相關申請案之交叉參考 本申請案主張2017年3月17日提交之美國臨時申請案第62/473,210號、2017年3月29日提交之美國臨時申請案第62/478,495號之優先權，其內容以全文引用之方式併入本文中。 序列表以引用之方式併入 本申請案與電子格式之序列表一起提交。序列表以2018年3月15日創建的大小為58,702位元組之名稱為616082010840SeqList.TXT之文件的形式提供。電子格式之序列表中之資訊以全文引用之方式併入本文中。
術語
呈現以下描述以使得一般熟習此項技術者能夠製得及使用各種實施例。僅提供特定方法組合物、技術及應用之描述作為實例。一般熟習此項技術者將容易地顯而易見本文所描述之實例之各種修改，且本文所描述之通用原理可應用於其他實例及應用，而不背離各種實施例之精神及範疇。因此，各種實施例不意欲限於本文所描述及展示之實例，但與申請專利範圍一致。 除非另外規定，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。若此章節中所闡述之定義與以引用方式併入本文中之專利、申請案、公開申請案及其他公開案中所闡述之定義相反或者不一致，則以此章節中所闡述之定義，而非以引用方式併入本文中的定義為準。本文所提供之標題僅為方便起見且不以任何方式限制本申請案。本文所提及之所有專利、申請案、公開之申請案及其他出版物以全文引用之方式併入本文中。 如本說明書中所使用，以下字語及片語一般意欲具有如在下文中所闡述之含義，但使用其之上下文另有說明之情況除外。術語「約」包括且描述值或參數本身。舉例而言，「約x」包括且描述「x」本身。在某些實施例中，當術語「約」結合測量值使用或用於改變值、單位、常數或值範圍時係指+/-1-10%之變化。在一些實施例中，當術語「約」結合測量值使用或用於改變值、單位、常數或值範圍時係指+/-5%之變化。在一些實施例中，當術語「約」結合測量值使用或用於改變值、單位、常數或值範圍時係指+/-10%之變化。術語「在…之間」包括且描述值或參數本身。舉例而言，「在x與y之間」包括且描述「x」及「y」本身。術語「及/或」包括替代方案中之標的物以及組合中之標的物。舉例而言，「x及/或y」包括「x或y」及「x及y」。此外，除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一(a)」及「該(the)」包括複數個參考物。因此，例如提及「抗體」包括多種此類抗體且提及「分析」包括提及熟習此項技術者已知之一或多種分析及其等效物。 應理解，本文所描述之本申請案之態樣及實施例包括「包含」、「組成」及「基本上由……組成」態樣及實施例。 如本文所使用之術語「抗體」意謂任何免疫球蛋白，包括單株雙特異性及多株抗體，包括IgG
1
、IgG
2a
、IgG
2b
、IgG
4
及其他。該術語在本文中用作集合名詞，其係指免疫球蛋白分子及/或免疫球蛋白分子之免疫學上活性部分之群體，亦即，含有抗體組合位點或互補位之分子。因此，提及「抗體」亦包括提及抗體之抗原結合片段中之任一者。抗體可來自廣泛多種宿主，且可為例如工程改造嵌合抗體或CDR移植抗體，包括人類化抗體。藉助於實例，一或多種抗體可衍生自任何哺乳動物種類，包括(但不限於)人類、猴、豬、馬、兔、狗、貓、鼠等或其他動物，諸如禽類(例如雞)。因此，術語「抗體」包括(但不限於)免疫球蛋白分子同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、免疫球蛋白分子亞同型(例如lgG1、lgG2、lgG3、lgG4、lgA1及lgA2)、免疫球蛋白分子同種異型(例如Gm，例如G1 m (f、z、a或x)、G2m (n)、G3m (g、b或c)、Am、Em及Km (1、2或3))、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、由至少兩個不同抗原決定基結合片段形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、CDR移植人類抗體、人類化抗體、駱駝源化 抗體、嵌合抗體、抗個體基因型(抗Id)抗體、胞內抗體、其抗原結合片段、以重組方式產生之抗體片段及其類似者。適用於本申請案中之抗體理解為對蛋白質A具有親和性。 術語「mAb」係指單株抗體。術語「半抗體」係指與一個免疫球蛋白輕鏈相關聯之一個免疫球蛋白重鏈。熟習此項技術者將亦認識到，術語「半抗體」可指Fab或Fab'片段。 術語「抗體片段」、「抗原結合片段」或其變化形式係指展現所需生物活性之抗體或抗原結合片段。抗體片段可藉由此項技術中常用之方法產生，諸如以重組方式產生。藉助於實例，「抗體片段」、「抗原結合片段」或其變化形式包括(但不限於)抗體片段，其包括可變重鏈及輕鏈結構域、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、Fab'片段、F(ab')
2
片段、抗原決定基結合片段或本文所描述之抗體中之任一者之衍生物。 「分離抗體」包括實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體之抗體(例如特異性結合MMP-9之分離抗體實質上不含特異性結合除MMP-9外之抗原之抗體)。另外，分離抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學品。 術語「靶抗體」、「靶抗原-結合片段」、「所需抗體」、「所需抗原結合片段」、「純化抗體」、「純化抗原結合片段」或其變化形式可指抗體或其抗原結合片段，其展現所需生物活性且由宿主細胞表現，繼而根據本發明之分離、純化方法或製程。因此，靶抗體或其抗原結合片段可實質上不含其他細胞材料及/或雜質。如本文所使用，靶抗體可指將適合與本文所描述之方法一起使用之任何抗體。在一個實施例中，適用於本文所描述之方法之靶抗體為抗MMP抗體(諸如抗MMP9抗體)、抗LOX抗體、抗LOXL抗體(包括抗LOXL2抗體)或抗DDR抗體(包括抗DDR2抗體)。 術語「獲自方法之抗體」或其變化形式係指藉由本文所描述之方法中之任一者純化、產生、處理或分離之抗體或抗體片段。在一些實施例中，抗體或抗體片段為靶抗體。在一些實施例中，抗體或抗體片段為分離抗體。 術語「雜質」、「產物雜質」或其變化形式係指除包含靶抗體或其抗原結合片段之樣品或混合物或組合物中存在之靶抗體、其抗原結合片段或抗體片段外，非所需化學或生物學材料，包括生物學大分子，諸如DNA、RNA或蛋白質。不受任何理論束縛，「雜質」、「產物雜質」或其變化形式可由沿著所需抗體產物(來自非酶促及/或酶促反應)、自樣品或混合物移除聚集體或宿主細胞蛋白質之肽主鏈一或多個鍵之非所需破壞所產生以使得所得抗體將在無非所需不良作用之情況下提供治療益處之片段產生。在一些實施例中，雜質可為來自HCCF之非所需材料。在某些實施例中，雜質可為來自HCP之非所需材料，諸如磷脂酶-B類2蛋白質(PLBL2)。在某些實施例中，雜質可為藉由含有肽延伸部分修飾之靶抗體。本文所使用之術語「聚集體」意謂兩個或多於兩個個別分子之聚結或低聚，包括(但不限於)蛋白質二聚體、三聚體、四聚體、寡聚物及其他高分子量物種。聚集體可為可溶或不可溶的。 本文所使用之術語「片段」係指歸因於肽鏈、酶促及/或化學修飾之解離來自靶分子之任何截斷蛋白質種類。 術語「宿主細胞蛋白質」(HCP)、「宿主細胞蛋白質」(HCP)或其變化形式係指衍生自宿主細胞之非靶蛋白質相關蛋白質類雜質。藉助於實例，HCP包括(但不限於)宿主磷脂酶-B類2蛋白質(PLBL2)。 術語「細胞培養物上清液」係指藉由培養產生相關重組抗體或靶抗體之宿主細胞獲得之溶液。除了重組抗體或靶抗體之外，細胞培養物上清液亦可包括細胞培養基之組分、宿主細胞分泌之代謝副產物以及經培養細胞之其他組分。在一些實施例中，細胞培養物上清液可為其中已移除或採集宿主細胞之組合物，以使得細胞培養物上清液一般不含細胞碎片及/或完整細胞。在某些實施例中，使用離心機及/或深度過濾採集細胞培養上清液以產生採集細胞培養液(HCCF)。HCCF包括HCP及靶抗體。 片語「宿主細胞(host cell/host cells)」係指表現重組多肽，例如重組抗體或重組抗體片段之細胞。如本發明中所使用，宿主細胞可或已吸收核酸，諸如載體，且支持核酸複製及一或多種經編碼產物產生。此外，宿主細胞係指多種細胞類型，包括(但不限於)原核細胞，諸如大腸桿菌(
Escherichia coli
)、雷特氏乳球菌(
Lactococcus lactis
)及芽孢桿菌屬(
Bacillus
)；真核細胞，包括酵母細胞，諸如巴斯德畢赤酵母(
Pichia pastoris
)、甲醇畢赤酵母(
Pichia methanolica
)及釀酒酵母(
Saccharomyces cerevisiae
)；昆蟲細胞，諸如桿狀病毒(bacuolovirus)及真核細胞；哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚腎(HEK 293)細胞、Vero細胞、嬰兒倉鼠腎(BHK)細胞、HeLa細胞、CV1猴腎細胞、馬丁-達比犬腎臟(MDCK)細胞、3T3細胞、骨髓瘤細胞株、COS細胞(例如COS1及COS7)、PC12、WI38細胞。在一些情況下，宿主細胞可涵蓋細胞之組合或混合物，諸如不同細胞類型或細胞株之混合培養物。 術語由包括靶抗體或其所需片段及一或多種污染物之組合物或溶液「純化(purify/purifying)」靶抗體或所需其片段意謂藉由自組合物或溶液移除(完全或部分)至少一種污染物提高靶抗體或其所需抗體片段在組合物或溶液中之純度。根據本申請案，本文所描述之方法將產生經純化(亦即，純化抗體)或實質上不含非所需分子之抗體或靶抗體，該等非所需分子諸如雜質、產物雜質、聚集體、片段、蛋白質、核酸、細胞培養物上清液、宿主細胞或宿主細胞蛋白質。藉助於實例，術語「蛋白質A純化抗體」提及藉由將混合物或宿主細胞培養液裝載至蛋白質A層析基質上產生、純化、處理或分離之抗體或靶抗體。蛋白質A純化抗體可進一步藉由本文所描述之一或多個步驟或方法產生、純化、處理或分離以產生最終純化或分離抗體。舉例而言，蛋白質A純化抗體將經受與深度過濾、膜過濾、陽離子交換層析、混合模式層析、超過濾、透濾或其組合結合之一或多個步驟以產生最終純化抗體或最終分離抗體。使用本文所描述之方法純化、產生、處理或分離之抗體可用於任何適合的目的，包括且不限於特徵、測試、評估以及活體外、活體內動物研究、臨床前研究、臨床研究、診斷、偵測、治療或處理。在一些實施例中，經純化抗體或分離抗體可用於或製備用於醫藥學上可接受之組合物。 術語「結合(bind/binding)」或其變化形式在論述分子與管柱材料之間的相互作用時意謂在使得分子可逆地固定於管柱材料之中或之上之條件下使分子曝露於管柱材料。 術語「移除(remove/removal)」或其變化形式當用於移除抗體碎片化產物雜質之上下文中時係指純化產物中抗體碎片化產物雜質之量降低。移除可或可不導致純化產物中之雜質不存在。藉助於實例，移除係指當與初始組合物中之雜質含量相比時，純化產物中之雜質降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍及高達30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。 術語「實質上純」係指主要種類存在之靶材(例如以莫耳計，其比組合物中之任何其他個別種類更豐富)。在一個實施例中，實質上純化部分為其中靶材佔存在之所有大分子物質之至少約50% (以莫耳計)之組合物。一般而言，實質上純組合物可包括相比於組合物中存在之所有大分子物質超過約80%靶分子，或超過約85%、超過約90%、超過約95%、超過約96%、超過約97%、超過約98%或超過約99%靶材。在一個實施例中，靶材純化至必需均勻性(藉由習知偵測方法在組合物中無法偵測出污染物質)且組合物包括基本上單一大分子物質，例如靶大分子或靶抗體。 術語「實質上無」、「實質上不含」或其變化形式係指以重量、體積或百分比計具有小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約19%、小於約18%、小於約17%、小於約16%、小於約15%、小於約14%、小於約13%、小於約12%、小於約11%、小於約10%、小於約9%、小於約8%、小於約7%、小於約6%、小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%或小於約1%非所需分子(諸如雜質產物雜質、聚集體、片段、蛋白質、核酸、細胞培養物上清液、宿主細胞或宿主細胞蛋白質)之靶材(諸如靶抗體、純化抗體或分離抗體)。在一個實施例中，「實質上純」或「實質上不含」係指不含雜質之靶材或抗體製劑。在某些實施例中，「實質上無」係指具有約20%或小於20%非所需分子、約19%或小於19%非所需分子、約18%或小於18%非所需分子、約17%或小於17%非所需分子、約16%或小於16%非所需分子、約15%或小於15%非所需分子、約14%或小於14%非所需分子、約13%或小於13%非所需分子、約12%或小於12%非所需分子、約11%或小於11%非所需分子、約10%或小於10%非所需分子、約9%或小於9%非所需分子、約8%或小於8%非所需分子、約7%或小於7%非所需分子、約6%或小於6%非所需分子、約5%或小於5%非所需分子、約4%或小於4%非所需分子、約3%或小於3%非所需分子、約2%或小於2%非所需分子或約1%或小於1%非所需分子之靶材或抗體製劑。 術語「重組」係指已人工或以合成方式(亦即，非天然)改變或藉由人工干預產生之生物材料，例如核酸或蛋白質。 