KR20210044821A - 개선된 단백질 회수 - Google Patents

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아메야 우메쉬 보르완카르
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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

본 개시내용은 부적절한 플러싱으로 인한 수율 손실을 최소화하고 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석을 방지하거나 감소시키는 회수 플러싱 기술을 사용하는 신규 플러싱 방법을 제공한다.

Description

개선된 단백질 회수
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 62/718,864의 우선권 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
다양한 치료 단백질의 피하 전달은, 특히 많은 양의 약물을 투여하는 것을 필요로 하는 모노클로날 항체와 같은 특정 단백질 하위유형에 대해서 빠르게 성장하고 있는 분야이다. 이들 분자를 적절하게 제제화하기 위해, 100 g/L 초과의 농도가 요구된다. 이들 분자를 이들 고농도로 제조하는 것 및 접선 흐름 여과 (TFF) 또는 다른 여과 방법을 사용하여 고농축 생성물을 규모상 대규모로 회수하는 것 둘 다는 어려운 것으로 알려져 있다.
접선 흐름 여과 (TFF)는 생체분자의 분리 및 정제를 위한 신속하고 효율적인 방법이다. 이는 광범위한 생물학적 분야, 예컨대 면역학, 단백질 화학, 분자 생물학, 생화학, 및 미생물학에 적용될 수 있다. TFF를 사용하여 10 mL로부터 수천 리터의 부피 범위의 샘플 용액을 농축 및 탈염시킬 수 있고, 이를 사용하여 대형 생체분자를 소형 생체분자로부터 분획화할 수 있고, 세포 현탁액을 수거할 수 있고, 발효 브로쓰 및 세포 용해물을 정화시킬 수 있다. 막 여과는 생명과학 실험실에서 널리 사용되는 분리 기술이다. 막 다공성에 따라, 이는 마이크로여과 또는 한외여과 공정으로 분류될 수 있다. 일반적으로 세공 크기가 0.001 내지 0.1 μm인 한외여과 막은 용해된 분자 (단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 및 다른 생체분자)를 농축 및 탈염시키고, 완충제를 교환하고, 거시적으로 분획화하는데 사용된다. 한외여과 막은 전형적으로 세공 크기가 아닌 분자량 컷오프 (MWCO)에 의해 분류된다.
약물 물질 단계에서 의도되는 높은 단백질 농도 (>150 mg/mL)에서의 고점도 한외여과 동안, 표적 농도를 달성하는 적재량은 한외여과/투석여과 (UF/DF) 공정에 따르는 것으로 널리 공지되어 있다. 제조 시 직면하게 되는 하나의 문제는, 수집 용기에의 불량한 회수 및 그에 따른 불량한 수율로 이어지는, 제조 배관 또는 다른 "홀드-업" 구역에서의 단백질의 체류이다. 따라서, 전형적인 실무는 총 수율을 증가시키기 위해 잔류 단백질을 수집 용기 내로 밀어 넣는 회수 플러싱을 사용해왔다. 플러싱 거동이 이상적인 플러그 유동 조건을 따르는 경우, 플러싱 동안 희석은 없을 것이고, 대신에 플러싱 완충제가 단백질을 수집 용기 내로 간단히 밀어 넣고 "홀드-업" 구역 내의 그의 자리를 차지할 것이고, 희석 없이 "홀드-업" 구역 내에 포획된 단백질의 회수는 문제가 되지 않을 것이다. 그러나, 실제의 조건 하에서, 회수 플러싱 완충제와 수집 용기에 밀어 넣고자 하는 단백질 사이에는 희석이 일어나기 때문에 회수 플러싱은 생성물의 희석을 유발한다. 따라서, 회수 플러싱 동안 표적 생성물의 희석을 감소시키거나 방지할 필요가 있다.
본 개시내용은 여과 후 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 완충제를 시간당 제곱 미터당 100 리터 (LMH) 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시킴으로써, 300 LMH의 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질의 희석과 비교하여 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 것에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 여과 후 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 농도를 개선시키거나 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 플러싱 완충제를 시간당 제곱 미터당 100 리터 (LMH) 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시킴으로써, 300 LMH의 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질 농도와 비교하여 표적 단백질 농도를 개선시키는 것에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 회수 플러싱에서 유동의 레이놀즈 수 ("Re")는 2000 미만, 1500 미만, 1000 미만, 900 미만, 800 미만, 700 미만, 600 미만, 500 미만, 400 미만, 300 미만, 200 미만, 100 미만, 90 미만, 80 미만, 70 미만, 60 미만, 50 미만, 40 미만, 30 미만, 20 미만, 10 미만, 5 미만, 4 미만, 또는 3 미만이고, 여기서 Re는 하기 식:
Re = Dυρ/μ
로 계산되며, 여기서 D는 비-원통형 유동 채널 기하구조의 경우의 채널의 직경 (m) 또는 등가 직경이고, υ는 평균 속도 (m/s) (Q/Ac)이고, ρ는 밀도 (kg/m3)이고, μ는 점도 (Pa·s)이다.
일부 실시양태에서, 회수 플러싱에서 유동의 레이놀즈 수 (Re)는 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 45, 약 1 내지 약 40, 약 1 내지 약 35, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 40, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 6, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 6, 약 2 내지 약 5, 약 3 내지 약 10, 또는 약 4 내지 약 6이다.
일부 실시양태에서, 회수 플러싱에서 유동의 레이놀즈 수 (Re)는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 또는 약 30이다. 일부 실시양태에서 회수 플러싱에서 유동의 Re는 약 3.8이다.
일부 실시양태에서, 플러싱 유량은 약 5 LMH 내지 약 100 LMH, 약 10 LMH 내지 약 100 LMH, 약 10 LMH 내지 약 90 LMH, 약 10 LMH 내지 약 80 LMH, 약 10 LMH 내지 약 70 LMH, 약 10 LMH 내지 약 60 LMH, 약 10 LMH 내지 약 50 LMH, 약 10 LMH 내지 약 40 LMH, 약 10 LMH 내지 약 30 LMH, 약 30 LMH 내지 약 50 LMH, 약 20 LMH 내지 약 100 LMH, 약 20 LMH 내지 약 90 LMH, 약 20 LMH 내지 약 80 LMH, 약 20 LMH 내지 약 70 LMH, 약 20 LMH 내지 약 60 LMH, 약 20 LMH 내지 약 50 LMH, 약 20 LMH 내지 약 40 LMH, 약 30 LMH 내지 약 100 LMH, 약 30 LMH 내지 약 90 LMH, 약 30 LMH 내지 약 80 LMH, 약 30 LMH 내지 약 70 LMH, 약 30 LMH 내지 약 60 LMH, 약 30 LMH 내지 약 50 LMH, 약 30 LMH 내지 약 40 LMH, 또는 약 20 LMH 내지 약 30 LMH이다.
일부 실시양태에서, 플러싱 유량은 적어도 약 10 LMH, 적어도 약 20 LMH, 적어도 약 30 LMH, 적어도 약 40 LMH, 적어도 약 50 LMH, 적어도 약 60 LMH, 적어도 약 70 LMH, 적어도 약 80 LMH, 적어도 약 90 LMH, 또는 적어도 약 100 LMH이다. 일부 실시양태에서, 플러싱 유량은 약 30 LMH이다.
본 방법은 약물 물질 단계에서 의도되는 높은 단백질 농도 (>150 mg/mL)에서의 고점도 한외여과 동안 특히 효과적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질의 점도는 적어도 약 1 센티포아즈 (cP), 적어도 약 2 cP, 적어도 약 3 cP, 적어도 약 4 cP, 적어도 약 5 cP, 적어도 약 6 cP, 적어도 약 7 cP, 적어도 약 8 cP, 적어도 약 9 cP, 적어도 약 10 cP, 적어도 약 11 cP, 적어도 약 12 cP, 적어도 약 13 cP, 적어도 약 14 cP, 적어도 약 15 cP, 적어도 약 16 cP, 적어도 약 17 cP, 적어도 약 18 cP, 적어도 약 19 cP, 적어도 약 20 cP, 적어도 약 21 cP, 적어도 약 22 cP, 적어도 약 23 cP, 적어도 약 24 cP, 적어도 약 25 cP, 적어도 약 26 cP, 적어도 약 27 cP, 적어도 약 28 cP, 적어도 약 29 cP, 또는 적어도 약 30 cP이다.
일부 실시양태에서, 표적 단백질의 점도는 높고, 적어도 약 20 센티포아즈 (cP), 적어도 약 21 cP, 적어도 약 22 cP, 적어도 약 23 cP, 적어도 약 24 cP, 적어도 약 25 cP, 적어도 약 26 cP, 적어도 약 27 cP, 적어도 약 28 cP, 적어도 약 29 cP, 적어도 약 30 cP, 적어도 약 31 cP, 적어도 약 32 cP, 적어도 약 33 cP, 적어도 약 34 cP, 적어도 약 35 cP, 적어도 약 36 cP, 적어도 약 37 cP, 적어도 약 38 cP, 적어도 약 39 cP, 적어도 약 40 cP, 적어도 약 41 cP, 적어도 약 42 cP, 적어도 약 43 cP, 적어도 약 44 cP, 적어도 약 45 cP, 적어도 약 46 cP, 적어도 약 47 cP, 적어도 약 48 cP, 적어도 약 49 cP, 적어도 약 50 cP, 적어도 약 51 cP, 적어도 약 52 cP, 적어도 약 53 cP, 적어도 약 54 cP, 적어도 약 55 cP, 적어도 약 56 cP, 적어도 약 57 cP, 적어도 약 58 cP, 적어도 약 59 cP, 적어도 약 60 cP, 적어도 약 61 cP, 적어도 약 62 cP, 적어도 약 63 cP, 적어도 약 64 cP, 적어도 약 65 cP, 적어도 약 66 cP, 적어도 약 67 cP, 적어도 약 68 cP, 적어도 약 69 cP, 적어도 약 70 cP, 적어도 약 71 cP, 적어도 약 72 cP, 적어도 약 73 cP, 적어도 약 74 cP, 적어도 약 75 cP, 적어도 약 76 cP, 적어도 약 77 cP, 적어도 약 78 cP, 적어도 약 79 cP, 적어도 약 80 cP, 적어도 약 81 cP, 적어도 약 82 cP, 적어도 약 83 cP, 적어도 약 84 cP, 적어도 약 85 cP, 적어도 약 86 cP, 적어도 약 87 cP, 적어도 약 88 cP, 적어도 약 89 cP, 적어도 약 90 cP, 적어도 약 91 cP, 적어도 약 92 cP, 적어도 약 93 cP, 적어도 약 94 cP, 적어도 약 95 cP, 적어도 약 96 cP, 적어도 약 97 cP, 적어도 약 98 cP, 적어도 약 99 cP, 또는 적어도 약 100 cP이다.
일부 실시양태에서, 표적 단백질의 점도는 약 2 cP 내지 약 10 cP, 약 3cP 내지 약 10 cP, 약 1 cP 내지 약 9 cP, 약 2 cP 내지 약 8 cP, 약 2 cP 내지 약 7 cP, 약 2 cP 내지 약 6 cP, 약 3 cP 내지 약 6 cP, 약 4 cP 내지 약 5 cP, 또는 약 2 cP 내지 약 5 cP이다.
일부 실시양태에서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 농도는 여과 전 적어도 약 100 g/L, 적어도 약 110 g/L, 적어도 약 120 g/L, 적어도 약 130 g/L, 적어도 약 140 g/L, 적어도 약 150 g/L, 적어도 약 160 g/L, 적어도 약 170 g/L, 적어도 약 180 g/L, 적어도 약 190 g/L, 적어도 약 200 g/L, 적어도 약 210 g/L, 적어도 약 220 g/L, 적어도 약 230 g/L, 적어도 약 240 g/L, 적어도 약 250 g/L, 적어도 약 260 g/L, 적어도 약 270 g/L, 적어도 약 280 g/L, 적어도 약 290 g/L, 또는 적어도 약 300 g/L이다.
