CZ297199B6

CZ297199B6 - Zpusob výroby imunoglobulinu pro intravenózní podání a dalsích imunoglobulinových produktu

Info

Publication number: CZ297199B6
Application number: CZ20004534A
Authority: CZ
Inventors: Laursen@Inga; Teisner@Borge
Original assignee: Statens Serum Institut
Priority date: 1998-06-09
Filing date: 1999-06-09
Publication date: 2006-09-13
Also published as: HUP0101988A3; EP2270044A1; SK18662000A3; CN1311797A; HK1151044A1; EP1493751A1; IL140155A; JP5478519B2; TR200100303T2; PT1084147E; KR20010052733A; PL344671A1; RU2001101454A; IL140155A0; HU228076B1; AU4257299A; RU2197500C2; BR9911131A; AU753468B2; WO1999064462A1

Abstract

Popisuje se zpusob purifikace imunoglobulinu G z hrubé frakce plazmatických proteinu obsahujících imunoglobulin. Tento zpusob zahrnuje radu kroku, z kterých jsou prednostne provádeny anexová a katexová chromatografie zapojené do série. Behem zpusobupurifikace se výhodne pouzívá acetátový pufr mající pH 5,0 az 6,0 a molaritu 5 az 25 mM. Popisuje se dále imunoglobulinový produkt, který je mozno získat tímto postupem, a který má cistotu vyssí nez 98 %, obsah IgG monomeru a dimeru vyssí nez 98,5 %, obsah IgA mensí nez 4 mg IgA/1 a který obsahuje méne nez 0,5 % polymeru a agregátu. Tento produkt nezahrnuje detergent, PEG nebo albumin jako stabilizátor. Produkt je stabilní, prostý viru, tekutý aje urcen k okamzitému intravenóznímu podání.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu purifíkace imunoglobulinů, tj. imunoglobulinu G (IgG) z nativní plazmy nebo z hrubé frakce plazmatických proteinů. Vynález se také týká imunoglobulinového produktu a použití takového imunoglobulinového produktu pro lékařské účely.

Dosavadní stav techniky

Lidský normální imunoglobulin pro použití v prevenci a v léčbě infekčních onemocnění byl zaveden ke konci čtyřicátých let dvacátého století. Bylo prokázáno, že lidský normální imunoglobulin připravený způsobem studené etanolové frakcionace podle Cohna a Oncleyho (Cohn E., et al., (1946), J. Am. Chem. Soc., 71, 541-550) a následně také modifikací podle Kistlera a Nitschmana (Kistler P a Nitschmann HS (1952), Vox Sang, 7, 414-424) je jak účinný, tak také bezpečný proti přenosu virové infekce, pokud je podán subkutánně nebo intramuskulárně.

Kongenitální nebo získané celkové či částečné chybění imunoglobulinů (primární a respektive sekundární syndrom imunodefícience) se manifestují četnými běžnými i závažnými infekcemi, obzvláště bakteriálního původu. Prevence takových infekcí bylo dříve dosahováno opakovanými intramuskulárními nebo subkutánními injekcemi velkého množství lidského normálního imunoglobulinu, a to až několikrát týdně jako celoživotní léčba, která je velmi bolestivá, pokud je lék podáván intramuskulárně. Na začátku šedesátých let byly proto učiněny pokusy o intravenózní podání lidského normálního imunoglobulinu. Klinické studie prokázaly, že zhruba u 5 % zdravých dobrovolníků a zhruba u 95 % pacientů s deficiencí imunoglobulinů dojde k rozvoji okamžitých nežádoucích účinků od dyspnoe až k cirkulačnímu šoku a tyto nežádoucí účinky měly tak závažný charakter, že intravenózní podávání imunoglobulinu muselo být opuštěno.

Důvodem výše zmíněných nežádoucích účinků se ukázaly být agregáty imunoglobulinů, které mezi jinými účinky silně aktivovaly komplementový systém. Toto bylo obzvláště patrné u pacientů postrádajících imunoglobuliny. Obzvláště závažné nežádoucí účinky anafýlaktického charakteru mohou být patrné u pacientů, u kterých dojde k rozvoji protilátek proti IgA. Následně byl vyvinut způsob zabránění tvorby agregátů a/nebo eliminace těchto agregátů během postupu přípravy a zhruba před dvaceti lety byla testována první generace imunoglobulinů pro intravenózní podání (IVIG) a tyto imunoglobuliny byly shledány jako vhodné pro toto použití.

Původním účelem IVIG bylo zmírnit infekční epizody u pacientů s kongenitálním nebo získaným celkovým či částečným chyběním imunoglobulinů a dále eliminovat diskomfort související s podáním lidského normálního imunoglobulinu. Další výhodou IVIG je, že velké dávky imunoglobulinu mohou být podány během krátké doby, a tímto způsobem je možné získat velmi rychle dostatečně vysoké koncentrace v krvi. Obzvláště při léčbě závažných bakteriálních infekcí je důležité ustavit rychle vysoké koncentrace v místech probíhající infekce.