術語「重組人類抗體」包括藉由重組手段製備、表現、產生或分離之人類抗體，諸如使用經轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體、自重組組合人類抗體庫分離之抗體、自人類免疫球蛋白基因轉基因之動物(例如小鼠)分離之抗體(參見例如Taylor, L. D.等人(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295，其全部教示內容以引用之方式併入本文中)或藉由涉及人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他手段製備、表現、產生或分離之抗體。此類重組人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區(參見Kabat, E. A.等人(1991)(相關免疫學之蛋白質之序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第五版,美國健康及公共服務部(U.S. Department of Health and Human Services), NIH公開案第91-3242號)。 術語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)包括已引入重組表現載體之細胞。應理解，此類術語意欲不僅指特定個體細胞，而且指此類細胞之後代。由於某些修飾可能因突變或環境影響而於後代中發生，此類後代可能實際上不與親本細胞相同，但仍包括於如本文所使用之術語「宿主細胞」之範疇內。 術語「多肽」或「蛋白質」可互換使用以指代具有兩個或多於兩個藉由肽鍵彼此接合之胺基酸殘基之分子。術語「多肽」係指抗體及其他非抗體蛋白質。非抗體蛋白質包括(但不限於)蛋白質，諸如細胞表面蛋白、分泌蛋白及融合蛋白或其片段之酶、受體、配位體。多肽可或可不融合至另一多肽。多肽亦可包括修飾，諸如(但不限於)糖基化、脂質附著、硫酸化、麩胺酸殘基之γ-羧基化、羥基化及ADP-核糖基化。多肽可具有科學或商業利益，包括基於蛋白質之治療劑。 術語「核酸分子」包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股的，但在一個態樣中為雙股DNA。片語「分離之核酸分子」亦意欲包括編碼二價雙特異性抗體之序列，諸如雙功能抗體，其中VH及VL區域不含有除雙功能抗體序列外之其他序列。 術語「病毒降低/不活化」係指特定樣品中之病毒粒子之數目降低(decrease)(「降低(reduction)」)，以及活性，例如(但不限於)在特定樣品中複製病毒粒子之感染力或能力降低(「不活化」)。病毒粒子之數目及/或活性之此類降低可為近似1%至約99%、約20%至約99%、約30%至約99%、約40%至約99%、約50%至約99%、約60%至約99%、約70%至約99%、約80%至99%及約90%至約99%。在某些非限制性實施例中，純化抗體產物中之病毒(若存在)之量小於病毒之ID
50
(將感染50百分比目標群體之病毒之量)，比該病毒之ID
50
小至少10倍，比該病毒之ID
50
小至少100倍，且比該病毒之ID
50
小至少1000倍。 如本文所使用之術語「深度過濾」意謂用包含矽藻土之過濾裝置過濾。在一些實例中，深度過濾利用遍及多孔過濾介質保留粒子之多孔過濾介質，諸如藉由包含矽藻土。此深度過濾裝置可為由具有逐漸降低之孔徑之一系列堆疊過濾器構成之多層過濾裝置且可具有三維迷宮類結構。此類深度過濾裝置之作用機制之實例包括(但不限於)裝置為陽離子性的且因此結合陰離子物質，諸如DNA及宿主細胞蛋白質之機制。或者，裝置為陰離子性的且因此結合陽離子性物質。 如本文所使用之術語「膜過濾」一般意謂使用物理阻擋層、多孔膜或過濾器分離流體中之粒子或流體中之濃分子之技術。基於粒子尺寸及形狀，使用壓力及具有不同孔徑之經專門設計之膜分離粒子。膜過濾方法包括反滲透、奈米過濾、超過濾及微過濾以便提高孔徑。 如本文所使用之術語「超過濾」係指藉由將組合物傳送通過一或多個具有指定孔徑直徑之半可滲透過濾器(或膜或介質)分離雜質之方法，其中較大分子量分子(例如＞100 Da)殘留於過濾器上且較低分子量分子傳送通過過濾器。較低分子量分子可為介質組分、抗體片段及/或其他雜質(污染物)，諸如脂多醣。 如本文所使用之術語「透濾」係指使用超過濾膜以自含有蛋白質、肽、核酸及其他生物分子之溶液完全移除、代替或降低鹽或溶劑之濃度。 如本文所使用之術語「賦形劑」係指常用作用於藥物之稀釋劑、媒劑、防腐劑、黏合劑或穩定劑之惰性物質，其賦予調配物有利的物理特性，諸如提高的蛋白質穩定性、提高的蛋白質溶解度及/或降低的黏度。賦形劑之實例包括(但不限於)蛋白質(例如(但不限於)血清白蛋白)、胺基酸(例如(但不限於)天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、甘胺酸)、界面活性劑(例如(但不限於) SDS、Tween 20、Tween 80、聚山梨醇酯及非離子界面活性劑)醣類(例如(但不限於)葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及海藻糖)、多元醇(例如(但不限於)甘露糖醇及山梨糖醇)、脂肪酸及磷脂(例如(但不限於)磺酸烷基酯及辛酸酯)。 如本文所使用之術語「醫藥學上可接受」意謂聯邦或州政府之監管機構批准或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)、歐洲藥典(European Pharmacopeia)或其他公認藥典中用於動物，且更尤其用於人類。 術語「穩定性」、「穩定」或其變化形式當用於以重組方式產生之多肽之調配物，例如包括以重組方式產生之抗體或抗體片段之醫藥調配物之上下文中時係指調配物中之多肽在製造、製備、運輸及儲存條件下粒子形成、聚集、降解或碎片化之耐性。「穩定」調配物在製造、製備、運輸及儲存條件下保留生物活性。相比於參考調配物，可藉由如HPSEC、靜態光散射(SLS)、傅立葉變換紅外光譜分析(FTIR)、圓二色譜(CD)、脲去摺疊技術、內在色胺酸螢光、差示掃描熱量測定及/或ANS結合技術所量測之粒子形成、聚集、降解或碎片化程度評估穩定性。 獲自多種來源之抗體通常含有衍生自宿主及/或細胞培養物基質之雜質。用於純化根據本申請案之抗體之方法用於移除一或多種非所需雜質。在某些態樣中，該等方法用於移除宿主細胞蛋白質(HCP)，磷脂酶-B類2蛋白質(PLBL2)。在一個實施例中，本申請案之方法適用於自HCCF，諸如PLBL2移除雜質。 在某些實施例中，本申請案之方法產生至少60%之HCCF抗體回收率。在某些實施例中，本申請案之方法產生至少65%之HCCF抗體回收率。在某些實施例中，本申請案之方法產生至少70%之HCCF抗體回收率。在實施例中，抗體回收率為約70%至約100%，約80%至約100%，或約85%至約95%。在另一實施例中，抗體回收率為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%及在其之間的任何範圍。在某些實施例中，本申請案之方法產生HCP含量相比於HCCF降低約500倍至約50,000倍、約1,000倍至約40,000倍、約10,0000倍至約30,0000倍之純化抗體製劑。在一個實施例中，本申請案之方法產生HCP含量相比於HCCF降低500倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、40,000倍或50,000倍及在其之間的任何範圍之純化抗體製劑。在某些實施例中，本申請案之方法產生PLBL2含量相比於HCCF降低約50倍至約10,000倍之純化抗體製劑。在一個實施例中，PLBL2含量降低約100倍至約1000倍。在一個實施例中，純化抗體中之PLBL2含量相比於HCCF降低約300倍。 在某些實施例中，本申請案之方法產生至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、或至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%之HCCF靶抗體回收率。在一些實施例中，靶抗體回收率為約70%至約100%，約80%至約100%，或約85%至約95%。在另一實施例中，靶抗體回收率為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%及在其之間的任何範圍。在某些其他實施例中，本申請案之方法產生HCP含量相比於HCCF降低約500倍至約50,000倍、約1,000倍至約40,000倍、約10,0000倍至約30,0000倍之純化靶抗體製劑。在一個實施例中，本申請案之方法產生HCP含量相比於HCCF降低500倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、40,000倍或50,000倍及在其之間的任何範圍之純化靶抗體製劑。在某些實施例中，本申請案之方法產生PLBL2含量相比於HCCF降低約50倍至約10,000倍之純化靶抗體製劑。在一個實施例中，PLBL2含量降低約100倍至約1000倍。在一個實施例中，純化靶抗體中之PLBL2含量相比於HCCF降低約300倍。
抗體
本發明之抗體可藉由多種技術，包括具有相關抗原之動物之免疫接種，繼而習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein (1975) Nature 256:495之標準體細胞雜交技術產生。儘管較佳為體細胞雜交程序，但原則上可採用生產單株抗體之其他技術，例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉化。在一個實施例中，用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統。 產生融合瘤為經極良好確立之程序。分離經免疫接種之脾細胞用於融合之免疫接種方案及技術為此項技術中已知。融合搭配物(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序亦為已知。 本發明之嵌合或人類化抗體可基於如本文所描述製備之非人類單株抗體之序列製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可獲自相關非人類融合瘤且使用標準分子生物學技術經工程改造以含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。舉例而言，為了產生嵌合抗體，鼠類可變區可使用此項技術中已知之方法連接至人類恆定區(參見例如美國專利第4,816,567號)。為了產生人類化抗體，鼠類CDR區可使用此項技術中已知之方法插入至人類框架中(參見例如美國專利第5,225,539號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。任何以重組方式表現、培養或以其他方式產生之抗體可使用本文所描述之方法純化。在某些實施例中，適合於與本文所描述之方法一起使用之抗體為抗LOXL2抗體、抗MMP9抗體、抗DDR1抗體及抗DDR2抗體。 可使用本文所描述之方法純化之抗體包括且不限於抗MMP抗體(包括抗MMP9抗體)、抗LOX抗體、抗LOXL2抗體(抗LOXL2抗體)及抗DDR抗體(包括抗DDR1抗體)。抗MMP9抗體之實例包括且不限於U.S. 2015-0140580、美國專利第8,377,443號、第8,501,916號、第9,120,863號及第9,260,532號中所揭示之彼等者，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含重鏈多肽，其包含選自由SEQ ID NO:2、20、36及45組成之群的胺基酸序列。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含輕鏈多肽，其包含選自由SEQ ID NO:3、21、30、35及46組成之群的胺基酸序列。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含重鏈多肽，其包含可變區，該可變區包含選自由SEQ ID NO:4、6-9、22及37組成之群的胺基酸序列。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含輕鏈多肽，其包含可變區，該可變區包含選自由SEQ ID NO:5、10-13、23、31及38組成之群的胺基酸序列。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含重鏈多肽，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:14-16之互補決定區(CDR)。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含輕鏈多肽，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:17-19之互補決定區(CDR)。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含重鏈多肽，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:24-26之互補決定區(CDR)。