por el tubo sin alterar las capas superior e inferior. Los filtros (filtros de profundidad secuencial Pall Corporation, 40 micrómetros, de 3 a 6 micrómetros, de 0.1 a 0.3 micrómetros, respectivamente) se preenjuagaron con 80 litros de agua purificada por metro cuadrado de área del filtro para retirar el carbón orgánico total, las sustancias lixiviables y las sustancias extraíbles y después se drenó. Después se trataron los filtros preenjuagados con un volumen de retención del filtro de una disolución tampón de pretratamiento que contenía fosfato de sodio 20 mM y cloruro de sodio 140 mM a pH 6.0 y después se drenó. Se decantó la disolución de clara de huevo, evitándose los materiales en forma de partículas de clara de huevo precipitados y agregados sedimentados y se filtró por una filtración en línea a un caudal de 1 litro por metro cuadrado por tipo de filtro o una presión diferencial menor que 207 kPa (30 psid) para retirar todo material precipitado no sedimentado y se recogió en un mezclador de un solo uso estéril. A la terminación de la filtración de la clara de huevo, la clara de huevo retenida en el sistema de filtración se descargó con un volumen de retención del tren de filtrado de la disolución tampón de pretratamiento que contenía fosfato de sodio 20 mM y cloruro de sodio 140 mM a pH 6.0 para recuperar el producto y recogerlo en un mezclador de un solo uso estéril. La disolución de clara de huevo filtrada se muestreó para la medición de la actividad enzimática y la absorbancia ultravioleta (UV) y se almacenó a una temperatura de 2 °C a 8 °C durante hasta 24 horas antes de que se usara para aislamiento de proteínas recombinantes en la clara de huevo por cromatografía de columna. En la tabla 1 se muestran los resultados de acidificación de clara de huevo usando el tampón ácido descrito anteriormente (es decir, NaOAc 5.7 M, pH 4.0 y 1.3 % p/p).
Tabla 1
Ejemplo de referencia 2: Método para preparar clara de huevo para procedimiento cromatográfico en masa sin etapa de sedimentación
Se descongelaron cuatrocientos kilogramos de clara de huevo congelada (±10 %) de clara de huevo congelada (-20 °C) a una temperatura de 2 °C a 8 °C (en una cámara frigorífica) en aproximadamente 24 a 72 horas. Se combinó la clara de huevo descongelada en un recipiente de mezcla cerrado de un solo uso con camisa y se mantuvo a una temperatura de 2 °C a 8 °C. Se añadió un tapón ácido que contenía acetato de sodio 5.7 M a pH 4.0 (1.08 % peso/peso) a la clara de huevo descongelada a 1 kilogramo por minuto, asegurando que la duración de la adición del tampón ácido no excediera de 5 minutos, para obtener un pH objetivo final de 6.0 ± 0.5. Se agitó de manera continua la disolución de clara de huevo acidificada durante 3 horas a una temperatura de 2 °C a 8 °C. La clara de huevo acidificada se calentó después a 21 °C ± 3 °C mediante un tanque con camisa antes de la filtración. Los filtros (filtros de profundidad secuencial Pall Corporation, 40 micrómetros, de 3 a 6 micrómetros, de 0.1 a 0.3 micrómetros, respectivamente) se preenjuagaron con 80 litros de agua purificada por metro cuadrado de área del filtro para retirar el carbón orgánico total, las sustancias lixiviables y las sustancias extraíbles. Se sustituyó el agua purificada en el tren de filtrado con una disolución tampón de pretratamiento que contenía fosfato de sodio 20 mM y cloruro de sodio 140 mM a pH 6.0 hasta que la conductividad del efluente del filtro estuvo en el intervalo de conductividad aceptable del tampón de pretratamiento (por ejemplo, de 10 mS/cm a 15 mS/cm). Se filtró la clara de huevo acidificada y mezclada homogéneamente por filtración en línea a un caudal de 1 litro por minuto por metro cuadrado por tipo de filtro o dando como resultado una presión diferencial <69 kPa (<10 psi) para retirar el material precipitado o agregado. El volumen de efluente de filtro inicial igual al 80 % del volumen de retención del tren de filtrado se usó para sustituir el tampón de pretratamiento y se desechó antes de la recogida del producto. El tampón de pretratamiento filtrado restante y la clara de huevo se recogieron en un mezclador de un solo uso estéril. A la terminación de la filtración de la clara de huevo, la clara de huevo retenida en el sistema de filtración se descargó con 1.5 volúmenes de retención del tren de filtrado (0.5 volúmenes de retención se recogen si bien queda 1 volumen de retención en el tren de filtración) de la disolución tampón de pretratamiento que contenía fosfato de sodio 20 mM y cloruro de sodio 140 mM a pH 6.0 para recuperar el producto y recogerlo en un tanque de mezcla de un solo uso estéril. Se muestreó la clara de huevo filtrada para medir la actividad enzimática y la absorbancia y se almacenó a una temperatura de 2 °C a 8 °C durante hasta 24 horas antes de que se usara para aislamiento de proteínas recombinantes en la clara de huevo por cromatografía de columna.
