BRPI0515649B1 - Processo para preparação de composições de anticorpo monoclonal altamente concentradas - Google Patents
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Abstract
processo para preparação de composições de proteínas altamente concentradas. a presente invenção fornece um processo para concentrar proteínas incluindo ultrafiltração, diafiltração e uma segunda seqüência ultrafiltração, em temperaturas elevadas, tais como aproximadamente acima de 30°c. a presente invenção inclui também um processo para preparar composições altamente concentradas de anticorpo e produtos de anticorpo altamente concentrados.
Description
[001] A presente invenção fornece um processo para concentrar proteínas incluindo ultrafiltração, diafiltração e uma segunda sequência ultrafiltração, em temperaturas elevadas, tais como aproximadamente acima de 30°C.
[002] Métodos para isolar, purificar e concentrar materiais biológicos são conhecidos e incluem, por exemplo, a cromatografia, a ultracentrifugação e a liofilização, vide geralmente, R. Hatti-Kaul et al., "Downstream Processing in Biotechnology," em Basic Biotechnology, Cap. 9, páginas 187-211, 2° ed., Cambridge University Press (2001). Os processos para fazer preparações concentradas de anticorpo monoclonal para a administração a seres humanos são conhecidos, vide, por exemplo, Patente US 6.252.055, que utiliza a ultra filtração e que recircula o filtrado resultante.
[003] Alguns desafios associado com os métodos de concentração de anticorpo disponíveis incluem, por exemplo, baixos fluxos, longo tempo do processo, áreas grandes da membrana, recuperação mecânica com perdas no rendimento, intervenção ou manipulação intensiva do operador e taxas baixas de transferência da massa, energia ineficiente e limites da pressão hidráulica no equipamento de concentração. Estes e outros desafios podem contribuir a um custo total elevado da manufatura e finalmente a um alto custo aos consumidores do fármaco terapêutico.
[004] Há uma necessidade de melhorar os processos para a preparação de formulações altamente concentradas de proteína, tais como preparações líquidas de anticorpo e produtos terapêuticos deste.
[005] Em termos gerais, a presente invenção relaciona-se de modo geral aos processos para concentrar proteínas, tais como processos para concentrar uma preparação de anticorpo, formulação farmacêuticas que contêm tal preparação e o uso deste na terapia humana ou animal.
[006] Nas incorporações a presente invenção fornece processos para preparação de proteínas altamente concentradas, tais como preparações de anticorpo; e produtos terapêuticos preparados pelo processo, tal como produtos de anticorpos terapêuticos. Sendo assim, a presente invenção fornece um processo para concentração de proteínas, constando de: uma primeira ultrafiltração de uma primeira preparação de anticorpo para fornecer uma segunda preparação de anticorpo; uma diafiltração da segunda preparação de anticorpo para fornecer uma preparação de anticorpo intermediário diafiltrado; e uma segunda ultrafiltração do diafiltrado da preparação intermediária de anticorpo para fornecer uma terceira preparação de anticorpo, em que uma ou mais das ultrafiltrações e a diafiltração são realizadas em temperaturas elevadas, por exemplo, cerca de 30 a 50°C aproximadamente.
[007] A presente invenção fornece também, nas incorporações, um processo para concentração de proteínas compreendendo de: uma primeira ultrafiltração de uma primeira mistura da proteína para fornecer uma segunda mistura da proteína; uma diafiltração da segunda mistura de proteína para fornecer uma mistura diafiltrada da proteína; e uma segunda ultrafiltração da mistura diafiltrada da proteína para fornecer uma terceira mistura da proteína, de modo que, uma ou mais das ultrafiltrações ou da diafiltração são realizadas, por exemplo, acima de 45°C.
[008] A presente invenção fornece também, nas incorporações, uma composição altamente concentrada de anticorpo preparada pelos processos acima.
[009] FIG. 1 ilustra um instrumento para realizar o processo preparativo, nas incorporações da presente invenção.
[0010] FIGs. 2 a 17 ilustram vários valores de processo mensurados ou observados de várias fases ou modos de processo, nas incorporações da presente invenção.
[0011] FIGS. 18 e 19 ilustram o efeito da temperatura elevada na qualidade do produto, nas incorporações da presente invenção.
[0012] FIGS. 20 e 21 ilustram o efeito da temperatura elevada sobre o controle de biocarga, nas incorporações da presente invenção.
[0013] FIG. 22 ilustra o efeito da temperatura elevada no processo de fluxo e no processo de tempo, nas incorporações da presente invenção.
[0014] FIGS. 23 a 25 ilustram vários valores de processo mensurados ou observados de várias fases ou do processo de aumento de escala, nas incorporações da presente invenção.
[0015] As várias incorporações da presente invenção serão descritas em detalhes com referência aos desenhos, se existirem. A referência às várias incorporações não limita o escopo da invenção, que é limitada apenas pelo escopo das reivindicações anexadas ao presente pedido. Adicionalmente, qualquer exemplo determinado nesta especificação não tem a intenção de ser limitante e meramente determina algumas de muitas incorporações possíveis para a invenção reivindicada.
[0016] Os seguintes são usados, a menos que descrito de outra maneira: “Ultrafiltrar”, “ultrafiltração”, “ultrafiltrado”, “UF” e termo similar refere-se a, por exemplo, discriminar moléculas entre a mistura, primeiramente com base no tamanho e na forma molecular, e realizar a separação de moléculas diferentes ou realizar a concentração de moléculas semelhantes utilizando membranas sintéticas semipermeáveis, com propriedades físicas e químicas apropriadas; “Diafiltrar”, “diafiltração”, “diafiltrado”, “diafiltrando”, “DF” e termo similares referem-se a, por exemplo, remover, substituir ou diminuir a concentração de sais ou de solventes das soluções ou misturas que contêm proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos ou outras biomoléculas utilizando-se uma membrana de ultrafiltração; “Pressão Transmembrana” ou “TMP” referem-se à pressão média aplicada da alimentação ao lado do filtrado da membrana calculada como TMP [bar] = [(PF + PR )/2] - Pf onde o PF é a pressão de alimentação, o PR é a retropressão e Pf é a pressão do filtrado; “Filtração de fluxo tangencial”, “filtração de fluxo cruzado”, “TFF” e termos similares referem-se a uma modalidade de filtração em que a solução contendo o soluto passa tangencialmente através da membrana de UF e sais ou solutos de baixo peso molecular passam completamente com a aplicação de pressão.
[0017] O termo “anticorpo” é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmento de anticorpos contanto que eles exibam atividade biológica desejada. Um anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imune que é capaz de reconhecer e se ligar a um antígeno específico. Descrito nos termos de sua estrutura, um anticorpo é uma proteína em forma de Y que consiste de quatro cadeias de aminoácido, duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Em um modelo suficientemente simplificado para esta apelação, cada anticorpo tem primeiramente duas regiões: uma região variável e uma região constante. A região variável, situada nas extremidades dos braços do Y, liga-se e interage com o antígeno alvo. Esta região variável inclui uma região determinante de complementaridade (CDR) que reconhece e liga o anticorpo a um sítio de ligação específico em um antígeno particular. A região constante, situada na cauda do Y, é reconhecida pelo sistema imune e interage com este (Janeway, C, Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Um antígeno do alvo tem geralmente numerosos sítios de ligação, chamados também os epítopos, reconhecidos por CDRs em anticorpos múltiplos. Cada anticorpo que se liga especificamente a um epítopo diferente tem uma estrutura diferente. Assim, um antígeno pode ter mais de um anticorpo correspondente.
[0018] A unidade básica do anticorpo de 4 cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e de duas cadeias pesadas (H) idênticas (um anticorpo IgM consiste de 5 da unidades básicas heterotetramérica junto com um polipeptídeo adicional denominado cadeia J, e contém consequentemente 10 sítios de ligação de antígeno, enquanto os anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar polivalentes reunidos que contém de 2 a 5 unidades básicas de 4 cadeias junto com a cadeia J). No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeia tem geralmente cerca de 150.000 Daltons. Cada cadeia L está ligada a uma cadeia H por uma ligação covalente de bissulfeto, enquanto as duas cadeias H são ligadas por um ou mais ligações de bissulfeto dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia leve e pesada também contém pontes dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia H contém, no N-terminal, um domínio variável (VH) seguido por uma série de domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e β e quatro domínios constantes (CH)para os isotipos μ e ε. Cada cadeia L contém, no N- terminal, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) em sua outra extremidade. O VL é alinhado com o VH e o CL alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Acredita-se que resíduos de aminoácido particulares formam uma relação entre a cadeia leve e os domínios variáveis da cadeia pesada. O emparelhamento de uma VH e VL juntas formam um único sítio de ligação ao antígeno. Para a estrutura e as propriedades das diferentes classes de anticorpo, vide, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8°edição, D. Stites, A. Terr e T. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 Capítulo 6.
[0019] A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuído a um dos dois tipos claramente distintos, denominados kappa e lambda, baseados nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a classes ou isotipos diferentes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM tendo a cadeia pesada denominados α, δ, ε, y e μ, respectivamente. As classes α e y são adicionalmente divididas em subclasses na base de diferenças relativamente menores na sequência do CH e na função, por exemplo, seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, e IgA2.
[0020] O termo “variável” refere-se ao fato de certos segmentos dos domínios variáveis apresentarem sequências extensamente diferentes entre os anticorpos. O domínio V media a ligação de antígenos e define a especificidade de um anticorpo específico para o seu antígeno específico. Entretanto, a variabilidade não é distribuída regularmente ao longo da série de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Ao contrário, as regiões V consistem de segmentos relativamente invariáveis denominados regiões de estrutura (FRs) de 15 a 30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade denominadas “regiões hipervariáveis” que apresentam de 9 a 12 aminoácidos de comprimento. Os domínios variáveis de cadeias leve e pesada nativas compreendem 4 FRs cada, adotando em grande parte configuração de folha β, conectadas por 3 regiões hipervariáveis, que formam alças (loops) que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha b. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem com a formação do sítio de ligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Estados Unidos. (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo ao antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
[0021] A expressão “região hipervariável”, quando utilizada no presente pedido, designa os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígenos. A região hipervariável compreende geralmente resíduos de aminoácidos de uma “região determinante de complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, por volta dos resíduos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no VL, e por volta de cerca de 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no VH) (Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Estados Unidos. (1991)) e/ou os resíduos de uma “alça (loop) hipervariável” (por exemplo, resíduos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no VL, e 26 a 32 (H1), 52A a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no VH (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))).
[0022] O termo “anticorpo monoclonal” da forma utilizada no presente pedido refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou ligam-se ao(s) mesmo(s) epítopo(s), exceto por possíveis variações que podem ocorrer durante a produção do anticorpo monoclonal, que podem estar presentes em menores quantidades. Tal anticorpo monoclonal inclui tipicamente um anticorpo que consta de uma sequência de polipeptídeo que se liga a um alvo, onde a sequência do polipeptídeo de ligação ao alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma sequência do polipeptídeo de ligação de único alvo de uma variedade de sequências de polipeptídeos. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um único clone de uma variedade de clones como, por exemplo, um pool de clones de hibridoma, clone por fago ou clone por DNA recombinante. Deve-se compreender que a sequência de ligação ao alvo selecionada pode adicionalmente ser alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade ao alvo, para humanizar a sequência de ligação ao alvo, para melhorar sua produção na cultura de células, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecíficos, etc.; e que um anticorpo que consta da sequência de ligação ao alvo alterada é também um anticorpo monoclonal na presente invenção. Em contraste, às preparações de anticorpo policlonal que incluem tipicamente os anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante em um antígeno. Além de sua especificidade, as preparações de anticorpo monoclonal são vantajosas pelo fato de que tipicamente não são contaminadas por outras imunoglobulinas. O adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo de ser obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser considerado como exigindo a produção do anticorpo através de qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma {Por exemplo, Kohler et al, Nature, 256:495 (1975); Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2aEd. 1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (Vide, por exemplo, Patente US 4.816.567), tecnologia de bibliotecas de fagos (vide, por exemplo, Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al, J. Mol Biol, 222:581-597 (1991); Sidhu et al, J. Mol. Biol 338(2):299-310 (2004); Lee et al, J.Mol.Biol.340(5):l073-l093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); e Lee et al, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), e tecnologias para produção de anticorpos humanos ou parecidos com estes nos animais que têm partes ou todo o loci ou genes que codificam sequências da imunoglobulina humana (vide, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits, et al, Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits, et al, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann, et al, Yearinlmmuno., 7:33 (1993); patente US 5.545.806; patente US 5.569.825; patente US 5.591.669 (todas da GenPharm); patente US 5.545.807; WO 1997/17852; patente US 5.545.807; patente US 5.545.806; patente US 5.569.825; patente US 5.625.26; patente US 5.633.425; e patente US 5.661.016; Marks, et al, Bio/Technoloev, 10: 779-783 (1992); Lonberg, etal, Nature. 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812813 (1994); Fishwild, et al, Nature Biotechnology. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology. 1_4: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol.. 13: 65-93 (1995).
[0023] Anticorpos “quiméricos” (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica a ou homologa as sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie especifica, ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da cadeia é idêntico a, ou homólogo, sequências correspondentes nos anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, de forma a exibira atividade biológica desejada (Patente US 4.816.567; e Morrison, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Anticorpo humanizado como usado no presente pedido é um subconjunto de anticorpos quiméricos.