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含輕鏈多肽，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:27-29之互補決定區(CDR)。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含輕鏈多肽，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:32-34之互補決定區(CDR)。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含重鏈多肽，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:39-41之互補決定區(CDR)。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含輕鏈多肽，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:42-44之互補決定區(CDR)。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含重鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2；及輕鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3，且該抗體可稱為AB0041。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含：包含可變區之重鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4；及包含可變區之輕鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 5，且該抗體可稱為AB0041。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含：重鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:36；及輕鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:35，且該抗體可稱為AB0046。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含：包含可變區之重鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 37；及包含可變區之輕鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 38，且該抗體可稱為AB0046。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含：重鏈多肽，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:39-41互補決定區(CDR)；及輕鏈多肽，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:42-44之互補決定區(CDR)。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含：重鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:45；及輕鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:46。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含：包含可變區之重鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 8；及包含可變區之輕鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 13。在某一實施例中，抗MMP9抗體包含：重鏈多肽，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:14-16之互補決定區(CDR)；及輕鏈多肽，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:17-19之互補決定區(CDR)。在一個實施例中，抗MMP9抗體具有：包含可變區之重鏈多肽CDR，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 8；及包含可變區之輕鏈多肽CDR，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 13。在某一實施例中，本文所描述之方法可用於從混合物或宿主細胞培養物產生、處理、純化或分離抗MMP9抗體AB0045。 抗LOX抗體及抗LOXL2抗體之實例包括且不限於WO 2009/035791及US 2009/0053324中描述之彼等者，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。在某一實施例中，抗LOXL2抗體包含重鏈多肽，其包含可變區，該可變區包含選自由SEQ ID NO:47及49組成之群的胺基酸序列。在某一實施例中，抗LOXL2抗體包含輕鏈多肽，其包含可變區，該可變區包含選自由SEQ ID NO:48及50組成之群的胺基酸序列。在某一實施例中，抗LOXL2抗體包含：包含可變區之重鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:47；及包含可變區之輕鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:48，且該抗體可稱為AB0023。在某一實施例中，抗LOXL2抗體包含：包含可變區之重鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:49；及包含可變區之輕鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:50，且該抗體可稱為AB0024。在一個實施例中，抗LOXL2抗體具有：包含可變區之重鏈多肽CDR，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:49；及包含可變區之輕鏈多肽CDR，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:50，且該抗體可稱為AB0024。在某一實施例中，本文所描述之方法可用於從混合物或宿主細胞培養物產生、處理、純化或分離抗LOXL2抗體AB0024。本文所描述之方法可適合於純化、處理、產生或分離包含選自由以下組成之群的序列之抗體：SEQ ID NO:2、3、4、5、8、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或其組合。
抗體產生
在本申請案之製程或方法之前，可視抗體表現之位點或位置而定，進行純化細胞碎片抗體之初始程序。一些抗體可直接由細胞分泌至周圍生長介質中；其他在細胞內製得。對於後面的抗體，純化處理之第一步驟典型地涉及：溶解細胞，其可藉由多種方法，包括機械剪切、滲壓衝擊或酶促處理進行。此類破壞使細胞之整個內含物釋放至均質物中，且另外產生次細胞片段，其歸因於其較小尺寸而難以移除。此等一般藉由差速離心或藉由過濾移除。在分泌抗體之情況下，來自此類表現系統之上清液一般首先使用可商購蛋白質濃縮過濾器，例如Amicon™或Millipore Pellicon™超過濾單元濃縮。在抗體分泌於培養基中之情況下，重組宿主細胞亦可例如藉由切向流過濾與細胞培養基分離。抗體可進一步使用本文所描述之抗體純化方法由培養基回收。 本申請案提供一種用於從包含抗體及至少一種HCP或雜質之混合物產生純化(或「HCP降低」或「雜質降低」)抗體製劑之方法。當抗體已使用上文所描述之方法及此項技術中之習知方法產生時，本文所描述之純化處理在分離步驟時開始。純化流程可包含採集、深度過濾、蛋白質A層析、病毒不活化、pH調整、陽離子交換層析、混合模式層析、病毒過濾及/或超過濾/透濾之步驟。此流程之變體包括(但不限於)省去陽離子交換層析、省去混合模式層析之變體，及/或設想逆轉精細純化步驟之次序且在呈現範疇內。在一些實施例中，純化流程包含以下步驟：採集(使用離心機及/或深度過濾)、蛋白質A層析(包括由混合物，諸如具有蛋白質A基質之HCCF，之後一或多個洗滌溶液裝載/吸收/捕集靶抗體)、病毒不活化(使用低pH，諸如約3.4至約3.8之pH持續30-90分鐘以便不活化)、pH調整(調節至約5.0至約7.5之pH，諸如6.0之pH，深度過濾C0HcX0HC)、陽離子交換層析(使用陽離子交換基質，諸如Poros XS)、混合模式層析(使用混合模式基質，諸如Capto黏著)、病毒過濾(用於移除剩餘病毒)及超過濾透濾(用於濃縮及調配蛋白質)。 在已獲得包含抗體之澄清溶液或混合物(亦即，採集細胞培養液(HCCF))後，使用不同純化技術組合，包括蛋白質A層析、離子交換分離步驟及疏水相互作用分離步驟進行抗體與諸如HCP之細胞產生之其他蛋白質之分離。分離步驟基於其電荷、疏水度或尺寸或其組合分離蛋白質混合物。分離可使用層析，包括蛋白質A樹脂及陽離子、陰離子及疏水相互作用進行。可採用若干不同層析樹脂以相對於特定所涉及之蛋白質，諸如靶抗體，控制或改變純化流程。各種蛋白質可以不同速率沿管柱向下遷移，實現隨著其沿管柱進一步向下傳送提高之物理分離，或選擇性地黏著至分離介質，隨後藉由不同溶劑區別地溶離。在一些情況下，當雜質尤其黏著於管柱且抗體不黏著於管柱，亦即，抗體存在於流通物中時抗體與雜質分離。其他因子可包括但不限於：因為蛋白質A結合於Fc區，Fc區之存在或不存在(例如在相比於其Fab片段之全長抗體之情形下)；在產生相關抗體時採用之特定生殖系序列；抗體(例如抗體之一級序列以及該分子之總體電荷/疏水性)之胺基酸組成；及抗體修飾，諸如肽延伸部分之存在。可使用經調整以利用該特徵之純化策略純化共用一或多個特徵之抗體。 本文所描述之方法將適用於處理、分離或純化任何抗體。抗體可在細胞培養物中、在噬菌體中或在各種動物中產生，該等動物包括(但不限於)牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、綿羊、狗、貓、猴、黑猩猩及猿。適用於本發明方法中之抗體可來自任何物質，但典型地為哺乳動物抗體。在一個實施例中，藉由此項技術中已知之重組手段產生抗體。舉例而言，重組抗體可藉由用包含編碼該抗體之DNA序列之載體轉染宿主細胞產生。一或多個載體可用於轉染表現宿主細胞中之至少一個可變輕鏈(VL)區及一個可變重鏈(VH)區之DNA序列。抗體產生及製造之重組手段之例示性描述包括Delves、抗體產生：必需技術(Wiley，1997)；Shephard等人,單株抗體(Monoclonal Antibodies)(牛津大學出版社(Oxford University Press), 2000)；及Goding, 單株抗體：原理及實踐(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice) (學術出版社(Academic Press), 1993)。此外，抗體可根據Kenney等人(「使用分泌捕集報導網製造單株抗體(Production of monoclonal antibodies using a secretion capture report web). 」Biotechnology 13:787-790, 1995)描述之方案製得。簡言之，用佐劑調配物中之抗原皮下注射(s.c.)小鼠。對於肽抗原，在免疫接種之前，肽共軛至牛血清白蛋白且調配於弗氏佐劑(FA)中。對於蛋白質抗原，蛋白質調配於鋁膠-胞壁醯二肽(ALD/MDP)佐劑中。分離來自該小鼠之脾臟及淋巴結之細胞且與適當的細胞融合且培養。分離次黃嘌呤-胺基喋呤-胸苷(HAT)選擇細胞之融合瘤庫且選殖。分選細胞且篩選血清及上清液是否存在抗體。 為高水準製造，使用最廣泛之哺乳動物表現系統為利用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中之二氫葉酸還原酶(「dhfr-」)或GS (谷醯胺酸合成酶)表現系統提供之基因擴增程序之一者。該系統為熟習此項技術者熟知的。該系統基於二氫葉酸還原酶「dhfr」基因，其編碼DHFR酶，其催化二氫葉酸轉化成四氫葉酸。用於細胞株產生之選擇系統之另一熟知實例為谷醯胺酸合成酶(GS)表現系統。GS為可與GS陰性及野生型細胞，諸如含有活性內源性GS基因之CHO細胞一起使用之顯性可選擇標記物。GS選擇需要使用GS酶抑制劑甲硫胺酸磺基肟(MSX)或使用不具有功能GS酶活性以及谷醯胺酸游離選擇之工程改造細胞株。為了實現高產量，用含有功能dhfr或GS基因以及編碼所需蛋白質之基因之表現載體轉染CHO細胞。在此情況下，所需蛋白質為重組抗體重鏈及/或輕鏈。 另外，抗體及抗體片段在諸如大腸桿菌(
E.coli