Ejemplo 3: Reducción del procedimiento de elaboración de clara de huevo para evaluar la carga directa en realización de filtración profunda y robustez de la acidificación de clara de huevo
Materiales
Todos las sustancias químicas usadas para los estudios de clarificación fueron de grado USP/MC. Los materiales fuente de clara de huevo se enumeran en la tabla 2. Todo el material fuente se almacenó a -20 °C y se descongeló a una temperatura de 2 °C a 8 °C 48 a 72 horas antes de su uso. Se combinó el material fuente y se mantuvo a una temperatura de 2 °C a 8 °C mediante la etapa de acidificación.
Tabla 2. Materiales fuente de clara de huevo
Para todas las preparaciones de tampón, se llevaron a cabo mediciones de conductividad utilizando medidores de pH/conductividad con temperatura compensada a 25 °C. Se midió el pH de tampones a 20 °C. Las formulaciones de la preparación de tampón en proceso se enumeran en la tabla 3 a continuación.
Tabla 3. Formulación de tampón
Equipo del procedimiento
Se inspeccionaron (mantenimiento preventivo) paletas de procesamiento (AKTA Explorers) por GE healthcare. El equipo de procesamiento (chasis Pall Stax y AKTA Explorers) lo mantuvo personal de Synageva PD durante todo el estudio de caracterización. En la tabla 4 a continuación se enumera todo el equipo de hardware usado en este ejemplo.
Tabla 4. Lista de equipo
Se fijaron chasis Pall STAX (PN# SXLSC02W) usando los filtros de profundidad STAX enumerados en la tabla 5 en la siguiente configuración (40 gm, 3 gm-6 gm, y 0.1 gm-0.3 gm) y un filtro adicional Sartobran P de 0.2 gm.
Chasis #1: Colector (inferior) ^ T2600 ^ Placa de ventilación (superior)
Chasis #2: Colector (inferior) ^ K200P ^ Placa de ventilación ^ Colector ^ Bio 10 ^ Placa de ventilación (superior) Se intercaló cada filtro en medio de un colector de entrada/salida de 3.8 cm (1.5") (P/N: 7008225) y una placa de ventilación superior. El volumen de retención de cada filtro individual se determinó empíricamente durante la descarga inicial de agua.
Tabla 5. Equipo de filtración profunda
Se usaron columnas XK 16/20 (GE Healthcare) para todo el empaquetamiento de columna de cromatografía de interacción hidrofóbica de fenilo (PHIC, por sus siglas en inglés). Toda la cromatografía se realizó en un AKTA Explorer equipado con software Unicorn versión 5.31 (GE Healthcare).
Procedimientos
Antes de empezar la etapa de clarificación, se descongelaron alícuotas de clara de huevo congelada (en total 20 l) para una temperatura de 2°C a 8 °C durante 48-72 horas. Se combinó la clara de huevo descongelada en un tanque de polipropileno de tamaño adecuado (25 l) con revestimiento del medio estéril (Thermo Scientific / Hyclone P/N 343050-0005). Se mezcló la clara de huevo combinada a homogeneidad usando un mezclador de cabeza [35 rad/s (330 rpm)] a una temperatura de 2°C a 8 °C. Después se acondicionó la clara de huevo combinada al pH objetivo por adición de acetato de sodio 5.7 M a pH 4.0. En la tabla 6 se enumera el volumen del acetato de sodio 5.7 M añadido para cada ejecución de clarificación para lograr el pH objetivo. Se controló el pH durante más de 2 horas para asegurar que se lograba el pH objetivo.