[0024] As formas “humanizadas” de anticorpos não-humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região hipervariável do paciente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças (loops) hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não- humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma sequência de imunoglobulina humana embora as regiões FR possam incluir uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação. O número destas substituições de aminoácidos na região FR tipicamente não é mais do que 6 na cadeia H, e não mais do que 3 na cadeia L. O anticorpo humanizado opcionalmente também constará de pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, vide: Jones, et al, Nature 321:522-525 (1986); Reichmann, et al, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
[0025] “Fragmentos de anticorpos” compreendem uma porção de anticorpo intacto, preferencialmente o ligante do antígeno ou a região variável de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (vide Patente US 5.641.870, Exemplo 2; Zapata, et al, Protein Ens. 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticorpos de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[0026] A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos “Fab”, cada qual com um único sítio de ligação de antígenos, e um fragmento “Fc” residual, cujo nome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. O fragmento de Fab consiste em uma cadeia L inteira junto com a região do domínio variável da cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Cada fragmento de Fab é monovalente com respeito à ligação do antígeno, isto é, tem um único sítio de ligação ao antígeno. O tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab’)2 que corresponde aproximadamente a dois fragmentos de Fab ligados por pontes de dissulfeto de que têm a atividade de ligação ao antígeno divalente e ainda é capaz de reticular antígeno. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos de Fab tendo adicionalmente poucos resíduos na região carboxi- terminal do domínio do CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. O Fab'- SH é a designação no presente pedido para Fab’ no qual o(s) resíduo(s) de cisteína(s) dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpos F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' o qual tem cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos.
[0027] O fragmento Fc compreende das parcelas do carboxi- terminal de ambas as cadeias H unidas por pontes dissulfetos. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas por sequências na região de Fc, que é também reconhecida em parte pelos receptores de Fc (FcR) encontrados em determinados tipos celulares.
[0028] “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio completo de reconhecimento e ligação de antígenos. Dito fragmento consiste de um dímero de um domínio de região variável de cadeia leve e de cadeia pesada em associação forte e não-covalente. Da dobra desses 2 domínios emanam 6 alças (loops) hipervariáveis (3 alças (loops) da cadeia H e 3 alças (loops) da cadeia L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação de antígenos e conferem especificidade de ligação de antígenos ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável simples (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um antígeno) possui a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora a uma afinidade menor do que todo o sítio de ligação.
[0029] Fragmentos de anticorpos “Fv de cadeia simples” ou “scFv” compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígenos. Para análise de scFv, vide Plückthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, Estados Unidos, págs. 269-315 (1994).
[0030] “Aproximadamente” modificando, por exemplo, a quantidade de um ingrediente nas composições, concentração de um ativo, volume de tampão, diavolumes, o tamanho de poro, aparência molecular, diminuição do peso molecular, temperatura do processo, tempo do processo, rendimentos, taxas de fluxo, pressões, biocarga, e como valores e escalas destes, empregados nos métodos da invenção, referem-se à variação na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, com os procedimentos de medição e de manipulação típicos utilizados na produção de concentrados ou soluções de uso; através do erro inadvertido nestes procedimentos; através de diferenças na manufatura, na fonte, ou na pureza dos ingredientes empregados para fazer as composições ou para realizar os métodos; e como considerações. O termo “aproximadamente” abrange também as quantidades que diferem devido ao tempo de uma composição com uma concentração ou uma mistura inicial particular. O termo “aproximadamente” abrange também as quantidades que diferem devido a mistura ou a processamento de uma composição com uma concentração ou mistura inicial. Se são modificadas ou não pelo termo “aproximadamente” as reivindicações incluem equivalentes às quantidades.
[0031] “Consistindo essencialmente de” refere-se ao processo de se obter uma composição concentrada de proteína ou a composição de anticorpo que incluam etapas e ingredientes listados na reivindicação, além de outras etapas e ingredientes que não afetam substancialmente as propriedades básicas e originais da composição, tais como a multiplicidade das etapas ou meio de tampão. Os ingredientes que afetam substancialmente as propriedades básicas da composição e do método da presente invenção dão características indesejáveis incluindo, por exemplo, biocarga, tal como a toxicidade indesejável ou a irritabilidade associada aos contaminantes.
[0032] O artigo indefinido “um(uns)” e seu artigo definitivo correspondente “o(s)” ou “a(s)”, como usados no presente pedido, são compreendidos para designar pelo menos um ou mais, ao menos que especificado de outra maneira.
[0033] A presente invenção fornece, nas incorporações, os processos acima mencionados e os produtos deste anticorpo concentrado.
[0034] Nas incorporações da presente invenção, os processos preparativos e os produtos deste podem ser utilizados para fazer preparações de anticorpo altamente concentradas e preparações similares, como por exemplo, purificar e concentrar proteínas ou substâncias parecidas de fontes naturais ou sintéticas, e tais produtos podem ser úteis no tratamento de circunstâncias patológicas, tais como, asma, câncer, psoríase, inibindo a angiogênese e circunstâncias patológicas desconhecidas.
[0035] Nas incorporações do processo acima mencionado para preparar composições altamente concentradas do anticorpo da presente invenção, seguem exemplificações adicionais de como fazer e usar os processos preparativos e os produtos da presente invenção.
[0036] Nas incorporações da presente invenção, é fornecido um processo para preparar composições de anticorpo altamente concentradas, por exemplo, de acordo com a realização das seguintes etapas na ordem enumerada, constando de: um primeiro ultrafiltrado de uma primeira preparação de anticorpo, tendo uma concentração de, por exemplo, aproximadamente 0,1 a 10 gramas por o litro (g/L), para fornecer uma segunda preparação de anticorpo como retido, tendo uma maior concentração de anticorpo, por exemplo, de aproximadamente 10 a 50 gramas por litro; um diafiltrado da segunda preparação de anticorpo resultante para fornecer uma preparação de anticorpo diafiltrado intermediária como retido, tendo uma concentração mais ou menos idêntica como a segunda preparação de anticorpo retida resultante, que é, diafiltrado para realizar uma troca de tampão no volume constante; e uma segunda ultrafiltração da preparação intermediária de anticorpo diafiltrado para fornecer uma terceira preparação de anticorpo como retido, tendo uma maior concentração de anticorpo, por exemplo, de aproximadamente 150 a 200 gramas por o litro.
[0037] O processo preparativo da presente invenção pode constar adicionalmente de etapa ou etapas opcionais de recuperação do produto, por exemplo, como divulgado e ilustrado no presente pedido.
[0038] Nas incorporações do processo acima mencionado da presente invenção, um ou mais da primeira ultrafiltração, diafiltração, e segunda ultrafiltração, podem ser realizadas a, por exemplo, aproximadamente 30°C a 70°C. Nas incorporações, estas etapas podem também ser realizadas a, por exemplo, aproximadamente 30°C a 50°C. Nas incorporações, estas etapas podem também ser realizadas a, por exemplo, aproximadamente 35°C a 50°C. Nas incorporações, estas etapas podem também ser realizadas a, por exemplo, aproximadamente 45°C, tal como, aproximadamente 45°C mais ou menos 5°C. Dependendo do tipo da preparação de anticorpo acima, para os processos realizados em temperaturas acima de aproximadamente 70°C, a preparação pode mostrar sinais de deterioração, tais como o desnaturação, aglomeração e fenômenos parecidos. Para os processos realizados em temperaturas abaixo de aproximadamente 30°C a 35°C, as taxas de fluxo são indesejavelmente baixas e o tempo do processo é indesejavelmente longo, fazendo do processo em baixas temperaturas menos atrativo para a produção comercial eficiente.
[0039] Nas incorporações, a primeira preparação de anticorpo pode ter uma concentração de anticorpo de, por exemplo, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 gramas por litro (g/L). A concentração de anticorpo é, por exemplo, uma concentração comum tipicamente disponível de outras etapas ou métodos preliminares de purificação da proteína ou anticorpo, tais como, centrifugação, filtração, cromatografia e procedimentos parecidos. A segunda preparação de anticorpo resultante obtida da primeira ultrafiltração pode ter uma concentração de anticorpo de, por exemplo, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 gramas por litro, por exemplo, aproximadamente de 20 a 40 gramas por litro, tal como 30 gramas por litro. Uma escala para a concentração de anticorpo da preparação de anticorpo intermediária pode depender, por exemplo, de um balanço de fatores, tais como o volume da amostra e o fluxo da amostra obtida com um tampão especial que contém a segunda preparação de anticorpo. A preparação intermediária de anticorpo pode ter uma concentração de anticorpo de, por exemplo, aproximadamente 25 a aproximadamente 35 gramas por litro e a terceira preparação de anticorpo pode ter uma concentração de anticorpo, por exemplo, de aproximadamente 170 a aproximadamente 200 gramas por litro. A terceira preparação de anticorpo, nas incorporações, pode ter uma concentração, por exemplo, de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 gramas por litro de anticorpo, como aproximadamente de 100 a 230 gramas por litro, e aproximadamente de 170 a 200 gramas por litro, como por exemplo, 185 gramas por litro.
[0040] Será evidente para uma pessoa especializada, compreender na presente invenção, que a preparação de anticorpo intermediária e a terceira preparação de anticorpo constam do mesmo ultrafiltrado retido à exceção de, por exemplo, diferenças na concentração do anticorpo resultante da primeira e segunda concentração por ultrafiltração, e diferenças no meio de suspensão de tampão resultante da troca de tampão na diafiltração. Assim, há pouca, se existir, mudança na composição, tais como a degradação do produto da proteína ou anticorpo alvo nas incorporações da presente invenção.
[0041] Os métodos convencionais de concentração por ultrafiltração podem geralmente ter um tempo maior e transferências (throughput) poucas e ineficientes tendo um processo consideravelmente longo, como por exemplo, um processo de diversos dias a diversas semanas, um processo com volume consideravelmente pequeno, ou ambos.
[0042] Nas incorporações, o processo de concentração da proteína da presente invenção pode ser realizado dentro, por exemplo, de aproximadamente 1 a 10 horas, preferivelmente dentro de aproximadamente 2 a 5 horas, e mais preferivelmente em aproximadamente 3 horas. As preferências favorecem um fluxo de produção mais elevado e áreas menores de membrana.
[0043] Nas incorporações, a primeira ultrafiltração pode ser realizada, por exemplo, em aproximadamente 35% do tempo total do processo. Assim, por exemplo, em um processo de purificação e concentração da presente invenção com aproximadamente 3 horas de tempo total do processo, a primeira ultrafiltração pode ser realizada em aproximadamente 45 minutos. Nas incorporações, a segunda ultrafiltração pode ser realizada, por exemplo, em aproximadamente 15% do tempo total do processo. Assim, por exemplo, em um processo de purificação e concentração da presente invenção com aproximadamente 3 hora de tempo total do processo, a segunda ultrafiltração pode ser realizada em aproximadamente 15 minutos. A diafiltração pode ser realizada, por exemplo, em aproximadamente 50% do tempo total do processo. Assim, por exemplo, no processo da presente invenção com aproximadamente 3 horas de tempo total do processo, a diafiltração pode ser realizada em aproximadamente 90 a aproximadamente 120 minutos.
[0044] Nas incorporações, a primeira e a segunda ultrafiltração podem ser realizadas, por exemplo, com uma membrana de ultrafiltração que tem um tamanho nominal do poro, ou corte de peso molecular, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 kilo Daltons. Outro tamanho nominal de poro apropriado é, por exemplo, de aproximadamente 10 a 40 kilo Daltons. Contudo outro tamanho nominal de poro apropriado ou o corte de peso molecular é de aproximadamente 30 kilo Daltons.
[0045] Nas incorporações, a primeira preparação de anticorpo pode conter, por exemplo, um anticorpo que tem um peso molecular evidente de, por exemplo, aproximadamente 100 a 200 kilo Daltons. Em outras incorporações, a primeira preparação de anticorpo pode conter um anticorpo que tem um peso molecular evidente de, por exemplo, aproximadamente 150 kilo Daltons como, por exemplo, quando a preparação de anticorpo compreende de anticorpo anti-IgE ou IgE, vide, por exemplo, patente US 6.172.213 atribuído a Genentech, Inc.
[0046] Outros anticorpos para o uso na presente invenção incluem os anticorpos para tratamento de câncer, vide, por exemplo: PCT/US02/19592; PCT/US01/20118; PCT/US01/25464; PCT/US01/26626; PCT/US02/28859; PCT/US02/41798; PCT/US02/12206; PCT/US03/11148; PCT/US02/12619; e PCT/US02/33050. Ainda outros anticorpos apropriados para o uso na presente invenção incluem um anticorpo anti-CD20 e anticorpos parecidos incluindo formas humanas, não humanas, murinas, híbrida e quimérica. Vide, por exemplo, Patente US 6.582.959 (VEGF) e pedido de patente US 2002/0122797 A1 (VEGF humano).
[0047] Nas incorporações, os anticorpos incluídos no escopo da presente invenção incluem anticorpos híbridos e recombinantes (por exemplo, anticorpos “humanizados” e “humanos”) sem levar em conta a espécie de origem ou classe da imunoglobulina ou da subclasse de designação, bem como, fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, F(ab')2, and Fv). Vide, patente US 4.816.567; Mage e Lamoyi, in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 79-97, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, (1987).
[0048] Anticorpos monoclonais podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpo por fago utilizando as técnicas descritas em Clackson et al.,1991, Nature 352:624-628 e Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597, por exemplo. Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem especificamente anticorpos “quiméricos” em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica a ou homologa às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie especifica, ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da cadeia é idêntico a, ou homólogo, sequências correspondentes nos anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, de forma a exibira atividade biológica desejada (Patente US 4.816.567; e Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855). Os anticorpos podem incluir anticorpos “primatizados”, que compreendem sequências de ligação de antígenos de domínio variável derivadas de primatas não-humanos (por exemplo, Macacos do Velho Mundo, Chipanzé) e sequências de região constante humana.
