ES2229784T3

ES2229784T3 - Proceso de produccion de inmunoglobulinas para administracion intravenosa y otros productos de inmunoglobulina.

Info

Publication number: ES2229784T3
Application number: ES99955389T
Authority: ES
Inventors: Inga Laursen; Boerge Teisner
Original assignee: Statens Serum Institut SSI
Current assignee: Statens Serum Institut SSI
Priority date: 1998-06-09
Filing date: 1999-06-09
Publication date: 2005-04-16
Anticipated expiration: 2019-06-09
Also published as: JP5478519B2; CN1196714C; EP2272870A1; EP1084147A1; EP2270044B1; ID27417A; PT1084147E; DK1084147T3; EP1493751A1; NZ509135A; DE69920693T2; KR20010052733A; EP2272870B1; CN1311797A; JP2011102314A; RU2001101454A; DE69920693D1; SK288128B6; HK1151044A1; CA2330170C

Abstract

Un proceso para purificar inmunoglobulina G (IgG) a partir de una fracción proteica plasmática que contiene inmunoglobulina cruda, en el que el proceso comprende las etapas de: (a) preparar una suspensión acuosa de la fracción proteica plasmática que contiene inmunoglobulina cruda; (b) agregar un agente precipitante de proteínas hidrosoluble, sustancialmente no desnaturalizante, a la suspensión de la etapa (a) en una cantidad suficiente para causar la precipitación de una alta proporción de las proteínas G que no son inmunoglobulinas, inmunoglobulinas agregadas y partículas que incluyen potencialmente partículas infecciosas tales como partículas virales, sin causar la sustancial precipitación de la inmunoglobulina G monomérica, formando de esta manera una mezcla de un sólido precipitado y un sobrenadante líquido; (c) recuperar un sobrenadante clarificado que contiene inmunoglobulina G de la mezcla de la etapa (b).

Description

Proceso de producción de inmunoglobulinas para administración intravenosa y otros productos de inmunoglo-
bulina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para purificar inmunoglobulina G (IgG), a partir de una fracción proteica de plasma crudo. La presente invención también se refiere a un producto de inmunoglobulina y al uso de tal producto de inmunoglobulina para propósitos médicos.

Antecedentes de la invención

Las inmunoglobulinas normales humanas (INH) para utilizarse en la prevención y tratamiento de un número de enfermedades infecciosas, fueron introducidas al final de la década de 1940. Las INH preparadas por el método de fraccionamiento alcohólico en frío según Cohn & Oncley (Cohn E. et al., (1946), J Am Chem Soc, 68, 459-475), (Oncley et al., (1949), J Am Chem Soc, 71,541-550) y subsecuentemente también por la modificación hecha por Kistler y Nitschmann (Kistler P and Nitschmann HS, (1952), Vox Sang, 7, 414-424) probaron ser eficientes y seguras contra la transmisión de infecciones virales cuando se administraban por vía subcutánea o intramuscular.

La falta de inmunoglobulinas congénita o adquirida total o parcial (síndrome de inmunodeficiencia primaria y secundaria, respectivamente) se manifiesta a través de infecciones ordinarias y graves frecuentes, especialmente de naturaleza bacteriana. La prevención de tales infecciones se logró previamente mediante inyecciones intramusculares o subcutáneas repetidas de grandes cantidades de INH por hasta varias veces a la semana como tratamiento de por vida, lo cual es muy doloroso cuando el medicamento se administra por vía intramuscular.

Por lo tanto, al principio de la década de los 60 se intentó la administración de INH por vía intravenosa. Los estudios mostraron que aproximadamente el 5% de voluntarios sanos y aproximadamente el 95% de pacientes con deficiencia de inmunoglobulinas, desarrolló efectos adversos inmediatos que variaban desde disnea hasta choque circulatorio y siendo de naturaleza tan grave que la administración intravenosa de INH tuvo que ser abandonada.

La razón de los efectos adversos anteriormente mencionados se debió a agregaciones de inmunoglobulinas las cuales, entre otros efectos, activaban fuertemente al sistema complemento. Esto se observó particularmente en pacientes que carecían de inmunoglobulinas. Se pudieron observar efectos adversos especialmente graves de naturaleza anafilática en pacientes que desarrollaron anticuerpos contra IgA. En consecuencia, se desarrollaron métodos para evitar la formación de agregados y/o eliminar estos agregados durante el proceso de preparación y hace unos veinte años se probó la primera generación de inmunoglobulinas para administración intravenosa (IGIV) y se encontraron adecuadas.

El propósito original de las IGIV fue aliviar los episodios infecciosos en pacientes con carencia de inmunoglobulinas congénita o adquirida, total o parcial, y eliminar los malestares relacionados con la administración de INH. Otra ventaja de las IGIV es que se pueden administrar grandes dosis de inmunoglobulina en un corto tiempo, por lo cual es posible obtener concentraciones sanguíneas suficientemente altas de manera muy rápida. Especialmente cuando se tratan infecciones bacterianas graves, es de importancia establecer altas concentraciones en los sitios de infección y de manera rápida.

En años recientes, las IGIV demostraron ser eficientes en otras enfermedades graves cuyo tratamiento de otra manera sería difícil, e.g. hemorragias causadas por la desaparición de las plaquetas sanguíneas con base inmunológica, el púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), en algunas enfermedades raras tales como el síndrome de Kawasaki y un número de enfermedades autoinmunitarias tales como la polirradiculitis (síndrome de Guillain-Barre). El tratamiento de otras enfermedades que ha sido difícil hasta la fecha, está siendo sometido a estudios clínicos con IGIV. El mecanismo de acción de estas enfermedades sólo se ha esclarecido parcialmente. El efecto se supone que está relacionado con las denominadas propiedades inmunomoduladoras de la IgG, e.g. un bloqueo de los receptores Fc\gamma de las células fagocíticas, un incremento del metabolismo de IgG, la desregulación de la producción de citocinas y la interferencia con una supuesta red de idiotipos/antiidiotipos, especialmente relevante para la neutralización de la reactividad autoinmunitaria.

La primera generación de IGIV se preparó mediante rompimiento con pepsina de la materia prima 8fracción II de Cohn), siendo el propósito del rompimiento la remoción de los agregados de inmunoglobulina. No se incluyeron etapas de cromatografía en columna en el proceso. El producto tenía que ser liofilizado con el fin de permanecer estable durante un periodo de tiempo razonable y se disolvía inmediatamente antes de su uso.

La materia prima para la IGIV eran INH que habían probado ser seguras con respecto a la transmisión de virus cuando se administraba por inyección intramuscular. Así pues, las IGIV se consideraron como seguras. Después de varios años de uso clínico, sin embargo, los productos de IGIV de algunos fabricantes sorpresivamente demostraron que causaban la transferencia de el virus de la hepatitis C.

Estudios para esclarecer el destino de los virus durante la producción de INH, demostraron que la remoción del virus en el proceso de fraccionamiento del plasma a INH no es muy bueno. La seguridad de las INH para uso intramuscular, es probable que se deba al hecho de que contiene inmunoglobulinas protectoras. En combinación con el modesto volumen inyectado y la vía intramuscular de administración, estas inmunoglobulinas protectoras podían neutralizar virus comunes en plasma no infeccioso. Las infecciones virales pueden ocurrir especialmente cuando grandes dosis de inmunoglobulinas se administran por vía intravenosa, tal como fue demostrado al principio de la década de 1990. Por lo tanto, se reconoció que el proceso de producción debería comprender una o más etapas bien definidas de inactivación y/o remoción de virus.

Una segunda generación de IGIV basada en moléculas de inmunoglobulina no rotas y no modificadas con baja actividad anticomplementaria y alta estabilidad, se introdujo a mediados de los 80, pero todavía en forma de producto liofilizado. Estas IGIV se purificaban mediante varias etapas de cromatografía. Los productos de este tipo actualmente dominan el mercado de IGIV. La primera y segunda generaciones de IGIV, por lo tanto, aparecen en forma de polvos liofilizados que se disuelven inmediatamente antes de su uso.

La disolución de la IGIV liofilizada es lenta (hasta 30 minutos para un frasco). A menudo se tienen que disolver varias porciones para un paciente. Como es de alta prioridad para los usuarios tener una IGIV en solución lista para su uso, se han introducido productos líquidos en el mercado. Lo que es más importante, todavía existe la necesidad de mejorar los procesos de producción con el fin de obtener una preparación de IGIV altamente purificada, estable y completamente natural, con mayor eficacia clínica y menos reacciones adversas. Por lo tanto existe la necesidad de desarrollar procesos mejorados para purificar IgG a partir de plasma crudo o de una fracción proteica plasmática para obtener un producto de IGIV líquido seguro contra virus. Finalmente, el proceso se debe diseñar de tal manera que pueda ser utilizado en una producción a gran escala.

El proceso de purificación descrito en la presente solicitud, conduce a obtener un producto de inmunoglobulina líquido para administración intravenosa que se puede caracterizar como una nueva generación de IGIV altamente purificada, completamente natural, biológicamente activa, doblemente inactivada para virus y estable, la cual no contiene ningún detergente, polietilenglicol (PEG) o albúmina como estabilizante.

El documento DE 411891201 describe un procedimiento para purificación de moléculas monoclonales IgG obtenidas de células de hibridoma. Este procedimiento no comprende las etapas (b) o (d) como se describe en la presente invención y el producto IgG no contiene IgG policlonal io todas las subclases IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, e IgG_{4}, adecuadas para el tratamiento de por ejemplo inmunodeficiencias y enfermedades autoinmunes como el producto IgG de la presente invención.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de purificación mejorado y a un producto de inmunoglobulina líquido mejorado el cual, ínter alía, se puede administrar por vía intravenosa.

Un producto de inmunoglobulina obtenido por el método de la presente invención, se puede denominar como IGIV de tercera generación. El proceso está caracterizado por las siguientes condiciones para el fraccionamiento: se evita el rompimiento con pepsina, los agregados y las partículas son removidos por precipitación (etapa del proceso validada para funcionar como etapa de remoción de virus), se logra una purificación adicional mediante métodos de cromatografía en columna de intercambio iónico, se introduce un tratamiento S/D como etapa inactivadora de virus y la preparación se formula en forma de producto líquido.