)之原核細胞中之表現在此項技術中沿用已久(Pluckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991)。培養物中之真核細胞之表現可供熟習此項技術者用作產生抗體及抗原結合片段之選擇方案(Raff, M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4:573-576；Trill J. J.等人(1995) Curr. Opinion Biotech 6:553-560)。在一個實施例中，靶抗體為抗離胺醯氧化酶同源物2 (LOXL2)抗體及其功能性片段，其可根據此項技術中熟知之方法產生。包括AB0023及AB0024之例示性抗LOXL2抗體描述於WO 2009/035791及US 2009/0053324中。在另一實施例中，抗體為抗金屬蛋白酶9 (MMP9)抗體及其功能性片段，其可根據此項技術中熟知之方法產生。包括AB0041及AB0045之例示性抗MMP9抗體及其片段揭示於U.S. 2015-0140580、美國專利第8,377,443號、第8,501,916號、第9,120,863號及第9,260,532號中。 在產抗體細胞之活體外培養之後，採集細胞培養液，由此提供HCCF。HCCF隨後根據本發明之方法經受純化。獲自其他來源之抗體亦可根據本文所揭示之方法純化。
層析
本申請案之實施例採用固定化蛋白質A基質作為純化抗體中之蛋白質A親和步驟。適合的蛋白質A親和基質包括(但不限於)MabSelect SuRe
TM
、MabSelect SuRe PCC
TM
、MabSelect SuRe LX
TM
(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA), Amsphere Protein A™樹脂(JSR Life Sciences)及ProSep® Ultra Plus (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)。在一些情況中，將測定蛋白質A樹脂對相關抗體之動態結合力(DBC)。舉例而言，MabSelect™管柱之DBC可藉由單一流動速率裝載或雙重流速裝載策略測定。單一流動速率裝載可在整個裝載時間段期間在約300 cm/hr之速度下評估。雙重流動速率裝載策略可藉由以約300 cm/hr之線性速度裝載管柱直至約35 mg蛋白質/mL樹脂，隨後使線性速度降低一半以允許裝載之最後部分滯留更長時間來測定。固定化蛋白質A基質可呈管柱形式或可用作批料純化中之漿料。用於用MabSelect™ SuRe包裝之適合的管柱包括1.0 cm×21.6 cm管柱(約17 mL床體積) (其可適用於小規模純化)或20 cm×21 cm管柱(約6.6 L床體積) (其可適用於大規模純化)。無論是以管柱還是批料形式採用，蛋白質A親和性層析方法為此項技術中已知的。如本文所使用，術語「層析」、「基質」或「層析基質」為可互換的。 在一些實施例中，蛋白質L基質用作蛋白質A基質之替代物，且在一些實施例中，相對於蛋白質A層析根據本文所描述之方法中之一或多者以及此項技術中已知之蛋白質L層析之彼等方法使用。在一個實施例中，蛋白質L基質為Capto L (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)。 在一個實施例中，蛋白質A基質為MabSelect SuRe
TM
，在下文中稱為MSS。蛋白質A基質可在樣品(諸如HCCF)裝載之前用適合的溶液平衡。在平衡之後，蛋白質A基質可視情況在樣品裝載之前使用平衡溶液或不同溶液洗滌一或多次。在允許靶抗體吸收至蛋白質A基質所需時間之後，將採用一或多種洗滌溶液以移除HCP。隨後，用蛋白質A基質純化之靶抗體(亦即，蛋白質A純化抗體)將使用適當的溶離溶液溶離。在某些實施例中，平衡溶液包含25 mM Tris、25 mM NaCl，且pH係約7.7。在一些實施例中，溶離溶液包含40 mM乙酸且pH係約3.1。在其他實施例中，蛋白質A基質在樣品裝載之前及之後用平衡溶液平衡。 溶離可使用熟習此項技術者熟知之技術監測。舉例而言，可使用280 nm處之吸收率，且可自約0.5 AU之初始偏轉開始至溶離峰後邊緣處約0.5 AU之閱讀收集溶離液。可隨後製備相關溶離部分以供進一步處理或純化。舉例而言，所收集之樣品(或初始回收率)可滴定至較低pH，隨後使用深度過濾來過濾，且隨後進行進一步分離步驟(諸如額外層析步驟)。 術語「平衡緩衝液」、「平衡溶液」或其變化形式係指可用於在裝載靶蛋白之前或之後藉由調節管柱pH自基質移除非所需殘餘物之緩衝液。舉例而言，平衡緩衝液可施加至蛋白質A基質作為蛋白質A層析步驟之部分。當用於抗體純化時，平衡緩衝液之pH為至少約6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8或7.9，且直至約7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。平衡緩衝液可基於參(羥基甲基)胺基甲烷(「Tris」) (pH在5.8-8.0範圍內)、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES) (pH在6.8-8.2範圍內)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS) (pH在6.5-7.9範圍內)或其他磷酸酯緩衝液(pH 5.8-8.0)。 術語「溶離緩衝液」、「溶離溶液」或其變化形式係指可用於自基質溶離(亦即，移除或採集)靶標之緩衝液。溶離pH可視蛋白質或抗體對基質之結合親和力而變化。典型地，蛋白質A基質之溶離緩衝液具有至少約2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4或3.5且直至約3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.5、4.7、4.8、4.9或5.0之pH。與混合模式基質一起使用之溶離緩衝液典型地具有至少約4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0且直至約5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0之pH。溶離緩衝劑之實例包括包含檸檬酸鈉、檸檬酸或乙酸之緩衝液。一些溶離緩衝液亦包括氯化鈣、氯化鈉、乙酸銨及氯化銨中之一或多者。 本文所描述之溶液中之任一者可進一步包括一或多種將提高蛋白質純度、穩定性及功能之試劑。實例包括(但不限於)還原劑，諸如2-巰基乙醇(BME)；二硫蘇糖醇(DDT)或參(2-羧基乙基)膦(TCEP)以保護免受氧化性損傷；蛋白酶抑制劑，包括(但不限於)抗纖維蛋白溶酶肽、胃酶抑素A及苯基甲烷磺醯基氟(PMSF)以抑制內源性蛋白酶使靶多肽降解；金屬螯合劑，包括(但不限於)乙二胺四乙酸(EDTA)及乙二醇四乙酸(EGTA)以使不活化金屬蛋白酶；滲壓劑，包括(但不限於)丙三醇；清潔劑及糖以使蛋白質結構穩定化或離子性穩定劑，包括(但不限於)鹽，諸如NaCI、KCI及(NH
4
)
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S0
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至以增強溶解度。 根據本申請案，待純化、分離或處理之靶抗體在捕集蛋白質A基質上之抗體之前由HCCF中之細胞培養物採集。用於例如在HCCF或任何其他來源中採集抗體之方法為此項技術中已知的。在一個實施例中，細胞培養物可為哺乳動物細胞培養物，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞培養物且採集可採用連續離心及/或深度過濾。根據本申請案，可利用任何適合的深度過濾器深度過濾HCCF。在一個實施例中，可使用X0HC深度過濾器(EMD Millipore Corporation, Billerica MA)。在一個實施例中，Emphaze
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過濾器(3M
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Emphaze
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AEX混合式純化器)可用於深度過濾。 所採集之抗體藉由此項技術中已知之任何手段吸附至蛋白質A基質上。在一個實施例中，蛋白質A基質可呈管柱形式且HCCF可藉由習知手段裝載至管柱上。在一個實施例中，可以分批模式進行蛋白質A層析，其中所採集之抗體與蛋白質A基質一起培育且准許抗體隨時間推移吸附至蛋白質A。在另一實施例中，將所採集之抗體添加至樹脂漿料或填充床或管柱中之蛋白質A基質中。可修改用於吸附步驟之流動速率(若使用管柱形式)及/或培育時間(若使用分批形式)以提高吸附至蛋白質A基質上之抗體之量。 在允許抗體吸附或裝載至蛋白質A基質上之足夠的時間之後，用包含一或多種添加劑之至少一種洗滌溶液洗滌蛋白質A基質。藉助於實例，一或多種添加劑選自脲、精胺酸、胍、辛酸酯及氯化鈉。在一個實施例中，至少一種添加劑為脲。在一個實施例中，至少一種添加劑為精胺酸。在一個實施例中，至少一種添加劑為胍。在一個實施例中，至少一種添加劑為辛酸酯。在一個實施例中，至少一種添加劑為氯化鈉。在一個實施例中，至少一種添加劑為磷酸鈉。在一個實施例中，洗滌溶液包含脲及氯化鈉。在一個實施例中，洗滌溶液包含辛酸酯及氯化鈉。包含脲之洗滌溶液亦可稱為「脲洗滌溶液」或「脲溶液」，其在本文中可互換使用。應理解，類似術語可用於包含一或多種其他添加劑之洗滌溶液。 在本申請案中，洗滌溶液pH係5.0至9.5。在一些實施例中，洗滌溶液具有小於約9.0、小於約8.5、小於8.0、小於7.5、小於7.0、小於6.5、小於6.0、小於5.5或小於5.0之pH值。在一些其他實施例中，洗滌溶液pH係超過5.0且小於約9.0、小於約8.5、小於8.0、小於7.5、小於7.0、小於6.5、小於6.0或小於5.5。在一些其他實施例中，洗滌溶液pH係超過5.5且小於約9.0、小於約8.5、小於8.0、小於7.5、小於7.0、小於6.5或小於6.0。在某些其他實施例中，洗滌溶液pH係超過6.0且小於約9.0、小於約8.5、小於8.0、小於7.5、小於7.0或小於6.5。在其他實施例中，洗滌溶液pH係超過6.5且小於約9.0、小於約8.5、小於8.0、小於7.5或小於7.0。在一些實施例中，洗滌溶液pH係超過7.0且小於約9.0、小於約8.5、小於8.0或小於7.5。在一個其他實施例中，洗滌溶液pH係超過7.5且小於約9.0、小於約8.5或小於8.0。在又一實施例中，洗滌溶液pH係超過8.0且小於約9.0或小於約8.5。在某些實施例中，洗滌溶液pH係5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0或9.5。在其他實施例中，洗滌溶液pH係5.0至5.5之間、5.5至6.0之間、6.0至6.5之間、6.5至7.0之間、7.0至7.5之間、7.5至8.0之間、8.0至8.5之間、8.5至9.0之間、9.0至9.5之間、5.0至6.0之間、5.0至6.5之間、5.0至7.0之間、5.0至7.5之間、5.0至8.0之間、5.0至8.5之間、5.0至9.0之間、5.0至9.5之間、5.5至6.5之間、5.5至7.0之間、5.5至7.5之間、5.5至8.0之間、5.5至8.5之間、5.5至9.0之間、5.5至9.5之間、6.0至7.0之間、6.0至7.5之間、6.0至8.0之間、6.0至8.5之間、6.0至9.0之間、6.0至9.5之間、6.5至7.5之間、6.5至8.0之間、6.5至8.5之間、6.5至9.0之間、6.5至9.5之間、7.0至8.0之間、7.0至8.5之間、7.0至9.0之間、7.0至9.5之間、7.5至8.5之間、7.5至9.0之間、8.0至9.0之間或8.0至9.5之間。可使用任何適合的緩衝液來獲得洗滌溶液之所需pH。藉助於實例，緩衝液為磷酸鈉、參(2-胺基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇或參(羥基甲基)胺基甲烷)。在一個實施例中，緩衝液為磷酸鈉。在另一實施例中，緩衝液為參(2-胺基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇或參(羥基甲基)胺基甲烷)。 本申請案之方法包含洗滌步驟，包含使用至少一種脲洗滌溶液。脲洗滌溶液或脲溶液包含約4000 mM (4 M)至約8000 mM (8 M)脲。在某些實施例中，脲洗滌溶液包含約4000 mM (4 M)、約4500 mM (4.5 M)、約5000 mM (5 M)、約5500 mM (5.5 M)、約6000 mM (6 M)、約6500 mM (6.5 M)、約7000 mM (7 M)、約7500 mM (7.5 M)或約8000 (8 M)之脲。另外，脲洗滌溶液pH係約5.0至約8.5。在一個實施例中，脲洗滌溶液pH係小於約9.0。在其他實施例中，脲洗滌溶液pH係小於約8.5。在一個實施例中，脲洗滌溶液為pH 5.5。在一個實施例中，脲洗滌溶液為pH 5.8。在另一實施例中，脲洗滌溶液為pH 6.5。在另一實施例中，脲洗滌溶液為pH 7.7。在又一實施例中，脲洗滌溶液為pH 8.2。在一些其他實施例中，脲洗滌溶液為pH 8.5。脲洗滌溶液可包含高達1500 mM (1.5 M)氯化鈉(NaCl)。