일부 실시양태에서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 농도는 약 100 g/L 내지 약 300 g/L, 약 110 g/L 내지 약 250 g/L, 약 120 g/L 내지 약 240 g/L, 약 150 g/L 내지 약 250 g/L, 약 130 g/L 내지 약 260 g/L, 약 140 g/L 내지 약 260 g/L, 약 160 g/L 내지 약 220 g/L, 또는 약 170 g/L 내지 약 230 g/L이다.
일부 실시양태에서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 농도는 약 90 g/L, 약 100 g/L, 약 110 g/L, 약 120 g/L, 약 130 g/L, 약 140 g/L, 약 150 g/L, 약 160 g/L, 약 170 g/L, 약 180 g/L, 약 190 g/L, 약 200 g/L, 약 210 g/L, 약 220 g/L, 약 230 g/L, 약 240 g/L, 약 250 g/L, 약 260 g/L, 약 270 g/L, 약 280 g/L, 약 290 g/L, 또는 약 300 g/L이다.
따라서, 본 방법은 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석을 방지하거나 감소시킴으로써 회수 플러싱 후의 단백질 수율 증가를 발생시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 수율은, (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 완충제를 시간당 제곱 미터당 100 리터 (LMH) 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키는 것으로 이루어진 회수 플러싱 공정 전의 표적 단백질의 농도와 비교하여 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%이다.
일부 실시양태에서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 수율은 300 LMH의 유량으로의 회수 플러싱 후에 수득되는 표적 단백질의 수율과 비교하여 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 또는 적어도 20% 증가된다. 일부 실시양태에서, (i)에서의 통과는 (ii)에서의 플러싱 유량보다 더 높은 공급물 유량으로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 공급물 유량은 적어도 200 LMH, 적어도 210 LMH, 적어도 220 LMH, 적어도 230 LMH, 적어도 240 LMH, 적어도 250 LMH, 적어도 260 LMH, 적어도 270 LMH, 적어도 280 LMH, 적어도 290 LMH, 적어도 300 LMH, 적어도 310 LMH, 적어도 320 LMH, 적어도 330 LMH, 적어도 340 LMH, 적어도 350 LMH, 적어도 360 LMH, 적어도 370 LMH, 적어도 380 LMH, 적어도 390 LMH, 적어도 400 LMH, 적어도 410 LMH, 적어도 420 LMH, 적어도 430 LMH, 적어도 440 LMH, 적어도 450 LMH, 적어도 460 LMH, 적어도 470 LMH, 적어도 480 LMH, 적어도 490 LMH, 또는 적어도 500 LMH이다.
일부 실시양태에서, 공급물 유량은 200 LMH 내지 500 LMH, 200 LMH 내지 450 LMH, 250 LMH 내지 450 LMH, 450 LMH, 300 LMH 내지 450 LMH, 300 LMH 내지 400 LMH, 또는 300 LMH 내지 350 LMH이다. 일부 실시양태에서, 공급물 유량은 약 300 LMH이다.
일부 실시양태에서, 여과 조립체는 막을 포함한다. 일부 실시양태에서, 여과 조립체에 유용한 여과 막은 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리아릴술폰, 재생 셀룰로스, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 셀룰로스 아세테이트, 폴리아크릴로니트릴, 비닐 공중합체, 폴리아미드 (예컨대 "나일론 6" 또는 나일론 66") 폴리카르보네이트, PFA, 또는 그의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 플러싱 완충제는 유기 또는 무기 산 또는 그의 염을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유기 또는 무기 산은 시트레이트 (예를 들어, 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물 등), 숙시네이트 (예를 들어, 숙신산-숙신산일나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산이나트륨 혼합물 등), 타르트레이트 (예를 들어, 타르타르산-타르타르산나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 (예를 들어, 푸마르산-푸마르산일나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨 혼합물, 푸마르산일나트륨-푸마르산이나트륨 혼합물 등), 글루코네이트 (예를 들어, 글루콘산-글루콘산나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산칼륨 혼합물 등), 옥살레이트 (예를 들어, 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 락테이트 (예를 들어, 락트산-락트산나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산칼륨 혼합물 등), 아세테이트 (예를 들어, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등), 트리메틸아민 염 (예를 들어, 트리스), 포스페이트, 또는 히스티딘이다. 일부 실시양태에서, 플러싱 완충제는 히스티딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 플러싱 완충제는 당을 포함한다. 일부 실시양태에서, 당은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 크실리톨, 에리트리톨, 락토스, 글루코스, 분말화 당, 또는 풀루란이다. 일부 실시양태에서, 플러싱 완충제는 20mM 히스티딘 및 250 mM 수크로스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 여과 완충제는 (i) 동안 사용된다. 일부 실시양태에서, 여과 완충제는 플러싱 완충제와 동일하다. 다른 실시양태에서, 여과 완충제는 플러싱 완충제와 상이하다. 일부 실시양태에서, 여과 완충제는 유기 및 무기 산 또는 그의 염을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유기 또는 무기 산은 시트레이트 (예를 들어, 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물 등), 숙시네이트 (예를 들어, 숙신산-숙신산일나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산이나트륨 혼합물 등), 타르트레이트 (예를 들어, 타르타르산-타르타르산나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 (예를 들어, 푸마르산-푸마르산일나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨 혼합물, 푸마르산일나트륨-푸마르산이나트륨 혼합물 등), 글루코네이트 (예를 들어, 글루콘산-글루콘산나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산칼륨 혼합물 등), 옥살레이트 (예를 들어, 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 락테이트 (예를 들어, 락트산-락트산나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산칼륨 혼합물 등), 아세테이트 (예를 들어, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등), 트리메틸아민 염 (예를 들어, 트리스), 포스페이트, 또는 히스티딘이다.
일부 실시양태에서, 여과 완충제는 당을 포함한다. 일부 실시양태에서, 당은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 크실리톨, 에리트리톨, 락토스, 글루코스, 분말화 당, 또는 풀루란이다. 일부 실시양태에서, 플러싱 완충제 및/또는 여과 완충제는 pH 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 또는 약 9.5이다.
일부 실시양태에서, 샘플은 순수한 단백질 샘플, 정화된 벌크 단백질 샘플, 세포 배양 샘플, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 샘플은 포유동물 세포를 포함하는 세포 배양 배지로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HEK293 세포, 마우스 골수종 (NS0), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK), 원숭이 신장 섬유모세포 (COS-7), 마딘-다르비 소 신장 세포 (MDBK) 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 표적 단백질은 항체 또는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgM, IgA, IgE, IgD, 및 IgG로부터 선택된 이소형이다. 일부 실시양태에서, IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-GITR 항체, 항-CXCR4 항체, 항-CD73 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, 항-LAG3 항체, 항-CSF1R 항체, 또는 항-IL8 항체이다.
일부 실시양태에서, 표적 단백질은 효소, 호르몬, 시토카인, 세포 표면 수용체, 프로테아제, 시토카인 수용체, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 이종 모이어티에 융합된다. 일부 실시양태에서, 이종 모이어티는 반감기 연장 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 Fc를 포함한다.
도 1은 크기 16의 공급물 배관 (176 cm2 막 면적)을 사용한 규모-축소 공정으로부터 생성된 데이터를 보여준다. 회수 플러싱 전에 TFF 체류물을 표적 농도 초과로 농축시킨 후, 다수의 상이한 회수 플러싱 유량을 시험하였다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 보다 높은 회수 플러싱 유량은 농축된 TFF 체류물의 보다 큰 희석으로 이어진다.
도 2는 다양한 단면적을 갖는 배관을 사용한 계산된 레이놀즈 수의 비교를 보여준다. 단면적은 표 1에 나타낸다.
도 3은 다양한 단면적의 튜브를 통해 고정된 속도로 이동하는 유체의 점도와 비교하여 계산된 레이놀즈 수의 비교를 보여준다.
본 개시내용은 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 고도로 효과적인 접근법을 제공한다. 구체적으로, 접근법은 계산된 레이놀즈 수 (Re)가 높을 때 발생하는 난류의 희석 효과를 해결하기 위해 보다 느린 유량을 사용한다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 유용한 계산된 Re는 2000 미만이다.
작업 실시예에 제시된 바와 같이, 접근법은 회수 플러싱 유량에 의해 유발되는 회수 플러싱 동안의 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는데 효과적이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 30 LMH의 회수 플러싱 유량을 사용하여 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지함으로써, 100 LMH의 회수 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질의 희석과 비교하여 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 방법을 제공한다. 이러한 시스템의 사용은 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석이 매우 최소한이 되게 하며, 이는 회수 플러싱의 부재로 인한, 또는 보다 빠른 회수 플러싱 유량으로 인한 과도한 희석으로 인한 생성물 수율 또는 농도의 손실 없이 보다 높은 최종 표적 농도에 도달되게 한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 단백질 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 혼합물로부터 관심 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 가능한 오염물은 숙주 세포 단백질 (HCP), 고분자량 종 (HMW), 저분자량 종 (LMW), 또는 DNA를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 혼합물은 수거된 세포 배양 유체, 세포 배양 상청액, 세포 용해물, 및 정화된 벌크로부터 유래된다.
I. 용어
본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본원에서 달리 명백하게 제공된 경우를 제외하고는, 본 출원에 사용된 각각의 하기 용어는 하기에 제시된 의미를 가질 것이다. 추가의 정의는 본 출원 전반에 걸쳐 제시된다.
본원에 사용된 용어 "및/또는"은 2개의 명시된 특색 또는 성분 각각을 함께 또는 따로 구체적으로 개시하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 각각의 하기 측면을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
측면이 언어 "포함하는"을 사용하여 본원에 기재된 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 통상의 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어에 대한 일반 사전을 제공한다.
단위, 접두어 및 기호는 시스템 인터내셔날 드 유니테스 (SI) 허용 형태로 나타내어진다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 본원에 제공된 표제는 본 개시내용의 다양한 측면을 제한하는 것이 아니며, 이는 본 명세서를 전체로서 참조할 수 있다. 따라서, 바로 하기에 정의되는 용어는 본 명세서를 그 전문을 참조하여 보다 완전하게 정의된다.
대안적 사용 (예를 들어, "또는")은 대안 중 하나, 둘 다, 또는 그의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 단수 형태는 임의의 언급되거나 열거된 성분 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 부분적으로 값 또는 조성이 측정 또는 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야에서의 실시에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 내에 있음을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 최대 20%의 범위를 의미할 수 있다. 또한, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어는 값의 최대 한 자릿수 또는 최대 5-배를 의미할 수 있다. 특정한 값 또는 조성이 본 출원 및 청구범위에 제공되는 경우에, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 그러한 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.
본원에 기재된 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는, 달리 나타내지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우에, 그의 분율 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "관심 단백질"은 그의 가장 넓은 의미로, 정제를 목적으로 하는 혼합물 중에 존재하는 임의의 단백질 (천연 또는 재조합)을 포함하는 것으로 사용된다. 이러한 관심 단백질은, 비제한적으로, 효소, 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 이뮤노글로불린 (예를 들어, 항체), 및/또는 임의의 융합 단백질을 포함한다.
용어 "정화"는 미립자를 제거하는 공정을 지칭한다. 정화는 정제 공정 동안 후속 크로마토그래피 (예를 들어, AEX 또는 CEX)에 대한 적재량을 낮출 수 있다. 일부 예에서, 정화는 세포 배양물로부터 콜로이드, 지질, DNA-RNA, 잔류 세포, 및 다른 입자를 제거하는 방법이다. 여과가 또한 사용될 수 있고, 심층 필터를 포함할 수 있다. "정화된 벌크"는 정화 공정에 적용된 혼합물을 지칭한다.