Debido a la mejorada pureza del producto de inmunoglobulina que se obtiene por el proceso de la presente invención, en comparación con los productos de la técnica anterior, no es necesaria la adición de estabilizantes tales como detergente no iónico, PEG o albúmina con el fin de evitar la agregación de la IgG durante el almacenamiento del IGIV como producto líquido. El producto que se obtiene por el proceso de la presente invención tiene una mayor calidad que los productos de la técnica anterior y proporciona mejores efectos clínicos y los efectos adversos, indeseables virtualmente están ausentes.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para purificar inmunoglobulinas, G(IgG), a partir de plasma crudo o de una fracción proteica plasmática que contiene inmunoglobulina cruda, en donde el proceso comprende los pasos de:

(a) preparar una suspensión acuosa de la fracción proteica plasmática que contiene inmunoglobulina cruda;

(b) agregar un precipitante de proteínas soluble, sustancialmente no desnaturalizante, a la suspensión de la etapa a) en una cantidad suficiente para causar la precipitación de una alta proporción de las proteínas G no inmunoglobulinas, inmunoglobulinas agregadas y partículas que incluyen potencialmente partículas infecciosas tales como partículas virales, sin causar la sustancial precipitación de la inmunoglobulina G monomérica, formando de esta manera una mezcla de un precipitado sólido y un sobrenadante líquido;

(c) recuperar un sobrenadante clarificado que contiene inmunoglobulina G a partir de la mezcla de la etapa (b) ;

(d) aplicar el sobrenadante clarificado que contiene inmunoglobulina G de la etapa (c) a una resina de intercambio aniónico y subsecuentemente intercambio catiónico;en la que la resina aniónico y la resina de intercambio catiónico serie y en la que el tampón usado para la croe intercambio aniónico y la cromatografía de catiónico es el mismo tampón; el pH de dicho tampón. debajo de 6,0

(e) lavar los contaminantes proteicos y las proteínas precipitadas de la resina de intercambio catiónico de la etapa (d) con una solución reguladora que tenga un pH y fuerza iónica suficientes para remover los contaminantes de la resina sin causar la sustancial elución de la inmunoglobulina G;

(f) eluir la inmunoglobulina G de la resina de intercambio catiónico de la etapa (e) con una solución reguladora sustancialmente no desnaturalizante que tenga un valor de pH y fuerza fónica suficientes para causar la eficiente elución de la inmunoglobulina G, recuperando de esta manera un eluato que contiene inmunoglobulina G;

(g) realizar una día/ultrafiltración del eluato que contiene inmunoglobulina G de la etapa (f) para concentrar y/o dializar el eluato y agregar opcionalmente un agente estabilizante;

(h) agregar una cantidad virucida de agente inactivador de virus a la fracción dializada/ultrafiltrada que contiene inmunoglobulina G y opcionalmente estabilizada de la etapa (g), obteniéndose una solución sustancialmente seguro contra virus que contiene inmunoglobulina G;

(i) aplicar la solución que contiene inmunoglobulina G de la etapa (h) a una resina de intercambio aniónico y subsecuentemente a una resina de intercambio catiónico;

(j) lavar la resina de intercambio catiónico de la etapa (i) con una solución reguladora que tenga un pH y fuerza fónica suficientes para lavar los contaminantes proteicos y el agente inactivador de virus de la resina, sin causar una sustancial elución de la inmunoglobulina G;

(k) eluir la inmunoglobulina G de la resina de intercambio catiónico de la etapa (j) con una solución reguladora sustancialmente no desnaturalizante que tenga un pH y fuerza iónica suficientes para causar la elución eficiente de la inmunoglobulina G, recuperando de esta manera un eluato que contiene inmunoglobulina G; y

(l) someter el eluato que contiene inmunoglobulina G de la etapa (k) a una día/ultrafiltración para disminuir la fuerza fónica y concentrar la inmunoglobulina G de la solución, y ajustar la osmolaridad mediante la adición de un sacárido.

La invención se refiere adicionalmente a un producto inmunogénico obtenible mediante el procedimiento y el uso de dicho producto durante la preparación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero con PID (Inmunodeficiencia Primaria), SID (Inmunodeficiencia Secundaria), ITP (Trobocitopenia Idiopátioca Púrpura), poliradiculitis, polineuropatías periféricas, enfermedad de Kawasaki, polimiositis, enfermedades autoinmunes severas crónicas, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), neuropatía motora multifocal, esclerosis múltiple, Miastenia Gravis, síndrome de Eaton-Lambert, Neuritis Óptica, epilepsia, abortos habituales, síndrome de antifosfolipido primario, artritis reumatoide, lupus eritrematoso sistémico, escleroderma sistémica, vasculitis, granulomatosis de Wegner, síndrome de Sjogren, artritis reumatoide juvenil, neutropenia autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, neutropenia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celíaca, asma, síndrome del choque séptico, síndrome de fatiga crónica, psoriasis, síndrome del choque tóxico, diabetes, sinusitis, cardiomiopatía dilatada, endocarditis, aterosclerosis, y adultos con infecciones con SIDA y bacterianas.

La materia prima del proceso de purificación de la presente invención puede ser plasma crudo, pero ventajosamente es una fracción proteica plasmática cruda que contiene inmunoglobulinas. La materia prima para el proceso de purificación puede ser plasma humano normal o se puede originar de donadores con altos títulos de anticuerpos específicos, e.g. plasma hiperinmune. En la presente descripción, el término "fracción plasmática que contiene inmunoglobulinas" abarca todas las materias primas posibles para el presente proceso, e.g. plasma libre de crioprecipitado o plasma libre de crioprecipitado a partir del cual se han removido varias proteínas plasmáticas tales como factor IX y antitrombina, diferentes fracciones de Cohn y fracciones obtenidas a partir de procedimiento de precipitación por PEG (Polson et al. (1964), Biochem Biophys Acta, 82, 463-475; Polson y Ruiz-Brazo, (1972)) Vos Sang, 23, 107-118) o con sulfato de amonio. En una modalidad preferida, la fracción proteica plasmática son las fracciones II y III de Cohn, pero la fracción II de Cohn o las fracciones I, II y III de Cohn se pueden utilizar también. Las diferentes fracciones de Cohn de preferencia se preparan a partir de plasma por el método de fraccionamiento de Cohn estándar, esencialmente tal como fue modificado por Kistler-Nitschmann. Además de las inmunoglobulinas, las fracciones de Cohn contienen por ejemplo fibrinógeno, alfa-globulinas y beta-globulinas, incluyendo varias lipoproteínas, las cuales de preferencia se remueven durante el subsecuente proceso de purificación. Puede haber presentes o no filtros, dependiendo del método de aislamiento utilizado para obtener las fracciones de Cohn (i.e., centrifugación o filtración).

La primera etapa del proceso según la presente invención, incluye preparar una suspensión acuosa de una fracción proteica plasmática que contiene inmunoglobulinas, en donde la concentración de IgG en la suspensión es suficientemente alta para que, durante la siguiente etapa de precipitación, una gran proporción de las proteínas no IgG, especialmente aquellas de más alto peso molecular, las inmunoglobulinas agregadas y otras proteínas agregadas así como partículas potencialmente infecciosas, se precipiten sin la sustancial precipitación de la IgG monomérica. Esto generalmente se logra si la concentración de la IgG en la suspensión regulada y filtrada es de cuando menos aproximadamente 4 g/L antes de la adición del agente precipitante. Debe tomarse en consideración que la influencia de la concentración proteica así como el pH y la temperatura de la suspensión en la etapa de precipitación, dependen del agente precipitante seleccionado.

Se prefiere que la fracción de proteína plasmática se suspenda en agua y/o una solución reguladora a una temperatura y pH sustancialmente no desnaturalizantes. El término "sustancialmente no desnaturalizante" implica que las condiciones a las cuales el término se refiere no causan la pérdida sustancial irreversible de la actividad funcional de las moléculas de IgG, e.g., pérdida de la actividad de unión al antígeno y/o pérdida de la función Fc biológica (véase el Ejemplo 2).

Ventajosamente, la fracción proteica plasmática se suspende en agua acidificada con al menos un sistema regulador de pH no desnaturalizante a volúmenes de 6 a 9, de preferencia de 7 a 8 veces mayores que el de la fracción proteica plasmática. El pH de la suspensión que contiene inmunoglobulinas de preferencia se mantiene por abajo de 6, por ejemplo dentro del rango de 4.0 a 6.0, preferiblemente de 5.1 a 5.7, más preferiblemente aproximadamente 5.4, con el fin de asegurar una solubilidad óptima de las inmunoglobulinas y para asegurar el efecto óptimo de la subsecuente etapa de precipitación con PEG. Se puede utilizar cualquier solución reguladora ácida adecuada, pero el sistema regulador de preferencia contiene cuando menos uno de los siguientes reguladores y ácidos: fosfato de sodio, acetato de sodio, ácido acético, HCl. Los técnicos en la materia observarán que se pueden utilizar muchas otras soluciones reguladoras.

La suspensión de inmunoglobulina de preferencia se mantiene a una temperatura fría, inter alía con el fin de evitar la sustancial desnaturalización proteica para minimizar la actividad de proteasa. La suspensión de inmunoglobulina y el agua, así como el sistema regulador agregado, de preferencia tienen la misma temperatura dentro del rango de 0 a 12°C, de preferencia de 0 a 8°C, más preferiblemente de 1 a 4°C.

La suspensión de una pasta precipitada, con etanol contiene relativamente grandes cantidades de material proteico agregado. Opcionalmente, la suspensión que contiene inmunoglobulinas se filtra con el fin de remover, e.g. los grandes agregados, el mejorador de filtración si lo hay y la pasta residual no disuelta. La filtración de preferencia se lleva a cabo por medio de filtros de profundidad, e.g. C 150 AF, AF 2000 ó AF 1000 (Schenk), 30LA (Cuno) o filtros similares. La remoción de agregados, mejoradores de filtración si los hay y material proteico residual no disuelto, también se puede llevar a cabo por centrifugación.

Se agrega cuando menos un precipitante de proteínas hidrosoluble, sustancialmente no desnaturalizante, a la suspensión filtrada que contiene inmunoglobulinas, en una cantidad suficiente para causar la precipitación de una alta proporción de las proteínas de peso molecular más alto, lipoproteínas, proteínas agregadas, entre éstas las inmunoglobulinas agregadas. Otros materiales particulados tales como partículas potencialmente infecciosas, e.g. partículas virales, también son precipitados sin causar la precipitación sustancial de la IgG monomérica. El término "partículas infecciosas" tal como se utiliza en la presente, comprende e.g. partículas de virus (tales como virus de la hepatitis, VIH 1 y VIH 2) y bacterias.

Los precipitantes de proteínas sustancialmente no desnaturalizantes e hidrosolubles son bien conocidos en el campo de la purificación de proteínas. Tales precipitantes se utilizan para fraccionar proteínas, dando como resultado la purificación parcial de las proteínas a partir de suspensiones. Los precipitantes de proteínas adecuados para ser utilizados en el proceso de la presente invención, incluyen varias formas de peso molecular de PEG, ácido caprílico y sulfato de amonio. Los técnicos en la materia observarán que se pueden utilizar otros precipitantes hidrosolubles y no desnaturalizantes como medios alternativos para la precipitación. El término "agregar un precipitante de proteínas" y variantes de ese término, significan la adición de uno o más tipos de agentes de precipitación de proteínas.

Un agente precipitante preferido es el agente orgánico PEG, particularmente PEG dentro del rango de peso molecular de 3000 a 8000 Da, tal como PEG 3350, PEG 4000, PEG 5000 y especialmente PEG 6000 (los números de estos compuestos de PEG específicos representan su peso molecular promedio). La ventaja de utilizar PEG como precipitante es que el PEG no es iónico y tiene propiedades estabilizantes de proteínas, e.g., el PEG en una baja concentración es bien conocido como estabilizantes para productos IGIV. La etapa de precipitación también funciona como etapa de remoción de virus. El PEG concentra y precipita los virus independientemente de la especie, tamaño y revestimiento de superficie de los mismos.

Una cantidad dada de precipitante de proteína se agrega a la suspensión filtrada para precipitar la mayoría de las proteínas de alto peso molecular y las proteínas agregadas y partículas, sin la precipitación sustancial de la IgG monomérica, formando una solución de sobrenadante limpio. El precipitante de proteína se puede agregar como sólido en polvo o en forma de una solución concentrada.

Para el PEG como precipitante, se aplica una regla general de que mientras más alto sea el peso molecular del compuesto, más baja será la concentración de PEG necesaria para causar que precipiten las proteínas. Cuando se utiliza PEG 3350, PEG 4000 ó de preferencia PEG 6000, la concentración del precipitante en la suspensión filtrada, ventajosamente, está en el rango de 3 a 15% en peso, por ejemplo de 4 a 10% (por ejemplo aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%), en donde 6% es la cantidad más preferida. En la etapa de precipitación, el proceso de precipitación se deja proceder cuando menos hasta que se alcance el equilibrio entre la fase sólida y la líquida, e.g., normalmente durante al menos 2 horas, por ejemplo de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 horas, de preferencia aproximadamente 4 horas. Durante la etapa de precipitación, la suspensión de preferencia se mantiene a baja temperatura (e.g. menos de aproximadamente 12°C, por ejemplo menos de aproximadamente 10°C, de preferencia entre 2 y 8°C). La temperatura más adecuada depende de la identidad del agente precipitante de proteínas.