在一個實施例中，脲洗滌溶液包含500 mM (0.5 M)至1000 mM (1 M) NaCl。在另一實施例中，脲洗滌溶液包含0 mM (0 M)NaCl。在一個實施例中，脲洗滌溶液包含4000 mM脲、1000 mM NaCl，且pH係約7.7。在另一實施例中，脲洗滌溶液包含6000 mM脲、1500 mM NaCl，且pH係約7.7。在另一實施例中，脲洗滌溶液包含6000 mM脲、0 mM NaCl，且pH係約8.2。在又一實施例中，脲洗滌溶液包含6000 mM脲、1500 mM NaCl，且pH係約8.2。 在抗體裝載之後，用脲洗滌溶液進行蛋白質A基質之至少一次洗滌。在一個實施例中，用脲洗滌溶液進行至少兩次洗滌。在另一實施例中，用脲洗滌溶液進行至少三次洗滌。在一個實施例中，額外洗滌可用不包含脲作為添加劑之洗滌溶液，諸如精胺酸洗滌溶液、胍洗滌溶液、NaCl洗滌溶液或辛酸酯洗滌溶液進行。可修改洗滌步驟(包括其中存在多次洗滌)之流動速率(若使用管柱形式)及/或培育時間(若使用分批形式)以控制或調節HCP降低及/或抗體回收率之量。在一個實施例中，洗滌步驟之流動速率為約50 cm/hr至約400 cm/hr。在另一實施例中，流動速率為約75 cm/hr至約250 cm/hr。在另一實施例中，使用脲洗滌溶液之洗滌步驟之流動速率為約75 cm/hr至約150 cm/hr。在某一實施例中，使用脲洗滌溶液之洗滌步驟之流動速率為100 cm/hr。 在一些態樣中，本申請案之方法包含洗滌步驟，包含至少一種包含精胺酸之洗滌溶液作為添加劑，該溶液可稱為精胺酸洗滌溶液或精胺酸溶液。在一個實施例中，除了用脲洗滌溶液洗滌至少一次之外，包含精胺酸洗滌溶液之洗滌步驟包含用精胺酸洗滌溶液洗滌至少一次。精胺酸洗滌溶液可包含約100 mM (0.1 M)至約1000 mM (1 M)精胺酸。舉例而言，精胺酸洗滌溶液可包含約100 mM (0.1 M)、約200 mM (0.2 M)、約300 mM (0.3 M)、約400 mM (0.4 M)、約500 mM (0.5 M)、約600 mM (0.6 M)、約700 mM (0.7 M)、約800 mM (0.8 M)、約900 mM (0.9 M)或約1000 mM (1 M)精胺酸。在一個實施例中，精胺酸洗滌溶液包含約400 mM (0.4 M)至約800 mM (0.8 M)精胺酸。在一些實施例中，精胺酸洗滌溶液包含約100 mM、400 mM或800 mM精胺酸。在某些實施例中，精胺酸洗滌溶液包含約800 mM精胺酸。此外，精胺酸洗滌溶液pH係約5.0至約8.0。舉例而言，精胺酸洗滌溶液pH係約5.8、約6.5或約7.7。在另一實施例中，精胺酸洗滌溶液包含800 mM精胺酸且pH係約7.7。 在某些態樣中，本申請案之方法包含洗滌步驟，包含至少一種包含胍之洗滌溶液作為添加劑，該溶液可稱為胍洗滌溶液或胍溶液。在一個實施例中，除了用脲洗滌溶液洗滌至少一次之外，包含使用胍洗滌溶液之洗滌步驟包含用胍洗滌溶液洗滌至少一次。在一個實施例中，胍洗滌溶液包含約500 mM (0.5 M)胍至約1000 mM (1 M)胍。舉例而言，胍洗滌溶液可包含約500 mM (0.5 M)、約600 mM (0.6 M)、約700 mM (0.7 M)、約800 mM (0.8 M)、約900 mM (0.9 M)或約1000 mM (1 M)胍。在某些實施例中，胍洗滌溶液可包含約600 mM或約1000 mM胍。此外，胍洗滌溶液pH係約5.0至約8.0。舉例而言，胍洗滌溶液pH係約5.8、約6.5或約7.7。在一些實施例中，胍洗滌溶液包含1000 mM胍且pH係約7.7。 在其他態樣中，本申請案之方法包含洗滌步驟，包含至少一種包含氯化鈉(NaCl)之洗滌溶液作為添加劑，該溶液可稱為NaCl洗滌溶液或NaCl溶液。在一個實施例中，除了用脲洗滌溶液洗滌至少一次之外，包含使用NaCl洗滌溶液之洗滌步驟包含用NaCl洗滌溶液洗滌至少一次。在一些實施例中，NaCl洗滌溶液可包含500 mM (0.5 M)至1000 mM (1 M) NaCl。舉例而言，NaCl洗滌溶液可包含約500 mM (0.5 M)、約600 mM (0.6 M)、約700 mM (0.7 M)、約800 mM (0.8 M)、約900 mM (0.9 M)或約1000 mM (1 M) NaCl。在某些實施例中，NaCl洗滌溶液可包含約500 mM或約1000 mM NaCl。NaCl洗滌溶液pH係約5.0至約8.0。舉例而言，NaCl洗滌溶液pH係約5.8、約6.5或約7.7。在一個實施例中，NaCl洗滌溶液包含500 mM NaCl且pH係約7.7。 在某些態樣中，本申請案之方法包含洗滌步驟，包含至少一種包含辛酸酯之洗滌溶液作為添加劑，該溶液可稱為辛酸酯洗滌溶液或辛酸酯溶液。在一個實施例中，除了用脲洗滌溶液洗滌至少一次之外，包含使用辛酸酯洗滌溶液之洗滌步驟包含用辛酸酯洗滌溶液洗滌至少一次。在一個實施例中，辛酸酯洗滌溶液包含約1 mM辛酸酯至約50 mM辛酸酯。舉例而言，辛酸酯洗滌溶液可包含約1 mM、約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM、約35 mM、約40 mM、約45 mM、約50 mM辛酸酯。在某些實施例中，辛酸酯洗滌溶液可包含約5 mM或約25 mM辛酸酯。此外，辛酸酯洗滌溶液pH係約5.0至約8.0。舉例而言，辛酸酯洗滌溶液pH係約5.8、約6.5或約7.7。在額外實施例中，辛酸酯洗滌溶液包含25 mM辛酸酯且pH係約7.7。 在一實施例中，本申請案之方法包含洗滌步驟，包含至少一種包含甘胺酸之洗滌溶液作為添加劑，該溶液可稱為甘胺酸洗滌溶液或甘胺酸溶液。在一個實施例中，除了用甘胺酸洗滌溶液洗滌至少一次之外，包含使用甘胺酸洗滌溶液之洗滌步驟包含用辛酸酯洗滌溶液洗滌至少一次。在一個實施例中，甘胺酸洗滌溶液包含約100 mM (0.1 M)至約1000 mM (1 M)甘胺酸。舉例而言，甘胺酸洗滌溶液可包含約100 mM、約100 mM、約300 mM、約400 mM、約500 mM、約600 mM、約700 mM、約800 mM、約900 mM或約1000 mM甘胺酸。在一些實施例中，甘胺酸洗滌溶液包含約500 mM (0.5 mM)至約1000 mM (1 M)NaCl。舉例而言，甘胺酸洗滌溶液可包含約500 mM、約600 mM、約700 mM、約800 mM、約900 mM或約1000 mM NaCl。在一些實施例中，甘胺酸洗滌溶液pH係約5.0至約8.5，諸如pH約8.0。在一些實施例中，甘胺酸洗滌溶液包含300 mM甘胺酸及500 mM NaCl，且pH係8.0。 根據本申請案，在一個實施例中，至少一種洗滌溶液包含至少兩種添加劑，其中一種添加劑為濃度為約500 mM (0.5 M)至1000 mM (1 M) NaCl或約500 mM (0.5 M)至約1500 mM (1.5 M) NaCl之氯化鈉。此類洗滌溶液可包含約500 mM (0.5 M)、約600 mM (0.6 M)、約700 mM (0.7 M)、約800 mM (0.8 M)、約900 mM (0.9 M)、約1000 mM (1 M)、約1100 mM (1.1 M)、約1200 mM (1.2 M)、約1300 mM (1.3 M)、約1400 mM (1.4 M)或約1500 mM (1.5 M)之NaCl。在某些實施例中，洗滌溶液包含至少兩種添加劑，其中一種添加劑為約500 mM或約1000 mM或約1500 mM之氯化鈉。在某些實施例中，包含至少兩種添加劑之洗滌溶液包含氯化鈉作為一種添加劑及脲作為第二添加劑。 用本文所描述之實施例中之任一者之洗滌溶液進行蛋白質A基質之至少一次洗滌。在一個實施例中，進行至少兩次洗滌。在另一實施例中，進行至少三次洗滌。應理解，可修改洗滌步驟之流動速率及/或培育時間以控制HCP降低及/或抗體回收率之量。洗滌步驟可包括一種洗滌溶液，其中使用至少約5或高達約10或20個管柱體積之單一洗滌溶液洗滌管柱。此外，處理可包括多於一種洗滌溶液，例如處理可包括兩種不同洗滌溶液。舉例而言，處理可包括脲洗滌溶液作為一種洗滌溶液及精胺酸洗滌溶液、胍洗滌溶液、NaCl洗滌溶液或辛酸酯洗滌溶液作為額外洗滌溶液。 前述洗滌溶液及洗滌流動速率中之任一者可組合且用於獲得靶抗體之任何所需回收率水準及足夠的HCP或雜質(諸如來自HCCF之PLBL2)降低。 在用至少一種洗滌溶液洗滌蛋白質A基質之後，抗體自蛋白質A基質溶離以獲得蛋白質A純化抗體。此項技術中已知之任何適合的緩衝液可用於自蛋白質A基質溶離抗體。溶離緩衝液或溶離溶液包含約5 mM至約65 mM乙酸。此外，溶離溶液pH係約2.5至3.5。在一個實施例中，溶離溶液包含5 mM至約65 mM乙酸且pH係約2.7至3.4。在一些實施例中，溶離溶液包含5 mM至約65 mM乙酸且pH係約2.9至3.4。在其他實施例中，溶離緩衝液包含40 mM乙酸且pH係3.1。可修改溶離步驟之流動速率及/或培育時間以控制抗體回收率之量。在一個實施例中，溶離步驟之流動速率為約50 cm/hr至約400 cm/hr。在另一實施例中，溶離步驟之流動速率為約75 cm/hr至約300 cm/hr。在另一實施例中，溶離步驟之流動速率為約75 cm/hr至約150 cm/hr。在另一實施例中，溶離步驟之流動速率為約250 cm/hr至約300 cm/hr。在某些實施例中，溶離步驟之流動速率為100 cm/hr。在一些實施例中，溶離步驟之流動速率為265 cm/hr。在一個實施例中，蛋白質A基質用包含25 mM Tris、25 mM NaCl之溶液平衡，且pH係約7.7。在一個實施例中，在樣品裝載之後，蛋白質A基質(亦即，裝載之蛋白質A基質)用平衡溶液，繼而脲洗滌溶液及平衡溶液洗滌，其中平衡溶液包含25 mM Tris、25 mM NaCl，且pH係約7.7。前述溶液及流動速率中之任一者可組合且用於靶抗體之任何所需回收率水準及足夠的HCP含量或雜質(諸如來自HCCF之PLBL2)降低。 本文所描述之方法將提供可足夠用於使用僅一個層析步驟，例如蛋白質A親和性層析之治療應用之純化靶抗體。包括(但不限於)層析、病毒不活化及/或過濾之額外步驟可視情況根據本申請案採用。額外層析步驟為領域中已知的。
病毒不活化及深度過濾
在一個實施例中，蛋白質A純化抗體可藉由此項技術中已知之任何手段經受病毒不活化。當提及病毒不活化時，病毒粒子可保留在最終產物中但呈非感染性形式。病毒不活化步驟可包含pH不活化步驟及/或化學不活化步驟。 pH不活化步驟可包括調節pH以使病毒不活化。在一個實施例中，蛋白質A純化抗體係在低pH下培育以使病毒雜質不活化。在一個實施例中，蛋白質A純化抗體在低於4.0，例如約3.4至約3.8之pH下培育。蛋白質A純化抗體可藉由添加酸(例如乙酸)調節至pH小於4.0，以實現所需pH。在一個實施例中，例如用乙酸將蛋白質A純化抗體調節至pH約3.4至約3.8。為了使病毒雜質不活化，培育pH經調節之蛋白質A純化抗體至少30分鐘以使病毒不活化。在一個實施例中，病毒不活化培育時間為約60分鐘。在另一實施例中，病毒不活化培育時間為約90分鐘。 在小於4.0之pH下培育之後，蛋白質A純化抗體之pH可調節至約4.0至約9.0之pH。在一些實施例中，pH調節至5.0。在某些實施例中，pH調節至6.0。任何適合的緩衝液可用於調節pH。在一個實施例中，tris鹼可用於調節pH。在一個實施例中，pH調節至約5.5至約6.5之pH或約5.8至約6.0之pH。額外HCP可在pH提高之後在病毒不活化之後自蛋白質A純化抗體沈澱出。在一個實施例中，沈澱HCP可藉由深度過濾移除。在其他實施例中，對病毒不活化、pH經調節之蛋白質A純化抗體採用至少一個深度過濾步驟。在另一實施例中，對病毒不活化、pH經調節之蛋白質A純化抗體採用至少兩個深度過濾步驟。可使用此項技術中已知之任何深度過濾手段。在一個實施例中，深度過濾手段選自由以下組成之群：C0HC及X0HC (均可購自EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)及其組合。在一個實施例中，對病毒不活化、pH經調節之蛋白質A純化樣品進行C0HC深度過濾，且其後進行X0HC深度過濾。在另一實施例中，深度過濾手段選自由以下組成之群：C0HC (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)及Emphaze
TM
(3M
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Emphaze
TM
AEX混合式純化器)。在一個實施例中，對病毒不活化、pH經調節之蛋白質A純化樣品進行C0HC深度過濾，且其後進行Emphaze
TM
深度過濾。根據本申請案，藉由使用深度過濾器，HCP含量降低，且例如HCP之百分比降低為約45%至約85%。 在一實施例中，該方法包括膜過濾步驟。膜過濾步驟可在病毒不活化及/或深度過濾之前或之後採用。膜過濾為此項技術中熟知的且熟習此項技術者將容易地顯而易見適合的膜過濾裝置。可能需要以化學方式使抗體製劑中之病毒不活化。化學不活化步驟可包括足以使病毒不活化之溶劑或清潔劑處理、照射及/或短暫曝露於高溫。如熟習此項技術者已知病毒不活化之此等方法，且熟習此項技術者可選擇適當的處理條件。
混合模式層析