[0049] Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante sobre o antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por não serem contaminados por outros anticorpos. O adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea de anticorpos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos à exceção das possíveis mutações naturais que podem estar presentes em quantidades menores, e não devem ser interpretados como requisito para a produção de anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados para o uso na presente invenção podem ser preparados por meio do método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser fabricados por meio de métodos de DNA recombinante. Outros métodos conhecidos para a produção de anticorpo são descritos, por exemplo, em Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103, Academic Press (1986); Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984). Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque (1987).
[0050] Vários métodos foram empregados para produzir anticorpos monoclonais (MAbs). A tecnologia de Hibridoma, que se refere a uma linhagem de células clonadas que produzem um único tipo de anticorpo, usa as células de várias espécies, incluindo camundongo (murino), hamster, ratos e humanas. Outro método para preparar a Mabs é a engenharia genética incluindo técnicas de DNA recombinante. Os anticorpos monoclonais feitos por estas técnicas incluem, entre outros, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Um anticorpo quimérico combina regiões de DNA codificante de mais de um tipo de espécie. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode derivar a região variável de um rato e a região constante de um ser humano. Um anticorpo humanizado vem predominantemente de um ser humano, mesmo que contenha porções não humanas. Como um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado pode conter uma região constante humana completa. Mas ao contrário de um anticorpo quimérico, a região variável pode ser parcialmente derivada de um ser humano. As porções não humanas, sintéticas de um anticorpo humanizado vêm frequentemente de CDRs em anticorpos murinos. Em qualquer evento, estas regiões são cruciais para permitir que o anticorpo reconheça e se ligue a um antígeno específico.
[0051] Como observado, anticorpos murinos desempenham um papel importante na tecnologia do anticorpo. Enquanto úteis para o diagnóstico e terapias a curto prazo, os anticorpos murinos não podem ser administrados por um longo prazo sem aumentar o risco de uma resposta imunogênica deletéria. Esta resposta, chamada de anticorpo humano anti-camundongo (HAMA), ocorre quando um sistema imune humano reconhece o anticorpo murino como estranho e ataca-o. Uma resposta de HAMA pode causar choque tóxico ou mesmo morte. Os anticorpos quiméricos e humanizados reduzem a probabilidade de uma resposta de HAMA, minimizando as parcelas não humanas dos anticorpos administrados. Além disso, os anticorpos quiméricos e humanizados têm o benefício adicional de ativar respostas imunes humanas secundárias, tais como a citotoxicidade celular dependente de anticorpo.
[0052] Um anticorpo “intacto” é aquele que compreende de uma região variável de ligação ao antígeno bem como um domínio constante da cadeia leve (CL) e domínios constantes da cadeia pesada CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes da sequência nativa humana) ou sequência de aminoácido variante deste. O anticorpo intacto pode ter uma ou mais “função efetora” que se refere a aquelas atividades biológicas atribuídas à região Fc (uma região da sequência nativa de Fc ou região da sequência de aminoácido variante de Fc) de um anticorpo. Os exemplos de funções efetoras do anticorpo incluem a ligação do Clq; citotoxicidade dependente do complemento; ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; baixa regulação dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor da célula B; BCR), etc.
[0053] Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, ao anticorpo intacto podem ser atribuídas diferentes “classes”. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e muitos destas podem ser divididas em “subclasses” (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondam às classes de diferentes anticorpos são denominados α, δ, y, ε e μ, respectivamente. As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
[0054] Nas incorporações, a primeira ultrafiltração concentra a primeira preparação de anticorpo para fornecer a segunda preparação de anticorpo que tem uma concentração de aproximadamente 30 gramas de anticorpo por litro, e a segunda ultrafiltração concentra a preparação intermediária de anticorpo (obtida pela diafiltração) para fornecer a terceira preparação de anticorpo que tem uma concentração de, por exemplo, aproximadamente 170 a aproximadamente 200 gramas de anticorpo por litro. A primeira e segunda ultrafiltração podem ser realizadas com a mesma membrana de ultrafiltro, e se desejado, dentro da mesma vasilha ou circuito do processo, por exemplo, para minimizar a manipulação, as perdas, extravasamento, com impactos no rendimento, na eficiência, e na economia. A primeira e segunda ultrafiltração podem ser realizadas com todos os instrumentos ou membrana apropriada do ultrafiltro. Muitos instrumentos e membranas apropriadas do ultrafiltro, que são capazes de realizar a operação de filtração de fluxo tangencial (TFF), ultrafiltrações e a diafiltração, são disponíveis comercialmente, como pela Millipore, Pall Corp. Nas incorporações, uma membrana de ultrafiltro apropriada pode ser, por exemplo, qualquer compósito de celulose regenerada, que tiver um perfil relativamente baixo de absorção de proteína comparado a outras membranas disponíveis do ultrafiltro como, por exemplo, polietersulfona.
[0055] A operação de diafiltração troca uma primeira composição de tampão presente na primeira e segunda preparação de anticorpo por um segundo tampão desejado na terceira preparação de anticorpo. Nas incorporações, o primeiro tampão pode constar, por exemplo, de uma mistura de cloreto de sódio aquoso e um tampão de TRIS, e o segundo tampão pode constar de, por exemplo, uma mistura do cloreto de histidina aquosa e cloreto da arginina. A diafiltração pode ser realizada por uma troca de tampão no volume constante, concentração constante ou em ambos. Nas incorporações, a diafiltração realiza uma troca do tampão a um volume constante e concentração constante. A diafiltração pode realizar uma troca de tampão, por exemplo, de aproximadamente 5 a 15 vezes o volume (isto é, diavolumes). A diafiltração pode realizar uma troca de tampão, por exemplo, de aproximadamente 8 vezes o volume (8 diavolumes), isto é, 8 vezes o volume da amostra que contem a preparação de anticorpo a ser trocada. Por exemplo, uma preparação de anticorpo de 10 litros pode ser diafiltrado em 5 (diavolumes) ou o volume de 50 litros de tampão de troca. O volume de troca e as preferências para o volume de troca consideram um contrapeso dos fatores, por exemplo, eficiência do processo de transferência, pureza do produto, padrões de aceitação governamentais e do cliente-paciente, e com padrões parecidos, e podem depender, por exemplo, da concentração e do tipo de tampão (por exemplo, o primeiro tampão) na primeira preparação do anticorpo e considerações parecidas.
[0056] A primeira e segunda ultrafiltração e a diafiltração são realizadas preferivelmente com filtração de fluxo tangencial (modo TFF) através de uma membrana de ultrafiltro, e a membrana de ultrafiltro é preferivelmente a mesma membrana para cada etapa. O rendimento do produto no pool final (isto é, a terceira preparação de anticorpo) pode ser, por exemplo, maior do que aproximadamente 70 % do peso, como por exemplo, aproximadamente 80 a 100 % do peso baseado no peso dos anticorpos da primeira preparação de anticorpo. O rendimento da terceira preparação de anticorpo pode ser, em incorporações, maior do que aproximadamente 90 % do peso, em incorporações, maior do que aproximadamente 95 % do peso, e em incorporações, maior do que aproximadamente 98 % do peso baseado no peso dos anticorpos da primeira preparação de anticorpo.
[0057] A primeira ultrafiltração pode ter uma taxa de recirculação, por exemplo, de aproximadamente 50 a 1000 mL/min, e preferivelmente de aproximadamente 100 a 1000 mL/min. A taxa da recirculação pode ser escalada de acordo com a área da membrana disponível, por exemplo, as áreas da membrana de 0,5 m2, 1,9 m2, 18,6 m2, 92,9 m2 (5, 20, 200, 1000 pés quadrados) e áreas parecidas permitem uma taxa cada vez mais elevadas de recirculação. Assim, uma escala apropriada da taxa de recirculação, nas incorporações, pode ser, por exemplo, de aproximadamente 5 L/min/m2 (0,5 L/min/ft2) a aproximadamente 50 L/min/m2 (5 L/min/ft2). Ultrafiltração e diafiltração podem ser realizadas, por exemplo, em pressões de transmembrana de aproximadamente 34,5 a aproximadamente 344,7 kPa (5 a aproximadamente 50 psi). Ultrafiltração e diafiltração podem ser realizadas, por exemplo, em pressões de transmembrana de aproximadamente 68,9 a aproximadamente 344,7 kPa (aproximadamente 10 a aproximadamente 50 psi). Nas incorporações da presente invenção é fornecido um processo de preparação de um concentrado para uma formulação mais diluída de anticorpo, o concentrado de anticorpo que tem uma biocarga mínima, por exemplo, menor ou abaixo do limite detectável como, por exemplo, menos que aproximadamente 100 CFU/mL.
[0058] As composições de anticorpo da presente invenção podem ser, por exemplo, preparação de anticorpo monoclonal concentrado para a administração aos seres humanos, como em uma concentração maior ou o igual que aproximadamente 100 g/l (mg/mL) como, por exemplo, aproximadamente de 120 a 170 g/l.
[0059] As composições de anticorpo da presente invenção podem ser, por exemplo, imunoglobulinas, como do grupo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM; subclasses destes; recombinantes destes; fragmentos destes; e misturas destes ou qualquer um antecedente. Em uma composição preferida de anticorpo da presente invenção inclui anticorpos anti-IgE recombinantes humanizados. As composições de anticorpo da presente invenção podem incluir um tampão. Um tampão preferido pode ser, por exemplo, uma mistura aquosa de cloreto de histidina e cloreto da arginina.
[0060] Os processos preparativos da presente invenção são realizados preferivelmente no mesmo instrumento e sem intervenção ou com intervenção mínima do operador, por exemplo, como ilustrado na FIG.1.
[0061] A primeira preparação de anticorpo pode ser fornecida ou preparada usando uma variedade de métodos químicos, físicos, mecânicos ou não mecânicos, ou métodos bioquímicos, tais como, moer, ultrasonicação, homogeneização, digestão enzimática, extração por solvente, centrifugação, cromatografia e métodos parecidos, e combinações destes, vide, por exemplo, o acima mencionado R. Hatti-Kaul et al., "Downstream Processing in Biotechnology," em Basic Biotechnology, Cap. 9. A terceira preparação de anticorpo pode ser adicionalmente processado, se desejado, usando-se, por exemplo, a nanofiltração (para remover, por exemplo, íons divalentes), osmose reversa (para remover, por exemplo, íons monovalentes), e métodos parecidos de purificação líquida. A terceira preparação de anticorpo da presente invenção atual pode ser empacotada, armazenada, ou ser diretamente usada. A terceira preparação de anticorpo pode ser, adicionalmente processada utilizando-se, por exemplo, uma etapa e concentração adicional como, por exemplo, métodos de secagem, liofilização, liofilização-reconstituição e métodos parecidos. O terceiro produto de anticorpo concentrado resultante pode reconstituído posteriormente, se desejado, com um líquido apropriado.
[0062] Consultando às figuras, A FIG. 1 ilustra um instrumento, nas incorporações da presente invenção, para realizar o processo preparativo incluindo um sistema de ultrafiltração e diafiltração (100) que tem uma unidade de ultrafiltração-difiltração TFF (UF-DF) (110), tendo uma membrana UF-DF (115), a qual esta em comunicação com o tanque de recirculação (120) este tanque serve como uma alimentação principal e um reservatório do retido. Nas incorporações, o tanque (120) pode ter um sistema de controle de temperatura constando, por exemplo, de um revestimento isolante (125), um termostato ou elemento de aquecimento de temperatura controlada (126), tal como um elemento calefator por resistência ou um sistema líquido aquecido circulando que inclua um aquecedor (não mostrado), um regulador de fluxo (127), como uma bomba de recirculação, e um líquido apropriado para transferência de calor, tal como a água, glicóis, ou misturas destes. Todos os componentes no circuito ou componente no circuito que contribuem ao fluxo ou que processam, como as tubulações, válvulas, bombas, tanques, e componentes parecidos, podem opcionalmente ser isolados ou opcionalmente adaptado para que o aquecedor externo mantenha o controle rigoroso sobre especificações de temperatura e evita alterações da temperatura na alça de fluido recirculador dentro e entre a câmara do filtro (110) e do tanque da recirculação (120). Nas incorporações, por exemplo, quando o sistema (100) está realizando a primeira ultrafiltração ou ultrafiltrando primeiramente, tal como no modo de carga de alimentação, o sistema pode incluir um tanque de alimentação opcional (128) que esteja em comunicação fluida com o tanque de alimentação de recirculação (120) e possa ser usada, por exemplo, compensar, reabastecer ou suplementar a fase líquida esgotada do tanque da recirculação (120).