Después de concluir la precipitación de proteínas, un sobrenadante clarificado que contiene IgG casi exclusivamente en forma monomérica, es recuperado de la mezcla del precipitado sólido y el sobrenadante líquido resultante de la precipitación. La recuperación se puede realizar por técnicas convencionales para separar líquidos de fases sólidas, por ejemplo centrifugación y/o filtración. De preferencia se utiliza una centrífuga de flujo (e.g. Westfalia) con una fuerza de 1000 a 5000 g.

Opcionalmente, el sobrenadante que contiene IgG recuperado clarificado, se filtra para remover las partículas grandes y agregados. Esto opcionalmente es seguido por una filtración estéril realizada mediante el uso de un filtro de esterilización convencional (tal como un filtro de 0.22 µm de Millipore o Sartorius), lo cual elimina e.g. bacterias de la solución.

El sobrenadante clarificado y opcionalmente filtrado que contiene IgG, se somete a cuando menos un paso, por ejemplo dos pasos, pero opcionalmente más pasos de cromatografía de intercambio aniónico y catiónico, con el fin de remover una proporción sustancial de los contaminantes no IgG remanentes, por ejemplo IgA, albúmina así como agregados. En una modalidad preferida, el sobrenadante clarificado y opcionalmente filtrado que contiene IgG se aplica a una resina de intercambio aniónico y subsecuentemente a una resina de intercambio catiónico, empacadas en dos columnas de dimensiones apropiadas.

Cuando se realizan las etapas de cromatografía de intercambio fónico para la purificación de IgG, se prefiere que las condiciones, e.g. el pH y la fuerza iónica, se seleccionen de tal manera que una gran porción de los contaminantes (e.g. proteínas que no son IgG tal como IgA, transferrina, albúmina y agregados) en la solución se unan a la resina de intercambio aniónico, mientras que sustancialmente ninguna cantidad de IgG se adsorba a la resina de intercambio aniónico. Con respecto a la subsecuente cromatografía de intercambio catiónico, las condiciones preferidas seleccionadas dan como resultado la unión de sustancialmente todas las moléculas de IgG presentes en la solución que fue aplicada a la resina de intercambio catiónico. Los contaminantes proteicos no adsorbidos a la resina de intercambio aniónico y el agente de precipitación, son removidos en el subsecuente lavado de la resina de intercambio catiónico.

En una modalidad preferida del proceso de la presente invención, la resina de intercambio aniónico y la resina de intercambio catiónico se conectan en serie. En el presente contexto, el término "se conecta en serie", cuando se utiliza con referencia a las resinas de intercambio fónico, significa que las proteínas que pasan a través de la resina de intercambio aniónico son cargadas directamente a la resina de intercambio catiónico, sin cambio de solución reguladora ni de otras condiciones.

Existen varias razones que hacen ventajoso que la cromatografía de intercambio aniónico y la cromatografía de intercambio catiónico se realicen en una sola etapa utilizando dos columnas de cromatografía conectadas en serie, en vez de dos etapas independientes de cromatografía, e.g. con diferentes composiciones de solución reguladora. El uso de dos columnas de cromatografía conectadas en serie hace más práctica la operación, e.g. no hay la necesidad de una etapa intermedia de colección de la fracción que contiene IgG entre los dos métodos de cromatografía de intercambio fónico, para posiblemente ajustar el pH y la fuerza iónica. Además, el flujo de solución reguladora se aplica a ambas columnas al mismo tiempo y las dos columnas se equilibran con la misma solución reguladora. Sin embargo, está contemplado que también es posible realizar la etapa de cromatografía en dos pasos, i.e. una resina de intercambio aniónico y la resina de intercambio catiónico no están conectadas en serie. Realizar la cromatografía en dos pasos, tal como se mencionó anteriormente, sería más laborioso en comparación con mantener las resinas de intercambio fónico conectadas en serie.

Actualmente se contempla que el alto grado de pureza, el alto contenido de monómeros y dímeros de IgG y el bajo contenido de IgA en el producto IGIV de la presente invención, se deben parcialmente al uso de dos columnas de cromatografía conectadas en serie.

Como será evidente para un técnico en la materia, los intercambiadores iónicos se pueden basar en varios materiales con respecto a la matriz así como a los grupos con carga unidos. Por ejemplo, se pueden utilizar las siguientes matrices, en las cuales los materiales mencionados pueden estar más o menos reticulados: basada en agarosa (tal como Sepharose CL-6B®, Sepharose Fast Flow® y Sepharose High Performance®), basadas en celulosa (tales como DEAE Sephacel®), basadas en dextrán (tales como Sephadex®), basadas en sílice y basadas en polímeros sintéticos. Para la resina de intercambio aniónico, los grupos con carga que se unen covalentemente a la matriz, por ejemplo pueden ser dimetilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE) y/o amonio cuaternario (Q). Para la resina de intercambio catiónico, los grupos con carga que están covalentemente unidos a la matriz, por ejemplo, pueden ser carboximetilo (CM), sulfopropilo (SP) y/o metilsulfonato (S). En una modalidad preferida del proceso de la presente invención, la resina de intercambio aniónico empleada es DEAE Sepharose Fast Flow®, pero se pueden utilizar otros intercambiadores de aniones. Una resina de intercambio catiónico preferida es la CM Sepharose Fast Flow®, pero también se pueden utilizar otros intercambiadores de cationes.

El volumen apropiado de resina utilizada cuando se empaca en una columna de cromatografía de intercambio fónico, se ve reflejado por las dimensiones de la columna, i.e. el diámetro de la columna y la altura de la resina, y varía dependiendo de, por ejemplo, la cantidad de IgG en la solución aplicada y la capacidad de unión de la resina utilizada.

Antes de realizar una cromatografía de intercambio ióníco, la resina de intercambio fónico de preferencia se equilibra con una solución reguladora que permite que la resina se una con sus contraiones. De preferencia, las resinas de intercambio aniónico y catiónico son equilibradas con la misma solución reguladora, ya que esto facilita el proceso puesto que sólo se tiene que preparar un y utilizar una solución reguladora.

Por ejemplo, si la resina de intercambio aniónico seleccionada es DEAE Sepharose FF® y la resina de intercambio catiónico es CM Sepharose FF® y las columnas se conectan en serie, entonces las columnas ventajosamente son equilibradas con una solución reguladora ácida no desnaturalizante que tenga aproximadamente el mismo pH y fuerza iónica que la solución de IgG a ser cargada. Es adecuada cualquiera de una variedad de soluciones reguladoras para la equilibración de las columnas de intercambio fónico e.g., acetato de sodio, fosfato de sodio, tris(hidroximetil)aminometano. Los técnicos en la materia observarán que se pueden utilizar muchas otras soluciones reguladoras para equilibrar la columna, en tanto que el pH y la conductividad sean aproximadamente las mismas que para la solución de IgG aplicada. Una solución reguladora preferida para equilibrar la columna de intercambio aniónico y la columna de intercambio catiónico cuando se conectan en serie, es una solución reguladora de acetato de sodio que tiene una concentración de acetato de sodio dentro del rango de 5 a 25 mM, por ejemplo dentro del rango de 10 a 20 mM, de preferencia aproximadamente 15 mM. Se prefiere que el pH de la solución reguladora de acetato de sodio utilizada para la equilibración, esté dentro del rango de 5.0 a 6.0, por ejemplo dentro del rango de 5.4 a 5.9, de preferencia aproximadamente 5.7. La conductividad está dentro del rango de 1.0 a 1.4 mS/cm, de preferencia aproximadamente 1.2 mS/cm. Las soluciones reguladoras de acetato adecuadas se pueden preparar con acetato de sodio trihidratado y ácido acético glacial.

Antes de cargar el sobrenadante clarificado y opcionalmente filtrado que contiene IgG en las columnas de intercambio iónico, la concentración de la solución reguladora y el pH del sobrenadante de preferencia se ajustan, si es necesario, a valores sustancialmente equivalentes a la concentración y pH de la solución reguladora de equilibración empleada.

Después de cargar el sobrenadante que contiene IgG en columnas en serie, las columnas de preferencia se lavan (lavado inicial) con un volumen de columna de una solución reguladora de lavado, con el fin de asegurar que la solución que contiene IgG sea transferida cuantitativamente de la columna de intercambio aniónico a la columna de intercambio catiónico. Subsecuentemente, las columnas de intercambio aniónico y catiónico se desconectan y la columna de intercambio catiónico de preferencia se lava con el fin de remover los contaminantes proteicos de la resina con una solución reguladora que tenga un pH y fuerza iónica suficientes para eluir sustancialmente todos los contaminantes de la resina de intercambio catiónico, sin causar una sustancial elución de la IgG.

El lavado inicial ventajosamente se realiza utilizado la solución reguladora de equilibración, aun cuando se pueden utilizar otras soluciones reguladoras con valores de concentración y pH similares para el lavado. Se prefiere que se utilice una solución reguladora de acetatos para lavar los contaminantes de la resina de intercambio catiónico. El pH de la solución reguladora puede ser de 5.0 a 6.0, por ejemplo puede estar dentro del rango de 5.2 a 5.8, por ejemplo aproximadamente 5.4.

La elución de la IgG de la resina de intercambio catiónico se realiza con una solución reguladora sustancialmente no desnaturalizante que tenga un pH y fuerza iónica suficientes para causar la elución eficiente de la IgG, recuperando de esta manera un eluato que contiene IgG. En este contexto, el término "elución eficiente" significa que cuando menos el 75%, por ejemplo el 80%, e.g. cuando menos el 85% de las proteínas IgG cargadas en las resinas de intercambio aniónico y catiónico en serie, son eluidas de la resina de intercambio catiónico. La elución ventajosamente se lleva a cabo en forma de una etapa de elución en gradiente. En el proceso de la presente invención, la solución reguladora preferida utilizada es acetato de sodio que tiene un pH dentro del rango de 5.0 a 6.0, por ejemplo de 5.2 a 5.8, preferiblemente aproximadamente 5.4 y una concentración dentro del rango de 5 a 40 mM, por ejemplo dentro del rango de 10 a 25 mM, de preferencia aproximadamente 15 mM.

Se prefiere que la concentración de sal de la solución reguladora eluyente sea suficientemente alta para desplazar la IgG de la resina. Sin embargo, se contempla que se puede utilizar un incremento de pH y una concentración de sales más baja para eluir la IgG de la resina. En una modalidad preferida del proceso de la presente invención, la elución se lleva a cabo en forma de una elución continua en gradiente de sal con concentraciones de cloruro de sodio dentro del rango de 5 a 500 mM, de preferencia de aproximadamente 125 a 350 mM de cloruro de sodio.

La elución también se puede llevar a cabo por elución en gradientes por etapas. Se contempla que la elución también se puede realizar en forma de una elución a sal constante, en la cual la solución reguladora de elución aplicada a la columna de intercambio catiónico solamente tiene una concentración de sal, en contraste con la elución en gradiente. Si se realiza una elución a sal constante, la concentración de sal ventajosamente puede estar dentro del rango de aproximadamente 350 a aproximadamente 500 mM de cloruro de sodio. La ventaja de la elución por gradiente en comparación con la elución a sal constante, es que la elución es más efectiva con un gradiente de sal, pero otra ventaja es que el eluato tiene una fuerza iónica más baja, lo cual es ventajoso debido a que es crítica una alta fuerza iónica para la estabilidad de la IgG. La solución reguladora de elución además puede comprender un agente estabilizante de proteínas, tal como los que se mencionarán más adelante. Se pueden utilizar varios otros sistemas de solución reguladora adecuados para eluir la IgG, tal como será observado por los técnicos en la materia.