在一個實施例中，蛋白質A純化抗體可經受混合模式層析步驟。混合模式層析步驟可在蛋白質A純化步驟之後及/或在病毒不活化步驟之後及/或在深度過濾步驟之後及/或在陽離子交換層析步驟之後進行。在一個實施例中，混合模式層析步驟在陽離子交換層析步驟之後進行。在一個實施例中，混合模式層析步驟在蛋白質A層析步驟之後進行。混合模式層析步驟可以結合及溶離方式及/或流通物模式進行。舉例而言，其可適用於以結合及溶離方式採用混合模式層析步驟，其中抗體結合於混合模式層析基質，而雜質並不結合。在抗體結合至混合模式基質之後，使抗體溶離以獲得純化抗體。或者，其可適用於以流通物方式採用混合模式層析步驟，其中抗體不結合(流動通過)混合模式層析基質，但雜質結合至混合模式層析基質。熟習此項技術者可調整條件以獲得抗體結合或流通，例如藉由調節pH、導電率或添加不同離液及親液鹽以使疏水相互作用最佳化，其將例如視待純化之抗體之電荷及電荷分佈或靶抗體及雜質上靜電(局部表面電荷)及疏水性小片之組合而定。 本發明中使用之混合模式層析基質為例如由具有固定化於其上之多峰配位體之載體組成之層析基質，該配位體包含一或多個陰離子或陽離子交換基團及一或多個芳族或雜環芳族系統。具有疏水性或氫鍵結功能之例示性混合模式陽離子交換基質包括(但不限於)可購自GE Healthcare Life Sciences (Marlborough, MA)之Capto MMC及Capto MMC ImpRes。具有疏水性或氫鍵結功能之例示性混合模式陰離子交換基質包括(但不限於)可購自GE Healthcare Life Sciences (Marlborough, MA)之Capto Adhere及Capto Adhere ImpRes。 在一個實施例中，混合模式層析步驟包含以結合及溶離方式採用之陰離子交換混合模式基質。混合模式層析步驟適用於移除HCP，諸如PLBL2，以及蛋白質A純化步驟之任何蛋白質A瀝出液。混合模式層析步驟亦適用於移除具有不同序列之產物相關雜質(例如片段、延長型物質或Fc經修飾之物質)。在一個實施例中，混合模式層析能夠以例如+1177Da之質量差移除抗體之肽序列延伸部分。可採用此項技術中已知的混合模式層析步驟之條件。亦可採用一或多個洗滌步驟，尤其若利用結合及溶離方式。在一個實施例中，陰離子交換混合模式基質，例如Capto Adhere或Capto Adhere ImpRes (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)以結合及溶離方式使用。在某一實施例中，蛋白質A純化抗體在約7.0至約9.0，約7.5至約8.5之pH下結合至混合模式基質。結合緩衝液可包括Tris。結合緩衝液亦可包括約35 mM至約65 mM NaCl、約40 mM至約55 mM NaCl。在裝載至混合模式基質上後，在一個實施例中，抗體可在約4.5至約6.0，約5.0至約5.6之pH下自混合模式基質溶離。溶離緩衝液可包括約90 mM至約150 mM氯化鈣(CaCl
2
)，約95至約110 CaCl
2
。在一個實施例中，溶離緩衝液可包括約120至約200 mM NaCl，約150至約180 mM NaCl。在另一實施例中，溶離緩衝液可包括約80 mM至約175 mM乙酸銨(NH
4
OAc)。在另一實施例中，溶離緩衝液可包括32 mM氯化銨(NH
4
Cl)。
額外層析步驟
可在本發明中採用額外層析步驟。實例包括陰離子交換(AEX)、陽離子交換(CEX)、疏水相互作用(HIC)、親水作用、氫鍵結、π-π鍵結、金屬親和性及親和性層析(包括蛋白G、包含藉由相關抗體結合之抗原之層析材料及包含Fc結合蛋白之層析材料)或其任何組合。舉例而言，陰離子交換或陽離子交換層析可在混合模式步驟之前或之後採用。陰離子及陽離子交換層析基質為此項技術中眾所周知的。陽離子交換基質之實例包括Capto
TM
S及SP Sepharose FF® (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)以及S Ceramic HyperD
TM
及HyperCel
TM
Star CEX (PALL Corporation, Port Washington, NY)及Poros® XS。可利用之陰離子交換基質之實例包括Capto Q及Capto DEAE (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)以及Q Ceramic HyperD
TM
及HyperCel
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Star AX (PALL Corporation, Port Washington, NY)。 基於疏水相互作用分離，疏水相互作用層析可移除蛋白質聚集體，諸如抗體聚集體及過程相關雜質。疏水相互作用層析步驟可與利用具有離子交換功能及疏水性功能兩者之層析樹脂之離子交換層析步驟同時進行。此類樹脂表徵為混合模式層析樹脂。在進行分離時，例如使用分批純化技術或使用管柱使樣品混合物與HIC材料接觸。在HIC純化之前，可能需要例如藉由將混合物傳送通過預管柱來移除任何離液試劑或極疏水性物質。藉由較高鹽濃度幫助抗體吸附至HIC管柱，但實際濃度可在廣泛範圍內改變，視抗體性質及所選特定HIC配位體而定。各種離子可視其是否促進疏水相互作用(鹽析作用)或破壞水結構(離液作用)且導致疏水相互作用弱化而定經配置。陽離子根據提高鹽析作用排序為Ba++；Ca++；Mg++；Li+；Cs+；Na+；K+；Rb+；NH
4
+，而陰離子可根據提高離液作用排序為PO-；S0
4
-；CH
3
CO
3
-；C1-；Br-；NO
3
-；C10
4
-；I-；SCN-。HIC管柱通常包含與疏水性配位體(例如烷基或芳基)偶合之鹼基質(例如交聯瓊脂糖或合成共聚物材料)。適合的HIC管柱包含經苯基取代之瓊脂糖樹脂(例如苯基Sepharose™管柱)。多種HIC管柱為可商購的。實例包括(但不限於)具有較低或較高取代之苯基Sepharose™ 6快速流管柱；苯基Sepharose™高效能管柱；辛基Sepharose™高效能管柱；Fractogel™ EMD丙基或Fractogel™ EMD苯基管柱；Macro-Prep™甲基或Macro-Prep™第三丁基支撐物；WP HI-丙基(C3) TM管柱；及Toyopearl™醚、苯基或丁基管柱。具有陽離子功能之疏水相互作用樹脂為可商購的且包括(但不限於) Capto MMC™、Capto MMC™ ImpRes (GE Healthcare, UK)、Nuvia™ cPrime™ (Biorad, CA)。具有陰離子功能之疏水相互作用樹脂(及膜產物)為可商購的且包括(但不限於) QyuSpeed D (QSD)膜及Sartobind Q膜。
過濾步驟
在抗體純化之後，純化抗體可經受過濾步驟，包括緩衝液交換，其可適用於自純化抗體移除病毒粒子及/或小分子及/或將純化抗體濃縮至所需濃度。為了藉由過濾移除病毒，可使用奈米過濾裝置。在一個實施例中，奈米過濾裝置可具有孔徑小於75 nm、小於50 nm或小於15 nm之膜。在一個實施例中，該方法包含病毒過濾步驟以提供病毒過濾純化抗體。為了過濾以移除病毒粒子，可使用適用於此類移除之任何已知的過濾器。用於病毒過濾之例示性裝置包括(但不限於) Viresolve® Pro Chromasorb™、Planova™、Plavnova™及BioEx。 在一實施例中，該方法包含超過濾/透濾(UF/DF)步驟。可在具有或不具有病毒移除步驟之情況下採用UF/DF以在所需緩衝液中提供濃縮抗體。UF/DF為超過濾及透濾之組合操作。在一個實施例中，UF/DF步驟移除粒子，濃縮抗體，且交換/修飾純化抗體之水性或緩衝液組合物。超過濾及透濾為此項技術中眾所周知的。在一些實施例中，採用過濾器，諸如膜超濾器、板超濾器、筒超濾器、袋超濾器或真空超濾器。在一些實施例中，採用來自EMD Millipore Corporation之30 kD Pellicon® 3膜。可採用之可商購UF/DF裝置由各種供應商，諸如EMD Millipore Corporation、PALL Corporation、GE Healthcare Life Sciences及Sartorious Corporation製造。用於UF/DF之例示性裝置包括(但不限於) Pellicon 3。根據本申請案，每一步驟(亦即，裝載、洗滌、溶離、過濾或病毒不活化)可重複多次以實現所需目的(亦即，純化、處理、產生或分離抗體)，且每一溶液(亦即，洗滌溶液、脲洗滌溶液、溶離溶液/緩衝液)可使用多次。舉例而言，裝載、洗滌、溶離、過濾或病毒不活化之步驟中之每一者可重複至少一次、兩次、三次或四次。 本申請案亦提供用於測定分離/純化抗體組合物中之宿主細胞蛋白質(HCP)或靶抗體之殘餘物水準之方法。如上文所描述，HCP合乎需要地由最終目標物質產物排除；未能鑑別且充分自靶抗體移除HCP可能導致功效降低及/或不利的個體反應。HCP或靶抗體可使用常用方法表徵，該等方法諸如酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)；尺寸排阻層析(SEC)，例如高效能尺寸排阻層析(HPSEC)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及毛細電泳法與SDS (CE-SDS)及反相高效液相層析(RP-HPLC)。 實例 以下非限制性實例係關於能夠減少宿主細胞蛋白質，包括PLBL2以提供純化抗體或靶抗體製劑之抗體純化方法之例示性實施例。應理解，可改變分析或研究之條件(諸如反應劑濃度、恢復值、培育溫度等)且可改變分析或研究之結果。在一些情況下，值可在至少一倍至兩倍範圍內改變。
實例 1
在標準細胞培養條件下在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生抗LOXL2抗體及抗MMP9抗體。抗體之實例包括抗LOXL2抗體，其包含：包含SEQ ID NO:49之可變區之重鏈多肽；及包含SEQ ID NO:50之可變區之輕鏈多肽。抗體之實例亦包括抗MMP9抗體，其包含SEQ ID NO:45之重鏈多肽及SEQ ID NO:46之輕鏈多肽。收集包含抗體之宿主細胞培養液(HCCF)以供進一步處理。測試純化方法之宿主細胞蛋白質(HCP)。對此分析採用細胞株特定ELISA分析。藉由LC/MS定量磷脂酶B-類2 (PLBL-2)。在變性、還原及烷基化之後，藉由蛋白分解(胰蛋白酶)消化物處理樣品。測試樣品中之PLBL-2轉化成胰蛋白酶肽。藉由反相LC/HR-MRM方法，在LTQ-軌道阱質譜儀上偵測與成熟中國倉鼠PLBL-2序列(Uniprot寄存號G3I6T1_CRIGR)中之胺基酸159至165相關之PLBL-2肽、LTFPTGR。使用針對藉由將不同層級之化學合成肽加標於對照樣品(標準添加)中來產生之標準曲線之測試樣品中之信號之標準化定量肽。測試樣品中之肽之質量數值上轉化成肽之莫耳，其指示樣品中之完整PLBL-2蛋白質之等效莫耳。將完整或整個PLBL-2之莫耳值轉化成PLBL-2之質量以便與抗體進行重量/重量比率比較(質量完整PLBL-2/質量抗MMP9抗體)且以ppm表示。在樣品處理之前，在測試樣品與定量標準之間使蛋白質濃度標準化。轉移層析、移動相及m/z分離以供在串聯四極質譜儀上使用。 將包含抗MMP9抗體之HCCF裝載至蛋白質A MSS基質上。HCCF具有2.55 g/L之抗體效價。相比於對照組，測試各種洗滌溶液自由管柱溶離之最終純化抗體移除宿主細胞蛋白質之能力。自MSS基質溶離之抗體用2 M乙酸調節且用2 M Tris鹼中和至約pH 5.0至6.0，且隨後評估蛋白質回收率及HCP含量。 對照洗滌溶液為標準蛋白質A親和性層析溶液且包括25 mM Tris及500 mM NaCl (pH 7.7)。此等實驗中測試之洗滌溶液含有500 mM NaCl至1500 mM NaCl及/或500 mM脲至6000 mM脲。此外，此等實驗中測試之洗滌溶液之pH範圍在5.8至8.2範圍內。例示性結果提供於表1中且描述於下文中。
表 1