Tabla 6. Acidificación de clara de huevo combinada
Antes de la filtración, se descargaron los filtros de manera individual con 80 l/m2 con agua filtrada RO/DI (osmosis inversa/desionización, por sus siglas en inglés). Durante la descarga de agua, el volumen de retención para cada filtrado se determinó de manera empírica. A la terminación de la descarga del agua, los filtros se instalaron en un tren continuo y se descargó con 16 l/m2 de tampón equilibrante de PHIC (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6.0). La descarga de tampón terminó cuando el pH y la conductividad del efluente satisfacieron las especificaciones del tampón de descarga (por ejemplo, pH 6.0 ± 0.1, conductividad 16.0 ± 2.0). Se cargó la clara de huevo combinada en el tren de filtrado usando un tubo de inmersión de 0.95 cm (3/8") (tubería I/P 73 Cole) a 1.0 l/min con mezcla continua (mezclador de cabeza, 32 rad/s (300 rpm). Se recogió el 80 % del volumen de retención acumulativo medido (~13.2 l) y se destinó a desecho. El líquido filtrado se recogió después en un contenedor de tamaño apropiado separado hasta que el precipitado de baja densidad coagulado entró en el tubo de inmersión. Después se descargó el tren de filtrado con 1.5 volúmenes de retención (~25 l) con un tampón de equilibrio tamponante. Se mezcló el líquido filtrado final usando una paleta de tanque limpia para asegurar la homogeneidad antes del muestreo. Se almacenó el líquido filtrado a una temperatura de 2°C a 8 °C durante la noche antes de separación mediante PHIC.
Antes de la separación mediante PHIC, se calentó el líquido filtrado almacenado a una temperatura de 2°C a 8 °C usando un baño de agua a temperatura ambiente. Se realizó filtración secundaria al líquido filtrado por un cartucho Sartobran 150 (0.45 um/0.22 um, P/N 5231307H4-00) para generar la carga PHIC final. En la tabla 7 se enumeran los tampones y parámetros usados en proceso.
Tabla 7. Etapas de operación unitaria de cromatografía PHIC
* CIP (limpieza en el sitio, por sus siglas en inglés)
Resultados y discusión
(1) Carga directa de clara de huevo acidificada (es decir, sin etapa de sedimentación)
Inicialmente, se llevó a cabo una única ejecución de punto central («ejecución 1»; escala 1 : 20; 20 l de clara de huevo acidificada a un pH de aproximadamente 6) para evaluar el impacto de carga directa (sin sedimentación, razón de carga de 20 l/m2) en realización de filtración profunda para establecer un modelo a escala experimental representativo. Para cada filtro (es decir, T2600, K200P, Bio10), aunque la presión de alimentación de entrada en el filtro aumentó linealmente durante la carga de clara de huevo acidificada, la presión diferencial no excedió de 69 kPa (10 psid). Además, la presión de la alimentación no aumentó más durante la descarga de tampón y presentó una disminución drástica en el filtro T2600. Estos resultados sugieren que la carga directa de la clara de huevo acidificada a los filtros no bloqueó significativamente los filtros durante esta ejecución.
Los resultados de recuperación de proteína se resumen en la tabla 8 a continuación. Como se muestra en la tabla 8, la recuperación de proteína después de la etapa de clarificación satisfizo la expectativa objetivo (>70 %).
Tabla 8. Recuperación de proteína después de clarificación
La realización en columna PHIC de la ejecución 1 proporcionó resultados comparables a los obtenidos a partir de ejecuciones que incluían una etapa de sedimentación de la clara de huevo acidificada. Además, se midió la pureza de proteína mediante análisis SDS-PAGE usando gel de Tris-glicina al 4 %-20 %. Las fracciones de eluyente de PHIC de la ejecución 1 no revelaron diferencias en el patrón de bandas cuando se compara con ejecuciones que incluyen una etapa de sedimentación. Estos datos sugieren que la carga directa de la clara de huevo acidificada durante la clarificación (es decir, filtración) no afectaba a la recuperación de proteína o la realización de la PHIC en términos de rendimiento y pureza.