용어 "바이러스 불활성화"는 혼합물로부터 감염성 바이러스 오염물을 제거하는 공정을 지칭한다. 예를 들어, 열-불활성화, 용매/세제 (S/D) 불활성화, pH 불활성화, 화학적 불활성화, 및/또는 자외선 조사 불활성화를 포함하여, 전염성 병원성 바이러스를 불활성화하기 위한 많은 상이한 방법이 현재 존재한다.
용어 "크로마토그래피"는 혼합물에 존재하는 다른 분자 (예를 들어, 오염물)로부터 관심 단백질 (예를 들어, 항체)을 분리하는 임의의 종류의 기술을 지칭한다. 통상적으로, 관심 단백질은 혼합물의 개별 분자가 이동 상의 영향 하에 또는 결합 및 용리 공정에서 고정 배지를 통해 이동하는 속도의 차이의 결과로서 다른 분자 (예를 들어, 오염물)로부터 분리된다. 용어 "매트릭스" 또는 "크로마토그래피 매트릭스"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 분리 공정에서 관심 단백질 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질, 예컨대 이뮤노글로불린)을 혼합물에 존재하는 다른 분자로부터 분리하는 임의의 종류의 흡착제, 수지 또는 고체 상을 지칭한다. 비제한적 예는 칼럼 또는 카트리지에 넣을 수 있는 미립자, 단일체 또는 섬유성 수지 뿐만 아니라 막을 포함한다. 매트릭스를 형성하기 위한 물질의 예는 폴리사카라이드 (예컨대 아가로스 및 셀룰로스); 및 다른 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 실리카 (예를 들어 제어된 세공 유리), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 상기 중 임의의 것의 유도체를 포함한다. 본 개시내용의 방법에 적합한 전형적인 매트릭스 유형에 대한 예는 양이온 교환 수지, 친화성 수지, 음이온 교환 수지 또는 혼합 모드 수지이다. "리간드"는 크로마토그래피 매트릭스에 부착되고 매트릭스의 결합 특성을 결정하는 관능기이다. "리간드"의 예는 이온 교환 기, 소수성 상호작용 기, 친수성 상호작용 기, 티오친화성 상호작용 기, 금속 친화성 기, 친화성 기, 생체친화성 기, 및 혼합 모드 기 (상기 언급된 것의 조합)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용될 수 있는 일부 바람직한 리간드는 강한 양이온 교환 기, 예컨대 술포프로필, 술폰산; 강한 음이온 교환 기, 예컨대 트리메틸암모늄 클로라이드; 약한 양이온 교환 기, 예컨대 카르복실산; 약한 음이온 교환 기, 예컨대 N5N 디에틸아미노 또는 DEAE; 소수성 상호작용 기, 예컨대 페닐, 부틸, 프로필, 헥실; 및 친화성 기, 예컨대 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본원에서 달리 명백하게 제공된 경우를 제외하고는, 본 출원에 사용된 각각의 하기 용어는 하기에 제시된 의미를 가질 것이다. 추가의 정의는 본 출원 전반에 걸쳐 제시된다.
용어 "친화성 크로마토그래피"는 관심 단백질 (예를 들어, Fc 영역 함유 관심 단백질 또는 항체)이 관심 단백질에 대한 특이적인 리간드에 특이적으로 결합하는 단백질 분리 기술을 의미한다. 이러한 리간드는 일반적으로 생체특이적 리간드로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 생체특이적 리간드 (예를 들어, 단백질 A 또는 그의 기능적 변이체)는 크로마토그래피 매트릭스 물질에 공유 부착되고, 용액이 크로마토그래피 매트릭스와 접촉함에 따라 용액 중 관심 단백질에 접근가능하다. 관심 단백질은 일반적으로 크로마토그래피 단계 동안 생체특이적 리간드에 대한 그의 특이적 결합 친화도를 유지하지만, 혼합물 중의 다른 용질 및/또는 단백질은 리간드에 인지가능하게 또는 특이적으로 결합하지 않는다. 고정된 리간드에의 관심 단백질의 결합은 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 크로마토그래피 매트릭스를 통해 통과되게 하는 한편, 관심 단백질은 고체 상 물질 상의 고정된 리간드에 특이적으로 결합되어 유지된다. 이어서, 특이적으로 결합된 관심 단백질은 적합한 조건 (예를 들어, 낮은 pH, 높은 pH, 높은 염, 경쟁 리간드 등) 하에 고정된 리간드로부터 활성 형태로 떨어지고, 이전에 칼럼을 통해 통과되도록 했던 오염 단백질 또는 단백질 불순물 없이, 용리 완충제와 함께 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과한다. 임의의 성분이 그의 각각의 특이적 결합 단백질, 예를 들어 항체를 정제하기 위한 리간드로서 사용될 수 있다. 그러나, 본 개시내용에 따른 다양한 방법에서, 표적 단백질을 함유하는 Fc 영역에 대한 리간드로서 단백질 A가 사용된다. 표적 단백질 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질)의 생체특이적 리간드 (예를 들어, 단백질 A)로부터의 용리 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 G 또는 단백질 L 또는 그의 기능적 변이체가 생체특이적 리간드로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체특이적 리간드, 예컨대 단백질 A는 Fc 영역 함유 단백질에 대한 결합, 세척 또는 생체특이적 리간드/표적 단백질 접합체의 재평형화를 위해 5-9의 pH 범위에서 사용된 다음, 적어도 1종의 염을 함유하는 약 4 이하의 pH를 갖는 완충제에 의해 용리된다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "정제하는", "분리하는" 또는 "단리하는"은 관심 단백질 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 관심 단백질의 순도를 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 관심 단백질의 순도의 정도는 조성물로부터 적어도 1종의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.
본원에 사용된 용어 "완충제"는 용액 중 그의 존재에 의해 pH의 단위 변화를 유발하기 위해 첨가되어야 하는 산 또는 알칼리의 양을 증가시키는 물질을 지칭한다. 완충 용액은 그의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH의 변화에 저항한다. 생물학적 시약과 함께 사용하기 위한 완충 용액은 일반적으로 용액의 pH가 생리학적 범위 내에 있도록 일정한 농도의 수소 이온을 유지할 수 있다. 전통적인 완충제 성분은 유기 및 무기 염, 산 및 염기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
크로마토그래피와 관련하여 본원에 사용된 용어 "크로마토그래피 칼럼" 또는 "칼럼"은 크로마토그래피 매트릭스 또는 수지로 충전된, 빈번하게는 실린더 또는 중공 기둥 형태의 용기를 지칭한다. 크로마토그래피 매트릭스 또는 수지는 정제에 사용되는 물리적 및/또는 화학적 특성을 제공하는 물질이다.
용어 "이온-교환" 및 "이온-교환 크로마토그래피"는 관심 이온화가능한 용질 (예를 들어, 혼합물 중 관심 단백질)이 혼합물 중의 용질 불순물 또는 오염물보다 하전된 화합물과 더 또는 덜 비-특이적으로 상호작용하도록, pH 및 전도성의 적절한 조건 하에, 관심 용질이 고체 상 이온 교환 물질에 (예를 들어, 공유 부착에 의해) 연결된 반대로 하전된 리간드와 상호작용하는 크로마토그래피 공정을 지칭한다. 혼합물 중 오염 용질은 이온 교환 물질의 칼럼으로부터 세척될 수 있거나, 또는 관심 용질보다 더 빠르게 또는 더 느리게 수지에 결합되거나 또는 수지로부터 배제된다. "이온-교환 크로마토그래피"는 구체적으로 양이온 교환 (CEX), 음이온 교환 (AEX), 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "오염물"은 그의 가장 넓은 의미로 혼합물 내의 임의의 바람직하지 않은 성분 또는 화합물을 포괄하는 것으로 사용된다. 세포 배양물, 세포 용해물, 또는 정화된 벌크 (예를 들어, 정화된 세포 배양물 상청액)에서, 오염물은, 예를 들어 세포 배양물 배지 중에 존재하는 숙주 세포 핵산 (예를 들어, DNA) 및 숙주 세포 단백질을 포함한다. 숙주 세포 오염물 단백질은, 비제한적으로, 숙주 세포에 의해 자연적으로 또는 재조합적으로 생산된 것, 뿐만 아니라 관심 단백질과 관련되거나 그로부터 유래된 단백질 (예를 들어, 단백질분해 단편) 및 다른 공정 관련 오염물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 오염물 침전물은 원심분리, 멸균 여과, 심층 여과 및 접선 흐름 여과와 같은 수단을 사용하여 세포 배양물로부터 분리된다.
용어 "레이놀즈 수" (Re)는 하기 식:
Re = Dυρ/μ
로 계산되며, 여기서 D는 비-원통형 유동 채널 기하구조의 경우의 채널의 직경 (m) 또는 등가 직경이고, υ는 평균 속도 (m/s) (Q/Ac)이고, ρ는 밀도 (kg/m3)이고, μ는 점도 (PA s)이다. 레이놀즈 수는 무차원 단위이고, 유동 유체에서의 관성력 대 점성력의 비를 기재한다. 이는 많은 유체 유동 상관관계에서 사용되고, 유체 유동형의 경계 (층류, 천이 및 난류)를 기재하는데 사용된다. 층류는 유체가 층 사이에 중단 없이 평행한 층으로 유동할 때 일어난다. 레이놀즈 수가 약 2,000 미만일 때, 튜브 내의 유동은 일반적으로 층류이다. 레이놀즈 수가 약 4,000 초과일 때, 유동은 난류이다. 2,000 내지 4,000의 레이놀즈 수는 층류와 난류 사이의 천이 영역을 나타낸다.
용어 "회수 플러싱"은 아직 수집 용기에 도달하지 않은 추가의 단백질을 대체하기 위해 그의 목적하는 표적 농도를 초과하여 이미 농축된 단백질 샘플을 플러싱에 적용하는 단백질 정제 단계를 지칭한다. 초과농축 단계에서 초과농축의 양은 회수 단계에 사용될 수 있는 플러싱 부피에 영향을 미치는데, 이는 최종 표적 단백질 농도에 도달하기 전에 가능한 희석의 양을 결정하기 때문이다. 규모상 많은 단백질 정제 공정에서, 유의한 양의 단백질이 배관, 관 또는 다른 "홀드-업" 구역 내의 수집 용기의 외부에 수용될 수 있고, 정제된 단백질 생성물을 수집하는데 사용되는 수집 용기 또는 다른 용기 내의 보다 많은 양의 단백질 생성물을 회수하기 위해 회수 플러싱이 필요하다. 회수 플러싱의 부재 하에서는, 대규모 단백질 정제 시스템의 배관, 관, 또는 다른 "홀드-업" 구역에 축적된 단백질 생성물이, 정제된 단백질 생성물을 수집하는데 사용되는 단백질 수집 용기 또는 다른 용기에 도달하지 못함으로 인해 달리 손실되거나 회수되지 않을 수 있다.
용어 "플러싱 완충제"는 전체적인 단백질 수율을 증가시키거나, 단백질을 그의 최종 표적 농도로 희석하거나, 또는 둘 다를 위해 사용되는, 회수 플러싱 동안 사용되는 용액 또는 혼합물을 지칭한다. 플러싱 완충제는 또한 단백질을 단백질이 축적되는 배관 또는 여과 조립체의 다른 구역으로부터 밀어내는데 사용된다.
용어 "여과 완충제"는 관심 단백질을 함유하는 공급물을 막 상에 또는 막을 통해 통과시키기 위해 사용되는, 여과 동안 사용되는 용액 또는 혼합물을 지칭한다.