[0063] Uma bomba (130) bombeia a alimentação do líquido do tanque (120) através da unidade de UF/DF (110) e recircula depois disso o retido resultante (a parcela não-filtrada ou porção do líquido de alimentação excluída da membrana) para o tanque recirculante (120). Um segundo tanque (140) armazena e opcionalmente bombeia (não mostrado) um tampão no circuito principal (alça 110-120) durante a diafiltração de volume constante. Por exemplo, a taxa da adição e o volume do tampão introduzido no circuito principal são preferivelmente na mesma taxa e volume em que o filtrado deixa o circuito principal através da membrana (115). O tanque do tampão (140) pode opcionalmente ser isolado com revestimento (143) e pode incluir o equivalente do elemento de aquecimento acima mencionado e de uma bomba de recirculação (não mostrados). Uma fonte opcional de gás inerte (145), como o nitrogênio, ou outras fontes comprimidas de gás podem ser usadas, por exemplo, para a recuperação do produto, para pressurizar o retorno do retido, para excluir o oxigênio, para nivelar, para a limpeza, para testar a integridade da membrana e para operações parecidas. Um terceiro tanque (160) é usado para coletar e recuperar o filtrado retirando a unidade (110). As válvulas (150,170) podem ser usadas como apropriado para regular o sentido e opcionalmente a taxa de fluxo líquida no sistema. Todos os valores e bombas podem ser atuados manualmente, coordenado por controle de computador, ou por ambos. Um quarto tanque opcional (190) e fluxo de saída que pode fornecer uma descarga de resíduo subordinado, recuperação do produto, ou sistema de monitoração, por exemplo, quando equipamento com um dispositivo de monitoração opcional (180), como um medidor de densidade ótica, filtro(s) opcional (ais) (185) como um filtro protetor, filtro de produto e subsistemas opcionais. Nas incorporações, o circuito fluido principal (laço 110-120) pode opcionalmente ser equipado com um sistema de monitoração em linha.
[0064] As preparações concentradas de anticorpo preparadas por processos da presente invenção podem ser usadas para a administração terapêutica humana, incluindo produtos de imunoglobulina, para administração intramuscular (IVIG) ou intravenosa (IMIG). As preparações concentradas de anticorpo da presente invenção podem incluir um estabilizador, por exemplo, uma solução salina de aminoácido tamponado, açúcares simples, ou como estabilizantes, quelantes de íons apropriados, tais como o EDTA ou íon de citrato, e combinações destes, vide, por exemplo, Wang, Y.-C. J. et al, "Parenteral formulations of proteins and peptides: stability and stabilizers,"J. Parenteral Sci. Technol, 42, Suppl. S3-S26 (1988). O sumário de Derwent JP01268646A (AN89-359879) relata que o pedido descreve uma preparação da injeção de um anticorpo IgG3 monoclonal que tem uma concentração de 0,1 microgramas/mL a 100 mg/mL. Acredita-se que o tema divulgado nestas publicações está fora do escopo da presente invenção.
[0065] As preparações de acordo com a presente invenção podem estar substancialmente livres dos agregados. Os níveis aceitáveis de contaminantes agregados seriam menos do que, por exemplo, aproximadamente 5 % do peso, e idealmente menos de 2 % do peso. Níveis tão baixos como 0,2 % do peso podem ser obtidos, embora os contaminantes agregados de aproximadamente 1 % de peso sejam mais típicos. A preparação nas incorporações pode também preferivelmente estar livre de os excipientes utilizados tradicionalmente para estabilizara a formulação policlonal, por exemplo, glicina e/ou maltose.
[0066] A presente invenção pode fornecer uma preparação de anticorpo monoclonal para a administração a um ser humano caracterizado pelo fato de que o anticorpo da preparação é um anticorpo recombinante e pode estar em uma concentração de 100 mg/mL ou maior, preferivelmente maior do que 150 mg/mL. A preparação é preferentemente substancialmente livre de qualquer agregação de proteína.
[0067] O pH de formulação farmacêutica da presente invenção dependerá em particular da rota de administração. Entretanto, a fim de maximizar a solubilidade do anticorpo na solução concentrada, o pH da solução deve ser diferente do pH do ponto isoelétrico (pi) do anticorpo.
[0068] Nas incorporações da presente invenção, a preparação monoclonal pode estar prevista para o uso na terapia humana. Várias desordens humanas podem ser tratadas como o câncer ou as doenças infecciosas, por exemplo, as aquelas mencionadas acima, e disfunções imunes, tal como, desordens mediadas por células T incluindo a vasculite severa, artrite reumatóide, lúpus sistêmico, também desordens autoimunes tais como a esclerose múltipla, doenças enxerto contra o hospedeiro, psoríase, diabetes juvenil, doença de Sjogren, doença de tireóide, miastenia grave, rejeição de transplante, doença inflamatória de cólon, asma, desordens mediadas por IgE, e desordens ou circunstâncias parecidas, ou combinações destas.
[0069] A presente invenção fornece, portanto nas incorporações o uso de uma preparação de anticorpo monoclonal concentrada como descrito no presente pedido no medicamento manufaturado para o tratamento de algumas das desordens acima mencionadas e desordens parecidas. É fornecido também um método de tratar um ser humano, tendo uma desordem, constando da administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma preparação de acordo com a presente invenção. As dosagens de tais preparações de anticorpo variarão com as circunstâncias que estão sendo tratadas e o receptor do tratamento, mas podem, por exemplo, ser na escala de aproximadamente 50 a aproximadamente 2000 mg para um paciente adulto, preferivelmente aproximadamente 100 a 1000 mg administrado diariamente ou semanalmente por um período entre 1 e 30 dias e repetida como necessário. As doses podem ser administradas como dose única ou doses múltiplas.
[0070] A etapa da formulação troca tipicamente um grande volume da substância purificada do fármaco, por exemplo, resultando da cromatografia por troca iônica, na composição e nas concentrações finais do excipiente. Não havia tipicamente nenhuma purificação obtida nesta etapa à exceção da remoção de pequenas moléculas. A ênfase estava no rendimento, na troca de tampão, e na robustez elevada na etapa da formulação. Durante a formulação através de TFF (filtração de fluxo tangencial), a proteína contida na solução de alimentação foi bombeada através do sistema de membrana e voltou à recipiente do reciclo (recirculação). A membrana da TFF reteve a proteína (como parte do retido) quando o filtrado (ou o permeado) foi passado através da membrana pela pressão. A pressão é chamada a pressão transmembrana (TMP) e é tipicamente controlada pela utilização de uma válvula de controle da pressão do retido. O processo foi conseguido pela sequência de uma primeira ultrafiltração (concentração), diafiltração (troca constante do volume de tampão), e de uma segunda ultrafiltração (concentração adicional). O número de diavolumes (equivalentes volumétricos) necessários para remover os componentes o tampão do processo pode prontamente ser calculado ou determinado experimentalmente.
[0071] O pH de um pool da cromatografia de troca iônica foi ajustado a um pH de aproximadamente 6 usando-se 0,5 M de ácido fosfórico aquoso. O pH ajustado do pool de troca iônica foi formulado pelo processo da ultrafiltração /diafiltração (UF/DF) da presente invenção usando uma membrana que tem uma eliminação molecular nominal de 10.000 - 30.000 Daltons. Antes de processar, a membrana UF foi equilibrada com tampão de diafiltração (histidina 0,02 M, HCl -arginina 0,2 M, pH 6).
[0072] O produto de uma troca aniônica (pool da troca iônica) foi então carregado no sistema e concentrado a uma concentração intermediária pela primeira ultrafiltração. O pool foi então diafiltrado (8 X ou 8 diavolumes) em sua formulação (histidina 0,02 M, HCL- arginina 0,2 M, pH 6). O pool foi então concentrado pela segunda ultrafiltração a uma concentração final maioria que 170 g/L e recuperado através de um filtro estéril de 0,22 micrômetros. O processo inteiro de UF/DF foi executado em um ponto da temperatura ajustado de aproximadamente 45°C. Este controle de temperatura foi obtido usando o controle de temperatura da troca iônica do pool entrante, do tampão da diafiltração e do uso de um revestimento isolante do tanque de recirculação para o processo de UF/DF como ilustrado no presente pedido.
[0073] Após a UF/DF, o pool recuperado foi diluído (isto é, condicionado) a uma concentração de cerca de 150 g/L em 0,02M de histidina e 0,2 M de HCL- arginina, 0,04% de polisorbato-20 em pH 6 (formulação final). Durante as etapas condicionantes foi permitida que a temperatura do volume formulado retornasse à temperatura ambiente. Após condicionar, o volume formulado foi recuperado outra vez através de um filtro estéril de 0,22 micrômetros.
[0074] O sistema de UF/DF pode ser regenerado com 0,1 N de hidróxido de sódio e sanitizado com Minncare® 1,4%. Quando não usado o sistema pode ser armazenado em 0,1 N de hidróxido de sódio aquosos. As membranas de UF/DF podem ser armazenadas, por exemplo, em 0,1% Roccal /20% em solução água -glicerol entre as campanhas.
[0075] Parâmetros de operação: Taxa de fluxo da alimentação a 5 L/min/m2 (0,5 L/min/ft2). Um controle constante da pressão do retido (por exemplo, 68,9 kPa [10 psig - sempre que mensurado em psig a conversão da pressão para kPa desconsidera a pressão atmosférica]) foi usado para a limpeza e balanceamento de pré-uso, visto que Cwan, a pressão constante do retido ou TMP constante foram usados para o processo.
[0076] Balanceamento de pré-uso: As seguintes preparações foram realizadas nos cassetes de membranas Pellicon-2 limpas antes do uso para assegurar que as membranas foram corretamente balanceadas.
[0077] Processo de Uso: O seguinte foi executado no pool inicial resultante da troca iônica (Q-pool) obtido de uma etapa precedente da separação, por exemplo, uma etapa de cromatografia de Q-Sepharose: Ultrafiltrando o primeiro ou primeira ultrafiltração (UF1) a uma concentração de aproximadamente 5 g/L em uma concentração para a diafiltração (CDF); diafiltrando ou diafiltração (DF1) com quatro (4) volumes de diafiltração (DV) com tampão DF; diafiltração continuada (DF2) com quatro (4) volumes de diafiltração (DV) com tampão DF; ultrafiltrando o segundo ou segunda ultrafiltração (UF2) a uma concentração final (Cfinal); e opcional recuperação do produto.
[0078] As etapas antecedentes foram realizadas tipicamente a baixa dP reciclável (mistura), por exemplo, 15 minutos.
[0079] Limpeza pós-uso: As seguintes sequência e circunstâncias tabuladas foram usadas para a limpeza nos cassetes de membrana Pellicon-2 imediatamente após o uso.
[0080] Definições para a modalidade de operação em TFF.
[0081] Única passagem com o Filtrado aberto (SPFO). O retido e o filtrado são dirigidos para drenar.
[0082] Válvula do Filtrado aberta.
[0083] A reciclagem total com o Filtrado aberto (TRFO). O retido e o filtrado são dirigidos para o recipiente de reciclagem. Válvula do Filtrado aberta.
[0084] Ultrafiltração do Grupo de Alimentação (FB-UF). O retido é dirigido ao tanque de reciclagem, o filtrado dirigido para o dreno, e o pool entrante é transferido ao tanque de reciclagem.
[0085] Ultrafiltração do grupo (B-UF). O retido é dirigido ao tanque de reciclagem e o filtrado é dirigido para o dreno.
[0086] Diafiltração (DF). O retido é dirigido ao tanque de reciclagem, o filtrado é dirigido para o dreno, e o tampão da diafiltração é transferido ao tanque de reciclagem.
[0087] dP refere-se a diferença de pressão.
[0088] Transferência do produto. A unidade da membrana de ultrafiltro e do tanque de reciclagem está aberta ao tanque do pool. A pressão de nitrogênio é controlada. O poolé transferido primeiramente usando a bomba de reciclagem e então é usado uma bomba peristáltica manual.
[0089] Transferência da alimentação. O pool entrante é bombeado ao tanque de reciclagem.
[0090] Reciclagem Total com o Filtrado Fechado (TRFC). O retido é dirigido ao recipiente de reciclagem. Válvula do Filtrado fechada.
[0091] “Q-pool” refere-se ao pool de proteína resultante de, por exemplo, uma etapa precedente da cromatografia em Q-Sepharose que seja condicionada com tampão, referida também como “pool condicionado”.
[0092] WFI refere-se à água para injeção.
[0093] Os seguintes exemplos servem para descrever de forma mais completa os modos de uso da invenção acima descrita, bem como determinar os melhores modos contemplados para a realização de vários aspectos da invenção. Compreende-se que estes exemplos de maneira alguma servem para limitar o verdadeiro escopo desta invenção, mas é preferivelmente apresentado para finalidades ilustrativas.
[0094] Um sistema piloto de UF para produção em escala foi usado para concentrar/formular o rhuMAb E25 (um anticorpo monoclonal humano recombinante para IgE, patente US 6.172.213). Um sistema Millipore Pelicon de Ultrafiltração /Diafiltração foi montado com uma membrana de compósito de celulose regenerada de 0,5 m2 (5,7 sqft) e 10.000 Daltons. O sistema consistiu em um suporte para membrana, uma bomba de alimentação de lóbulo giratório Waukeskaw modelo 6, encanamento da recirculação em aço inoxidável 1,28 cm (%”) 316L, e um recipiente de recirculação. Os indicadores/ transmissores de pressão (Anderson) foram situados na entrada (ALIMENTAÇÃO), no escoador (RETIDO) e no permeado (FILTRADO) do suporte da membrana. Os medidores de fluxo (Yokogawa ADMAG) foram situados na entrada (ALIMENTAÇÃO) e no permeado (FILTRADO) do suporte da membrana. Uma válvula regulando a retro pressão (Mikroseal) foi situada no escoador do suporte da membrana para controlar a pressão do retido e para efetuar a pressão transmembrana (TMP). Um tanque envolvido de aço inoxidável de 40 litros 316L foi usado para o recipiente de recirculação. Este tanque foi colocado com um indicador de nível, um agitador montado no topo (Lightnin), um disjuntor e uma válvula do fundo do vórtex (NovAseptic). O controle de temperatura foi conseguido com o uso da temperatura modulado por alimentação de glicol ao revestimento do tanque.