Los resultados anteriores sugieren que la clara de huevo acidificada puede cargarse directamente a los filtros durante la etapa de clarificación sin etapa de sedimentación. Este método se aplicó después a las ejecuciones del estudio de la robustez (es decir, ejecuciones 1 y 2) descritas en la siguiente sección.
(2) Robustez de la acidificación de la clara de huevo
Se usó un diseño experimental de nivel 2, factor 2 (alto/bajo, bajo/alto) para evaluar la robustez de la etapa de acidificación de la clara de huevo. Las condiciones experimentales se definen en la tabla 6. En la ejecución 2, se llevó
a cabo acidificación durante 24 horas para lograr un pH final de 5.67 (es decir, aproximadamente 5.7). En la ejecución 3, se llevó a cabo acidificación durante 6 horas para lograr un pH final de 6.25 (es decir, aproximadamente 6.3). Los resultados demuestran que las dos ejecuciones presentaron aumentos de presión de la alimentación lineal comparables y presiones de la alimentación máximas debido a ensuciamiento aumentado de T2600. Se observó una menor presión de la alimentación máxima en la ejecución 2, que se cree que es debido a una correlación entre el pH de la clara de huevo y la viscosidad de la clara de huevo (es decir, pH de clara de huevo menor dando como resultado menor viscosidad de la clara de huevo). En ningún caso la presión de la alimentación excedió de 69 kPa (10 psig), que demuestra una realización comparable a la de la ejecución 1.
Después de la etapa de clarificación, las recuperaciones de proteína en las ejecuciones 2 y 3, respectivamente, fueron del 71 % y 83 %, que satisfacía las expectativas objetivo (es decir, >70 % ) y fueron comparables a la de la ejecución 1 (es decir, el 79 %). Después de separación mediante PHIC, los rendimientos de proteína en las ejecuciones 2 y 3, respectivamente, fueron del 59 % y 68 %, resultados que fueron comparables a los obtenidos a partir de las ejecuciones que incluían una etapa de sedimentación. Las superposiciones del cromatograma comparando las ejecuciones 2 y 3 a ambas ejecuciones 1 confirmaron una realización de la columna comparable.
Los resultados anteriores sugieren que la variación de pH y tiempo de acidificación no dio como resultado un impacto negativo significativo respecto a la actividad enzimática o el rendimiento. Así, la etapa de clarificación fue robusta cuando se llevó a cabo en dos intervalos ensayados (es decir, pH 5.7-6.3 de acidificación y tiempo de acidificación de 6-24 horas).
(3) Estabilidad en proceso de la clara de huevo
Se llevaron a cabo estudios de retención del procedimiento para definir los tiempos de retención máximos para los tres puntos de retención de operación unitaria siguientes: (1) clara de huevo descongelada (2 °C-8 °C), (2) clara de huevo acidificada (2 °C-8 °C y temperatura normal), y (3) clara de huevo clarificada (2 °C-8 °C y temperatura normal). Se evaluó la estabilidad del producto (en términos de actividad enzimática) durante un periodo de tiempo de 72 a 96 horas. Se llevaron a cabo dos estudios de estabilidad separados para evaluar el impacto sobre la varianza del parámetro de clarificación sobre los tiempos de retención del producto en las etapas de clara de huevo acidificada y clarificada. Se tomaron alícuotas de 60 ml (dos para cada uno de la clara de huevo acidificada y clarificada) de cada uno de los dos experimentos de robustez anteriores (es decir, ejecuciones 2 y 3) y se almacenaron a una temperatura de 2 °C a 8 °C o a temperatura normal. Se tomaron muestras de 1.5 ml cada 24 horas hasta 72 horas (pH 5.7 / 24 horas) o 96 horas (pH 6.3 / 6 horas). Debido a restricciones de tiempo, no se llevó a cabo un estudio de estabilidad en la ejecución 1 (punto central). Los parámetros del diseño de la estabilidad se resumen en la tabla 9 a continuación.