De preferencia, se aplica cuando menos una gente estabilizante de proteínas a la fracción de IgG inmediatamente después o durante la elución. Los agentes estabilizantes de proteínas son conocidos para los técnicos en la materia e incluyen, por ejemplo, diferentes alcoholes de azúcares y sacáridos (tales como sorbitol, manosa, glucosa, trealosa, maltosa), proteínas (tales como albúmina), aminoácidos (tales como lisina, glicina) y agentes orgánicos (tales como PEG). Ventajosamente, el estabilizante seleccionado puede ser uno que pueda ser removido de la solución que contiene IgG en las etapas subsecuentes.

La concentración adecuada del agente estabilizante de proteínas en la solución que contiene IgG,,depende del agente específico empleado. En una modalidad preferida, el agente estabilizante es sorbitol, de preferencia a una concentración final dentro del rango de 2 a 15% (p/v) de sorbitol, e.g. aproximadamente 2.5%.

Después de la elución de la columna de intercambio catiónico, el eluato de preferencia se desaliniza (Le., se dializa) y ventajosamente se concentra. El cambio de solución reguladora y la concentración de IgG se pueden realizar mediante un proceso combinado de día/ultrafiltración. El término "día/ultrafiltración" tal como se utiliza en la presente, significa que la diálisis y la concentración por diafiltración y ultrafiltración, respectivamente, se realizan en una sola etapa. Está contemplado que la diafiltración y la ultrafiltración se realicen en forma de dos etapas separadas. Sin embargo, con el fin de prevenir la pérdida innecesaria de producto, actualmente se prefiere realizar la diálisis y la concentración por los métodos de diafiltración y ultrafiltración en una sola etapa.

Las membranas empleadas para la día/ultrafiltración ventajosamente tienen un corte de peso nominal dentro del rango de 10,000 a 100,000 Da. Un tipo de membrana preferido para el proceso de la presente invención es una membrana de polisulfona con un corte de peso nominal de 30,000 Da, comercializada por Millipore. Se pueden emplear otras membranas de ultrafiltración de materiales y porosidad comparables.

El grado de concentración puede variar considerablemente. La solución se concentra desde aproximadamente 10 g/L de IgG hasta aproximadamente 100 g/L, de preferencia de aproximadamente 50 g/L. Después de la concentración, el concentrado de IgG ventajosamente se dializa contra una solución reguladora de baja fuerza fónica. Además de remover los iones de sal, esta etapa también remueve contaminantes de bajo peso molecular de la solución y proporciona un mecanismo para el intercambio de solución reguladora para la siguiente etapa de purificación. Una solución reguladora preferida para la diafiltración es acetato de sodio 15 mM, pH 5.4 conteniendo 2.5% (p/v) de sorbitol. El intercambio de solución reguladora se continúa hasta que la conductividad de la solución ultrafiltrada se reduzca a un valor menor de aproximadamente 1.5 mS/cm, de preferencia menor' de aproximadamente 1.3 mS/cm. Durante la día/ultrafiltración, el pH de preferencia se mantiene dentro del rango de 4.0 a 6.0, de preferencia de 5.1 a 5.7, más preferiblemente a aproximadamente 5.4.

Después de la día/ultrafiltración, la concentración del agente estabilizante de proteínas ventajosamente se ajusta en la solución, si es necesario, a una concentración final óptima característica para el agente estabilizante de proteínas específico que se utilizó. Si se emplea sorbitol, la concentración de sorbitol de preferencia se ajusta a aproximadamente 10% en peso.

Se prefiere que la solución estabilizada se filtre con un filtro que tenga un diámetro de poro dentro del rango de 0.2 a 1.0 µm, de preferencia de aproximadamente 0.45 µm, con el fin de remover los agregados antes de la siguiente etapa. En esta etapa, la solución que contiene IgG tiene un aspecto de solución transparente de volumen apropiado con una alta estabilidad como el resultado combinado de la alta pureza, la baja fuerza iónica, el pH ácido, la relativamente alta concentración de IgG y el estabilizante agregado.

En el proceso de producción del producto IGIV, actualmente se incorporan cuando menos dos etapas definidas y validadas de remoción e inactivación de virus, en donde estas etapas de preferencia son la precipitación con PEG como etapa de remoción de virus general y un tratamiento con S/D como etapa inactivadora de virus contra virus envueltos en lípidos. Además, los estrictos requerimientos de seguridad contra virus de las materias primas, según las normas internacionales y la capacidad reductora de virus bien conocida de un proceso de purificación de etapas múltiples, la incorporación de dos etapas de reducción viral independientes que son activas contra virus envueltos y no envueltos, el medicamento de la presente invención es sustancialmente seguro contra virus.

Los virus infecciosos envueltos en lípidos que todavía pudieran estar presentes en la solución que contiene IgG, de preferencia son inactivados en. esta etapa del proceso mediante la adición de una cantidad virucida de un agente inactivador de virus a la solución que contiene IgG. El término una "cantidad virucida" del agente inactivador de virus, tal como se utiliza en la presente, significa una cantidad que dé origen a una solución en la cual las partículas virales sustancialmente se han vuelto no infecciosas, obteniéndose una "solución que contiene IgG segura contra virus" tal como se define en la técnica. Tal "cantidad virucida" dependerá del agente inactivador de virus empleado así como de condiciones tales como el tiempo de incubación, el pH, la temperatura, el contenido de lípidos y la concentración de proteínas.

El término "agente inactivador de virus" tal como se utiliza en la presente, denota un agente o un método que se puede utilizar con el fin de inactivar virus envueltos en lípidos así como virus envueltos en materiales no lipídicos. El término "agente inactivador de virus" debe entenderse que abarca tanto una combinación de tales agentes y/o métodos, siempre y cuando sea apropiada, así como un solo tipo de tales agentes o métodos.

Los agentes inactivantes de virus preferidos son detergentes y/o disolventes, de preferencia mezclas de detergente/disolvente. Debe entenderse que el agente inactivador de virus opcionalmente es una mezcla de uno o más detergentes con uno o más disolventes. El tratamiento con disolvente/detergente (S/D) es una etapa, ampliamente utilizada para inactivar virus envueltos en lípidos (e.g. VIH1 y VIH2, hepatitis tipo C y no A-B-C, VLTH1 y 2, la familia de herpesvirus, incluyendo CMV y virus de Epstein-Barr) en productos sanguíneos. Se puede utilizar una amplia variedad de detergentes y disolventes para la inactivación de virus. El detergente se puede seleccionar del grupo que consiste de detergentes no fónicos y fónicos y se selecciona de modo que sea sustancialmente no desnaturalizante. De preferencia se utiliza un detergente no iónico, ya que facilita la subsecuente eliminación del detergente de la preparación de IgG en las etapas posteriores. Los detergentes adecuados se describen, e.g en Shanbrom et al en las Patentes Norteamericanas US 4,314,997 y US 4,315,919. Los detergentes preferidos son aquellos que se venden en el comercio con las marcas Triton X-100 y Tween 80. Los disolventes preferidos para utilizarse en los agentes inactivadores de virus son dialquilfosfatos o trialquilfosfatos como los descritos por ejemplo por Neurath y Horowitz en la Patente Norteamericana US 4,764,369. Un disolvente preferido es el tri(n-butil)fosfato (TNBP). Un agente inactivador de virus especialmente preferido para la práctica de la presente invención, es una mezcla de TNBP y Tween 80, pero alternativamente se pueden utilizar otras combinaciones. La mezcla preferida se agrega en un volumen tal que la concentración de TNBP en la solución que contiene IgG quede dentro del rango de 0.2 a 0.6% en peso, de preferencia a una concentración de aproximadamente 0.3% en peso. La concentración de Tween 80 en la solución que contiene IgG está dentro del rango de 0.8 a 1.5% en peso, de preferencia a una concentración de aproximadamente 1% en peso.

La etapa de inactivación de virus se lleva a cabo bajo condiciones que inactivan virus envueltos, dando como resultado una solución que contiene IgG sustancialmente segura contra virus. En general, tales condiciones incluyen una temperatura de 4 a 30°C, por ejemplo de 19 a 28°C, de 23 a 27°C, de preferencia aproximadamente 25°C y un tiempo de incubación que se encuentre efectivo por medio de estudios de validación. Generalmente es suficiente un tiempo de incubación de 1 a 24 horas, de preferencia de 4 a 12 horas, por ejemplo aproximadamente 6 horas, para asegurar una suficiente inactivación de virus. Sin embargo, las condiciones apropiadas (temperatura y tiempos de incubación) dependen del agente inactivador de virus empleado, del pH y de la concentración de proteínas y el contenido de lípidos de la solución.

Se contempla que también se pueden emplear otros métodos para la remoción o inactivación de virus para producir un producto seguro contra virus, tal como la adición de azul de metileno con la subsecuente inactivación por radiación con luz ultravioleta o nanofiltración.

Después del tratamiento con el disolvente/detergente, la solución ventajosamente se diluye con una solución reguladora. Opcionalmente, la solución que contiene IgG sustancialmente segura contra virus se filtra, de preferencia a través de un filtro de profundidad como los previamente descritos en una etapa anterior del proceso de la presente invención y/o a través de un filtro estéril.

Después de la inactivación del virus y preferiblemente una filtración, se realiza la cromatografía de intercambio iónico con el fin de remover el agente inactivador de virus y los contaminantes proteicos. Esta etapa de preferencia se realiza de la manera ya descrita para la etapa de cromatografía de intercambio fónico previa en el presente proceso, con la excepción de que el volumen de la resina de intercambio aniónico es de aproximadamente la mitad al de la resina de intercambio catiónico y que el lavado antes de eluir la IgG es más extenso, utilizándose cuando menos seis volúmenes de columna de solución reguladora. Adicionalmente, en una modalidad preferida de,la presente invención, la solución reguladora de equilibración es acetato de sodio con una concentración dentro del rango de aproximadamente 5 a 25 mM, de preferencia 15 mM y un pH dentro del rango de aproximadamente 5.0 a 5.8, de preferencia 5.4. Como se mencionó previamente, el contenido de acetato de sodio y el pH de la solución que contiene IgG de preferencia se ajustan a la misma concentración y pH que la solución reguladora de equilibración. Adicionalmente, en una modalidad preferida de la presente invención, se agrega un agente estabilizante de proteínas, de preferencia maltosa, al eluato recuperado hasta una concentración final dentro del rango de 1 a 5%, de preferencia de aproximadamente 2.5% en peso.

El método preferido para eliminar el agente inactivador de virus, es por cromatografía de intercambio fónico. Sin embargo también están contemplados otros métodos tales como la extracción oleosa y métodos cromatográficos alternativos. El método apropiado dependerá del agente inactivador de virus empleado. La remoción del disolvente/detergente, entonces, se puede realizar uniendo la IgG a una resina y subsecuentemente, lavando bien el agente inactivador con una solución reguladora. La cromatografía de intercambio catiónico es un método útil. En una modalidad preferida de la presente invención, también se realiza una cromatografía de intercambio aniónico además de la cromatografía de intercambio catiónico, con el fin de mejorar la calidad y la pureza global del producto final del proceso de la presente invención.