용어 "여과 조립체"는 단백질 정제를 수행하는데 사용되는 전체 시스템을 지칭한다. 여과 조립체의 한 예는 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템으로, 여기서 관심 단백질을 함유하는 공급물은 여과막에 수직인 공급물 유동에 적용된다. 상업적으로 입수가능한 TFF 시스템은 AKTA® 플럭스 접선 흐름 여과 시스템 (지이 라이프 사이언시스(GE Life Sciences))을 포함한다. 여과 조립체의 또 다른 예는 직접 흐름 여과 (DFF) 시스템으로, 여기서 관심 단백질을 함유하는 공급물은 여과막에 평행인 공급물 유동에 적용된다.
용어 "공급물 유량" (LMH), 또는 때때로 "교차-유량"은 관심 단백질을 함유하는 공급물이 여과막에 수직인 공급물 유동에 적용되는 접선 흐름 여과 (TFF) 단백질 정제의 단계에서의 유량을 지칭한다. 공급물의 접선 흐름은 필터의 표면 상에 포획된 입자가 축적되어 여과를 방해하는 것을 방지한다. 한외여과 농축 단계 동안, 한외여과 막 카세트로의 공급물 유동은 농축 및 완충제 교환을 위해 필요한 막횡단 압력 (TMP) 및 교차흐름 플럭스를 제공한다. 직접 흐름 여과 (DFF) 시스템과 관련하여, 용어 "공급물 유량"은 여과막에 평행인 유량을 지칭한다.
용어 "플러싱 유량" (LMH)은 수집 용기 내에 존재하지 않는 단백질을 대체하기 위해 그의 목적하는 표적 농도를 초과하여 이미 농축된 단백질 샘플을 플러싱에 적용하는 단백질 정제 단계에서 사용되는 유량을 지칭한다. 플러싱 유량은 정제 공정의 회수 플러싱 단계 동안 플러싱 완충제가 시스템을 통해 유동하는 속도를 나타낸다.
용어 "투석여과"는 단백질, 펩티드, 핵산, 및 다른 생체분자를 함유하는 용액으로부터 염 또는 용매를 제거하거나, 대체하거나, 또는 그의 농도를 낮추는 공정을 지칭한다. 공정은 분자 크기에 기초하여 용액 또는 혼합물의 성분을 분리하기 위해 투과가능한 막 필터를 사용한다. 막의 세공보다 더 작은 분자는 막을 자유롭게 통과한다.
용어 "한외여과"는 필터를 사용하여 하나의 크기의 입자를 또 다른 크기의 입자로부터 분리하는 공정을 지칭한다. 한외여과는 단백질 농축 및 완충제 교환을 위해 널리 사용되는 압력-구동 막 공정이다. 한외여과는 막 세공보다 더 큰 종은 잔류하고 더 작은 종은 필터를 통과하는 크기-기반 분리이다. 한외여과는 압력 하에 막을 가로지르는 상이한 성분의 여과율의 차이를 통해 이루어진다.
용어 "항체"는, 일부 실시양태에서, 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역 (본원에서 CH로 약칭됨)으로 구성된다. 일부 항체, 예를 들어 자연 발생 IgG 항체에서, 중쇄 불변 영역은 힌지 및 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 일부 항체, 예를 들어 자연 발생 IgG 항체에서, 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 (본원에서 CL로 약칭됨)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역 사이에 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 중쇄는 C-말단 리신을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 용어 "항체"는 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "IgG 항체", 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 항체는, 일부 실시양태에서, 자연-발생 IgG 항체의 구조를 갖고, 즉 동일한 하위부류의 자연-발생 IgG 항체와 동일한 수의 중쇄 및 경쇄 및 디술피드 결합을 갖는다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체는 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄 (LC)로 이루어질 수 있으며, 여기서 2개의 HC 및 LC는 자연-발생 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 항체에서 각각 발생하는 동일한 수 및 위치의 디술피드 가교에 의해 연결된다 (항체가 돌연변이되어 디술피드 가교가 변형되지 않는 한).
이뮤노글로불린은 IgA, 분비형 IgA, IgG 및 IgM을 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상적으로 공지된 이소형 중 임의의 것으로부터의 것일 수 있다. IgG 이소형은 특정 종에서 하위부류로 나뉜다: 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 마우스에서 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3. 이뮤노글로불린, 예를 들어 IgG1은 최대 수개의 아미노산이 서로 상이한 여러 동종이형으로 존재한다. "항체"는, 예로서, 자연-발생 및 비-자연 발생 항체 둘 다; 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 및 비인간 항체 및 완전 합성 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, LC 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편 (파파인 절단으로부터의 단편) 또는 유사한 1가 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 F(ab')2 단편 (펩신 절단으로부터의 단편) 또는 유사한 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)로 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체도 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
"Fc 영역" (결정화가능 단편 영역), "Fc 도메인" 또는 "Fc"는 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 상에 위치한 Fc 수용체 또는 전형적 보체계의 제1 성분 (C1q)에 대한 결합을 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개하는 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 따라서, Fc 영역은 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인 (예를 들어, CH1 또는 CL)을 제외한 항체의 불변 영역을 포함한다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소형에서, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄의 제2 (CH2) 및 제3 (CH3) 불변 도메인으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편을 포함하고; IgM 및 IgE Fc 영역은 각각의 폴리펩티드 쇄에 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH 도메인 2-4)을 포함한다. IgG 이소형은 특정 종에서 하위부류로 나뉜다: 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 마우스에서 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3. IgG의 경우, Fc 영역은 이뮤노글로불린 도메인 CH2 및 CH3, 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 힌지를 포함한다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계의 정의는 본원에 정의된 바와 같이 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 IgG1의 경우 아미노산 잔기 D221, IgG2의 경우 V222, IgG3의 경우 L221 및 IgG4의 경우 P224로부터 중쇄의 카르복시-말단까지의 스트레치로 정의되며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따른다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 아미노산 237로부터 아미노산 340까지에 이르고, CH3 도메인은 Fc 영역에서 CH2 도메인의 C-말단 측에 위치하며, 즉 이는 IgG의 아미노산 341로부터 아미노산 447 또는 446 (C-말단 리신 잔기가 부재하는 경우) 또는 445 (C-말단 글리신 및 리신 잔기가 부재하는 경우)까지에 이른다. 본원에 사용된 Fc 영역은 임의의 동종이형 변이체를 포함한 천연 서열 Fc, 또는 변이체 Fc (예를 들어, 비-자연-발생 Fc)일 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 FcγR 패밀리의 수용체를 포함하고 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγR 패밀리는 3종의 활성화 (마우스에서 FcγRI, FcγRIII, 및 FcγRIV; 인간에서 FcγRIA, FcγRIIA, 및 FcγRIIIA) 및 1종의 억제 (FcγRIIB) 수용체로 이루어진다. 인간 FcγR의 다양한 특성은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 대부분의 선천성 이펙터 세포 유형은 1종 이상의 활성화 FcγR 및 억제 FcγRIIB를 공동-발현하는 반면에, 자연 킬러 (NK) 세포는 1종의 활성화 Fc 수용체 (마우스에서 FcγRIII 및 인간에서 FcγRIIIA)를 선택적으로 발현하지만 마우스 및 인간에서 억제 FcγRIIB는 발현하지 않는다. 인간 IgG1은 대부분의 인간 Fc 수용체에 결합하고, 그것이 결합하는 활성화 Fc 수용체의 유형과 관련하여 뮤린 IgG2a와 동등한 것으로 간주된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다.
본원에 사용된 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE 항체)를 지칭한다.
아미노산은 본원에서 그의 통상적으로 공지된 3문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명 위원회에 의해 권장되는 1문자 기호에 의해 지칭된다. 마찬가지로, 뉴클레오티드도 그의 통상적으로 허용되는 단일-문자 코드에 의해 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합 (또한 펩티드 결합으로도 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하고, 특정 길이의 생성물을 지칭하지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "단백질"은 일부 경우에 아미드 결합 이외의 결합에 의해 회합될 수 있는 1개 이상의 폴리펩티드로 구성된 분자를 포괄하는 것으로 의도된다. 다른 한편으로는, 단백질은 또한 단일 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 이러한 후자의 경우에, 단일 폴리펩티드 쇄는 일부 경우에 함께 융합되어 단백질을 형성하는 2개 이상의 폴리펩티드 서브유닛을 포함할 수 있다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 또한 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질분해적 절단, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 비제한적으로 포함하는 발현후 변형의 생성물을 지칭한다. 폴리펩티드 또는 단백질은 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 이는 화학적 합성을 포함한 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는 단일 핵산 뿐만 아니라 복수의 핵산을 포괄하는 것으로 의도되고, 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들어, 메신저 RNA (mRNA), 상보적 DNA (cDNA), 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 지칭한다. 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적인 결합 (예를 들어, 펩티드 핵산 (PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함한다.
용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 1종 이상의 핵산 절편, 예를 들어, DNA, cDNA, 또는 RNA 단편을 지칭한다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 적용되는 경우에, 용어 "단리된"은 그의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 지칭하고, 예를 들어, 벡터에 함유된 항원 결합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 개시내용의 목적상 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가의 예는 이종 숙주 세포에 유지되거나 또는 용액 중의 다른 폴리뉴클레오티드로부터 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 개시내용에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성에 의해 생산된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결 신호를 포함할 수 있다.
범위: 본원에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는, 달리 나타내지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우에, 그의 분율 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "HMW 종"은 혼합물에 존재하는 임의의 1종 이상의 원치 않는 단백질을 지칭한다. 고분자량 종은 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 다른 다량체를 포함할 수 있다. 이들 종은 종종 생성물 관련 불순물로 간주되며, 공유 또는 비-공유 연결될 수 있고, 또한 예를 들어 소수성 아미노산 잔기가 극성 용매에 노출되어 응집을 유발할 수 있는 미스폴딩된 단량체로 이루어질 수 있다.
용어 "LMW 종"은 혼합물에 존재하는 임의의 1종 이상의 원치않는 종을 지칭한다. 저분자량 종은 종종 생성물 관련 불순물로 간주되고, 클리핑된 종, 또는 이량체이도록 의도된 화합물 (예컨대 모노클로날 항체)에 대한 절반 분자를 포함할 수 있다.
용어 "숙주 세포 단백질" 또는 HCP는 의도된 관심 단백질의 생산과 비관련된, 숙주 세포에 의해 생성된 바람직하지 않은 단백질을 지칭한다. 바람직하지 않은 숙주 세포 단백질은 상류 세포 배양물 상청액 내로 분비될 수 있다. 바람직하지 않은 숙주 세포 단백질은 또한 세포 용해 동안 방출될 수 있다. 상류 세포 배양을 위해 사용되는 세포는 성장, 전사 및 단백질 합성을 위해 단백질을 필요로 하고, 이들 비관련 단백질은 최종 약물 제품에서 바람직하지 않다.
본 개시내용의 다양한 측면이 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.
II. 회수 플러싱 방법
본 개시내용은 여과 후 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 완충제를 시간당 제곱 미터당 300 리터 (LMH) 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시킴으로써, 300 LMH의 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질의 희석과 비교하여 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 것에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 여과 후 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 농도를 개선시키거나 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 플러싱 완충제를 시간당 제곱 미터당 300 리터 (LMH) 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시킴으로써, 300 LMH의 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질 농도와 비교하여 표적 단백질 농도를 개선시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질의 목적하는 농도는 약 100 mg/mL, 약 110 mg/mL, 약 120 mg/mL, 약 130 mg/mL, 약 140 mg/mL, 약 150 mg/mL, 약 160 mg/mL, 약 170 mg/mL, 약 180 mg/mL, 약 190 mg/mL, 또는 약 200 mg/mL 초과이다.