[0095] Durante este funcionamento, a taxa de fluxo da alimentação foi ajustada a uma taxa constante de 2,85 L/min (5L/min/m2 [0,5L/min/ft2]). Durante toda operação pré-uso e pós-uso o controle de pressão do retido foi ajustado a uma constante de 68,9 kPa (10 psig). Durante as operações de ultrafiltração e diafiltração o sistema usou um esquema de controle de Cwan para controlar o fluxo através da membrana, vide, por exemplo, Reis, et al., “Constant Cwaii Ultrafiltration Process Control”, J. of Membrane Science, 130 (1997), 123140.
[0096] Antes do processo, a solução de armazenamento do sistema (NaOH 0,1N) foi descarregada em uma única passagem para o modo de drenagem, primeiramente purificada com água 20L/m2 (2L/ft2) (PW) e então com tampão de diafiltração (50 mM de histidina/pH 6.0) 10L/m2 (1L/ft2). Depois que descarregado, o sistema foi equilibrado re-circulando o tampão de diafiltração 5 L/m2 (0,5L/ft2) por 10 minutos. O pH da solução re-circulada foi verificado para confirmar o equilíbrio. O nível no tanque foi reduzido então a um valor mínimo mensurável para minimizar a diluição do pool entrante de proteína. O pool de proteína resultante de uma etapa precedente da cromatografia em Q- Sepharose foi mensurado para ser 3,2 g E25/L e teve um volume de 43,1 litros. A proteína estava em uma solução de tampão TRIS 25 mM e aproximadamente NaCl 200 mM e pH ajustado para 6,2. Para iniciar o funcionamento o pool de proteína foi transferido à recipiente de recirculação. No recipiente o pool foi agitado através de um impulsor montado no topo e a temperatura foi mantida em temperatura ambiente (20-25°C).
[0097] Durante o processo o pool foi concentrado no modo UF1 a 50 g E25/L (cerca de 2,8L). No começo da diafiltração, o ponto da temperatura ajustada no recipiente foi aumentado para 40°C. O aumento na temperatura e no controle foi afetado pelo fluxo quente de glicol através do revestimento exterior do tanque. O pool foi diafiltrado então com 8 diavolumes de tampão de diafiltração. A diafiltração foi executada em um volume constante, que foi conseguido combinando a taxa de fluxo da solução protegida que está sendo transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está sendo removido do sistema. No final da diafiltração, o pool foi concentrado adicionalmente na modalidade UF2. Esta fase foi executada também ajustando o ponto da temperatura a 40°C. O alvo para esta concentração final foi de 110 g/l. Isto foi obtido sem a necessidade reduzir a taxa de fluxo da alimentação. Em seguida, mistura uma redução a pressão baixa foi executada onde a bomba de alimentação foi controlada para manter uma pressão mínima de 5-68,9 kPa (10 psig) através da canaleta da alimentação. Uma amostra foi puxada do tanque de recirculação e uma concentração do volume final de aproximadamente 120 g/l foi mensurada. A tabela 1 sumariza os resultados da produção e do fluxo de UF1, DF (DF1+DF2), e UF2. TABELA 1
[0098] Fig. 2 mostra os valores do processo observado ou medido sobre os parâmetros de tempo para a taxa de fluxo da alimentação (210), temperatura do tanque (220), dP da alimentação (230), TMP (240), taxa de fluxo do filtrado (250) durante as várias fases ou modalidade do processo incluindo UF1 (10), DF (20), UF2 (30).
[0099] Fig. 3 mostra os valores do processo observado ou medido sobre o tempo para a concentração E25 (310), fluxo (320) e TMP (240).
[00100] Fig. 4 mostra os valores do processo observado ou medido sobre o tempo para a diminuição da pressão contra a concentração da proteína observada para UF1(410) e UF2 (420) a 37°C.
[00101] O pool de proteína foi recuperado por uma série das etapas. Primeiro o pool de recirculação foi bombeado para o tanque através de um Millipac 200, com um filtro de 0.22 mícrons esterilizado usando a bomba de alimentação de lóbulo giratória. A solução da proteína foi deslocada em seguida da unidade do encanamento e da membrana com um fluxo do gás nitrogênio de 34,5 kPa (5 psig) aplicado para baixo do ponto mais elevado na linha do retido. A fase final foi um fluxo para abaixo do tanque e da linha de alimentação, também usando o gás nitrogênio a 34,5 kPa (5 psig).
[00102] A recuperação do produto foi acreditada por ser melhorada comparada ao exemplo 1 quando conduzida na temperatura ambiente porque a temperatura elevada utilizada em uma ou mais ultrafiltração, diafiltração ou as etapas de recuperação reduziu o efeito viscoso. Por exemplo, quando o controle de temperatura foi desligado durante a recuperação do produto, o sistema esfriou lentamente durante esta operação que causou dificuldades na recuperação da unidade da membrana. Alternativamente, a recuperação pode ser executada primeiramente pelo suporte da membrana e então pelo recipiente de recirculação.
[00103] Para determinar a perda de massa durante a recuperação, 1,74 litros de tampão de DF foram adicionados ao sistema e recirculados por aproximadamente 5 minutos e recuperados usando a mesma sequência que descrita acima. Este volume foi analisado então para a concentração da proteína com os outros pools. A tabela 2 sumariza os resultados. TABELA 2
[00104] Após o processo, a membrana foi regenerada em única seguido passagem de lavagem usando NaOH 0,1N, 10L/m2 (1L/ft2) seguido pela recirculação total 5 L/m2 (0.5L/ft2) por 30 minutos. Isto foi seguido pela lavagem por 10L/m2 (1L/ft2) de PW (água pura). Seguido por uma recirculação total da solução de 300 ppm Minncare® por 30 minutos. O sistema foi outra vez foi lavado com 10L/m2 (1L/ft2) PW e re-circulado finalmente por 15 minutos com NaOH 0,1N e armazenado. O pool recuperado foi diluído a 80 g E25/L e condicionado na formulação final de 50 mM de histidina /150 mM de trealose /0,02% polisorbato 20 / pH 6,0. A qualidade de produto foi avaliada por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para o Q-Pool entrante e para o volume final recuperado. Estes dados são sumarizados na tabela 3. TABELA 3
[00105] O exemplo 1 foi realizado com as seguintes exceções. Antes do processo, a solução do armazenamento do sistema (NaOH 0.1N) foi primeiramente lavada em uma única passagem pelo modo de drenagem com água purificada 20L/m2 (2L/ft2) (PW) e então com tampão de diafiltração 10L/m2 (1L/ft2) (20 mM de histidina /pH 6,0). Após a lavagem o sistema foi equilibrado recirculando o tampão de diafiltração 5L/m2 (0,5L/ft2) por 10 minutos. O pH da solução recirculada foi verificado para confirmar o equilíbrio. O nível no tanque foi reduzido então a um valor mínimo mensurável para minimizar a diluição do pool entrante de proteína.
[00106] O pool de proteína que resultante da etapa da cromatografia em Q-Sepharose foi medido para ser 3,3 g E25/L e ter um volume de 33,3 L. A proteína estava em uma solução tampão de TRIS 25 mM e aproximadamente 200 mM de NaCl e pH ajustados para 6,2. Para iniciar o funcionamento o pool de proteína foi transferido ao recipiente de recirculação. No recipiente o pool foi agitado através de um impulsor montado no topo e a temperatura foi mantida em temperatura ambiente (20-25°C). Durante o processo o pool foi concentrado a baixo no modo UF1 a 50 g E25/L (aproximadamente 2,2 litros). O pool foi então diafiltrado com 8 diavolumes do tampão de diafiltração. A diafiltração foi executada em um volume constante, em que o volume foi obtido combinando a taxa de fluxo de ser transferida no tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está sendo removido do sistema. A diafiltração foi executada também em temperatura ambiente. No final da diafiltração, o pool foi mais concentrado no modo UF2. O alvo para esta concentração final era 110 g/l. Entretanto, devido a uma redução da alta pressão através da canaleta da alimentação, esta concentração não foi obtida. Em uma tentativa de se conseguir esta concentração a taxa de fluxo da alimentação foi reduzida a 1,4 L/min em uma concentração adicional de aproximadamente 80 g E25/L, devido uma queda de pressão através da canaleta da alimentação que alcançou 345 kPa (50 psig). UF2 continuou até que a queda de alta pressão de 345 kPa (50 psig) foi novamente alcançada e o processo foi interrompido. Em seguida, uma queda de baixa pressão foi tentada com uma bomba de alimentação para manter uma queda de pressão de 34,5 kPa (5 psig) através da canaleta da alimentação. Outra vez, a natureza viscosa da solução de proteína se tornou difícil de conseguir que a bomba de lóbulo giratório alcançasse pressões adicionais. Uma amostra foi retirada do tanque de recirculação e uma concentração final de aproximadamente 104 g/l foi mensurada. A tabela 4 sumariza a produção e o fluxo mensurado durante as fases UF1, DF (DF1+DF2), e UF2. TABELA 4
[00107] Fig. 5 mostra os valores do processo observados ou medidos sobre a tempo para os parâmetros da taxa de fluxo da alimentação (210), a temperatura do tanque (220), o dP da alimentação (230), TMP (240), e da taxa de fluxo do filtrado (250) durante as várias fases ou modalidade do processo incluindo UF1 (10), DF (20), UF2 (30).
[00108] Fig. 6 mostra os valores do processo observado ou medido sobre o tempo para a concentração E25 (310), fluxo (320) e TMP (240).
[00109] Fig. 7 mostra os valores do processo observado ou medido sobre o tempo para a diminuição da pressão contra a concentração da proteína observada para UF1(410) e UF2 (420) a 24°C.
[00110] O pool de proteína foi recuperado por uma série das etapas. Primeiro o pool de recirculação foi bombeado para o tanque através de um Millipac 200, com um filtro de 0.22 mícrons esterilizado usando a bomba de alimentação de lóbulo giratória. A solução da proteína foi deslocada em seguida da unidade do encanamento e da membrana com um fluxo do gás nitrogênio de 34,5 kPa (5 psig) aplicado para baixo do ponto mais elevado na linha do retido. A fase final foi um fluxo para abaixo do tanque e da linha de alimentação, também usando o gás nitrogênio a 34,5 kPa (5 psig).
[00111] Para determinar a perda de massa durante a recuperação, 1,85 litros de tampão de DF foram adicionados ao sistema e recirculados por aproximadamente 5 minutos e recuperados usando a mesma sequência do exemplo 1. Este volume foi analisado então para a concentração da proteína com os outros pools. A tabela 5 sumariza os resultados. TABELA 5
[00112] Após o processo, a membrana foi regenerada em única passagem de lavagem usando NaOH 0,1N, 10L/m2 (1L/ft2) seguido pela recirculação total 5L/m2 (0.5L/ft2) por 30 minutos. Isto foi seguido pela lavagem por 10L/m2 (1L/ft2) de PW (água pura). Seguido por uma recirculação total da solução de 300 ppm Minncare® por 30 minutos. O sistema foi outra vez foi lavado com 10L/m2 (1L/ft2) PW e recirculado finalmente por 15 minutos com NaOH 0,1N e armazenado. O pool recuperado foi diluído a 80 g E25/L e condicionado na formulação final de 20 mM de histidina / 250 mM de sacarose /0,02% polisorbato 20 / pH 6,0. A qualidade de produto foi avaliada por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para o Q-Pool entrante e para o volume final recuperado. Estes dados são sumarizados na tabela 6. TABELA 6
[00113] O exemplo 1 foi repetido com as seguintes exceções. Concentrado /fórmula era o rhuMAb E26 (um anticorpo monoclonal humano recombinante para IgE). Os produtos deste exemplo foram usados na avaliação toxicológica. Um sistema Millipore Pelicon de Ultrafiltração /Diafiltração foi montado com uma membrana de compósito de celulose regenerada de 1,06 m2 (11,4 sqft) e 10.000 Daltons. Durante as operações de ultrafiltração e diafiltração a pressão do retido foi mantida entre aproximadamente 41,4 a 55,2 kPa (6-8 psig). O pool de proteína que resultou da etapa precedente por cromatografia em Q-Sepharose foi mensurado para ser 6,7 g E26/L e teve um volume de 59,3 litros.
[00114] Porque o pool entrante era maior do que o recipiente de recirculação, o processo UF1 começou no modo de carga de alimentação. Neste modo, o Q-Pool foi adicionado ao recipiente de recirculação aproximadamente na mesma taxa que filtrado passava através da membrana TFF para o dreno. Depois de o Q-Pool restante ser transferido ao recipiente de recirculação, o processo UF1 continuou no modo de carga. Durante o UF1 o pool foi concentrado a 50 g E26/L (aproximadamente 7,9 L). No começo do diafiltração o ponto ajustado da temperatura do recipiente de recirculação foi aumentado para 40°C. O aumento na temperatura e o controle foi afetado pelo fluxo quente de glicol através do revestimento exterior do tanque. O pool foi então diafiltrado com 8 diavolumes do tampão de diafiltração. A diafiltração foi executada em um volume constante, que foi conseguido combinando a taxa de fluxo da solução protegida que está sendo transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está sendo removido do sistema. No final da diafiltração, o pool foi concentrado adicionalmente na modalidade UF2 a uma concentração final de 109 g E26/L (3.6L). Esta fase foi executada também ajuntando o ponto da temperatura a 40°C. Em seguida, misturando uma queda na pressão baixa foi executada onde a bomba de alimentação foi controlada para manter uma pressão mínima de 34,5 a 68,9 kPa (5-10 psig) através da canaleta da alimentação.