Después de la etapa de cromatografía de intercambio iónico, el eluato que contiene IgG de preferencia se dializa y se concentra; de esta manera el contenido de los restantes componentes proteicos más pequeños también se reduce efectivamente. De manera ventajosa, esto se puede llevar a cabo por día/ultrafiltración tal como ya se describió anteriormente. La solución reguladora empleada para la diafiltración es acetato de sodio, de preferencia una concentración de aproximadamente 4 a 10 mM, preferiblemente de 7.5 mM y a un pH dentro del rango de aproximadamente 4.0 a 6.0, de preferencia de aproximadamente 5.1 a 5.7, por ejemplo aproximadamente 5.4. Alternativamente, se pueden utilizar otras soluciones reguladoras tales como fosfato de sodio o ácidos para la diafiltración. La diafiltración continúa hasta que la conductividad sea menor o igual a 1 mS/cm. Opcionalmente, la solución que contiene IgG se esteriliza por filtración adicional.

Si se desea, la solución que contiene IgG purificada que está sustancialmente libre del agente inactivador de virus, es sometida a otros tratamientos con el propósito de hacerla adecuada para su formulación como producto líquido para ser administrado, por ejemplo por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular.

Desde un punto de vista práctico, se prefiere que el contenido de la formulación líquida del producto de inmunoglobulina sea el mismo para el almacenamiento que para el uso. La concentración final de IgG en el producto de preferencia está en el rango de 0.25 a 20% en peso (correspondiendo a una cantidad de 2.5 a 200 g de IgG/L), por ejemplo de aproximadamente 1 a 20%, i.e. aproximadamente 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%.

Se sabe que una alta concentración de proteínas da como resultado una mayor estabilidad de la IgG. Por otro lado, una alta concentración de IgG significa que la velocidad máxima de infusión cuando se administra la IgG intravenosamente al paciente, tiene que ser muy baja con el fin de disminuir los problemas de transfusión debidos a la alta presión osmótica del producto. Una concentración actualmente recomendada para la administración intravenosa por la Farmacopea Europea (Ph.Eur.) es de 5% (p/v). Por otro lado, un producto muy concentrado (e.g. 10% o mayor) ventajosamente sirve para inyección intramuscular o subcutánea.

Aunque no es preferido, es evidente que los productos obtenidos por las diversas etapas del proceso de la presente invención también se pueden utilizar, por ejemplo, como productos liofilizados en vez de formulaciones líquidas, aunque esto es menos favorable en comparación con el uso de los productos de inmunoglobulina en forma de formulaciones líquidas listas para usar. Esta última modalidad se describirá con mayores detalles más adelante.

Los productos de inmunoglobulina líquidos son más estables a una fuerza fónica marcadamente inferior que la del plasma, i.e. la conductividad de preferencia es menor de 1.0 mS/cm, de preferencia de aproximadamente 0.8 mS/cm.

El pH tiene un impacto sobre la estabilidad de la IgG y sobre la velocidad de infusión. Los productos de inmunoglobulina líquidos son más estables en condiciones ácidas, i. e. por abajo del punto isoeléctrico de la IgG, pH 6.4-8.5. Mientras más cercano esté el valor de pH al valor de pH fisiológico (7.1-7.3), mayor velocidad de infusión se podrá emplear. Como consecuencia de la estabilidad requerida, el pH del producto de inmunoglobulina de la presente invención de preferencia estará dentro del rango de 5.1 a 5.7, por ejemplo entre 5.2 y 5.6, de preferencia aproximadamente 5.4.

Además, el producto de inmunoglobulina puede comprender agentes estabilizantes de proteínas como los previamente descritos. Además de alcoholes de azúcar y sacáridos (tales como sorbitol, manosa, glucosa, trealosa, maltosa), también se pueden utilizar proteínas (como albúmina), aminoácidos (como lisina, glicina) y agentes orgánicos (como PEG y Tween 80) se pueden usar como agentes estabilizantes. La concentración adecuada del agente estabilizante en la solución que contiene IgG, depende del agente específico empleado, como ya se describió previamente.

La solución de IgG purificada se ajusta, si es necesario, con el fin de obtener una solución estable e isotónica. El término "solución isotónica" tal como se utiliza en la presente, denota que la solución tiene la misma presión osmótica que el plasma. Como se mencionó anteriormente, la fuerza iónica es marcadamente más baja en el producto de inmunoglobulina de la presente invención en formulación líquida, que en el plasma. Por esta razón, se prefieren utilizar monosacáridos o disacáridos para incrementar la osmolaridad de la solución, puesto que estos no afectan la fuerza iónica. En una modalidad preferida de la presente invención, se agrega maltosa a una concentración que asegure que la solución sea isotónica y, al mismo tiempo, la maltosa funciona como agente estabilizante de inmunoglobulinas. Esto se realiza de preferencia agregando la maltosa hasta una concentración final dentro del rango de aproximadamente 5 a 15% (p/v), de preferencia 10% (p/v); alternativamente, se pueden utilizar otros sacáridos tales como manosa y glucosa.

Las condiciones finales preferidas para el producto de inmunoglobulina son un compromiso entre estabilidad y condiciones fisiológicamente aceptables con respecto, por ejemplo, al pH, fuerza iónica y tonicidad. Además, el producto de inmunoglobulina debe cumplir con los requerimientos de pruebas de control de calidad, tal como se especifican en la Monografía No. 918, Ph. Eur. 1997.

Las principales ventajas del producto obtenido por el método de la presente invención, son que, cuando se formula como preparación líquida, el producto es una combinación de un líquido, un producto listo para usarse el cual, al mismo tiempo, es muy estable, altamente purificado, tiene una distribución de subclases de IgG muy normal y tiene un contenido de IgA extremadamente bajo, así como un bajo contenido de IgM, y retiene la actividad de anticuerpos y la actividad biológica, lo cual se demuestra por la función Fc.

Además, esencialmente no contiene agregados de inmunoglobulinas y/u otras proteínas plasmáticas medidas como polímeros mayores que dímeros y tiene una actividad anticomplementaria baja y tiene un muy alto contenido de monómeros y dímeros de IgG. La IgG monomérica constituye cuando menos el 90%, lo cual se considera como ideal. Debido a la alta estabilidad, es posible evitar la adición de otros agentes estabilizantes, tales como albúmina, glicina, detergente o PEG. Finalmente, el producto es seguro contra virus, ya que el proceso comprende etapas bien definidas y validadas de reducción de virus con el propósito de remover y/o inactivar tanto virus con envoltura lipídica como virus con envoltura no lipídica.

El propósito de validar una etapa de producción como etapa de reducción de virus, es proporcionar evidencia de que el proceso de producción inactivará/removerá efectivamente los virus, los cuales se sabe que contaminan las materias primas o que podrían concebiblemente hacerlo. Los estudios de validación incluyen la adición deliberada de un virus antes de las etapas de producción a ser validadas y medir el grado de su remoción/inactivación después de la etapa o etapas de producción. Las restricciones de las Buenas Prácticas de Manufactura evitan la introducción deliberada de cualquier virus a las instalaciones de producción. Por lo tanto, la validación se debe realizar en un laboratorio por separado equipado para trabajo virológico en una versión a escala disminuida de la etapa de producción y deben ser realizadas por personal con experiencia virológica en conjunto con ingenieros de producción. La cantidad de virus agregada a la materia prima para la etapa de producción que va a ser validada, debe ser lo más alta posible con el fin de determinar la capacidad de la etapa de producción para inactivar/remover virus adecuadamente. Sin embargo, el virus deberá ser agregado de tal manera que la composición del material de producción no se altere significativamente. De preferencia, el volumen, del inóculo de virus será igual o menor al 10%.

Se deberán llevar a cabo ensayos de infectividad cuantitativa según los fundamentos de GLP y pueden involucrar la formación de placas, detección de otros efectos citopáticos tales como la formación de sincitios o focos y titulación de punto final (e.g., ensayos de TCID50), detección de la síntesis de antígenos virales u otros métodos. El método debe tener una sensibilidad y reproducibilidad adecuadas y se deberá realizar con suficientes replicaciones y controles para asegurar una exactitud estadística adecuada de los resultados.

Típicamente, una etapa de proceso se desafía con 6 logaritmos de virus y si se logra una reducción en el orden de 4 logaritmos o más, estos es indicativo de un claro efecto con el virus de prueba particular en investigación. De manera similar, una reducción en el orden de 4.5 logaritmos, 5 logaritmos o aún 5.5 logaritmos, es indicativa de un claro efecto con el virus de prueba particular que está en investigación y dicha etapa puede ser clasificada como una etapa de reducción de virus validada.

Los estudios de validación de virus se deben llevar a cabo con virus que se asemejen a aquellos que puedan contaminar el producto tanto como sea posible y, en segundo lugar, que representen un rango tan amplio de propiedades fisicoquímicas como sea posible, con el fin de probar la capacidad del sistema para eliminar virus en general.

Los estudios de validación de virus se deben llevar a cabo según la CPMP Nota para Lineamientos sobre Estudios de Validación de Virus: Diseño, Contribución e Interpretación de Estudios que Validan la Inactivación y Remoción de Virus (CPMP/BWP/268/95) y Nota para Lineamientos sobre Productos Medicinales Derivados de Plasma (CPMP/BWP/269/95).

Los estudios de validación del proceso de la presente invención se presentan en el Ejemplo 5.

El producto de la presente invención tiene una pureza mayor del 95%, preferiblemente mayor del 98%. El grado de pureza ínter aria, se debe al hecho de que el producto de la invención se obtiene mediante cuando menos una, de preferencia dos, opcionalmente conectadas en serie, etapas de cromatografía de intercambio aniónico y de intercambio catiónico. Vale la pena notar en este contexto que ha sido posible obtener un alto rendimiento a pesar del número de etapas de procesamiento empleadas, en escala de producción de cuando menos 3.5 g de proteína de IgG por kg de plasma congelado fresco.

Los estudios comparativos que se llevaron a cabo (Ejemplo 2) demostraron que el producto de inmunoglobulina obtenido por el proceso de la presente invención tiene propiedades funcionales ideales, tales como una prominente actividad de unión de antígeno y una alta función Fc. El medicamento actualmente preferido desarrollado por los presentes inventores es una solución de inmunoglobulina al 5% en peso. Las pruebas de estabilidad hasta la fecha han indicado una estabilidad a 4°C durante más de un año, Le., que el producto de inmunoglobulina está desprovisto de la formación de agregados o fragmentación de inmunoglobulinas G, pérdida de la actividad biológica deseada o incremento de actividades indeseables, e.g. actividad anticomplementaria y actividad prekalicreína, tal como se midió in vitro.

Con base en la presente invención, es posible obtener un producto de IgG que tiene una pureza mayor del 95%, por ejemplo 96% o cuando menos 97%, por ejemplo cuando menos 98%, de preferencia cuando menos 99%, más preferiblemente cuando menos 99.5% de pureza. El producto de IgG debe contener menos de 6 mg de IgA/L, por ejemplo menos de 4 mg de IgA/L, de preferencia menos de 3 mg de IgA/L, más preferiblemente menos de 2 mg de IgA/L.

Debe enfatizarse que otros productos contienen estabilizantes en forma de detergente, PEG o albúmina. En una modalidad preferida, el producto de la presente invención no contiene ninguno de dichos estabilizantes, en vez de eso se ha seleccionado un sacárido bien tolerado.

El producto según la presente invención tiene como característica un contenido muy bajo de polímeros y agregados. En una modalidad preferida, el producto de la presente invención contiene menos de 1.5% de polímeros y agregados, por ejemplo menos del 1%, e.g. menos de 0.5% o menos de 0.25% de polímeros y agregados. El contenido de monómeros y dímeros de IgG es cuando menos del 95%, por ejemplo cuando menos 96% o cuando menos 97%, e.g. cuando menos 98%, de preferencia cuando menos 98.5% ó 99%. El contenido de IgG monomérica es de cuando menos 90% en el producto.