하류 제조 공정에서 관심 단백질을 정제하기 위한 표준 접근법은 회수 플러싱으로부터 발생하는 희석을 수용하기 위해 단백질 용액을 약간 더 높은 농도로 (예를 들어, 20% 더 높게) 농축시키는 것이다. 이러한 전략은 제제화 전에 50 mg/mL의 비교적 낮은 농도에서의 UF/DF 작업에 잘 작용한다. 예를 들어, 표적 단백질은 여과 단계에서 55-60 mg/mL로 농축될 수 있고, 제제화 전에 50 mg/mL로 희석될 수 있다. 55-60 mg/mL의 단백질 농도에서, 일부 모노클로날 항체의 점도는 전형적으로 실온에서 2-6 cP의 범위이다.
높은 단백질 농도의 경우에, 최종 농도 및 희석은 악순환으로 이어진다. 단백질 농도가 높은 경우에, 회수 플러싱이 단백질을 정확한 농도로 희석되도록 하여 초과-희석을 피하기 위해 표적 단백질을 매우 높은 수준으로 (즉, 여과 후 목적하는 농도보다 더 높게) 농축시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 단백질을 고농도, 예를 들어 150 mg/mL 내지 170 mg/mL로 농축시키는 것은 실질적인 시간이 걸릴 수 있고, 막을 통한 추가의 채널 통과가 발생하고 생성물 품질에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있다. 또한, 여과 단계 동안/후에 고농도가 달성된 후에도, 회수 플러싱 동안 생성물의 초과-희석의 위험이 높다. 이는 규모상 많은 단백질 정제 공정에서, 상당량의 단백질이 배관 또는 관 내의 체류물 탱크의 외부에 수용될 수 있기 때문이다. 따라서, 배관 또는 관 내에 수용된 다량의 단백질로 인해, 초기 회수 플러싱으로 수집 용기 내에 회수 생성물의 전체 양이 축적되지 않을 수 있다. 이는 추가의 회수 플러싱으로 이어질 수 있고, 이는 최종 생성물 농도를 추가로 희석할 수 있다. 본 방법은 플러싱 완충제의 플러싱 유량을 느리게 함으로써 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석을 방지하거나 감소시키도록 설계된다. 따라서, 본 방법은 회수 플러싱 공정 동안 추가의 회수 플러싱 단계를 생략하거나 회피할 수 있게 한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 여과 후 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 완충제를 시간당 제곱 미터당 300 리터 (LMH) 미만, 약 250 LMH 미만, 약 200 LMH 미만, 약 150 LMH 미만, 약 140 LMH 미만, 약 130 LMH 미만, 약 120 LMH 미만, 약 110 LMH 미만, 또는 약 100 LMH 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시킴으로써, 300 LMH의 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질의 희석과 비교하여 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 것에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 여과 후 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 농도를 개선시키거나 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 플러싱 완충제를 시간당 제곱 미터당 300 리터 (LMH) 미만, 약 250 LMH 미만, 약 200 LMH 미만, 약 150 LMH 미만, 약 140 LMH 미만, 약 130 LMH 미만, 약 120 LMH 미만, 약 110 LMH 미만, 또는 약 100 LMH 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시킴으로써, 300 LMH의 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질 농도와 비교하여 표적 단백질 농도를 개선시키는 것에 관한 것이다.
본 방법에 따른 표적 단백질의 희석을 방지하거나 감소시키기 위해, 여과 조립체에서의 유동은 층류이다. 층류는 유체가 층 사이에 중단 없이 평행한 층으로 유동할 때 일어난다. 레이놀즈 수가 약 2,000 미만일 때, 튜브 내의 유동은 일반적으로 층류이다. 레이놀즈 수가 약 4,000 초과일 때, 유동은 난류이다. 2,000 내지 4,000의 레이놀즈 수는 층류와 난류 사이의 천이 영역을 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, 회수 플러싱에서 유동의 레이놀즈 수 ("Re")는 2000 미만, 1900 미만, 1800 미만, 1700 미만, 1600 미만, 1500 미만, 1400 미만, 1300 미만, 1200 미만, 1100 미만, 1000 미만, 900 미만, 800 미만, 700 미만, 600 미만, 500 미만, 400 미만, 300 미만, 200 미만, 100 미만, 90 미만, 80 미만, 70 미만, 60 미만, 50 미만, 40 미만, 30 미만, 20 미만, 10 미만, 5 미만, 4 미만, 3 미만, 2 미만, 또는 1 미만이고, 여기서 Re는 하기 식:
Re = Dυρ/μ
로 계산되며, 여기서 D는 비-원통형 유동 채널 기하구조의 경우의 채널의 직경 (m) 또는 등가 직경이고, υ는 평균 속도 (m/s) (Q/Ac)이고, ρ는 밀도 (kg/m3)이고, μ는 점도 (Pa·s)이다.
일부 실시양태에서, 회수 플러싱에서 유동의 레이놀즈 수 (Re)는 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 45, 약 1 내지 약 40, 약 1 내지 약 35, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 3, 약 2 내지 약 40, 약 2 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 6, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 6, 약 2 내지 약 5, 약 3 내지 약 10, 약 4 내지 약 6, 약 3 내지 약 4, 또는 약 2 내지 약 3이다.
일부 실시양태에서, 회수 플러싱에서 유동의 레이놀즈 수 (Re)는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 또는 약 30이다. 일부 실시양태에서, 회수 플러싱에서 유동의 레이놀즈 수 (Re)는 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 또는 약 60이다. 일부 실시양태에서, 회수 플러싱에서 유동의 Re는 약 3.8이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 여과 후 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 완충제를 시간당 제곱 미터당 약 100 리터 (LMH) 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시킴으로써, 300 LMH의 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질의 희석과 비교하여 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 것에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 여과 후 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 농도를 개선시키거나 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 플러싱 완충제를 시간당 제곱 미터당 약 100 리터 (LMH) 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시킴으로써, 300 LMH의 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질 농도와 비교하여 표적 단백질 농도를 개선시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 플러싱 유량은 약 5 LMH 내지 약 100 LMH, 약 10 LMH 내지 약 100 LMH, 약 10 LMH 내지 약 90 LMH, 약 10 LMH 내지 약 80 LMH, 약 10 LMH 내지 약 70 LMH, 약 10 LMH 내지 약 60 LMH, 약 10 LMH 내지 약 50 LMH, 약 10 LMH 내지 약 40 LMH, 약 10 LMH 내지 약 30 LMH, 약 30 LMH 내지 약 50 LMH, 약 20 LMH 내지 약 100 LMH, 약 20 LMH 내지 약 90 LMH, 약 20 LMH 내지 약 80 LMH, 약 20 LMH 내지 약 70 LMH, 약 20 LMH 내지 약 60 LMH, 약 20 LMH 내지 약 50 LMH, 약 20 LMH 내지 약 40 LMH, 약 30 LMH 내지 약 100 LMH, 약 30 LMH 내지 약 90 LMH, 약 30 LMH 내지 약 80 LMH, 약 30 LMH 내지 약 70 LMH, 약 30 LMH 내지 약 60 LMH, 약 30 LMH 내지 약 50 LMH, 약 30 LMH 내지 약 40 LMH, 또는 약 20 LMH 내지 약 30 LMH이다.
일부 실시양태에서, 플러싱 유량은 적어도 약 10 LMH, 적어도 약 20 LMH, 적어도 약 30 LMH, 적어도 약 40 LMH, 적어도 약 50 LMH, 적어도 약 60 LMH, 적어도 약 70 LMH, 적어도 약 80 LMH, 적어도 약 90 LMH, 또는 적어도 약 100 LMH이다. 일부 실시양태에서, 플러싱 유량은 약 30 LMH이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 여과 후 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 완충제를 시간당 제곱 미터당 약 30 리터 (LMH) 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시킴으로써, 300 LMH의 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질의 희석과 비교하여 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 것에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 여과 후 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 농도를 개선시키거나 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 플러싱 완충제를 시간당 제곱 미터당 약 30 리터 (LMH) 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시킴으로써, 300 LMH의 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질 농도와 비교하여 표적 단백질 농도를 개선시키는 것에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 표적 단백질의 점도는 적어도 약 1 센티포아즈 (cP), 적어도 약 2 cP, 적어도 약 3 cP, 적어도 약 4 cP, 적어도 약 5 cP, 적어도 약 6 cP, 적어도 약 7 cP, 적어도 약 8 cP, 적어도 약 9 cP, 적어도 약 10 cP, 적어도 약 11 cP, 적어도 약 12 cP, 적어도 약 13 cP, 적어도 약 14 cP, 적어도 약 15 cP, 적어도 약 16 cP, 적어도 약 17 cP, 적어도 약 18 cP, 적어도 약 19 cP, 적어도 약 20 cP, 적어도 약 21 cP, 적어도 약 22 cP, 적어도 약 23 cP, 적어도 약 24 cP, 적어도 약 25 cP, 적어도 약 26 cP, 적어도 약 27 cP, 적어도 약 28 cP, 적어도 약 29 cP, 또는 적어도 약 30 cP이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 높은 점도를 갖는 표적 단백질을 여과하는데 특히 효과적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질의 점도는 높고, 적어도 약 20 센티포아즈 (cP), 적어도 약 21 cP, 적어도 약 22 cP, 적어도 약 23 cP, 적어도 약 24 cP, 적어도 약 25 cP, 적어도 약 26 cP, 적어도 약 27 cP, 적어도 약 28 cP, 적어도 약 29 cP, 적어도 약 30 cP, 적어도 약 31 cP, 적어도 약 32 cP, 적어도 약 33 cP, 적어도 약 34 cP, 적어도 약 35 cP, 적어도 약 36 cP, 적어도 약 37 cP, 적어도 약 38 cP, 적어도 약 39 cP, 적어도 약 40 cP, 적어도 약 41 cP, 적어도 약 42 cP, 적어도 약 43 cP, 적어도 약 44 cP, 적어도 약 45 cP, 적어도 약 46 cP, 적어도 약 47 cP, 적어도 약 48 cP, 적어도 약 49 cP, 적어도 약 50 cP, 적어도 약 51 cP, 적어도 약 52 cP, 적어도 약 53 cP, 적어도 약 54 cP, 적어도 약 55 cP, 적어도 약 56 cP, 적어도 약 57 cP, 적어도 약 58 cP, 적어도 약 59 cP, 적어도 약 60 cP, 적어도 약 61 cP, 적어도 약 62 cP, 적어도 약 63 cP, 적어도 약 64 cP, 적어도 약 65 cP, 적어도 약 66 cP, 적어도 약 67 cP, 적어도 약 68 cP, 적어도 약 69 cP, 적어도 약 70 cP, 적어도 약 71 cP, 적어도 약 72 cP, 적어도 약 73 cP, 적어도 약 74 cP, 적어도 약 75 cP, 적어도 약 76 cP, 적어도 약 77 cP, 적어도 약 78 cP, 적어도 약 79 cP, 적어도 약 80 cP, 적어도 약 81 cP, 적어도 약 82 cP, 적어도 약 83 cP, 적어도 약 84 cP, 적어도 약 85 cP, 적어도 약 86 cP, 적어도 약 87 cP, 적어도 약 88 cP, 적어도 약 89 cP, 적어도 약 90 cP, 적어도 약 91 cP, 적어도 약 92 cP, 적어도 약 93 cP, 적어도 약 94 cP, 적어도 약 95 cP, 적어도 약 96 cP, 적어도 약 97 cP, 적어도 약 98 cP, 적어도 약 99 cP, 또는 적어도 약 100 cP이다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질의 점도는 약 20 cP 내지 약 100 cP, 약 20 cP 내지 약 90 cP, 25 cP 내지 약 100 cP, 약 25 cP 내지 약 90 cP, 약 30 cP 내지 약 100 cP, 약 30 cP 내지 약 90 cP, 약 30 cP 내지 약 80 cP, 약 30 cP 내지 약 70 cP, 약 40 cP 내지 약 60 cP이다. 다른 실시양태에서, 표적 단백질의 점도는 약 10 cP, 약 20 cP, 약 30 cP, 약 40 cP, 약 50 cP, 약 60 cP, 약 70 cP, 약 80 cP, 약 90 cP, 또는 약 100 cP이다.