[00115] A tabela 7 sumariza os resultados da produção e do fluxo de UF1, DF (DF1+DF2), e UF2. TABELA 7
[00116] Fig. 8 mostra os valores do processo observados ou medidos sobre a tempo para os parâmetros da taxa de fluxo da alimentação (210), a temperatura do tanque (220), o dP da alimentação (230), TMP (240), e da taxa de fluxo do filtrado (250).
[00117] Fig. 9 mostra os valores do processo observado ou medido sobre o tempo para a concentração E26 (910), fluxo (920) e TMP (940).
[00118] Fig. 10 mostra os valores do processo observado ou medido sobre o tempo para a queda da pressão contra a concentração da proteína observada para UF1(1010) e UF2 (1020).
[00119] Apenas antes da recuperação do produto, uma amostra de 10 mL foi analisada para a detecção e uma titulação da biocarga. Um limite típico de rejeição é a 1000 unidades formadoras de colônia (CFU) por mL. Os resultados deste teste foi 1,8 CFU/mL, um valor apropriado para esta etapa e bem abaixo do limite de rejeição. Para determinar a perda de massa durante a recuperação, 908.1 mL de tampão de DF foram adicionados ao sistema e recirculados por aproximadamente 5 minutos e recuperados usando a mesma sequência descrita acima. Este volume foi analisado então para a concentração de proteína com os outros pools. A tabela 8 sumariza os resultados. TABELA 8
[00120] O pool recuperado foi diluído a 80 g E25/L e condicionado na formulação final de 50 mM de histidina / 150 mM de trealose /0,02% polisorbato 20 / pH 6,0. A qualidade de produto foi avaliada por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para o Q-Pool entrante, o pool de retido após UF1, o pool do retido após DF e para o volume final recuperado. Estes dados são sumarizados na tabela 9. TABELA 9
[00121] O exemplo 3 foi repetido com as seguintes exceções. Dois sistemas de UF para produção em escala foram usados para concentrar/ formular o rhuMAb E26. Dois sistemas do Ultrafiltração /Diafiltração da Millipore Pelicon foram montados todos com 1,06 m2 (11,4 sqft), em membrana de compósito de celulose regenerada com um tamanho de poro para 10.000 Daltons e outra com um tamanho de poro para 30.000 Daltons. As pressões do retido foram mantidas aproximadamente a 41,4 a 62,1 kPa (6-9 psig).
[00122] O pool de proteína que resultou da etapa de cromatografia em Q-Sepharose precedente foi mensurada para ser 5.85 g E26/L e teve um volume de 62,4 L. Durante a UFl, o pool foi concentrado a 50 g E26/L (aproximadamente 7,3 L). No fim da diafiltração, o pool foi adicionalmente concentrado no modo UF2 a uma concentração final de 107,5 g E26/L (3,4L). A tabela 10 sumariza os resultados da produção e do fluxo de UF1, DF e UF2. TABELA 10
[00123] Para determinar a perda de massa durante a recuperação, 987 mL de tampão de DF foram adicionados ao sistema e recirculados por aproximadamente 5 minutos e recuperados usando a mesma sequência descrita acima. Este volume foi analisado então para a concentração da proteína com os outros pools. A tabela 11 sumariza os resultados. TABELA 11
[00124] Fig. 11 mostra os valores do processo observados ou medidos sobre a tempo para os parâmetros da taxa de fluxo da alimentação (210), a temperatura do tanque (220), o dP da alimentação (230), TMP (240), e da taxa de fluxo do filtrado (250) durante as várias fases ou modalidade do processo incluindo UF1 (10), DF (20), UF2 (30) e baixo dP (40), para o processo de 10 kD.
[00125] Fig. 12 mostra os valores do processo observado ou medido sobre o tempo para a concentração E26 (1210), fluxo (1020) e TMP (1240) durante as várias fases ou modalidade do processo incluindo UF1 (10), DF (20), UF2 (30) e baixo dP (40), para o processo de 10 kD.
[00126] Fig. 13 mostra os valores do processo observado ou medido sobre o tempo para a queda da pressão contra a concentração da proteína observada para UF1(1310) e UF2 (1320) para o processo de 10 kD.
[00127] O pool de proteína que resultou da etapa de cromatografia em Q-Sepharose precedente foi mensurada para ser 5.85 g E26/L e teve um volume de 64,5 L. Durante a UFl, o pool foi concentrado a 50 g E26/L (aproximadamente 7,5 L). No fim da diafiltração, o pool foi adicionalmente concentrado no modo UF2 a uma concentração final de 117,5 g E26/L (3,2L). A tabela 12 sumariza os resultados da produção e do fluxo de UF1, DF e UF2. TABELA 12
[00128] Para determinar a perda de massa durante a recuperação, 918 mL de tampão de DF foram adicionados ao sistema e recirculados por aproximadamente 5 minutos e recuperados usando a mesma sequência descrita acima. O pool recuperado foi diluído a 80 g E25/L e condicionado na formulação final de 50 mM de histidina / 150 mM de trealose /0,02% polisorbato 20 / pH 6,0. A tabela 13 sumariza os resultados. TABELA 13
[00129] Fig. 14 mostra os valores do processo observados ou medidos sobre a tempo para os parâmetros da taxa de fluxo da alimentação (210), a temperatura do tanque (220), o dP da alimentação (230), TMP (240), e da taxa de fluxo do filtrado (250) durante as várias fases ou modalidade do processo incluindo UF1 (10), DF (20), UF2 (30) e baixo dP (40), para o processo de 30 kD.
[00130] Fig. 15 mostra os valores do processo observado ou medido sobre o tempo para a concentração E26 (1510), fluxo (1520) e TMP (1540) durante as várias fases ou modalidade do processo incluindo UF1 (10), DF (20), UF2 (30) e baixo dP (40), para o processo de 30 kD.
[00131] Fig. 16 mostra os valores do processo observado ou medido sobre o tempo para a queda da pressão contra a concentração da proteína observada para UF1(1610) e UF2 (1620) para o processo de 30 kD.
[00132] O exemplo 1 foi repetido com as seguintes exceções.
[00133] Um sistema de UF para produção em escala foi usado concentrar/ formular um rhuMAb E25 líquido (um anticorpo monoclonal humano recombinante para IgE). O produto pode ser usado na aplicação terapêutica e na pesquisa de bio-equivalência em humanos. Um sistema Millipore Pelicon de Ultrafiltração /Diafiltração com 0,5 m2 (5,7 sqft) foi montado com uma membrana de compósito de celulose regenerada, com um tamanho de poro para 30.000 Daltons. Cada sistema consistiu de um suporte para membrana, uma bomba de alimentação giratória Viking S3S, encanamento da recirculação do aço inoxidável 316L de 3,8 cm (1%") e um recipiente de recirculação 250-L.
[00134] Um tanque de 250 L revestido de aço inoxidável 316L foi usado para o recipiente de recirculação. O controle de temperatura deste tanque foi conseguido pela modulação da temperatura por alimentação de glicol no revestimento do tanque. A temperatura de alimentação do glicol no revestimento do tanque foi aumentada ou diminuída usando -se troca de calor por vapor ou fonte fria de glicol respectivamente.
[00135] Para este funcionamento, a taxa de fluxo de alimentação foi ajustada a uma taxa constante de 114 L/min (5L/min/m2 [0,5L/min/ft2]). O tampão de diafiltração (20 mM de histidina / 200 mM cloreto de arginina / pH 6,0) foi preparado em um tanque separado. A temperatura deste tampão foi ajustada para 45°C antes do inicio do processo. Isto permitiu o controle exato da temperatura durante todo o processo.
[00136] Antes de processar, a solução de armazenamento do sistema (NaOH 0,1N) foi equilibrada em uma única passagem para drenar primeiramente a modo primeiro com água para injeção (WFI) 10L/m2 (1L/ft2) e então tampão de diafiltração 10L/m2 (1L/ft2). Após as lavagens, o sistema foi equilibrado recirculando o tampão de diafiltração 5L/m2 (0,5L/ft2) por 10 minutos. O pH da solução re-circulada foi verificado para confirmar o equilíbrio.
[00137] O pool de proteína que resultante da etapa da cromatografia em Q-Sepharose foi medido para ser 5.2562 g E25/L e ter um volume de 1.141 L. A proteína estava em uma solução tampão de TRIS 25 mM e aproximadamente 200 mM de NaCl e pH ajustados para 6,2. Para iniciar o funcionamento o pool de proteína foi transferido ao recipiente de recirculação, através de um filtro com 0,22 mícrons de poro; a um nível de aproximadamente 200 litros no tanque. Como o pool entrante era maior do que o recipiente de recirculação, o processo UF1 começou no modo de carga de alimentação. Neste modo, o Q-Pool foi adicionado ao recipiente de recirculação aproximadamente na mesma taxa que o filtrado passava através da membrana de TFF ao dreno. Depois de o Q-Pool restante ser transferido ao recipiente de recirculação, o processo UF1 continuou no modo de carga. Durante o UF1 o pool foi concentrado a 30 g E25/L (aproximadamente 200 L). O pool foi então diafiltrado com 8 diavolumes do tampão de diafiltração. Durante a diafiltração o ponto ajustado da temperatura do recipiente de recirculação foi mantido entre 40 e 50°C. A diafiltração foi executada em um volume constante, que foi conseguido combinando a taxa de fluxo da solução protegida que está sendo transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está sendo removido do sistema. No final da diafiltração, o pool foi concentrado adicionalmente na modalidade UF2 a uma concentração final > 170 g E25/L (35L). Esta fase do modo UF2 foi executada também ajustando a elevação da temperatura a 45°C +/- 5°C. Em seguida, mantendo uma queda na pressão de 34,5 a 68,9 kPa (5-10 psig) através do canal de alimentação. Uma amostra foi puxada e uma varredura por spec (spec scan) foi executada para confirmar a concentração antes da recuperação. A concentração desta amostra foi de 219 g E25/L. A tabela 14 sumariza os resultados da produção e do fluxo mensurado durante as fases UF1, DF (DF1+DF2) e UF2. TABELA 14
[00138] Apenas antes da recuperação do produto, uma amostra de 30 mL foi analisada para a detecção e uma titulação da biocarga. O resultado deste teste foi <0,3 CFU/mL. O pool de proteína foi recuperado por uma série das etapas. Primeiro, o produto foi deslocado da membrana em um modo de passagem única usando 5 litros de tampão de DF adicionados à linha do retido. O produto foi filtrado em um tanque de recuperação através de um filtro estéril da classe de 0,22 micra de poro 0,7 m2 (7.4 ft2), seguido por um filtro estéril da classe de 0,22 micra de poro 0,2 m2 (2 ft2). O pool no tanque da recirculação foi bombeado então para o tanque usando uma bomba de alimentação de lóbulo giratória. A solução de proteína residual foi deslocada em seguida para baixo da linha do tanque e da alimentação com um fluxo de gás nitrogênio a 34,5 kPa (5 psig). A fase final foi um fluxo para baixo da unidade da membrana, que constava agora na maior parte de tampão de DF do deslocamento inicial do produto. Esta fase usou também o gás nitrogênio a 34,5 kPa (5 psig) aplicado sobre ponto o mais elevado na linha do retido. O pool recuperado foi primeiramente diluído a aproximadamente 153 g E25/L usando o tampão de DF. Finalmente, o pool foi condicionado na forma final de 20 mM de histidina/ 200 mM de HCl -arginina /0,04% polisorbato 20 /pH 6,0. Os volumes do pool recuperado, do pooldiluído, e do pool condicionado (Q- pool) foram então analisados individualmente para a concentração da proteína. A tabela 15 sumariza os resultados. TABELA 15
[00139] Fig. 17 mostra os parâmetros do fluxo da alimentação (210), temperatura do tanque (220), dP da alimentação (230), TMP (240), taxa de fluxo do filtrado (250) durante as várias fases ou modalidade do processo incluindo UF1 (10), DF1(20), DF2 (25), UF2 (30) e dP baixo (50).