Algunos estudios han demostrado el efecto clínico del producto según la presente invención en comparación con los productos IGIV registrados. El producto ha sido bien tolerado por los pacientes y el tiempo de recambio de las inmunoglobulinas en la circulación se ha determinado que es cuatro semanas. En los presentes estudios, el efecto inmunomodulador de IGIV, SSI ha demostrado ser convincente (los datos se presentan en el Ejemplo 3).

Las indicaciones para IGIV son hipo/agammaglobulinemia incluyendo inmunodeficiencia variable común, síndrome de Wiskott-Aldrich e inmunodeficiencia combinada grave (SCID), hipo/agammaglobulinemia secundaria en pacientes con leucemia linfática crónica (LLC) y mieloma múltiple, niños con SIDA e infecciones bacterianas, púrpura trombocitopénica idiopática crónica (PTI), trasplante de médula ósea alogénico (TMO), enfermedad de Kawasaki y síndrome de Guillan-Barré.

Neurología: polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), neuropatía motora multifocal, esclerosis múltiple, miastenia grave, síndrome de Eaton-Lambert, neuritis óptica, epilepsia.

Ginecología: Abortus habitualis, síndrome antifosfolípido primario.

Reumatología: artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, escleroderma sistémico, vasculitis, granulomatosis de Wegner, síndrome de Sjógren, artritis reumatoide juvenil.

Hematología: neutropenia autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, neutropenia.

Gastrointestinal: enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad celíaca.

Otros: asma, síndrome de choque séptico, síndrome de fatiga crónica, psoriasis, síndrome de choque tóxico, diabetes, sinusitis, cardiomiopatía dilatada, endocarditis, aterosclerosis, adultos con SIDA e infecciones bacterianas.

Aparte de las indicaciones mencionadas para el tratamiento con productos IGIV, varias enfermedades autoinmunitarias graves que comúnmente responden a la terapia con corticosteroides e inmunosupresores, están consideradas como trastornos blancos para la terapia con el producto de la presente invención. Entre éstas hay varias enfermedades neurológicas tales como polirradiculitis y algunas polineuropatías periféricas mediadas por el sistema inmune, pero también algunos trastornos reumáticos inflamatorios crónicos y trastornos vasculares tales como vasculitis sistémica que involucra vasos pequeños, polimiositis y otras.

Un modo diferente de acción del producto de la presente invención puede ser la eliminación de antígenos infecciosos en infecciones crónicas y un incremento del metabolismo de IgG.

La presente invención se ilustrará adicionalmente con los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1 Etapas de proceso en la purificación de inmunoglobulina (con excepción de la etapa 5, todas las etapas se llevan a cabo a 5 ± 3°C)

Etapa 1

Preparación de la fracción II + III de Cohn en pasta

La fracción II + III de Cohn en pasta se prepara a partir de plasma humano por el método de fraccionamiento de Cohn estándar (Cohn E., et al., (1946) J Am Chem Soc, 459-475) esencialmente tal como fue modificado por Kistler-Nitschmann (Kistler P y Nitschmann HS, (1952), Vox Sang, 7, 414-424). La precipitación con etanol se inicia después de que el crioprecipitado ha sido removido y, si se desea, después de la adsorción de ciertas proteínas plasmáticas (tales como el factor IX y la antitrombina) en por ejemplo un material de intercambio iónico y/o una matriz de Heparina Sepharose®.

Las condiciones exactas (pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de proteína) para obtener la fracción II-III en pasta aparecen en la figura de la página 266 de Harns JR (ed), Blood Separation and Plasma Fractionation, Wiley-Liss, Nueva York, 1991. La pasta se aísla en un filtro agregando un auxiliar de filtración antes de la filtración.

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Etapa 2

Extracción de inmunoglobulinas de la fracción II + III de Cohn en pasta

A partir de 140 kg de la fracción II + III en pasta incluyendo 30 kg de auxiliar de filtración (Schenk, Alemania) (correspondiendo a un volumen inicial de plasma de aproximadamente 1150 kg), la extracción se logra primero agregando 525 kg de solución reguladora de fosfato de sodio/acetato 2.33 mM, pH 4.0, con agitación lenta durante aproximadamente 1.5 horas, seguido por dos adiciones consecutivas de 350 kg de agua inyectable (Al) con agitación durante 1.5 horas después de cada adición. Finalmente, se agregan aproximadamente 280 kg de fosfato de sodio/acetato 21.5 mM, pH 7.0, ajustando de esta manera el pH de la suspensión a 5.4.

La suspensión se filtra a través de un filtro de profundidad (C-150AF, Schenk, Alemania). El filtrado contiene, entre otras proteínas, las inmunoglobulinas.

Etapa 3

Precipitación de agregados proteicos y remoción de virus por PEG 6000

Se agrega PEG 6000 (Merck, Alemania) al filtrado de la etapa 2 a una concentración final de 6% en peso. Después de una precipitación durante 4 horas, la suspensión de PEG se centrifuga hasta la claridad en una centrífuga de flujo completo (Westfalia BKA28, Alemania) y se filtra a profundidad (50LA y 90LA, Cuno, Francia) y subsecuentemente se esteriliza por filtración a través de un filtro de 0.22 µm (Durapore, Millipore, EUA). El sobrenadante de PEG filtrado se ajusta con una solución reguladora agregando una parte de solución reguladora de acetato de sodio 0.45 M, pH 5.7, a 29 partes del sobrenadante, para alcanzar un pH de 5.7.

Etapa 4

Purificación por cromatografía de intercambio aniónico y catiónico en serie (I)

Se empacan dos columnas de cromatografía con 56 L de DEAE Sepharose FF® (Pharmacia Biotech, Suecia) y 56 L de CM Sepharose FF® (Pharmacia Biotech, Suecia), respectivamente. Las columnas se conectan en serie para que el flujo de líquido primero pase a través de la resina de DAE Sepharose, subsecuentemente a través de la resina CM Sepharose. Las resinas de las columnas se equilibran con solución reguladora de acetato de sodio 15 mM, pH 5.7. Después, se aplica la solución de la etapa 3 a las dos columnas en serie.

Durante la cromatografía de intercambio iónico, la mayoría de las proteínas contaminantes en la solución aplicada se unen a la resina DEAE Sepharose. Mientras que la IgG pasa a través sin unirse a la resina DEAE Sepharose, la IgG se une a la resina CM Sepharose cuando la solución migra a través de ella. Después de la aplicación de la solución y el lavado con un volumen de columna de solución reguladora de equilibración, la columna de DEAE se desconecta de la columna CM. Después, la columna CM se lava con tres volúmenes de columna de solución reguladora de acetato de sodio 15 mM, pH 5.4 y después la IgG es eluida con un gradiente de NaCl de 125 a 350 mM de NaCl, acetato de sodio 15 mM, pH 5.4. La fracción de IgG eluida se colecta en sorbitol a una concentración final de 2.5% en peso.

Etapa 5

Tratamiento con disolvente/detergente (S/D) de la fracción IgG

La fracción IgG eluida se concentra y se desaliniza por ultra/diafiltración hasta una concentración de aproximadamente 50 g de IgG/litro. La membrana empleada es una membrana de polisulfona, de corte de peso nominal de 30 kDa (Millipore). La diafiltración se realiza contra una solución reguladora de acetato de sodio 15 mM, pH 5.4, conteniendo 2.5% en peso de sorbitol y se continúa hasta que la conductividad sea menor de 1.4 mS/cm. Se determina el contenido de IgG de la solución espectrofotométricamente, midiendo a 280 nm (A_{280}). La concentración del sorbitol se ajusta a 10% en peso y la solución se filtra a través de un filtro de 0.45 \mum (Pall Corporation, GB). Después se agregan Tween 80 y TNBP a una concentración final de 1 y 0.3% en peso, respectivamente, para el subsecuente tratamiento S/D. El tratamiento S/D procede durante cuando menos 6 horas a 25°C.

Etapa 6

Remoción del S/D por cromatografía de intercambio iónico (II)

Se equilibran dos columnas conectadas en serie empacadas con 28 L de DEAE y 56 L de CM Sepharose FF®, respectivamente, con acetato de sodio 15 mM, pH 5.4. La fracción de IgG tratada con S/D de la etapa 5 se diluye con 5 partes de solución reguladora de acetato 15 mM, pH 5.4, se filtra a través de un filtro de profundidad (Cuno 90 LA) y posteriormente se esteriliza por filtración (Sartobran, Sartorius) y se aplica a las dos columnas cgnectadas en serie. La cromatografía de intercambio iónico y la subsecuente elución de la IgG de la columna CM se llevan a cabo esencialmente de la manera descrita en la etapa 4, excepto que la columna CM se lava extensamente con 6 volúmenes de columna de solución reguladora para remover los agentes del tratamiento S/D. La fracción IgG eluida se colecta en maltosa (Merck, Alemania) a una concentración final de 2.5% en peso.

Etapa 7

Concentración final y formulación de la inmunoglobulina para administración intravenosa

La fracción de IgG eluida de la etapa 6 se somete a una ultrafiltración y se desaliniza por diafiltración contra acetato de sodio 7.5 mM, conteniendo 2.5% en peso de maltosa, pH 5.4 hasta una conductividad final menor de 1 mS/cm. La membrana empleada es una membrana de polisulfona con un corte de peso nominal de 100 kDa, lo cual permite que las proteínas de menor peso molecular sean eliminadas. La concentración final de IgG se ajusta a 50 g/litro y la maltosa se ajusta a una concentración final de 10% (p/v). La preparación final ajustada con maltosa se filtra a través de un filtro estéril (Sartopure GF 2, Sartorius) y se llena en frascos asépticamente.

Ejemplo 2 Resultados de un estudio analítico de un producto obtenido por el proceso de la presente, en comparación con otros productos IGIV

1

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 1: \+   \begin{minipage}[t]{143mm}Sin corrección para HSA; 2:
declarado por el productor; 3:   corregido para el pico HSA; 4:
utilizado como
estabilizante.\end{minipage} \cr}

Pureza (composición de proteínas)

Los requerimientos de pureza de Farmacopea para una preparación IGIV son de cuando menos 95% de IgG; es decir, no más de 5% de proteínas contaminantes que no son IgG presentes. La pureza se considera de muy alta importancia por varias razones. Desde un punto de vista racional, sólo la proteína que es portadora de la función deseada debe estar presente y otras proteínas contaminantes pueden ser potencialmente peligrosas, e.g., causar efectos adversos indeseables y/o influenciar la estabilidad del producto.

La pureza se puede analizar, por ejemplo, por una técnica electroforética de la manera descrita detalladamente en la Farmacopea Europea Ph. Eur., 1997, páginas 964-965, en donde las proteínas se separan en un gel de acetato de celulosa. Sin embargo, por propósitos prácticos se utiliza un gel de agarosa. Después de la electroforesis, el gel se fija, se seca y se tiñe. Finalmente, las bandas de proteína son monitoreadas por barrido. A partir de la tabla anterior se observa que el producto de la presente invención es virtualmente puro (99.8%).

Albúmina

El contenido de albúmina se analizó por inmunoelectroforesis cruzada, esencialmente de la manera descrita por C.B. Laurell (anal Biochem (1965), 1,0, 358-361). Se analizaron 5 \muL del producto contra anticuerpos contra albúmina humana (DAKO A/S, Dinamarca, No. A0001 (1/100)). Debido a la alta pureza, no fue detectable albúmina en el producto analizado de la presente invención.

Contenido de monómeros y dímeros de IgG

El contenido de monómeros y dímeros de IgG se puede analizar por cromatografía de permeación en gel y se monitorea a partir del cromatograma al integrar las áreas de los picos de monómero y de dímero, cf. Ph. Eur. Los resultados de los diversos análisis se listan en la tabla anterior, a partir de la cual se observa que la suma de las áreas de monómero + dímero constituye el 99.3% del área total del cromatograma (partiendo de esto, la IgG monomérica constituye el 92%) para el producto de la presente invención.