일부 실시양태에서, 표적 단백질의 점도는 낮고, 약 2 cP 내지 약 10 cP, 약 3cP 내지 약 10 cP, 약 1 cP 내지 약 9 cP, 약 2 cP 내지 약 8 cP, 약 2 cP 내지 약 7 cP, 약 2 cP 내지 약 6 cP, 약 3 cP 내지 약 6 cP, 약 4 cP 내지 약 5 cP, 또는 약 2 cP 내지 약 5 cP이다.
따라서, 본 방법은 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석을 방지하거나 감소시킴으로써 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 농도를 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 농도는 여과 전에 적어도 약 100 g/L, 적어도 약 110 g/L, 적어도 약 120 g/L, 적어도 약 130 g/L, 적어도 약 140 g/L, 적어도 약 150 g/L, 적어도 약 160 g/L, 적어도 약 170 g/L, 적어도 약 180 g/L, 적어도 약 190 g/L, 적어도 약 200 g/L, 적어도 약 210 g/L, 적어도 약 220 g/L, 적어도 약 230 g/L, 적어도 약 240 g/L, 적어도 약 250 g/L, 적어도 약 260 g/L, 적어도 약 270 g/L, 적어도 약 280 g/L, 적어도 약 290 g/L, 또는 적어도 약 300 g/L 적어도 약 200 g/L, 적어도 약 210 g/L, 적어도 약 220 g/L, 적어도 약 230 g/L, 적어도 약 240 g/L, 적어도 약 250 g/L, 적어도 약 260 g/L, 적어도 약 270 g/L, 적어도 약 280 g/L, 적어도 약 290 g/L, 또는 적어도 약 300 g/L이다.
일부 실시양태에서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 농도는 약 100 g/L 내지 약 300 g/L, 약 110 g/L 내지 약 250 g/L, 약 120 g/L 내지 약 240 g/L, 약 150 g/L 내지 약 250 g/L, 약 130 g/L 내지 약 260 g/L, 약 140 g/L 내지 약 260 g/L, 약 160 g/L 내지 약 220 g/L, 또는 약 170 g/L 내지 약 230 g/L이다.
일부 실시양태에서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 농도는 약 100 g/L 내지 약 300 g/L, 약 110 g/L 내지 약 300 g/L, 약 110 g/L 내지 약 290 g/L, 약 120 g/L 내지 약 290 g/L, 약 120 g/L 내지 약 280 g/L, 약 130 g/L 내지 약 280 g/L, 약 130 g/L 내지 약 270 g/L, 약 140 g/L 내지 약 270 g/L, 약 140 g/L 내지 약 260 g/L, 약 150 g/L 내지 약 260 g/L, 약 150 g/L 내지 약 250 g/L, 약 160 g/L 내지 약 250 g/L, 약 160 g/L 내지 약 240 g/L, 약 170 g/L 내지 약 240 g/L, 약 170 g/L 내지 약 230 g/L, 약 180 g/L 내지 약 230 g/L, 약 180 g/L 내지 약 220 g/L, 약 190 g/L 내지 약 220 g/L, 약 190 g/L 내지 약 210 g/L, 또는 약 200 g/L 내지 약 210 g/L이다.
일부 실시양태에서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 농도는 약 90 g/L, 약 100 g/L, 약 110 g/L, 약 120 g/L, 약 130 g/L, 약 140 g/L, 약 150 g/L, 약 160 g/L, 약 170 g/L, 약 180 g/L, 약 190 g/L, 약 200 g/L, 약 210 g/L, 약 220 g/L, 약 230 g/L, 약 240 g/L, 약 250 g/L, 약 260 g/L, 약 270 g/L, 약 280 g/L, 약 290 g/L, 또는 약 300 g/L이다.
일부 실시양태에서, 본 방법에 따른 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 수율은 회수 플러싱 공정 전의 표적 단백질의 농도와 비교하여 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%이다.
일부 실시양태에서, 본 방법에 따른 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 수율은 300 LMH의 유량으로 회수 플러싱 후에 수득된 표적 단백질의 수율과 비교하여 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%, 적어도 약 26%, 적어도 약 27%, 적어도 약 28%, 적어도 약 29%, 적어도 약 30%, 적어도 약 31%, 적어도 약 32%, 적어도 약 33%, 적어도 약 34%, 적어도 약 35%, 적어도 약 36%, 적어도 약 37%, 적어도 약 38%, 적어도 약 39%, 또는 적어도 약 40% 증가된다. 일부 실시양태에서, (i)에서의 통과는 (ii)에서의 플러싱 유량보다 더 높은 공급물 유량으로 이루어진다.
본 방법에 따르면, 표적 단백질은 여과가 진행되는 동안 여과 조립체를 통해 통과한다. 접선 흐름 여과 (TFF) 단계에서 표적 단백질을 함유하는 공급물의 유량은 플러싱 유량과 대조적으로 본원에서 공급물 유량으로 지칭된다. 공급물의 접선 흐름은 필터의 표면 상에 포획된 입자가 축적되어 여과를 방해하는 것을 방지한다. 한외여과 농축 단계 동안, 한외여과 막 카세트로의 공급물 유동은 농축 및 완충제 교환을 위해 필요한 막횡단 압력 (TMP) 및 교차흐름 플럭스를 제공한다.
본 개시내용에서, 공급물 유량은 플러싱 유량보다 더 높다. 일부 실시양태에서, 공급물 유량은 적어도 200 LMH, 적어도 210 LMH, 적어도 220 LMH, 적어도 230 LMH, 적어도 240 LMH, 적어도 250 LMH, 적어도 260 LMH, 적어도 270 LMH, 적어도 280 LMH, 적어도 290 LMH, 적어도 300 LMH, 적어도 310 LMH, 적어도 320 LMH, 적어도 330 LMH, 적어도 340 LMH, 적어도 350 LMH, 적어도 360 LMH, 적어도 370 LMH, 적어도 380 LMH, 적어도 390 LMH, 적어도 400 LMH, 적어도 410 LMH, 적어도 420 LMH, 적어도 430 LMH, 적어도 440 LMH, 적어도 450 LMH, 적어도 460 LMH, 적어도 470 LMH, 적어도 480 LMH, 적어도 490 LMH, 또는 적어도 500 LMH이고, 여기서 플러싱 유량은 공급물 유량보다 더 낮고, 예를 들어 100 LMH 미만이다.
일부 실시양태에서, 공급물 유량은 200 LMH 내지 500 LMH, 200 LMH 내지 450 LMH, 250 LMH 내지 450 LMH, 450 LMH, 300 LMH 내지 450 LMH, 300 LMH 내지 400 LMH, 또는 300 LMH 내지 350 LMH이다. 일부 실시양태에서, 공급물 유량은 약 300 LMH이다.
본 방법에 따르면, 여과 조립체는 관심 단백질의 여과를 수행하는데 사용된다. 여과 조립체는 일반적으로 필터 홀더, 여과 카세트, 및 여과물이 유동하는 포트와 같은 요소를 포함한다. 여과 카세트는 통상적으로 생체분자의 분리 및 정제에 사용되는 막 필터를 수용하는 조립체의 요소이다. 여과 막은 관심 표적 단백질을 정제하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 여과 막은 단백질 및 보다 작은 용질이 여과물 내로 통과하도록 하면서 세포, 세포 파편, 소기관, 및 다른 성분은 잔류시키는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 여과 조립체는 막을 포함한다. 다른 실시양태에서, 여과 조립체 막에 유용한 막은 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리아릴술폰, 재생 셀룰로스, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 셀룰로스 아세테이트, 폴리아크릴로니트릴, 비닐 공중합체, 폴리아미드 (예컨대 "나일론 6" 또는 나일론 66") 폴리카르보네이트, PFA, 또는 그의 임의의 조합으로부터 유래된다.
본 개시내용에 따른 방법은 배관, 관 또는 다른 "홀드-업" 구역 내의 수집 용기의 외부에 수용되는 단백질을 회수하기 위해 회수 플러싱 동안 플러싱 완충제의 사용을 포함한다. 모든 정제된 단백질이 초기 정제 실행 동안 수집 용기에 도달하는 것은 아니기 때문에, 정제된 단백질 생성물을 수집하는데 사용되는 수집 용기 또는 다른 용기 내에 보다 많은 양의 단백질 생성물을 회수하기 위해 회수 플러싱이 필요하다. 일부 경우에, 단백질 정제 및 높은 수준으로의 농축은 원치 않는 단백질 응집으로 이어질 수 있다. 완충제의 pH, 염 함량, 또는 다른 성분의 변형은 정제 및 농축 공정 동안 단백질 응집 또는 다른 원치 않는 효과를 방지하기 위해 필요할 수 있다. 일부 실시양태에서, 플러싱 완충제는 유기 또는 무기 산 또는 그의 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유기 또는 무기 산은 시트레이트 (예를 들어, 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물 등), 숙시네이트 (예를 들어, 숙신산-숙신산일나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산이나트륨 혼합물 등), 타르트레이트 (예를 들어, 타르타르산-타르타르산나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 (예를 들어, 푸마르산-푸마르산일나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨 혼합물, 푸마르산일나트륨-푸마르산이나트륨 혼합물 등), 글루코네이트 (예를 들어, 글루콘산-글루콘산나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산칼륨 혼합물 등), 옥살레이트 (예를 들어, 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 락테이트 (예를 들어, 락트산-락트산나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산칼륨 혼합물 등), 아세테이트 (예를 들어, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등), 트리메틸아민 염 (예를 들어, 트리스), 포스페이트, 또는 히스티딘이다. 일부 실시양태에서, 플러싱 완충제는 히스티딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 플러싱 완충제는 당을 포함한다. 일부 실시양태에서, 당은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 크실리톨, 에리트리톨, 락토스, 글루코스, 분말화 당, 또는 풀루란이다. 일부 실시양태에서, 플러싱 완충제는 20mM 히스티딘 및 250 mM 수크로스를 포함한다.
본 개시내용의 방법에 따르면, 여과 완충제는 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키는 공정 동안 사용된다. 여과 완충제는 하류 크로마토그래피 및 여과 장비의 보호에 필수적이고, 단백질 정제 및 농축 공정 동안 사용된다. 플러싱 완충제는 단백질 정제 및 농축 공정 후에 플러싱 회수 동안 사용된다는 점에서, 여과 완충제는 플러싱 완충제와 상이하다. 일부 실시양태에서, 여과 완충제 중의 성분은 플러싱 완충제 중의 것과 동일하다. 다른 실시양태에서, 여과 완충제 중의 성분은 플러싱 완충제 중의 것과 상이하다.
단백질 정제 및 높은 수준으로의 농축은 원치 않는 단백질 응집으로 이어질 수 있다. 완충제의 pH, 염 함량, 또는 다른 성분의 변형은 정제 및 농축 공정 동안 단백질 응집 또는 다른 원치 않는 효과를 방지하기 위해 필요할 수 있다. 일부 실시양태에서, 여과 완충제는 유기 및 무기 산 또는 그의 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유기 또는 무기 산은 시트레이트 (예를 들어, 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물 등), 숙시네이트 (예를 들어, 숙신산-숙신산일나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산이나트륨 혼합물 등), 타르트레이트 (예를 들어, 타르타르산-타르타르산나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 (예를 들어, 푸마르산-푸마르산일나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨 혼합물, 푸마르산일나트륨-푸마르산이나트륨 혼합물 등), 글루코네이트 (예를 들어, 글루콘산-글루콘산나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산칼륨 혼합물 등), 옥살레이트 (예를 들어, 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 락테이트 (예를 들어, 락트산-락트산나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산칼륨 혼합물 등), 아세테이트 (예를 들어, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등), 트리메틸아민 염 (예를 들어, 트리스), 포스페이트, 또는 히스티딘이다.