[00140] O exemplo 5 foi repetido com as seguintes exceções. Um sistema de UF para produção em escala foi usado concentrar/ formular um rhuMAb E25 líquido (E25, um anticorpo monoclonal humano recombinante para IgE). Um sistema Millipore Pelicon de Ultrafiltração /Diafiltração foi montado com uma membrana de compósito de celulose regenerada com 0,5 m2 (5,7 sqft), com um tamanho de poro para 30.000 Daltons. Cada sistema consistiu de um suporte para membrana, uma bomba de alimentação giratória Viking S3S, encanamento da recirculação do aço inoxidável 316L de 3,8 cm (1%") e um recipiente de recirculação 250-L. Um tanque de 250 L revestido de aço inoxidável 316L foi usado para o recipiente de recirculação. A taxa de fluxo de alimentação foi ajustada a uma taxa constante de 114 L/min (5 L/min/m2 [0,5L/min/ft2]). Durante toda a operação de pré-uso e pós-uso as o controle de pressão do retido foi ajustado a uma constante de 68,9 kPa (10 psig). Durante as operações da ultrafiltração e diafiltração o sistema usou o esquema do controle Cwall para controlar o fluxo através da membrana. O tampão de diafiltração (20 mM de histidina / 200 mM cloreto de arginina / pH 6,0) foi preparado em um tanque separado. A temperatura deste tampão foi ajustada para 45°C antes do inicio do processo. Isto permitiu o controle exato da temperatura durante todo o processo. O controle de temperatura deste tanque foi conseguido pela modulação da temperatura por alimentação de glicol no revestimento do tanque. O pool de proteína que resultante da etapa da cromatografia em Q-Sepharose foi medido para ser 5,5438 g E25/L e ter um volume de 1082 L. A proteína estava em uma solução tampão de TRIS 25 mM e aproximadamente 200 mM de NaCl e pH ajustados para 6,2. Apenas antes do funcionamento, a temperatura deste pool foi ajustada a 45°C. Para iniciar o funcionamento o pool de proteína foi transferido ao recipiente de recirculação, através de um filtro com 0,22 micra de poro; a um nível de aproximadamente 200 litros no tanque. No recipiente o pool foi agitado por agitador montado no topo e a temperatura foi mantida a (40-50°C). Porque o pool entrante era maior do que o recipiente de recirculação, o processo UF1 começou no modo de carga de alimentação. Neste modo, o Q-Pool foi adicionado ao recipiente de recirculação aproximadamente na mesma taxa que filtrado passava através da membrana TFF para o dreno. Depois de o Q-Pool restante ser transferido ao recipiente de recirculação, o processo UF1 continuou no modo de carga. Durante o UF1 o pool foi concentrado a 30 g E25/L (aproximadamente 200 L). O pool foi então diafiltrado com 8 diavolumes do tampão de diafiltração. Durante a diafiltração o ponto ajustado da temperatura do recipiente de recirculação foi mantido entre 40 e 50°C. A diafiltração foi executada em um volume constante, que foi conseguido combinando a taxa de fluxo da solução protegida que está sendo transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está sendo removido do sistema. No final da diafiltração, o pool foi concentrado adicionalmente na modalidade UF2 a uma concentração final > 170g E25/L (35L). Esta fase do modo UF2 foi executada também ajustando a elevação da temperatura a 45°C +/- 5°C. Em seguida, mantendo uma queda na pressão de 34,5 a 68,9 kPa (5-10 psig) através do canal de alimentação. Uma amostra foi puxada e uma varredura por spec (spec scan) foi executada para confirmar a concentração antes da recuperação. A concentração desta amostra foi de 191 g E25/L e o volume do pool foi de 31,9 L. Um gráfico do processo do parâmetro tempo excedente era comparável aqueles acima observados e sumariados na Fig 17. TABELA 16
[00141] Apenas antes da recuperação do produto, uma amostra de 30 mL foi analisada para a detecção e uma titulação da biocarga. O resultado deste teste foi abaixo do limite de detecção (< 0,13 CFU/mL).
[00142] O pool de proteína foi recuperado por uma série das etapas. Primeiro, o produto foi deslocado da membrana em um modo de passagem única usando 5 litros de tampão de DF adicionados à linha do retido. O produto foi filtrado em um tanque de recuperação através de um filtro estéril da classe de 0,22 micra de poro 0,7 m2 (7.4 ft2), seguido por um filtro estéril da classe de 0,22 micra de poro 0,2 m2 (2 ft2). O pool no tanque da recirculação foi bombeado então para o tanque usando uma bomba de alimentação de lóbulo giratória. A solução de proteína residual foi deslocada em seguida para baixo da linha do tanque e da alimentação com um fluxo de gás nitrogênio a 34,5 kPa (5 psig). A fase final foi um fluxo para baixo da unidade da membrana, que constava agora na maior parte de tampão de DF do deslocamento inicial do produto. Esta fase usou também o gás nitrogênio a 34,5 kPa (5 psig) aplicado sobre ponto o mais elevado na linha do retido. O pool recuperado foi primeiramente diluído a aproximadamente 153 g E25/L usando o tampão de DF. Finalmente, o pool foi condicionado na forma final de 20 mM de histidina/ 200 mM de HCl -arginina /0,04% polisorbato 20 /pH 6,0. Os volumes do pool recuperado, do pooldiluído, e do pool condicionado (Q-pool) foram então analisados individualmente para a concentração da proteína. A tabela 15 sumariza os resultados. TABELA 17
[00143] Amostras E25 a 30 g/l e 150 g/l em histidina e tampões Q foram mantidas em várias temperaturas por 24 horas. As amostras foram submetidas a mensuração por turbidimetria e ensaios SEC. Os resultados da turbidimetria contra a temperatura para E25 a 30 g/l no tampão Q são mostrados na Fig 18. A Fig 19 mostra a quantidade de agregado solúvel de E25 (150 g/l em tampão histidina 50mM, pH 6,0) observado sobre o tempo e a temperatura de 23°C, 40°C, 50°C, 60°C e 70°C. Os quatro intervalos de tempo (0 horas, 4 horas, 7,5 horas, e 24 horas) para cada uma destas temperaturas são mostrados como o conjunto de quatro barras da esquerda para a direita como 1810 e 1910, nas Figs. 18 e 19. A turbidimetria da solução estava essencialmente inalterada após 24 horas a 60°C. Nenhum agregado solúvel de E25 significativo foi observado abaixo de 70°C, que sugere que as amostras do produto eram substancialmente estáveis até pelo menos 60°C e pelo menos 24 horas.
[00144] Amostras de E25 a 30 g/l em tampão de arginina e histidina foram inoculadas com 103 unidades formadoras de colônias por o mL para dois organismos do teste: um Gram positivo (Staphylococcus aureus); e um Gram negativo (Pseudomonas chloror aphis). As amostras foram feitas após 1,5 hora e 6 horas. Os resultados mostrados nos gráficos de barra das Figs. 20 e 21 indicam que estes organismos estão ambos diminuídos com o aumento da temperatura. Os três intervalos de temperatura (25°C, 40°C, e 50°C) para cada intervalo observado de tempo são mostrados como conjunto de três barras da esquerda para a direita como 2010 e 2110, nas Figs. 20 e 21. As inoculações mostradas foram conduzidas em tampão de arginina com concentrações de proteína a 30 g/l.
[00145] Amostras E25 a 10 g/l em arginina 0,2M, 25 mM de tampão histidina, pH 6,0 foram avaliadas para sua influência no fluxo contra a pressão transmembrana (TMP). A Fig 22 mostra que a elevação da temperatura no sistema aumentou também o fluxo do processo durante as operações de UF/DF. Excursões do fluxo a vários volumes de concentrações e em três temperaturas diferentes 23°C (2210), 40°C (2220) e 46°C (2230) foram executados. O coeficiente de transferência de massa e o fluxo de filtrado aumentaram em aproximadamente 2 a aproximadamente 3 vezes fornecendo consideravelmente um tempo de processo reduzido.
[00146] Um sistema piloto de UF para produção em escala foi usado para concentrar/formular o rhuMAb anti-CD20 (2H7, um anticorpo monoclonal humano recombinante). O exemplo 1 foi repetido com as seguintes exceções. Um sistema Millipore Pelicon de Ultrafiltração /Diafiltração foi montado com uma membrana de compósito de celulose regenerada de 1,6 m2 (17,5 sqft), para 30.000 Daltons. Cada sistema consistiu de um suporte para membrana, uma bomba de alimentação giratória Viking S3S, encanamento da recirculação do aço inoxidável 316L de 3,8 cm (17") e um recipiente de recirculação 40-L. Válvulas reguladores de contrapressão foram H.D. Baumann, Inc. A temperatura da alimentação de glicol no revestimento do tanque foi elevada ou diminuída regulado como necessário utilizando um trocador de calor elétrico, uma fonte fria do glicol, ou ambos.
[00147] Durante este funcionamento, a taxa de fluxo da alimentação foi ajustada a uma taxa constante de 8,5 L/min (aproximadamente 5 L/min/m2 [0,5L/min/ft2]). A Fig. 23 expõe que o valor sobre o tempo tende para a taxa de fluxo da alimentação (210) escala de 0 a 20, pH (212) escala de 2 a 12, taxa de fluxo do filtrado (250) escala de 0 a 5, tanque de reciclagem (2320) escala de 0 a 45, dP do retido (2350) escala de 0 a 100 durante as várias fases ou modalidade do processo incluindo UF1 (10), DF1 (20), e UF2 (30).
[00148] Durante as operações de ultrafiltração e diafiltração o sistema usou a pressão constante do retido seguida por um esquema constante de controle de pressão delta de alimentação/retido para controlar o fluxo através da membrana. O tampão de diafiltração (30 mM de acetato do sódio /pH 4,9) foi preparado em um tanque separado. A temperatura deste tampão foi ajustada a 45°C antes do processo para o controle exato da temperatura no processo inteiro. Antes de processar, a solução do armazenamento do sistema (0,1N de NaOH) foi equilibrada em uma única passagem para drenar primeiramente o modo com 10L/m2 (1 L/ft2) de água para injeção (WGI) e então o tampão de diafiltração 10L/m2 (1L/ft2). Após as lavagens o sistema foi equilibrado recirculando 5L/m2 (0,5 L/ft2) de tampão de diafiltração por 10 minutos. O pH da solução recirculada foi verificado para confirmar o equilíbrio.
[00149] O pool de proteína que resultou da etapa de cromatografia em Q-Sepharose precedente foi mensurada para ser 2,31 g 2H7/L e teve um volume de 356 L. A proteína estava em uma solução de 6 mM de HEPES livre de ácido / 19 mM de HEPES sal do sódio e 25 mM de acetato do sódio que tinha sido ajustado a um pH 5,3 com ácido acético 0,5 M. Apenas antes do funcionamento, a temperatura deste pool foi ajustado a 45°C. Para iniciar o funcionamento o pool de proteína foi transferido ao recipiente de recirculação, através de um filtro com 0,22 micra de poro; a um nível de aproximadamente 40 litros no tanque. No recipiente o pool foi agitado por agitador montado no topo e a temperatura foi mantida a 40-50°C.
[00150] Devido ao pool entrante ser maior do que o recipiente de recirculação, o processo UF1 começou no modo de carga de alimentação (vide figura 23). Neste modo, o Q-Pool foi adicionado ao recipiente de recirculação aproximadamente na mesma taxa que filtrado passava através da membrana TFF para o dreno. Depois de o Q-Pool restante ser transferido ao recipiente de recirculação, o processo UF1 continuou no modo de carga. Durante o UF1 o pool foi concentrado a 50 g 2H7/L (aproximadamente 16 L). O pool foi então diafiltrado com 10 diavolumes do tampão de diafiltração. Durante a diafiltração o ponto ajustado da temperatura do recipiente de recirculação foi mantido entre 40 e 50°C. A diafiltração foi executada em um volume constante, que foi conseguido combinando a taxa de fluxo da solução protegida que está sendo transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está sendo removido do sistema. No final da diafiltração, o pool foi concentrado adicionalmente na modalidade UF2 a uma concentração final > 190 g 2H7/L (4,3 L). Ver na Fig 23 a incorporação do controle constante de dP em 345 kPa (50 psig) no fim desta fase. Esta fase foi executada também ajustando a elevação da temperatura a 45°C +/- 5°C. Em seguida, mantendo uma queda na pressão onde a bomba de alimentação foi controlada para manter 138 kPa (20 psig) através do canal de alimentação. Uma amostra foi puxada e uma medida da densidade foi executada para confirmar a concentração antes da recuperação. A concentração desta amostra foi de 189 g 2H7/L. A tabela 16 sumariza os resultados de produção e fluxo. TABELA 18
[00151] O pool de proteína foi recuperado por uma série das etapas. Primeiro, o produto foi deslocado da membrana em um modo de passagem única usando 0,2 litros de tampão de DF adicionados à linha do retido. O produto foi filtrado em um tanque de recuperação através de um filtro estéril da classe de 0,22 micra de poro. O pool no tanque da recirculação foi bombeado então para o tanque usando uma bomba de alimentação de lóbulo giratória. A solução de proteína residual foi deslocada em seguida para baixo da linha do tanque e da alimentação com um fluxo de gás nitrogênio a 34,5 kPa (5 psig). A fase final foi um fluxo para baixo da unidade da membrana, que constava agora na maior parte de tampão de DF do deslocamento inicial do produto. Esta fase usou também o gás nitrogênio a 34,5 kPa (5 psig) aplicado sobre ponto o mais elevado na linha do retido.
[00152] Se necessário, o pool recuperado foi primeiramente diluído a aproximadamente 175 g 2H7/L usando o tampão de diluição (30 mM acetato de sódio, pH 5,3). Finalmente, o pool foi diluído a uma concentração de 150 g 2H7/L e condicionado na forma final de 30 mM de acetato de sódio, 49% trealose, 0.21% de polisorbato, pH 5,3.
[00153] Os volumes do pool recuperado, do pooldiluído e do pool condicionado foram então analisados para a concentração da proteína. A tabela 17 apresenta os resultados. TABELA 19
Nota: Os rendimentos incluem a perda devido à amostragem. O volume e a concentração recuperados do poolincluem a adição do deslocamento do tampão.
[00154] Após o processo, a membrana foi regenerada em uma única passagem de lavagem usando NaOH 0,1N, 10L/m2 (1L/ft2) seguido pela recirculação total 5L/m2 (0,5L/ft2) por 30 minutos. Isto foi seguido pela lavagem por 10L/m2 (1L/ft2) de PW (água pura). Seguido por uma recirculação total da solução de Minncare® por 30 minutos. O sistema foi outra vez foi lavado com 10L/m2 (1L/ft2) de PW e recirculado finalmente por 15 minutos com NaOH 0,1N e armazenado.
[00155] Um sistema piloto de UF para produção em escala foi usado para concentrar/formular o rhuMAb anti-CD20 (2H7) para o uso em um estudo clínico de fase I em humanos em uma facilidade de manufatura GMP. O exemplo 10 foi repetido com as seguintes exceções.