Contenido de polímeros y agregados

La presencia de polímeros y agregados se sabe que causa graves efectos adversos, a menudo síntomas similares a la influenza. Debido al muy alto grado de pureza alcanzado por el suave proceso de producción, el producto de inmunoglobulina obtenido por el proceso de la presente invención está sustancialmente libre de polímeros y agregados.

Los polímeros se pueden analizar por cromatografía de permeación en gel y los picos de proteína con tiempos de retención más cortos que el tiempo de retención para la IgG dimérica, se consideran como poliméricos, de la manera descrita en la Ph. Eur.

Según la Ph. Eur. y otras normas, el contenido de agregados de proteína de preferencia debe ser menor del 3%. El producto del proceso de la presente invención no contiene cantidades medibles de agregados y, por lo tanto, se considera que tiene menos del 0.1% de polímeros y agregados.

Actividad anticomplementaria (AAC) y actividad activadora de prekalicreína (APK)

Las AAC y APK se midieron de la manera, descrita en la Ph. Eur.

La AAC de preferencia debe ser tan baja como sea posible. Según la Ph. Eur, el consumo de complemento debe ser menor o igual al 50%. El consumo de complemento de la muestra medida del producto de la presente invención, es de aproximadamente 30%, i.e. es comparable al de los otros productos analizados. Debe observarse que la presencia de albúmina tiende a suprimir el consumo de complemento (observación de los inventor).

La APK, si está presente en cantidades sustanciales, es esencial para el efecto adverso hipotensor del producto. Por lo tanto, la APK de preferencia debe ser tan baja como sea posible en un producto de inmunoglobulina. Según la Ph. Eur., debe ser <35 UI/ml cuando se mide de la manera señalada en dicha referencia. La APK del producto de la presente invención, así como la de los demás productos analizados, es menor que el nivel de cuantificación del método, i.e., por abajo de 8.5 EI/ml.

Hemaglutininas

La fracción IgM de las inmunoglobulinas plasmáticas comprende las hemaglutininas; es decir, anticuerpos contra los antígenos de tipo sanguíneo A y B. La presencia de tales anticuerpos puede causar efectos adversos indeseables debido a la posibilidad de reacción hemolítica si el receptor es portador de tipos sanguíneos A y/o B.

Según los requerimientos de Farmacopea, el contenido de hemaglutininas debe ser más bajo que lo que cause aglutinación de eritrocitos A/B en una dilución 1:64 del producto de inmunoglobulina. Todos los productos analizados cumplieron con este requerimiento.

Función Fc

La retención de las actividades de unión al antígeno es esencial para las funciones biológicas de las IGIV. Esto también es aplicable a la actividad inmunomoduladora. Por otro lado, la retención de la función Fc es esencial para el efecto de las IGIV sobre varias células fagocíticas y la activación del sistema complemento. La función Fc se puede demostrar utilizando varias técnicas, pero una metodología aceptada y descrita en la Ph. Eur., mide el potencial activador del complemento de los anticuerpos en las preparación contra antígeno de rubéola. La actividad se compara a la de una preparación biológica de referencia (BRP, Ph. Eur.) de inmunoglobulinas, establecida como 100%. El producto cumple con la prueba y la actividad relativa es mayor del 60% con respecto a la preparación de referencia. Parece que la función Fc del producto de la presente invención se conserva muy bien, particularmente en comparación con los demás productos líquidos analizados, muy probablemente debido al suave proceso de purificación.

Distribución de subclase

La distribución de subclases de IgG se mide por un método de inmunodifusión de Mancini estándar, esencialmente de la manera descrita por A. Ingild (Scand J Immunol, (1983), 17, 41). Las concentraciones se determinan utilizando un suero de referencia de la OMS (67/97). Se requiere que la distribución de subclases debe estar en el rango del plasma humano normal con concentraciones medianas en el rango de 3.7 a 10.2 g de IgGl/L de suero, de 1.1 a 5.9 g de IgG2/L de suero, de 0.15 a 1.3 g de IgG3/L de suero y de 0.06 a 1.9 g de IgG4/L de suero (R Djurup et al. Scand J. Clin Lab Invest 48, 77-83). Así pues, la distribución de subclases de todos los productos es aceptable.

Contenido de IgA

Se sabe que la presencia de IgA causa potencialmente sensibilización de los receptores deficientes de IgA. Si un paciente deficiente de IgA recibe una preparación de inmunoglobulina que contiene IgA, la IgA se puede considerar como un antígeno extraño y el resultado puede ser la inducción de anticuerpos contra la IgA en el receptor. La siguiente vez que se infunda una preparación conteniendo IgA al paciente, se puede provocar una reacción anafilática. Por lo tanto, es esencial que la preparación de inmunoglobulina contenga tan poca IgA como sea posible. La IgA en un producto IGIV puede ser monitoreada utilizando una técnica de ELISA, e.g. en donde se utiliza un anticuerpo policlonal anti-IgA para capturar la IgA y se emplea una anti-IgA marcada para la detección de la unión de IgA. Se construyen estándares mediante diluciones de un calibrador (No. X908, DAKO A/S, Dinamarca) con un contenido declarado de IgA.

El producto del proceso descrito en el Ejemplo 1 contiene menos de 2 mg de IgA/L, lo cual es un contenido de IgA considerablemente más bajo que el de los demás productos líquidos analizados. Las similitudes fisicoquímicas entre la IgG y la IgA dificultan la separación de estas inmunoglobulinas durante un proceso de purificación. Sin embargo, las dos cromatografías de intercambio aniónico/catiónico en el proceso reducen el contenido de IgA hasta un nivel muy bajo.

Contenido de IgM

En una preparación de Ig, la IgM se puede monitorear utilizando una técnica de ELISA, e.g. en donde se utiliza un anticuerpo policlonal anti-IgM para capturar la IgM y se emplea un suero anti-IgM marcado para la detección. Se construyen estándares mediante diluciones de un calibrador (No. X908, DAKO A/S, Dinamarca) con un contenido declarado de IgM. En la tabla puede observarse que el contenido de IgM del producto de la presente invención es muy bajo y es marcadamente más bajo que el de los otros productos líquidos.

Tween 80, TNBP y PEG

El Tween 80, TNBP y PEG se miden por los procedimientos estándar. En general, el contenido de estos aditivos debe ser tan bajo como sea posible.

pH

El pH de los productos líquidos analizados es ácido, pH 5.6-5.7, mientras que el de los productos liofilizados analizados es neutro después de la dilución, con un pH de 6.7.

Concentración total de proteínas

Según la Ph. Eur., la concentración de proteínas debe ser de cuando menos 50 g/L ± 10%; todos los productos cumplen con este requerimiento. La concentración de proteínas se mide por el método de Kjeldahl.

Estabilizantes de maltosa y glucosa

Los sacáridos se utilizan comúnmente como estabilizantes de productos de inmunoglobulina, tienen buenas propiedades estabilizantes y son fácilmente excretados. El contenido de maltosa, sacarosa y glucosa se determina utilizando un paquete comercial (Boehringer Mannheim, Alemania) con maltosa como referencia.

Parece ser que los dos productos liofilizados estabilizados con albúmina y albúmina así como PEG, respectivamente, también contienen un estabilizante sacárido en concentraciones de aproximadamente 15 mg/ml a 20 mg/ml. El producto de la presente invención y el otro producto líquido están estabilizados de manera muy similar, e.g., con aproximadamente 9%, 88 mg/ml y 92 mg/ml de maltosa. Con respecto al contenido de polímeros y agregados como parámetro de estabilidad, el producto de la presente invención tiene una mayor estabilidad que el otro producto líquido analizado, aunque sus formulaciones parecen ser muy similares.

Ejemplo 3 Resultados de estudios clínicos

Los estudios clínicos del producto de la presente invención, también referido como IGIV, SSI, se llevaron a cabo según las normas ICH y CPMP/388/95.

Se examinaron la farmacocinética, el efecto y la seguridad. Los estudios clínicos hasta la fecha,han incluido cuatro grupos de pacientes: pacientes con síndrome de inmunodeficiencia primaria (15 pacientes), síndrome de inmunodeficiencia secundaria (6 pacientes), púrpura trombocitopénica idiopática (15 pacientes) y pacientes con polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (5 pacientes).

Los pacientes con síndrome de inmunodeficiencia primaria o secundaria fueron tratados con 0.2 a 0.4 g/kg, con intervalos de 2 a 5 semanas. Los pacientes con púrpura trombocitopénica idiopática se trataron con 400 mg(kg al día durante cinco días o con 1000 mg/kg al día durante dos días.

Como medida de seguridad, se determinaron las transaminasas séricas, creatinina sérica y marcadores virales en todos los pacientes. Cinco pacientes con púrpura trombocitopénica idiopática fueron sometidos a un seguimiento de marcadores virales, renales y de seguridad hepática durante hasta un total de 24 semanas.

Farmacocinética

Se midió la T112 a 30.5 días (mediana). Esto está según los resultados de los otros medicamentos IGIV.

Efecto

Para pacientes con síndrome de inmunodeficiencia primaria y secundaria, los días perdidos por enfermedad, hospitalizaciones, días bajo terapia de antibióticos, días con fiebre y el número de neumonías, se registraron respectivamente durante un periodo de 6 meses, durante el cual los pacientes habían sido tratados con otros medicamentos IGIV registrados. En los siguientes 6 meses durante los cuales los pacientes fueron tratados con la inmunoglobulina SSI, líquida, se registraron los mismos parámetros.

La conclusión es que la inmunoglobulina SSI, líquida, es tan efectiva como las otras composiciones IGIV para la profilaxis/prevención de infecciones en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia primaria y secundaria.

En el 80% de los pacientes con púrpura trombocitopénica idiopática, el número de plaquetas se elevó de <30 x 10^{9}/L antes del tratamiento con inmunoglobulina SSI líquida, a \geq50 x 10^{9}/L después del tratamiento. El incremento en la cuenta de plaquetas y la duración de la remisión en los pacientes individuales fueron del mismo nivel que después de la administración de la misma dosis de otros medicamentos IGIV, en los casos en donde la comparación fue posible. Un paciente que recibió IGIV por primera vez fue refractario a la prueba del fármaco. Tal reacción al IGIV no es infrecuente y, por lo tanto, no es sorpresiva. Los detalles de la elevación de las plaquetas y la duración de dicha elevación se están estudiando.

La conclusión es que la inmunoglobulina SSI líquida es tan efectiva como los demás medicamentos IGIV en el tratamiento de la baja cuenta de plaquetas en pacientes con púrpura trombocitopénica idiopática.

Según los clínicos y pacientes que sufren de polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, la IGIV SSI ha mostrado una eficacia idéntica a la IGIV administrada antes del estudio. La IGIV SSI fue tolerada por los pacientes al igual que los otros productos IGIV fueron tolerados.

Seguridad

Aparte de un evento adverso grave, la esplenectomía realizada por el investigador determinó que no tenía relación con el fármaco, sólo se han registrado eventos adversos menores. Estos efectos adversos principalmente fueron cefalalgia con fiebre y vómito. Hasta la fecha no ha habido informes de signos vitales anormales durante las infusiones de IGIV SSI. No se han registrado seroconversiones virales. No ha habido reportes de daños hepáticos o renales ni casos de choques anafilácticos.

Los estudios clínicos demuestran que la inmunoglobulina SSI líquida es bien tolerada. La frecuencia de efectos secundarios, grado y naturaleza de los mismos no se desvía de la experiencia que se tiene con otros medicamentos IGIV.