일부 실시양태에서, 여과 완충제는 당을 포함한다. 일부 실시양태에서, 당은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 크실리톨, 에리트리톨, 락토스, 글루코스, 분말화 당, 또는 풀루란이다. 일부 실시양태에서, 플러싱 완충제 및/또는 여과 완충제는 pH 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 또는 약 9.5이다.
본 발명의 방법에 따르면, 관심 단백질을 함유하는 샘플은 먼저 여과 조립체를 통해 통과된 다음, 회수 플러싱에 적용한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 이미 여과 및 회수 플러싱 단계의 바로 상류에서 이전의 정제 활동, 예컨대 바이러스 여과, 음이온-교환 크로마토그래피 (AEX), 양이온-교환 크로마토그래피 (CEX), 심층 여과, 산 처리, 또는 단백질 A 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 정제 및 여과에 적용되는 샘플은 세포 배양물, 세포 용해물, 또는 정화된 벌크 (예를 들어, 정화된 세포 배양물 상청액)와 같은 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 순수한 단백질 샘플, 정화된 벌크 단백질 샘플, 세포 배양 샘플, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 샘플은 포유동물 세포를 포함하는 세포 배양 배지로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HEK293 세포, 마우스 골수종 (NS0), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK), 원숭이 신장 섬유모세포 (COS-7), 마딘-다르비 소 신장 세포 (MDBK) 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된다.
본 방법에 유용한 표적 단백질은 자연 발생 또는 재조합적으로 생산된 임의의 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 고점도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 고분자량 (예를 들어, 100 kDa 내지 500 kDa)을 갖는 단백질이다. 다른 실시양태에서, 표적 단백질은 저분자량을 갖는 단백질이다. 다른 실시양태에서, 표적 단백질은 적어도 약 10 kDa, 적어도 약 20 kDa, 적어도 약 30 kDa, 적어도 약 40 kDa, 적어도 약 50 kDa, 적어도 약 60 kDa, 적어도 약 70 kDa, 적어도 약 80 kDa, 적어도 약 90 kDa, 적어도 약 100 kDa, 적어도 약 110 kDa, 적어도 약 120 kDa, 적어도 약 130 kDa, 적어도 약 140 kDa, 적어도 약 150 kDa, 적어도 약 160 kDa, 적어도 약 170 kDa, 적어도 약 180 kDa, 적어도 약 190 kDa, 또는 적어도 약 200 kDa, 및 최대 400 kDa 또는 500 kDa의 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 표적 단백질은 항체 또는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgM, IgA, IgE, IgD, 및 IgG로부터 선택된 이소형이다. 일부 실시양태에서, IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 선택된다. 본 방법은 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 항체에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-GITR 항체, 항-CXCR4 항체, 항-CD73 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, 항-LAG3 항체, 항-CSF1R 항체, 또는 항-IL8 항체이다.
일부 실시양태에서, 표적 단백질은 효소, 호르몬, 시토카인, 세포 표면 수용체, 프로테아제, 시토카인 수용체, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 이종 모이어티에 융합된다. 일부 실시양태에서, 이종 모이어티는 반감기 연장 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 이종 모이어티는 알부민, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 부분, 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드, 이뮤노글로불린 G (IgG), 알부민-결합 폴리펩티드 (ABP), PAS화 모이어티, HES화 모이어티, XTEN, PEG화 모이어티, Fc 영역, 및 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 비-폴리펩티드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 Fc를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 Ig 불변 영역의 항원-비의존성 이펙터 기능, 특히 단백질의 순환 반감기를 변경시키는 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 부분에 대한 아미노산 치환을 포함한다 (예를 들어, Fc 변이체).
실시예
실시예 1
규모-축소 설계의 평가
잠재적인 회수 플러싱 공정을 평가하기 위해, 배관 크기에서의 변화를 분석하기 위해 규모-축소 모델을 설계하였다. 이러한 규모 축소 모델은 176cm2 막 면적을 사용하였고, 먼저 크기 16 배관을 사용하여 시험하였다. 모델링에 사용된 다양한 배관이 표 1에 기재되어 있다. 250 g/L의 출발 단백질 농도를 사용하였고, 다양한 플러싱 공급물 유량을 시험하였다. 이 데이터를 도 1에 나타내었다. 보다 높은 플러싱 공급물 유량은 보다 낮은 최종 단백질 농도로 이어지고, 따라서 도 1에서 관찰되는 바와 같이 보다 낮은 플러싱 유량이 바람직할 것이다.
표 1. 규모 의존성 배관
Figure pct00001
레이놀즈 수에 대한 유량 파라미터의 효과를 고정 점도 및 밀도를 갖는 혼합물을 사용하여 연구하였고, 도 2에 상세히 나타내었다. 혼합물은 17 cP의 점도 및 1.08g/cm3의 밀도를 가졌고, 30 리터/M2/시간의 고정 유량을 사용하였다. 사용된 다양한 배관의 단면에서의 차이로 인해, 각각의 배관에 대한 구체적인 유량은 조정되어야 했다. CM150 시스템에 대해서는 0.03L/분의 유량을 사용하였고, DCM에 대해서는 0.04L/분의 유량을 사용하였다.
레이놀즈 수에 대한 점도의 영향을 또한 0.019 m/s의 고정 유량을 사용하여 평가하였다. 이들 데이터를 도 3에 요약하였다. 보다 높은 점도는 각각의 배관 유형에서 보다 높은 계산된 레이놀즈 수로 이어졌다.
실시예 2
다양한 모노클로날 항체를 사용한 플러싱 전략의 평가
3종의 모노클로날 항체 (A, B, 및 C)를 설계된 플러싱 공정을 사용하여 평가하였다. 항체 A 플러싱 공정으로부터 수집된 데이터를 표 2에 상세히 나타내었다. 이들 데이터는 플러싱 플럭스 (LMH), 레이놀즈 수 (Re), 체류물 농도, 정제된 약물 물질 농도, 수율, 예상된 수율, 및 플러싱 부피를 포함한다. 규모-축소 플러싱 공정의 평가 후, 접근법을 또한 모노클로날 항체 A에 대한 CM150 접선 흐름 여과 (TFF) 규모에서 검증하였다. 모든 경우에, 유량은 30 리터/M2/시간의 플럭스로 설정되었다. CM150 시스템에서 사용된 배관의 단면을 고려하면, 이는 CM150 시스템에서 265의 레이놀즈 수에 상응한다. 모노클로날 항체 B 및 C에 대해 추가의 규모 축소 및 CM150 TFF 데이터를 생성하고, 이들 데이터를 각각 표 2 및 표 3에 제시한다.
표 2. 모노클로날 항체 A에 대한 데이터
Figure pct00002
표 3. 모노클로날 항체 B의 30 리터/M2/시간 회수 플러싱
Figure pct00003
표 3. 모노클로날 항체 C의 30 리터/M2/시간 회수 플러싱
Figure pct00004
발명의 상세한 설명 섹션은 청구범위를 해석하는데 사용되는 것으로 의도되며 발명의 내용 및 요약서 섹션은 그렇지 않다는 것이 인지될 것이다. 발명의 내용 및 요약서 섹션은 본 발명자(들)에 의해 고려된 바와 같은 본 발명의 하나 이상의 예시적인 측면을 제시하지만 본 발명의 모든 예시적인 측면을 제시할 수 있는 것은 아니므로, 본 발명 및 첨부된 청구범위를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명은 명시된 기능 및 그의 관계의 구현을 예시하는 기능적 빌딩 블록의 도움으로 상기 기재되었다. 이들 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본원에서 임의적으로 규정되었다. 명시된 기능 및 그의 관계가 적절하게 수행되는 한 대안적 경계가 규정될 수 있다.
구체적 측면의 상기 설명은 본 발명의 일반적 성질을 충분히 밝힐 것이며, 통상의 기술자는 관련 기술분야의 기술 내의 지식을 적용함으로써 본 발명의 일반적 개념에서 벗어나지 않으면서 과도한 실험 없이도 이러한 구체적 측면을 다양한 적용에 용이하게 변형 및/또는 적합화할 수 있다. 따라서, 이러한 적합화 및 변형은 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 측면의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서의 용어 또는 어구는 교시 및 지침에 비추어 통상의 기술자에 의해 해석되도록, 본원의 어구 또는 용어는 설명을 위한 것이지 제한하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
본 발명의 폭 및 범주는 상기 기재된 예시적인 측면 중 어떠한 것에 의해서도 제한되지 않아야 하고, 오직 하기 청구범위 및 그의 등가물에 따라 정의되어야 한다.

Claims (50)

  1. (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 완충제를 시간당 제곱 미터당 100 리터 (LMH) 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시킴으로써, 300 LMH의 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질의 희석과 비교하여 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 것을 포함하는, 여과 후 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 희석을 감소시키거나 방지하는 방법.