在另一組實驗中，對於此組實驗，HCCF MSS裝載起始材料中之HCP之初始或起始水準量測為約43,300 ppm。此會降低至519 ppm (當洗滌溶液含有0.5 M NaCl及25 mM Tris (pH 7.7)時)；降低至553 ppm (當洗滌溶液含有0.5 M NaCl及25 mM磷酸鈉(pH 7.7)時)；降低至350 ppm (pH 5.8)或384 ppm (pH 7.7) (當洗滌溶液含有1.0 M NaCl、1.0 M脲及25 mM磷酸鈉時)；降低至241 ppm (pH 5.8)或271 ppm (pH 7.7) (當洗滌溶液含有1.0 M NaCl、2.0 M脲及25 mM磷酸鈉時)；降低至96 ppm (pH 5.8)或130 ppm (pH 7.7) (當洗滌溶液含有1.0 M NaCl、4.0 M脲及25 mM磷酸鈉時)；降低至273 ppm (pH 5.8)或305 ppm (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.8 M精胺酸及25 mM磷酸鈉時)；降低至424 ppm (pH 5.8)或413 ppm (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.6 M胍及25 mM磷酸鈉時)；降低至495 ppm (當洗滌溶液含有0.5 M NaCl、25 mM辛酸酯及25 mM磷酸鈉(pH 7.7)時)；且降低至655 ppm (當洗滌溶液含有0.01% Tween 20及25 mM磷酸鈉(pH 6.5)時)。 亦測定各種洗滌條件下抗體回收率水準。抗體回收率之平均水準為97.4% (當洗滌溶液含有0.5 M NaCl及25 mM Tris (pH7.7)時)；90.1% (pH 5.8)、99.2% (pH 6.5)或100.4% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.5 M NaCl及25 mM磷酸鈉時)；102.1% (pH 5.8)、105.5% (pH 6.5)或101.6% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有1.0 M NaCl及25 mM磷酸鈉時)；100.6% (pH 5.8)、99.1% (pH 6.5)或104.3% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.5 M NaCl、0.5 M脲及25 mM磷酸鈉時)；100.8% (pH 5.8)、103.8% (pH 6.5)或103.8% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.5 M NaCl、1.0 M脲及25 mM磷酸鈉時)；94.7% (pH 5.8)、98.6% (pH 6.5)或99.4% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.5 M NaCl、2.0 M脲及25 mM磷酸鈉時)；84.0% (pH 5.8)、91.4% (pH 6.5)或94.4% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.5 M NaCl、4.0 M脲及25 mM磷酸鈉時)；95.6% (pH 5.8)、101.9% (pH 6.5)或101.8% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有1.0 M NaCl、0.5 M脲及25 mM磷酸鈉時)；98.4% (pH 5.8)、105.9% (pH 6.5)或101.8% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有1.0 M NaCl、1.0 M脲及25 mM磷酸鈉時)；92.0% (pH 5.8)、98.1% (pH 6.5)或97.6% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有1.0 M NaCl、2.0 M脲及25 mM磷酸鈉時)；77.5% (pH 5.8)、90.2% (pH 6.5)或93.8% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有1.0 M NaCl、4.0 M脲及25 mM磷酸鈉時)；93.8% (pH 5.8)、102.7% (pH 6.5)或101.0% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.1 M精胺酸及25 mM磷酸鈉時)；102.1% (pH 5.8)、102.2% (pH 6.5)或101.7% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.4 M精胺酸及25 mM磷酸鈉時)；97.4% (pH 5.8)、99.9% (pH 6.5)或99.1% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.8 M精胺酸及25 mM磷酸鈉時)；98.9% (pH 5.8)、101.3% (pH 6.5)或98.6% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.6 M胍及25 mM磷酸鈉時)；99.3% (pH 5.8)、102.0% (pH 6.5)或100.9% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有1.0 M胍及25 mM磷酸鈉時)；93.2% (pH 5.0)或104.3% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.5 M NaCl、10 mM辛酸酯及25 mM磷酸鈉時)；100.6% (pH 6.5)或101.9% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.5 M NaCl、25 mM辛酸酯及25 mM磷酸鈉(pH 7.7)時)；及100.9% (pH 5.8)、100.6% (pH 6.5)或100.4% (pH 7.7) (當洗滌溶液含有0.01% Tween 20及25 mM磷酸鈉時)。 此研究結果指示當測試相比於對照組時，包含精胺酸、胍或脲與氯化鈉之組合之洗滌溶液在pH 5.8至pH 8.2範圍內會使得HCP含量降低。亦使用質譜分析評估所選溶離庫之宿主細胞蛋白質PLBL2水準。MSS裝載池HCCF中之PLBL2之水準為約1600 ppm。與對照洗液0.5 M NaCl，pH 7.7相比，4 M脲、0.5 M NaCl HCP倍數降低自78倍改變至338倍。結果提供於表2中。
表 2
在另一組實驗中，將包含抗LOXL2抗體之HCCF裝載至蛋白質A基質上。相比於用對照洗滌溶液產生之相同庫，測試各種洗滌溶液在pH調整至pH 5.0-5.1 (在過濾之前pH 5)之後且在pH調整及無菌過濾(pH調節池/pH 5 EDF無菌)之後自由管柱(天然池)天然池溶離之最終純化抗體移除宿主細胞蛋白質之能力。 各種洗滌條件包括對照洗滌溶液(25 mM Tris、500 mM NaCl (pH 7.7))；進一步包含10 mM檸檬酸鈉之對照洗滌溶液；包含2 M脲、0.5 M NaCl之脲洗滌溶液，pH 7.7；包含2 M脲、0.5 M NaCl之脲洗滌溶液，pH 5.5；包含4 M脲、1 M NaCl之脲洗滌溶液，pH 7.7；包含0.3 M甘胺酸、0.6 M NaCl之甘胺酸洗滌溶液，pH 8.0；及包含0.3 M甘胺酸、0.6 M NaCl、0.5% P80之甘胺酸洗滌溶液，pH 8.0。量測在過濾之前自然HCP之水準(pH 5)及pH經調節/pH 5 EDF無菌過濾庫且結果概述於表3中。
表 3
使用親水性(GRAVY)方法之總平均計算包括抗MMP9抗體、抗LOXL2 IgG4抗體及參考IgG4抗體之IgG4抗體之疏水性指數。參見例如Kyte, J.及Doolittle, R.F.,用於呈現蛋白質疏水性特徵之簡單方法(A simple method for displaying the hydrophobic character of a protein), J. Mol. Biol., 157: 105-132 (1982)。抗MMP9抗體具有-0.40427之GRAVY值，抗LOXL2抗體具有-0.38790之GRAVY值，且參考IgG4抗體具有‑0.44909之GRAVY值。此資料展現所有三個IgG4抗體具有如GRAVY方法所測定之類似疏水性，且表明本申請案之方法可能對不同IgG4同型及/或具有類似疏水性指數之抗體有效。除此等實例中測試之抗體之彼等者外，本申請案之方法可適用於具有不同GRAVY值及/或疏水性指數之廣泛範圍的抗體。 在另一組實驗中，兩個陽離子交換多峰樹脂Capto MMC及Capto MMC ImpRes (均來自GE Healthcare)證明對於結合及溶離及流通模式，HCP小於1對數下降值，自約600 ppm降至175-210 ppm。
實例 2
在本實例中，混合模式層析用作採用Capto
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黏著樹脂之精加工步驟之最終層析步驟。混合模式層析可分解具有不同序列之產物雜質，諸如片段、延長型物質或Fc修飾物質。混合模式層析指示以+1177Da之質量差移除抗體C端之獨特肽延伸部分(延長型雜二聚體雜質)(SEQ ID NO:1:EAEAASASELFQ)。混合模式層析方法可用作最終層析步驟以幫助移除除本實例中移除之+1177 Da肽延伸部分雜質外之多種雜質。 使用陰離子交換層析(諸如Capto Q)之抗MMP9產物之後續處理由親和性蛋白質A層析步驟、病毒不活化、深度過濾、陽離子交換層析及陰離子交換層析組成。然而，在用於減少倉鼠磷脂酶B類2 (PLBL2)宿主細胞蛋白質之修飾處理之發展期間，最終層析步驟(精製步驟)自陰離子交換層析改變為採用Capto黏著樹脂之多峰陰離子交換層析。如下評估此精製步驟修改降低產物庫中之產物相關雜質之含量之能力。 在陽離子交換層析步驟之後，使用可購自GE Healthcare Life Sciences (Marlborough, MA)之Capto黏著陰離子交換混合模式基質進行混合模式層析步驟。將使用Capto黏著之此混合模式層析步驟與使用Capto Q之陰離子交換層析步驟進行比較。使用包含不同pH值及導電率之多種條件進行實驗。在使用Capto黏著之一些實驗中，流通模式涉及條件，其中pH在6-8之間變化且導電率為5-20 mS/cm。在使用Capto黏著之一些實驗中，結合及溶離方法涉及條件，其中樣品在8.0之pH及6-12 mS/cm之導電率下裝載，且在5.0+/-0.1之pH及8-10 mS/cm之導電率下進行溶離。將混合模式(Capto黏著)池之產物特徵與由陰離子交換(Capto Q)產生之庫進行比較，可歸因於使用Capto黏著產生多種觀測結果。 發現混合模式(Capto黏著)池之電荷變異體譜不具有由使用Capto Q之陰離子交換產生之池中存在之最酸性變異體峰值。此歸因於酸性峰百分比自陰離子交換(Capto Q)池之16.0%降低至混合模式(Capto黏著)池之12.5%。表4提供使用Capto黏著或Capto Q之抗MMP9方法中之處理中間物之電荷變異體譜。隨後可歸因於Capto黏著庫中觀測到之Fc+1177 Da物質降低，發現Capto黏著池中觀測到之酸性峰%降低，如下文更詳細地所論述。
表 4
使用完整質譜分析以分析使用Capto Q及Capto黏著方法純化之庫之完整及降低重鏈質量。藉由陰離子交換(Capto Q)純化之池結果指示具有與抗MMP9抗體之預期重鏈序列相比+1177 Da之質量差之物質之存在。其他分析揭示，+1177 Da修飾歸因於由胺基酸序列EAEAASASELFQ (SEQ ID NO: 1)組成之抗體之C端上之獨特肽延伸部分。抗MMP9抗體之觀測到之完整及降低MS資料提供於表5中。
表 5
觀測到之完整質量匹配抗MMP9抗體之理論質量值(參見表5中之G0F及G1F/G0F管柱)。藉由使用陰離子交換(Capto Q)作為第三層析步驟(表5，BI回合2 BDS及參考標準抗MMP9)之處理產生之材料中觀測到之Fc+1177 Da物質，但藉由使用混合模式基質(Capto黏著) (表5，BI回合3或4 BDS)處理產生之材料中未觀測到。觀測到之降低質量亦匹配理論質量值(表5)。 進一步證明，藉由採用精製步驟中之混合模式(Capto黏著)基質之反相液相層析移除含有經修飾重鏈之+1177 Da物質。藉由混合模式基質(Capto黏著)及陰離子交換基質(Capto Q)產生之庫經IdeS蛋白酶處理，其將完整抗體分解成Fc及Fab
2
片段。反相液相層析隨後用於鑑別每一池中存在之分解物質，包括+1177 Da物質之存在或不存在。在使用陰離子交換(Capto Q)產生之所有BI回合2製程中間物中之約17.5分鐘處之峰處觀測到+1177 Da物質。然而，使用混合模式精製步驟(Capto黏著)產生之製程中間物中不存在+1177 Da物質。此提出藉由使用Capto黏著移除Fc+1177 Da物質。 此等結果表明，相比於陰離子交換(Capto Q)精製步驟，藉由使用混合模式(Capto黏著)精製步驟展現之離子交換層析(IEC)譜改變歸因於+1177 Da物質之移除。 進行電荷變異體溶離份之液相層析質譜分析(LC-MS)分析以測定+1177 Da修飾重鏈是否影響陰離子交換(Capto Q)池(而非混合模式(Capto黏著)池)中觀測到之酸性區域。參考標準抗MMP9抗體藉由IEC高效液相層析(IEC-HPLC)分級成六個峰。此等峰呈現在約13分鐘(峰1)、約13.75分鐘(峰2)、約15分鐘(峰3)、約16分鐘(峰4)、約17分鐘(峰5)及約18.5分鐘(峰6)處。酸性峰包括峰1及2，且鹼性峰包括峰4、5及6。收集每一溶離份且根據串聯質譜法(MS/MS)測試。 對餾分之六個IEC峰中之每一者進行萃取離子層析(EIC)。+1177 Da物質之全部掃描m/z為927.48
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。經由IEC-HPLC及反相HPLC (RP-HPLC)測試展示具有提高水準之+1177 Da物質之峰1及2展示峰1溶離份之EIC中之+1177 Da物質且可存在於峰2溶離份中，同樣歸因於與其他溶離份相比峰1及峰2溶離份中存在之48.04至48.07分鐘處之相對較高豐度峰。 MS/MS層析圖證明，+1177 Da物質(m/z 927.48
2+