Ejemplo 4 Resultados de estudios de estabilidad para IGIV líquida

Con el fin de probar si el producto de IGIV líquido es estable con el tiempo, se realizó un estudio de estabilidad en Condiciones Reales y Tiempo Real. Se incluyó un total de 4 lotes consecutivos (250 ml cada muestra) del producto IGIV en el estudio y se almacenaron a una temperatura entre 2 y 8°C durante cuando menos 12 meses. Las muestras de los cuatro lotes fueron analizadas en el tiempo cero, a los 6 meses y a los 12 meses de almacenamiento. Los resultados del estudio se presentan a continuación en forma del promedio de los 4 lotes.

3

4

Todas las pruebas anteriormente mencionadas se llevaron a cabo según la Ph. Eur. y de la manera descrita en el Ejemplo 2.

La observación de que el contenido de monómeros y dímeros es constante en un periodo de 12 meses, indica que no se forman polímeros en la muestra. La presencia de polímeros de inmunoglobulina se sabe, entre otras cosas, que causa graves efectos adversos, a menudo síntomas similares a la influenza. Debido a la muy alta estabilidad del producto de inmunoglobulina obtenido por el proceso de la presente invención, el producto está sustancialmente libre de polímeros y agregados, incluso después de un largo periodo de almacenamiento.

No se observó ningún incremento en la AAC con el tiempo, aunque se han incluido en este estudio de estabilidad lotes que expresan deliberadamente una alta AAC. Si se observa un incremento de AAC, podría indicar que se podrían estar formando agregados durante el almacenamiento. Así pues, la AAC constante con el tiempo indica que no se están formando agregados.

Los resultados además indican que no se desarrolló actividad activadora de prekalicreína durante el almacenamiento del producto, ya que la actividad APK no se incrementó. Sin embargo, debe observarse que los valores medidos están por abajo del nivel de cuantificación mínimo.

La medición de la función Fc indica la presencia de IgG funcional intacta que se ha mantenido, durante el almacenamiento. Así pues, no hay proteasas presentes en las muestras, ya que éstas habrían degradado las proteínas y por lo tanto disminuido la función Fc. No ha habido tampoco desnaturalización de moléculas IgG, ya que esto habría disminuido la actividad de unión al antígeno.

Como es conocido por los técnicos en la materia, podría haber diferencias en la estabilidad de las diversas clases de IgG. Como puede observarse en los presentes resultados, todas las subclases se mantuvieron durante el almacenamiento, indicando que el producto es estable. Esto es respaldado adicionalmente por el hallazgo de que la composición de proteínas de IgG en las muestras con aproximadamente la misma concentración de proteínas totales, casi no fue alterada con el tiempo, indicando que no existe una degradación general de la IgG, es decir, el producto de la presente invención es estable y se puede almacenar durante cuando menos 12 meses a 2-8°C sin tener cambios significativos de sus características y, mediante esto, se demuestra su eficacia y su seguridad.

Ejemplo 5 Etapas de reducción de virus validadas en el proceso de la presente de IGIV Remoción de virus mediante una etapa de partición

Precipitación de los virus presentes en la solución de inmunoglobulina por polietilenglicol.

Se han realizado estudios de validación de virus empleando dos pequeños virus no envueltos, obteniéndose las siguientes reducciones de virus:

remoción de 6.3 log_{10} del virus de la hepatitis A (VHA)

remoción de 7.2 log_{10} del virus de la polio.

Se realizaron estudios de validación de virus empleando dos virus envueltos, obteniéndose las siguientes reducciones de virus:

remoción de 7.6 logr_{10} de VIH

remoción de 7.5 log_{10} de BVDV

Inactivacion de virus por una etapa de tratamiento con S/D

Tratamiento de la solución de inmunoglobulina con 1% de Tween 80 + 0.3% de TNBP, a 25°C durante \geq6 horas. Se realizaron estudios de validación de virus. empleando 4 virus envueltos, obteniéndose los siguientes resultados de reducciones de virus:

inactivación de 7.4 log_{10} de VIH

inactivación de 5.3 log_{10} de virus Sindbis

inactivación de 4.1 log_{10} de BVDV

inactivación de 5.1 log_{10} de PRV

Se llevó a cabo un total de 8 estudios de validación sobre dos diferentes etapas en el proceso de la presente invención. La etapa de precipitación con PEG se validó como etapa de remoción de virus empleando 4 diferentes virus, dos pequeños virus no envueltos VAH y virus de la polio, y dos virus envueltos VIH y BVDV como modelo para el virus de la hepatitis C. Estos estudios demostraron que los cuatro virus fueron removidos eficientemente por la precipitación con PEG. La etapa de precipitación con PEG, por lo tanto, se validó como una etapa de remoción de virus eficiente. El tratamiento con S/D se validó empleando cuatro diferentes virus envueltos. A partir de los datos de los estudios de validación, se observa que la etapa de tratamiento con S/D inactivó eficientemente los cuatro virus. Por lo tanto, el tratamiento con S/D se validó como una etapa eficiente de inactivación de virus. Ambas etapas de reducción en el proceso IGIV, la remoción por precipitación con PEG y la inactivación por tratamiento con S/D, fueron validadas, declarándose que son eficientes para remover e inactivar cuatro diferentes virus cada una. Los factores de reducción acumulativos de VIH y BVDV en el proceso son 15 y 11.6, respectivamente. Por todo esto, el producto del proceso de la presente invención se puede considerar como seguro contra virus.

Claims

1. Un proceso para purificar inmunoglobulina G (IgG) a partir de una fracción proteica plasmática que contiene inmunoglobulina cruda, en el que el proceso comprende las etapas de:

(b) agregar un agente precipitante de proteínas hidrosoluble, sustancialmente no desnaturalizante, a la suspensión de la etapa (a) en una cantidad suficiente para causar la precipitación de una alta proporción de las proteínas G que no son inmunoglobulinas, inmunoglobulinas agregadas y partículas que incluyen potencialmente partículas infecciosas tales como partículas virales, sin causar la sustancial precipitación de la inmunoglobulina G monomérica, formando de esta manera una mezcla de un sólido precipitado y un sobrenadante líquido;

(c) recuperar un sobrenadante clarificado que contiene inmunoglobulina G de la mezcla de la etapa (b);

(d) aplicar el sobrenadante clarificado que contiene inmunoglobulina G de la etapa (c) a una resina de intercambio aniónico y subsecuentemente a una resina de intercambio catiónico, en la que la resina de intercambio aniónico y la resina de intercambio catiónico se conectan en serie y en la que el tampón usado para la cromatografía de intercambio aniónico y la cromatografía de intercambio catiónico es el mismo tampón; el pH de dicho tampón está por debajo de 6,0;

(e) lavar los contaminantes proteicos y la proteína precipitada de la resina de intercambio catiónico de la etapa (d) con una solución reguladora que tenga un pH y fuerza fónica suficientes para remover los contaminantes de la resina, sin causar la sustancial elución de la inmunoglobulina G;

(h) agregar una cantidad virucida de un agente inactivador de virus a la fracción día/ultrafiltrada que contiene inmunoglobulina G y opcionalmente estabilizada de la etapa (g), obteniéndose una solución sustancialmente segura contra virus que contiene inmunoglobulina G;

(j) lavar la resina de intercambio catiónico de la etapa (i) con una solución reguladora que tenga un pH y fuerza iónica suficientes para lavar los contaminantes proteicos y el agente inactivador de virus de la resina, sin causar una sustancial elución de la inmunoglobulina G;

(l) someter el eluato que contiene inmunoglobulina G de la etapa (k) a una día/ultrafiltración para disminuir la fuerza iónica y concentrar la inmunoglobulina G de la solución, y ajustar la osmolaridad mediante la adición de un sacárido.

2. El proceso según la reivindicación 1, en el que la fracción proteica plasmática que contiene inmunoglobulina G se selecciona del grupo que consiste de fracción II de Cohn; fracciones II y III de Cohn;y fracciones I, II y III de Cohn.

3. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la suspensión de la etapa (a) se mantiene a una temperatura de 0 a 12°C y la suspensión de la etapa (a) se mantiene a un pH por abajo de 6.

4. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el precipitante de proteínas de la etapa (b9 se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol (PEG), ácido caprílico y sulfato de amonio.

5. El proceso según la reivindicación 4, en el que el precipitante de proteínas se selecciona del grupo que consiste de PEG dentro de un rango de peso molecular de 3000 a 8000 Da, tal como PEG 3350, PEG 4000, PEG 5000 y PEG 6000.

6. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la resina de intercambio aniónico y la resina de intercambio catiónico de la etapa (i) están conectadas en serie.

7. Un proceso según la reivindicación 6, en el que la solución reguladora utilizada para la cromatografía de intercambio aniónico y la cromatografía de intercambio catiónico es la misma solución reguladora y el pH de dicha solución reguladora está por abajo de 6.0.

8. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la resina de intercambio aniónico de la etapa (d) y/o de la etapa (i) contiene grupos dietilaminoetilo y/o la resina de intercambio catiónico de la etapa (d) y/o de la etapa (i) contiene grupos carboximetilo, siendo preferiblemente las resinas DEAE Sepharose FF® y CM Sepharose FF®.

9. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la solución reguladora utilizada en las etapas de los incisos (b) a (l) es una solución reguladora de acetato, tal como una solución reguladora de acetato con un pH de 5.0 a 6.0 y que tiene una molaridad de 5 a 25 mM.

10. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente inactivador de virus de la etapa (h) es una mezcla de cuando menos un detergente fónico o no iónico y cuando menos un disolvente.

11. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente inactivador de virus de la etapa (h) es una mezcla de cuando menos un detergente sustancialmente no desnaturalizante y cuando menos un disolvente de tri(alquilo inferior)fosfato.

12. Un producto de inmunoglobulina en el que se puede obtener por el proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un producto de inmunoglobulina según la reivindicación 12, en el que tiene las siguientes características:

a) una pureza mayor del 98%,

b) un contenido de monómeros y dímeros de IgG mayor del 98.5%,

c) un contenido de IgA menor de 4 mg de IgA/L, y

d) un contenido de IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4.

14. Un producto de inmunoglobulina según la reivindicación 13, en el que no comprende detergente, PEG ni albúmina como estabilizante.

15. Un producto de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, que contiene menos de 3 mg/L de IgA.

16. Un producto de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, que contiene entre 55 y 65% de IgG1, entre 30 y 40% de IgG2, entre 2 y 5% de IgG3 y entre 1 y 4% de IgG4.

17. Un producto de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, que contiene menos de 0.5% de polímeros y agregados.

18. Un producto de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, que es líquido.

19. Un producto de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, para uso en medicina.

20. Un producto de inmunoglobulina según la reivindicación 19, para administración intravenosa instantánea.

21. El uso de un producto de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero con PID (inmunodeficiencia primaria), SID (inmunodeficiencia secundaria), PTI (Púrpura Trombocitopénica Idiopática), polirradiculitis, neuropatías periféricas, enfermedad de Kawasaki, polimiositis, enfermedades autoinmunitarias crónicas graves, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), neuropatía motora multifocal, esclerosis múltiple, miastenia grave, síndrome de Eaton-Lambert, neuritis óptica, epilepsia, Abortus habitualis, síndrome antifosfolípidos primario, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, escleroderma sistémico, vasculitis, granulomatosis de Wegner, síndrome de Sjógren, artritis reumatoide juvenil, neutropenia autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, neutropenia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad celíaca, asma, síndrome de choque séptico, síndrome de fatiga crónica, psoriasis, síndrome de choque tóxico, diabetes, sinusitis, cardiomiopatía dilatada, endocarditis, aterosclerosis y adultos con SIDA e infecciones bacterianas.

22. El uso según la reivindicación 21, en el que el mamífero es un ser humano.