Tabla 9. Diseño de la estabilidad en proceso
Los resultados demuestran que la actividad enzimática para los tres puntos de retención en proceso (clara de huevo descongelada, acidificada y clarificada) fue estable durante la totalidad del estudio de transcurso del tiempo (hasta 96 horas) a una temperatura de 2 °C a 8 °C. Además, la variación del pH de acidificación o el tiempo de acidificación en general no afectó negativamente a la actividad enzimática. Una sola serie de parámetros de ensayo (pH 5.7,
temperatura ambiente) para el punto de retención de clara de huevo acidificada presentó una disminución de ~20 % en actividad enzimática.
Sin embargo, el objetivo de almacenamiento del procedimiento comercial actual para la clara de huevo acidificada es de 2 °C a 8 °C y, por lo tanto, esta observación no es un riesgo para el procedimiento comercial. Basándose en los datos, la clara de huevo descongelada/combinada fue estable durante hasta 168 horas (incluyendo el tiempo de descongelación inicial de 72 horas) a una temperatura de 2 °C a 8 °C, la clara de huevo acidificada fue estable hasta 96 horas a una temperatura de 2 °C a 8 °C y la fase de la clara de huevo clarificada fue estable hasta 96 horas a una temperatura de 2 °C a 8 °C o temperatura ambiente.
(4) Estudio de eliminación de ADN suplementario
Aunque la propia clara de huevo no contiene ADN, el procedimiento de recogida de la clara de huevo puede dar como resultado la presencia de ADN genómico huésped por la introducción de cantidades minoritarias de yema de huevo en la combinación de clara de huevo. La clara de huevo acidificada y clarificada procedente de los estudios de las ejecuciones 1-3 anteriores se analizó en cuanto al ADN genómico huésped. Los análisis revelaron lo siguiente: 1. Se detectó ADN en la clara de huevo combinada y acidificada
2. Se identificó eliminación de ADN significativa durante la etapa de clarificación
Estos datos sugieren que además de la eliminación de proteína huésped de la clara de huevo, la etapa de clarificación proporciona un medio para retirar ADN genómico huésped de la combinación de producto.
Otras realizaciones están dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.
Claims (12)
1. Un método para preparar clara de huevo para procedimiento cromatográfico en masa, comprendiendo el método las siguientes etapas:
añadir un tampón ácido que comprenda un agente ácido a una combinación de clara de huevo, siendo el contenido de tampón ácido desde aproximadamente el 0.5 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso por kilogramo de clara de huevo,
mezclar el tampón ácido y la clara de huevo para formar clara de huevo mezclada con un pH desde aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5 y
permitir que la clara de huevo mezclada se sedimente de manera que la clara de huevo se separe en capas superior, media e inferior.
2. El método según la reivindicación 1, en donde el agente ácido se selecciona del grupo que consiste en ácido acético, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido fluorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido cítrico, ácido bórico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido bórico, ácido oxálico, ácido úrico y ácido barbitúrico.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde el tampón ácido comprende además acetato de sodio en una concentración de aproximadamente 5 M a aproximadamente 6 M.
4. El método según las reivindicaciones 1-3, en donde el tampón ácido representa de aproximadamente el 0.5 % en peso a aproximadamente el 2 % en peso por kilogramo de clara de huevo.
5. El método según las reivindicaciones 1-4, en donde el pH de la clara de huevo mezclada es de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.3.
6. El método según las reivindicaciones 1-5, en donde el pH de la clara de huevo mezclada tiene un valor de manera que la clara de huevo mezclada se haga menos viscosa.
7. El método según las reivindicaciones 1 -6, en donde la combinación de clara de huevo tiene un volumen de al menos aproximadamente 10 litros.
8. El método según las reivindicaciones 1-7, en donde el tampón ácido se añade a la combinación de clara de huevo en un solo bolo intravenoso.
9. El método según las reivindicaciones 1-8, en donde la adición del tampón ácido y la mezcla de la clara de huevo se realizan simultáneamente.
10. El método según las reivindicaciones 1-9, que comprende además una etapa de aislamiento de la capa media y una etapa de filtrado de la capa media después de la etapa de aislamiento.
11. El método según las reivindicaciones 1-10, que comprende además una etapa de centrifugación después de la etapa de mezcla, en donde la clara de huevo mezclada se centrifuga para separar precipitados que comprenden complejos ovomucina-lisozima de sobrenadante.
12. El método según las reivindicaciones 1-11, en donde la clara de huevo comprende una proteína terapéutica recombinante exógena a clara de huevo.
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