  2. (i) 여과가 진행되는 동안 표적 단백질을 함유하는 샘플을 공급물 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시키고, (ii) 회수 플러싱 동안 플러싱 완충제를 시간당 제곱 미터당 100 리터 (LMH) 미만인 플러싱 유량으로 여과 조립체를 통해 통과시킴으로써, 300 LMH의 플러싱 유량에 의해 수득되는 표적 단백질 농도와 비교하여 표적 단백질 농도를 개선시키는 것을 포함하는, 여과 후 회수 플러싱 동안 표적 단백질의 농도를 개선시키거나 증가시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 회수 플러싱에서 유동의 레이놀즈 수 ("Re")가 2000 미만, 1500 미만, 1000 미만, 900 미만, 800 미만, 700 미만, 600 미만, 500 미만, 400 미만, 300 미만, 200 미만, 100 미만, 90 미만, 80 미만, 70 미만, 60 미만, 50 미만, 40 미만, 30 미만, 20 미만, 10 미만, 5 미만, 4 미만, 또는 3 미만이고, 여기서 Re는 하기 식:
    Re = Dυρ/μ
    로 계산되며, 여기서 D는 비-원통형 유동 채널 기하구조의 경우의 채널의 직경 (m) 또는 등가 직경이고, υ는 평균 속도 (m/s) (Q/Ac)이고, ρ는 밀도 (kg/m3)이고, μ는 점도 (Pa·s)인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 회수 플러싱에서 유동의 Re가 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 45, 약 1 내지 약 40, 약 1 내지 약 35, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 40, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 6, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 6, 약 2 내지 약 5, 약 3 내지 약 10, 또는 약 4 내지 약 6인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 회수 플러싱에서 유동의 Re가 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 또는 약 30인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 회수 플러싱에서 유동의 Re가 약 3.8인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 플러싱 유량이 약 5 LMH 내지 약 100 LMH, 약 10 LMH 내지 약 100 LMH, 약 10 LMH 내지 약 90 LMH, 약 10 LMH 내지 약 80 LMH, 약 10 LMH 내지 약 70 LMH, 약 10 LMH 내지 약 60 LMH, 약 10 LMH 내지 약 50 LMH, 약 10 LMH 내지 약 40 LMH, 약 10 LMH 내지 약 30 LMH, 약 30 LMH 내지 약 50 LMH, 약 20 LMH 내지 약 100 LMH, 약 20 LMH 내지 약 90 LMH, 약 20 LMH 내지 약 80 LMH, 약 20 LMH 내지 약 70 LMH, 약 20 LMH 내지 약 60 LMH, 약 20 LMH 내지 약 50 LMH, 약 20 LMH 내지 약 40 LMH, 약 30 LMH 내지 약 100 LMH, 약 30 LMH 내지 약 90 LMH, 약 30 LMH 내지 약 80 LMH, 약 30 LMH 내지 약 70 LMH, 약 30 LMH 내지 약 60 LMH, 약 30 LMH 내지 약 50 LMH, 약 30 LMH 내지 약 40 LMH, 또는 약 20 LMH 내지 약 30 LMH인 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 플러싱 유량이 적어도 약 10 LMH, 적어도 약 20 LMH, 적어도 약 30 LMH, 적어도 약 40 LMH, 적어도 약 50 LMH, 적어도 약 60 LMH, 적어도 약 70 LMH, 적어도 약 80 LMH, 적어도 약 90 LMH, 또는 적어도 약 100 LMH인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 플러싱 유량이 약 30 LMH인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질의 점도가 높은 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 표적 단백질의 점도가 적어도 약 1 센티포아즈 (cP), 적어도 약 2 cP, 적어도 약 3 cP, 적어도 약 4 cP, 적어도 약 5 cP, 적어도 약 6 cP, 적어도 약 7 cP, 적어도 약 8 cP, 적어도 약 9 cP, 적어도 약 10 cP, 적어도 약 11 cP, 적어도 약 12 cP, 적어도 약 13 cP, 적어도 약 14 cP, 적어도 약 15 cP, 적어도 약 16 cP, 적어도 약 17 cP, 적어도 약 18 cP, 적어도 약 19 cP, 적어도 약 20 cP, 적어도 약 21 cP, 적어도 약 22 cP, 적어도 약 23 cP, 적어도 약 24 cP, 적어도 약 25 cP, 적어도 약 26 cP, 적어도 약 27 cP, 적어도 약 28 cP, 적어도 약 29 cP, 또는 적어도 약 30 cP인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 표적 단백질의 점도가 적어도 약 20 센티포아즈 (cP), 적어도 약 21 cP, 적어도 약 22 cP, 적어도 약 23 cP, 적어도 약 24 cP, 적어도 약 25 cP, 적어도 약 26 cP, 적어도 약 27 cP, 적어도 약 28 cP, 적어도 약 29 cP, 적어도 약 30 cP, 적어도 약 31 cP, 적어도 약 32 cP, 적어도 약 33 cP, 적어도 약 34 cP, 적어도 약 35 cP, 적어도 약 36 cP, 적어도 약 37 cP, 적어도 약 38 cP, 적어도 약 39 cP, 적어도 약 40 cP, 적어도 약 41 cP, 적어도 약 42 cP, 적어도 약 43 cP, 적어도 약 44 cP, 적어도 약 45 cP, 적어도 약 46 cP, 적어도 약 47 cP, 적어도 약 48 cP, 적어도 약 49 cP, 적어도 약 50 cP, 적어도 약 51 cP, 적어도 약 52 cP, 적어도 약 53 cP, 적어도 약 54 cP, 적어도 약 55 cP, 적어도 약 56 cP, 적어도 약 57 cP, 적어도 약 58 cP, 적어도 약 59 cP, 적어도 약 60 cP, 적어도 약 61 cP, 적어도 약 62 cP, 적어도 약 63 cP, 적어도 약 64 cP, 적어도 약 65 cP, 적어도 약 66 cP, 적어도 약 67 cP, 적어도 약 68 cP, 적어도 약 69 cP, 적어도 약 70 cP, 적어도 약 71 cP, 적어도 약 72 cP, 적어도 약 73 cP, 적어도 약 74 cP, 적어도 약 75 cP, 적어도 약 76 cP, 적어도 약 77 cP, 적어도 약 78 cP, 적어도 약 79 cP, 적어도 약 80 cP, 적어도 약 81 cP, 적어도 약 82 cP, 적어도 약 83 cP, 적어도 약 84 cP, 적어도 약 85 cP, 적어도 약 86 cP, 적어도 약 87 cP, 적어도 약 88 cP, 적어도 약 89 cP, 적어도 약 90 cP, 적어도 약 91 cP, 적어도 약 92 cP, 적어도 약 93 cP, 적어도 약 94 cP, 적어도 약 95 cP, 적어도 약 96 cP, 적어도 약 97 cP, 적어도 약 98 cP, 적어도 약 99 cP, 또는 적어도 약 100 cP인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 표적 단백질의 점도가 약 2 cP 내지 약 10 cP, 약 3cP 내지 약 10 cP, 약 1 cP 내지 약 9 cP, 약 2 cP 내지 약 8 cP, 약 2 cP 내지 약 7 cP, 약 2 cP 내지 약 6 cP, 약 3 cP 내지 약 6 cP, 약 4 cP 내지 약 5 cP, 또는 약 2 cP 내지 약 5 cP인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 농도가 여과 전 적어도 약 100 g/L, 적어도 약 110 g/L, 적어도 약 120 g/L, 적어도 약 130 g/L, 적어도 약 140 g/L, 적어도 약 150 g/L, 적어도 약 160 g/L, 적어도 약 170 g/L, 적어도 약 180 g/L, 적어도 약 190 g/L, 적어도 약 200 g/L, 적어도 약 210 g/L, 적어도 약 220 g/L, 적어도 약 230 g/L, 적어도 약 240 g/L, 적어도 약 250 g/L, 적어도 약 260 g/L, 적어도 약 270 g/L, 적어도 약 280 g/L, 적어도 약 290 g/L, 또는 적어도 약 300 g/L인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 농도가 약 100 g/L 내지 약 300 g/L, 약 110 g/L 내지 약 250 g/L, 약 120 g/L 내지 약 240 g/L, 약 150 g/L 내지 약 250 g/L, 약 130 g/L 내지 약 260 g/L, 약 140 g/L 내지 약 260 g/L, 약 160 g/L 내지 약 220 g/L, 또는 약 170 g/L 내지 약 230 g/L인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 농도가 약 90 g/L, 약 100 g/L, 약 110 g/L, 약 120 g/L, 약 130 g/L, 약 140 g/L, 약 150 g/L, 약 160 g/L, 약 170 g/L, 약 180 g/L, 약 190 g/L, 약 200 g/L, 약 210 g/L, 약 220 g/L, 약 230 g/L, 약 240 g/L, 약 250 g/L, 약 260 g/L, 약 270 g/L, 약 280 g/L, 약 290 g/L, 또는 약 300 g/L인 방법.
  17. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 수율이 (i) 및 (ii)로 이루어진 회수 플러싱 공정 전의 표적 단백질의 농도와 비교하여 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 플러싱 후의 표적 단백질의 수율이 300 LMH의 유량으로의 회수 플러싱 후에 수득되는 표적 단백질의 수율과 비교하여 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 또는 적어도 20% 증가되는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, (i)에서의 통과가 (ii)에서의 플러싱 유량보다 더 높은 공급물 유량으로 이루어지는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 공급물 유량이 적어도 200 LMH, 적어도 210 LMH, 적어도 220 LMH, 적어도 230 LMH, 적어도 240 LMH, 적어도 250 LMH, 적어도 260 LMH, 적어도 270 LMH, 적어도 280 LMH, 적어도 290 LMH, 적어도 300 LMH, 적어도 310 LMH, 적어도 320 LMH, 적어도 330 LMH, 적어도 340 LMH, 적어도 350 LMH, 적어도 360 LMH, 적어도 370 LMH, 적어도 380 LMH, 적어도 390 LMH, 적어도 400 LMH, 적어도 410 LMH, 적어도 420 LMH, 적어도 430 LMH, 적어도 440 LMH, 적어도 450 LMH, 적어도 460 LMH, 적어도 470 LMH, 적어도 480 LMH, 적어도 490 LMH, 또는 적어도 500 LMH인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 공급물 유량이 200 LMH 내지 500 LMH, 200 LMH 내지 450 LMH, 250 LMH 내지 450 LMH, 450 LMH, 300 LMH 내지 450 LMH, 300 LMH 내지 400 LMH, 또는 300 LMH 내지 350 LMH인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 공급물 유량이 약 300 LMH인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 여과 조립체가 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리아릴술폰, 재생 셀룰로스, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 셀룰로스 아세테이트, 폴리아크릴로니트릴, 비닐 공중합체, 폴리아미드 (예컨대 "나일론 6" 또는 나일론 66") 폴리카르보네이트, PFA, 또는 그의 임의의 조합으로부터 유래된 막을 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 플러싱 완충제가 유기 및 무기 산 또는 그의 염을 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 유기 또는 무기 산이 시트레이트 (예를 들어, 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물 등), 숙시네이트 (예를 들어, 숙신산-숙신산일나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산이나트륨 혼합물 등), 타르트레이트 (예를 들어, 타르타르산-타르타르산나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 (예를 들어, 푸마르산-푸마르산일나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨 혼합물, 푸마르산일나트륨-푸마르산이나트륨 혼합물 등), 글루코네이트 (예를 들어, 글루콘산-글루콘산나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산칼륨 혼합물 등), 옥살레이트 (예를 들어, 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 락테이트 (예를 들어, 락트산-락트산나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산칼륨 혼합물 등), 아세테이트 (예를 들어, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등), 트리메틸아민 염 (예를 들어, 트리스), 포스페이트, 또는 히스티딘인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 플러싱 완충제가 히스티딘을 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 플러싱 완충제가 당을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 당이 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 크실리톨, 에리트리톨, 락토스, 글루코스, 분말화 당, 또는 풀루란인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 플러싱 완충제가 20mM 히스티딘 및 250 mM 수크로스를 포함하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 여과 완충제가 (i) 동안 사용되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 여과 완충제가 플러싱 완충제와 동일한 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 여과 완충제가 플러싱 완충제와 상이한 것인 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 여과 완충제가 유기 및 무기 산 또는 그의 염을 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 유기 또는 무기 산이 시트레이트 (예를 들어, 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물 등), 숙시네이트 (예를 들어, 숙신산-숙신산일나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산이나트륨 혼합물 등), 타르트레이트 (예를 들어, 타르타르산-타르타르산나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 (예를 들어, 푸마르산-푸마르산일나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨 혼합물, 푸마르산일나트륨-푸마르산이나트륨 혼합물 등), 글루코네이트 (예를 들어, 글루콘산-글루콘산나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산칼륨 혼합물 등), 옥살레이트 (예를 들어, 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 락테이트 (예를 들어, 락트산-락트산나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산칼륨 혼합물 등), 아세테이트 (예를 들어, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등), 트리메틸아민 염 (예를 들어, 트리스), 포스페이트, 또는 히스티딘인 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 여과 완충제가 당을 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 당이 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 크실리톨, 에리트리톨, 락토스, 글루코스, 분말화 당, 또는 풀루란인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 플러싱 완충제 및/또는 여과 완충제가 pH 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 또는 약 9.5인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 순수한 단백질 샘플, 정화된 벌크 단백질 샘플, 세포 배양 샘플, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 세포 배양 샘플이 포유동물 세포를 포함하는 세포 배양 배지로부터 유래된 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HEK293 세포, 마우스 골수종 (NS0), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK), 원숭이 신장 섬유모세포 (COS-7), 마딘-다르비 소 신장 세포 (MDBK) 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된 것인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질이 항체 또는 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 표적 단백질이 항체를 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 항체가 IgM, IgA, IgE, IgD, 및 IgG로부터 선택된 이소형인 방법.
  44. 제43항에 있어서, IgG 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 선택된 것인 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항-GITR 항체, 항-CXCR4 항체, 항-CD73 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, 항-LAG3 항체, 항-CSF1R 항체, 또는 항-IL8 항체인 방법.
  46. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질이 효소, 호르몬, 시토카인, 세포 표면 수용체, 프로테아제, 시토카인 수용체, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  47. 제41항 또는 제46항에 있어서, 표적 단백질이 융합 단백질인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 융합 단백질이 이종 모이어티에 융합된 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 이종 모이어티가 반감기 연장 모이어티인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 반감기 연장 모이어티가 Fc를 포함하는 것인 방법.
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