)定位於峰1溶離份中且在峰2溶離份中亦觀測到。+1177 Da物質在其他溶離份中之任一者(亦即，峰3、4、5或6)中未觀測到。此資料展示，+1177 Da物質位於電荷變異體分析之酸性區域內且為抗MMP9抗體產物之酸性變異體。 進行額外實驗以確認+1177 Da物質對應於電荷變異體譜之第一酸性峰。此藉由富集+1177 Da物質且將其電荷譜與參考標準抗MMP9抗體之電荷譜進行比較來實現，其含有第一酸性峰與一些+1177 Da物質。+1177 Da物質材料使用標準Capto黏著處理，經由低pH條帶相(0.1 M乙酸，pH 3.0)產生。亦在低pH條帶相之後依次進行兩次額外洗滌(0.1 M乙酸銨pH 4.5，50 mM氯化鈣pH 4.5)。測試所有溶離份之+1177 Da物質，但發現0.1 M乙酸溶離份(條帶池)以含有最高水準之+1177 Da物質(28.5%+1177 Da (對於0.1 M乙酸溶離份)相對於0.4%+1177 Da (對於溶離池))。 +1177 Da物質進一步藉由使用標準Capto黏著處理，藉由在capto黏著上自capto黏著再裝載條帶池且隨後典型的capto黏著步驟溶離，繼而額外pH梯度條帶相增濃。換言之，pH 5.5至pH 3.0之溶離後pH梯度用於自自然抗MMP9抗體產物解析度大於單獨使用低pH條帶相分離+1177 Da物質。將含有更高水準+1177 Da物質之溶離份混合一起且量測電荷變異體。+1177 Da物質增濃材料展示與參考標準抗MMP9抗體電荷變異體譜相比電荷變異體譜中之最左側酸性峰顯著提高。在約10分鐘之滯留時間下，+1177 Da物質非增濃材料之吸收率為約15 mAU。在相同滯留時間下，在電荷變異體譜上增濃+1177 Da物質具有約75mAU之吸收率。參考標準抗MMP9抗體之吸收率大於70 mAU。此確認Fc+1177 Da物質為可在電荷變異體譜中偵測到之酸性電荷變異體。 最終，應用混合模式(Capto黏著)證明Fc+1177 Da修飾物質完全移除，如完整及降低質量光譜分析所確認。此甚至在Fc+1177 Da物質之水準下觀測到明顯高於正常水準。舉例而言，Capto黏著證明+1177 Da物質完全移除直至Fc+1177 Da水準增加測試之9倍。
實例 3
將包含抗MMP9抗體之HCCF裝載至蛋白質A MSS基質上。HCCF具有2.55 g/L之抗體效價。在265-400 cm/hr裝載下已確定每公升MSS樹脂32.0 g-36.0 g抗MMP9抗體之裝載密度。蛋白質A層析步驟中使用之洗滌溶液為25 mM Tris，500 mM NaCl，在pH 7.7下。在蛋白質A層析步驟之後，來自蛋白A管柱(Mabselect SuRe
TM
池)之溶離液經受低pH病毒不活化。此池調節至約5.0至6.0之pH且在該pH下保持約60分鐘。其後，在300 LMH (5 L/m
2
/min)下進行深度過濾。Cygnus ELISA版本3.0用於HCP分析。為了評估濾液池中之過濾通量及HCP水準之影響，在過濾之每一階段，在多個體積通量點(50、100、150及200 L/m
2
)處獲取較小體積樣品(1 mL)以便HCP評估。同樣亦分析整個過濾之HCP水準。例示性結果展示於表6中。
表 6 實例 4
在本實例中，測定出，在蛋白質A層析步驟中使用之洗滌緩衝液中，濃度為4 M至6 M之提高脲與濃度為0.5 M至1.5 M之降低氯化鈉之組合導致蛋白質A層析庫中之半抗體水準統計顯著降低。洗滌緩衝液中濃度為4 M至6 M之提高脲與濃度為0.5 M至1.5 M之降低氯化鈉之組合可用於降低多種產物相關雜質之水準，諸如截斷及半抗體形式。 在後期處理特徵期間，以多變量方式研究方法參數，其中單獨地且還與其他產物參數組合研究每一方法參數對方法效能及產物品質屬性之影響。在此等研究中，脲濃度水準在2 M至6 M之間變化以及認為對蛋白質A純化顯著之其他參數。基於產物品質及方法效能評估脲濃度以及其他參數之影響。 量測半抗體且用非還原性毛細電泳法(nrCE)監測為蛋白質A庫中之產物品質屬性中之一者。包括蛋白質A裝載密度、中間物洗滌流動速率、脲濃度、氯化鈉濃度以及裝載密度之方法參數展示為對溶離庫中之半抗體水準統計顯著。 對於溶離庫中之半抗體水準，產生基於裝載密度(g/L)、洗滌流動速率(cm/hr)、脲濃度(M)及氯化鈉濃度(M)之預測特徵。預測特徵證明，脲濃度似乎為對半抗體水準具有最高有效影響之因素。觀測到，更高脲濃度導致池中之半抗體之較低含量。脲濃度自2 M改變至6 M導致純化池中之半抗體水準自5.2%降低至2.7%。特定言之，當脲濃度設定在2 M下時，純化池中之半抗體水準為5.177%，當脲濃度設定在4 M下時，純化池中之半抗體水準為3.884%，且當脲濃度設定在6 M下時，純化池中之半抗體水準為2.6937%。峰2 (半抗體)定量中之不確定性為所使用之nrCE-SDS分析中之約+/-2.0%。在此研究中，半抗體消除率產生之模型具有0.3之r
2
，其指示在此研究中觀測到之半抗體水準之大部分變化形式可不僅僅歸因於單獨的洗滌緩衝液脲濃度。因此，儘管脲之濃度對庫中之半抗體之水準具有統計顯著影響，產生之模型具有低預測值(r
2
=0.3)。此指示該模型中未捕獲之其他參數在使用脲洗滌溶液之蛋白質A洗滌期間對半抗體物質之消除率具有顯著且相關影響。 進行後續研究以評估脲濃度及氯化鈉濃度之脲洗滌溶液參數，同時修正裝載/溶離條件以處理參數目標。裝載密度固定在28 g/L下以提供處理相關更高裝載調節，其將代表半抗體消除率之挑戰情境，而不影響目標處理條件下產物回收率。在所有組合中測試0 M、2 M、4 M及6 M之脲濃度及0.5 M及1.5 M之氯化鈉濃度以判明各自對半抗體消除率之統計貢獻。 用在半抗體之定量中具有改良不確定性(＜+/-1%)之改良之非還原性毛細電泳法-十二烷基硫酸鈉雷射誘導之螢光(nrCE-SDS LIF)分析測試半抗體水準。此提供更多確定性，半抗體之消除率水準可歸因於所研究之方法參數。 產生單變量曲線，展示每一方法參數/指標與如LIF-nrCE-SDS所量測之半抗體水準之相關性。例示性結果提供於表7中。觀測到，當脲濃度以4 M至6 M之濃度提高時且當氯化鈉濃度小於1.5 M時改良半抗體消除率，而此伴有方法步驟產率之輕微降低。此表明，具有4 M至6 M範圍內之提高濃度之脲及0.5 M至1.5 M範圍內低於1.5 M之降低濃度之NaCl之洗滌緩衝液降低與蛋白質A之疏水相互作用，導致結合的抗體部分溶離及不成比例地更多半抗體物質。
表 7
使用含有0 M、4 M或6 M脲、具有0.5 M之氯化鈉濃度之洗滌溶液篩選兩個額外IgG4抗體。亦在＞4 M之脲濃度下觀測到半抗體物質此等抗體降低。例示性結果提供於表8中。
表 8
所有三個分子之數據集之比較展示與抗MMP9、抗LOXL2及IgG4對照分子之半抗體水準降低線性相關之步驟產率(分別r2=0.96、0.87及0.64)。 總之，測定出半抗體消除率明顯受洗滌溶液組成影響且與方法步驟產率高度相關。結果展示，脲濃度及氯化鈉濃度參數對方法產率、蛋白質A純化具有顯著影響，且方法產率與此方法步驟之半抗體消除率高度相關。另外，方法步驟產率主要藉由將洗滌溶液中之脲之濃度提高至4 M至6 M範圍內大於4 M之濃度較低。
實例 5
在本實例中，測定出，採用pH梯度或多步驟溶離以自蛋白質A及蛋白質L親和性樹脂恢復IgG1/IgG4抗體產物可導致半抗體物質部分分解及以小於可偵測半抗體水準恢復產物之能力。此處理亦可以迭代方式使用以使半抗體物質相比於小於1.0%之起始水準增濃大於10倍。可採用pH梯度或多步驟溶離以降低多種產物相關雜質之水準，諸如錯誤摺疊抗體形式、聚集體、截斷及半抗體形式。 在一些態樣中，使用Capto黏著之抗MMP9處理之後續處理由親和性蛋白質A層析步驟與使用40 mM乙酸(pH 3.1)溶離之步驟組成。修改溶離步驟以判定產物相關雜質(諸如半抗體)水準是否可進一步降低。修改溶離步驟以適用於在20-30個管柱體積(CV)上以0-100%緩衝液B之比率組合緩衝液A及緩衝液B之梯度溶離階段(亦即，逐漸自100%緩衝液A轉變成100%緩衝液B)，或各4個CV下50%緩衝液B、60%緩衝液B及75%緩衝液B下之多步驟溶離階段。緩衝液A由25 mM檸檬酸鈉(pH 5.0)組成。緩衝液B由25 mM檸檬酸鈉(pH 2.7)組成。可利用兩個溶離策略(pH梯度溶離及多步驟溶離)以恢復直至含有小於半抗體物質之可偵測水準之半抗體耗盡池中之裝載抗體之40%。 進行研究以表明等效半抗體消除率可使用包括MabSelect (完整蛋白質A配位體)、MabSelect SuRe (重組Z結構域四聚配位體)及MabSelect SuRe pcc (較小珠粒尺寸，較高配位體偶合密度)之蛋白質A樹脂之代表性樣品實現。亦測試Capto L作為替代方案，抗體親和性樹脂亦在低pH下溶離，但結合於抗體之不同區域(可變輕鏈(VI)結構域(對於蛋白質L)相對於主要CH2/CH3結構域(對於蛋白質A配位體))。類似半抗體分解用兩種IgG4抗體產物(抗MMP9及抗LOXL2抗體)及一種IgG1產物(抗GP120抗體)實現。 在大多數情況下，使用具有Capto Q病毒過濾(VF)池及經調配之原料藥之抗MMP9抗體產物進行pH梯度研究，其使用MabSelect SuRe平衡緩衝液(25 mM Tris，25 mM NaCl，pH 7.7)經稀釋至10 g/L。初始實驗(表9，實驗1至4)在MabSelect、Capto L MabSelect SuRe及MabSelect SuRe樹脂上利用10 g/L之裝載密度。此研究指示，兩個親和性配位體能夠部分分解半抗體，且MabSelect (蛋白質A配位體)之單體物質優於Capto L (蛋白質L配位體)且導致來自單體之半抗體之改良峰分辨率(0.21相比於0.10(對於Capto L)。MabSelect之半抗體物質之增濃亦更高，其中與Capto L之2.2之最大倍數增濃相比，其具有3.8之最大倍數增濃。MabSelect SuRe樹脂被認為優於MabSelect，將峰值分辨率改良至0.33且將半抗體物質之最大倍數增濃提高至8.5。MabSelect SuRe及MabSelect SuRe pcc (較小樹脂直徑)在10 g/L裝載密度下具有等效分辨率及半抗體增濃效能。然而，在裝載密度提高至36 g/L之後，MabSelect SuRe pcc之峰值分辨率(0.41)現在優於MabSelect SuRe (0.28)，且最大倍數增濃亦改良(2.5倍對比1.9倍增濃)。此證明，MabSelect SuRe pcc樹脂(較小珠粒尺寸)可在高4倍裝載密度下獲得類似半抗體峰值分辨率，其產生此處理相關選擇方案(表9，實驗6)。儘管半抗體物質似乎非共價相關聯以在生理pH下形成單株抗體單體，結果表明大量半抗體在溶離相之低pH條件下保留解離。因此，利用梯度或多步驟低pH溶離條件可採用與蛋白質A及蛋白質L配位體兩者之親合力作用。 額外實驗證明藉由pH梯度溶離半抗體消除率之若干較多屬性。在20 g/L之裝載密度下，具有重組Z結構域蛋白質A之MabSelect SuRe pcc樹脂用於分解兩種額外抗體產物之半抗體物質及兩種不同IgG同型(抗LOXL2、IgG4；及抗GP120、IgG1) (表9，實驗7及8)。初始半抗體百分比為5.1% (對於抗LOXL2產物)及0.24% (對於抗GP120產物)。使用抗LOXL2 IgG4之實驗產生0.23之峰值分辨率及1.9之半抗體物質之最大倍數增濃(表9，實驗7)。使用抗GP120 IgG1之實驗產生0.30之峰值分辨率及7.9之半抗體物質之最大倍數增濃(表9，實驗8)。此展現，此pH梯度途徑應適用於結合至蛋白質A配位體之所有IgG同型(IgG1/2/4)。來自抗GP120實驗之資料展現，此途徑具有自半抗體水準起始之偵測下限(LLOD)開始之可應用性測試範圍。另外，此等分離在自採集細胞培養液裝載之抗體材料上進行。此展現，宿主細胞雜質之存在不影響蛋白質A pH梯度溶離分解半抗體物質之能力。 額外實驗證明，在20 g/L之裝載密度下之半抗體純化之優良分辨率用MabSelect PrismA實現，其相比於MabSelect SuRe樹脂(表9，實驗9及10)具有更高抗體結合力及經修飾之配位體化學物質(鹼金屬穩定重組Z結構域蛋白質A)。在使用抗LOXL2 IgG4或抗GP120 IgG1抗體產物之單獨實驗中使用MabSelect PrismA樹脂。使用抗LOXL2 IgG4之實驗產生0.41之峰值分辨率及2.1之半抗體物質之最大倍數增濃(表9，實驗9)。使用抗GP120之實驗產生0.30之峰值分辨率及9.5之半抗體物質之最大倍數增濃(表9，實驗10)。此進一步展現，此途徑可應用於具有基於pH之溶離機制之抗體親和性配位體。
表 9
在另一組實驗中，經由三次pH梯度溶離連續循環處理抗MMP9抗體產物(表10)。第一循環具有3.4%初始半抗體且具有9.5%半抗體回收率(2.8×最大倍數增濃)。第二循環具有10.3%初始半抗體且具有半抗體之22.2%回收率(2.2×最大倍數增濃)。第三循環具有32.5%初始半抗體且具有半抗體之45.7%回收率(1.4×最大倍數增濃)。所有三次循環之裝載密度為40 g/L。結果證明，處理可在半抗體之更高純度水準下，隨著效率降低，使約3-33%之起始水準半抗體分解半抗體物質。
表 10
總體而言，來自表9及10之資料表明，此途徑具有缺失下限(LLOD)至起始半抗體水準之32.5%之可應用性測試範圍。 總之，此實例證明，基於pH梯度之溶離可部分分解半抗體物質且將其水準降低至不可偵測之水準與大於40%回收率。此可用多種抗體親和性配位體(例如蛋白質A、重組Z結構域四聚體、蛋白質L、重組鹼金屬穩定Z結構域六聚體)、不同IgG同型(IgG1、IgG4)及抗體產物(例如抗MMP9、抗LOXL2、抗GP120)、不同水準雜質(HCCF、純化處理中間物庫)、不同中間物洗滌步驟(使用具有Capto Q或Capto黏著之洗滌緩衝液之抗MMP9方法)及不同水準之起始半抗體(LLOD至32.5%)實現，其中分辨率效能無損失。降低珠粒尺寸及提高結合力均被認為有利於改良pH梯度分離之分辨率及最大裝載密度兩者，因此改良整個處理。
表 11