[00156] O pool de proteína que resultou da etapa de cromatografia em Q-Sepharose precedente foi mensurada para ser 3.729 g 2H7/L e teve um volume de 262 L. A proteína estava em uma solução de 6 mM de HEPES livre de ácido / 19 mM de HEPES sal do sódio e 25 mM de acetato do sódio que tinha sido ajustado a um pH 5,3 com ácido acético 0,5 M. Apenas antes do funcionamento, a temperatura deste pool foi ajustado a 45°C. Para iniciar o funcionamento o pool de proteína foi transferido ao recipiente de recirculação, através de um filtro com 0,22 micra de poro; a um nível de aproximadamente 40 litros no tanque. No recipiente o pool foi agitado por agitador montado no topo e a temperatura foi mantida a 40-50°C.
[00157] Durante o UF1 o pool foi concentrado a 50 g 2H7/L (aproximadamente 20 L). A Fig. 24 demonstra que a tendência de valor sobre a hora para o tanque de reciclagem (210) escala de -0.713963 295.989, dP do retido (2420), escala de -0.237899 a 98.6629, taxa de fluxo da alimentação (250) escala de -0.356981 a 147.994 e taxa de fluxo do filtrado (2450) escala de -0.118994 a 49.3315 durante o processo. O pool foi então diafiltrado com 10 diavolumes do tampão de diafiltração. Durante a diafiltração o ponto ajustado da temperatura do recipiente de recirculação foi mantido entre 40 e 50°C. A diafiltração foi executada em um volume constante, que foi conseguido combinando a taxa de fluxo da solução protegida que está sendo transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está sendo removido do sistema. No final da diafiltração, o pool foi concentrado adicionalmente na modalidade UF2 a uma concentração final > 190 g 2H7/L (5,25 L). Ver na Fig 24 a incorporação do controle constante de dP em 276 kPa (40 psig) no fim desta fase. Esta fase foi executada também ajustando a elevação da temperatura a 45°C +/- 5°C. Em seguida, mantendo uma queda na pressão onde a bomba de alimentação foi controlada para manter 138 kPa (20 psig) através do canal de alimentação. Uma amostra foi puxada e uma medida da densidade foi executada para confirmar a concentração antes da recuperação. A concentração desta amostra foi de 194 g 2H7/L. A tabela 18 sumariza os resultados de produção e fluxo. TABELA 20
[00158] Apenas antes da recuperação do produto, uma amostra de 30 mL foi analisada para a detecção e uma titulação da biocarga. O resultado deste teste foi abaixo do limite de detecção (< 0,13 CFU/mL). O pool de proteína foi recuperado por uma série das etapas do exemplo 10. Os volumes do pool recuperado, do pool diluído, e do pool condicionado foram então analisados para a concentração da proteína. A tabela 19 apresenta os resultados. A membrana foi regenerada como no exemplo 10. TABELA 21
[00159] O exemplo 11 foi repetido com as seguintes exceções. O pool de proteína que resultou da etapa de cromatografia em Q-Sepharose precedente foi mensurada para ser 5,106 g 2H7/L e teve um volume de 196 L. A proteína estava em uma solução de 6 mM de HEPES livre de ácido / 19 mM de HEPES sal do sódio e 25 mM de acetato do sódio que tinha sido ajustado a um pH 5,3 com ácido acético 0,5 M. Apenas antes do funcionamento, a temperatura deste pool foi ajustado a 45°C. Para iniciar o funcionamento o pool de proteína foi transferido ao recipiente de recirculação, através de um filtro com 0,22 micra de poro; a um nível de aproximadamente 40 litros no tanque. No recipiente o pool foi agitado por agitador montado no topo e a temperatura foi mantida a 40-50°C.
[00160] Durante o UF1 o pool foi concentrado a 50 g 2H7/L (aproximadamente 20 L). A Fig. 24 demonstra que a tendência de valor sobre a hora para o tanque de reciclagem (210) escala de 0 a 150, dP do retido (2520), escala de 0 a 100, taxa de fluxo da alimentação (250) escala de 0 a 100 e taxa de fluxo do filtrado (2550) escala de 0 a 50 durante o processo. O pool foi então diafiltrado com 10 diavolumes do tampão de diafiltração. Durante a diafiltração o ponto ajustado da temperatura do recipiente de recirculação foi mantido entre 40 e 50°C. A diafiltração foi executada em um volume constante, que foi conseguido combinando a taxa de fluxo da solução protegida que está sendo transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está sendo removido do sistema. No final da diafiltração, o pool foi concentrado adicionalmente na modalidade UF2 a uma concentração final > 190 g 2H7/L (5.26 L) outra vez utilizando o controle de dP constante no final desta fase (vide, figura 25). Esta fase foi executada também ajustando a elevação da temperatura a 45°C +/- 5°C. Em seguida, mantendo uma queda na pressão onde a bomba de alimentação foi controlada para manter 138 kPa (20 psig) através do canal de alimentação. Uma amostra foi puxada e uma medida da densidade foi executada para confirmar a concentração antes da recuperação. A concentração desta amostra foi de 191 g 2H7/L. A tabela 20 sumariza os resultados de produção e fluxo. TABELA 22
[00161] Apenas antes da recuperação do produto, uma amostra de 30 mL foi analisada para a detecção e uma titulação da biocarga. O resultado deste teste foi abaixo do limite de detecção (< 0,13 CFU/mL). O pool de proteína foi recuperado por uma série das etapas do exemplo 11. Os volumes do pool recuperado, do pool diluído e do pool condicionado foram então analisados para a concentração da proteína. A tabela 21 apresenta os resultados. A membrana foi regenerada como no exemplo 11. TABELA 23
[00162] Todas as publicações, patentes e documentos de patente são incorporados no presente pedido pela referência em sua totalidade, como se incorporado individualmente pela referência. A presente invenção foi descrita em referência às várias incorporações e técnicas específicas e preferidas. Entretanto, deve-se compreender que muitas variações e modificações podem ser feitas quando permanecem dentro do espírito e do escopo da invenção.
Claims (46)
1. PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES DE ANTICORPO MONOCLONAL ALTAMENTE CONCENTRADAS, caracterizado por compreender: (a) uma primeira ultrafiltração de uma primeira preparação de anticorpo que tem uma concentração de anticorpo de 0,1 a 10 gramas por litro para fornecer uma segunda preparação de anticorpo que compreende um retido da primeira ultrafiltração, em que a segunda preparação de anticorpo tem uma concentração de anticorpo de 10 a 50 gramas por litro; (b) uma diafiltração da segunda preparação de anticorpo para fornecer uma preparação de anticorpo intermediária diafiltrada que compreende um retido da diafiltração, em que, na diafiltração, há troca do primeiro tampão por um segundo tampão; e (c) uma segunda ultrafiltração da preparação de anticorpo intermediária diafiltrada para fornecer uma terceira preparação de anticorpo que compreende um retido da segunda ultrafiltração, em que a terceira preparação de anticorpo tem uma concentração de anticorpo de 150 a 200 gramas por litro; em que a primeira ultrafiltração, a segunda ultrafiltração e a diafiltração são realizadas em temperaturas de 35°C a 50°C, em que o anticorpo é rhuMAb E25.
2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela primeira ultrafiltração, a segunda ultrafiltração e a diafiltração serem executadas a 40°C a 50°C.
3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por uma ou mais dentre a primeira ultrafiltração, a segunda ultrafiltração e a diafiltração serem executadas a 45°C.
4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela primeira preparação de anticorpo ter uma concentração de anticorpo de 1 a 5 gramas por litro.
5. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela segunda preparação de anticorpo ter uma concentração de anticorpo de 20 a 50 gramas por litro.
6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela segunda preparação de anticorpo ter uma concentração de anticorpo de 20 a 40 gramas por litro.
7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela terceira preparação de anticorpo ter uma concentração de anticorpo de 170 a 200 gramas por litro.
8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela preparação de anticorpo intermediária diafiltrada e pela terceira preparação de anticorpo compreenderem o retido do ultrafiltro.
9. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela preparação de anticorpo intermediária ter uma concentração de anticorpo de 25 a 35 gramas por litro e pela terceira preparação de anticorpo ter uma concentração de anticorpo de 170 a 200 gramas por litro.
10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela primeira ultrafiltração concentrar a primeira preparação de anticorpo para fornecer a segunda preparação de anticorpo que possui uma concentração de anticorpo de 30 gramas por litro e pela segunda ultrafiltração concentrar a preparação de anticorpo intermediária para fornecer uma terceira preparação de anticorpo que possui uma concentração de anticorpo de 170 a 200 gramas por litro.
11. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo processo ser realizado dentro de 1 a 10 horas.
12. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo processo ser realizado dentro de 2 a 5 horas.
13. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo processo ser realizado dentro de 3 horas.
14. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pela primeira e pela segunda ultrafiltrações serem realizadas com uma membrana de ultrafiltro que tem o tamanho nominal do poro de 5 a 50 kilo Daltons.
15. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela primeira e pela segunda ultrafiltrações serem realizadas com uma membrana de ultrafiltro que tem o tamanho nominal do poro de 10 a 30 kilo Daltons.
16. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pela primeira preparação de anticorpo conter um anticorpo que tem um peso molecular aparente de 100 a 200 kilo Daltons.
17. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela primeira preparação de anticorpo conter um anticorpo que tem um peso molecular aparente de 150 kilo Daltons.
18. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelas etapas de filtração (a), (b) e (c) utilizarem uma membrana de ultrafiltração.
19. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pela primeira e pela segunda ultrafiltrações serem realizadas com a mesma membrana de ultrafiltro.
20. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pela membrana de ultrafiltração utilizada na etapa de filtração (a) ser utilizada na etapa (b) e na etapa (c).
21. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pela primeira ultrafiltração, pela segunda ultrafiltração e pela diafiltração serem realizadas com filtração com fluxo tangencial através de uma membrana de ultrafiltro.
22. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pela primeira ultrafiltração, pela segunda ultrafiltração e pela diafiltração serem realizadas com filtração com fluxo tangencial através da mesma membrana de ultrafiltro.
23. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pela primeira e pela segunda ultrafiltração serem realizadas com uma membrana de ultrafiltro de compósito de celulose regenerada.
24. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pela diafiltração realizar uma troca de tampão em volume constante, concentração constante, ou ambos.
25. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pela diafiltração realizar uma troca de tampão de 5 a 15 vezes o volume.
26. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela diafiltração realizar troca de tampão de 8 vezes o volume.
27. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pela etapa (a) compreender mais de uma etapa de diafiltração.
28. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por uma primeira etapa de diafiltração realizar troca de tampão de 4 vezes o volume e uma segunda etapa de diafiltração realizar troca de tampão de 4 vezes o volume.
29. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pela diafiltração trocar um tampão que possui uma composição que difere daquela da etapa (a).
30. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo primeiro tampão compreender uma mistura de cloreto de sódio aquoso e de um tampão TRIS.
31. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 30, caracterizado pelo segundo tampão compreender uma mistura do cloreto de histidina aquoso e cloreto de arginina.
32. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo rendimento da terceira preparação de anticorpo ser maior do que 70% em peso baseado no peso dos anticorpos na primeira preparação de anticorpo.
33. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo rendimento da terceira preparação de anticorpo ser de 80 a 100% em peso baseado no peso dos anticorpos na primeira preparação de anticorpo.
34. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo rendimento da terceira preparação de anticorpo ser maior do que 98% em peso baseado no peso dos anticorpos na primeira preparação de anticorpo.
35. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pela primeira ultrafiltração ter uma taxa de recirculação de 5 L/min/m2 a 50 L/min/m2 (0,5 L/min/ft2 a 5 L/min/ft2).
36. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pela ultrafiltração e pela diafiltração serem realizadas com uma pressão de transmembrana de 34,5 kPa (5 p.s.i.) a 345 kPa (50 p.s.i.).
37. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pela ultrafiltração e pela diafiltração serem realizadas com uma pressão transmembrana de 68,9 kPa (10 p.s.i) a 344,7 kPa (50 p.s.i.).
38. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo rendimento da etapa (c) ser de 800 g/m2/hr (80 g/ft2/hr), 1200 g/m2/hr (120 g/ft2/hr), 1350 g/m2/hr (135 g/ft2/hr), 1450 g/m2/hr (145 g/ft2/hr), 1750 g/m2/hr (175 g/ft2/hr), 1800 g/m2/hr (180 g/ft2/hr), 2650 g/m2/hr (265 g/ft2/hr), 2850 g/m2/hr (285 g/ft2/hr), ou 2900 g/m2/hr (290 g/ft2/hr).
39. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelos níveis de agregados contaminantes na composição de anticorpo altamente concentrada serem de menos de 5% em peso.
40. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado pelos níveis de agregados contaminantes na composição de anticorpo altamente concentrada serem de menos de 2% em peso.
41. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado por ser fornecida uma composição de anticorpo altamente concentrada com uma biocarga detectável menor do que 100 CFU/mL.
42. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pela terceira preparação de anticorpo ter uma biocarga detectável de 1,8 CFU/ml.
43. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pela terceira preparação de anticorpo ter uma biocarga detectável de menos de 0,13 CFU/ml.
44. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pela primeira preparação de anticorpo ter sido submetida a um processo de purificação anterior à etapa (a).
45. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo anticorpo contido na primeira preparação de anticorpo ser 99,8% puro antes da etapa (a).
46. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizado pela terceira preparação de anticorpo ser diluída após a segunda ultrafiltração para uma formulação final de 150 g/L em 0,02 M de histidina, 0,2 M de arginina-HCL, 0,04% de polissorbato-20, pH 6.
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