V posledních letech bylo dále prokázáno, že IVIG jsou účinné u dalších závažných onemocnění, jejichž léčba může být jinak obtížná, například se jedná o krvácení způsobená vymizením krevních destiček na podkladě imunologických mechanizmů, tzv. idiopatickou trombocytopenickou purpuru (ITP), dále o některá vzácná onemocnění, jako jsou například Kawasakiho syndrom a celá řada autoimunních onemocnění, jako je například polyradikulitida (Guillan Barreho syndrom). Také další onemocnění, která byla do současnosti obtížně léčitelná, jsou v současnosti předmětem klinických studií s IVIG. Mechanizmus účinku u těchto onemocnění byl objasněn pouze částečně. Předpokládá se, že účinek se týká takzvaných imunomodulačních vlastností IgG, například blokády Fcy-receptorů, na fagocytárních buňkách, zvýšeného metabolismu IgG, sní

-1 CZ 297199 B6 žení tvorby cytokinů a interference s předpokládanou sítí idiotypů/antiidiotypů, obzvláště důležitých pro neutralizaci autoimunní reaktivity.

První generace IVIG byla připravena pepsinovým štěpením výchozího materiálu (Cohnova frakce II), účelem štěpení bylo odstranění imunoglobulinových agregátů. V tomto postupu nebyly zahrnuty žádné kroky na bázi sloupcové chromatografíe. Produkt musel být lyofilizován, aby zůstal stabilní po přiměřeně dlouhou dobu a byl rozpouštěn těsně před použitím.

Výchozím materiálem pro IVIG byl lidský normální imunoglobulin, u kterého bylo prokázáno, že je bezpečný s ohledem na možný přenos virů, pokud byl tento imunoglobulin používán pro intramuskulární injekční podání. IVIG byl tedy považován za bezpečný. Po několika letech klinického používání však bylo u IVIG produktů některých výrobců překvapivě prokázáno, že způsobují přenos viru hepatitidy C. Studie prováděné za účelem objasnění osudu virů během výroby lidského normálního imunoglobulinu prokázaly, že přestup viru frakcionačním postupem z plazmy do frakce s lidským normálním imunoglobulinem je nevelký. Bezpečnost lidského normálního imunoglobulinu pro intramuskulární použití je pravděpodobně způsobena faktem, že obsahuje ochranné imunoglobuliny. V kombinaci s malými injekčně podávanými objemy a intramuskulárním způsobem podání mohou tyto ochranné imunoglobuliny neutralizovat běžné viry v plazmě a činit je neinfekčními. Obzvláště pokud jsou podávány intravenózně velké dávky imunoglobulinů, mohou se objevit virové infekce, jak bylo popsáno na začátku devadesátých let. Z tohoto důvodu bylo určeno, že proces výroby by měl zahrnovat jeden nebo více dobře definovaných kroků k inaktivaci virů a/nebo k jejich odstranění.

Druhá generace IVIG založená na nenaštěpených a nemodifikovaných molekulách imunoglobulinu s nízkou antikomplementámí aktivitou a vyšší stabilitou byla zavedena uprostřed osmdesátých let, ale stále ve formě lyofilizovaného produktu. Tento IVIG byl purifikován několika chromatografickými kroky. Produkty tohoto typu v současnosti dominují na trhu s IVIG. První a druhá generace IVIG se tak objevují jako lyofilizované prášky, které se rozpouštějí těsně před použitím.

Rozpouštění lyofilizovaných IVIG je pomalé (do 30 minut pro jednu lahvičku). Často musí být rozpuštěno pro jednoho pacienta několik lahviček. Protože je pro uživatele vysoce prioritní mít IVIG v roztoku připraveném k použití, byly zavedeny na trh tekuté produkty. Ještě důležitější je, že stále existuje potřeba zlepšení postupu výroby, aby bylo možno získat vysoce purifikovaný, stabilní a plně nativní preparát IVIG s vyšší klinickou účinností a menším počtem nežádoucích lékových reakcí. Je tedy potřeba získat dále rozvinutý a vylepšený postup purifíkace IgG z nativní plazmy nebo plazmatické proteinové frakce za účelem získání tekutého IVIG produktu bez přítomnosti viru. Konečně, postup by měl být navržen takovým způsobem, aby mohl být použit při výrobě ve velkém měřítku.

Purifikační postup popsaný v předkládané přihlášce vede k tvorbě tekutého imunoglobulinového produktu pro intravenózní podání, který může být charakterizován jako vysoce purifikovaná, plně nativní, biologicky aktivní, podrobená dvojité inaktivaci virů a stabilní nová generace IVIG, která neobsahuje žádný detergent, polyethylen glykol (PEG) nebo albumin jako stabilizátor.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká zlepšeného purifikačního postupu a zlepšeného tekutého imunoglobulinového produktu, který, inter alia, může být podán intravenózně.

Imunoglobulinový produkt získaný způsobem, který je předmětem předkládaného vynálezu, může být nazýván IVIG třetí generace. Postup je charakterizován následujícími podmínkami frakcionace: neprobíhá pepsinové štěpení, agregáty a částice jsou odstraněny precipitací (krok, který byl ověřen, že vede k odstranění virů), další purifíkace je dosaženo sloupcovou ionexovou

-2CZ 297199 B6 chromatografií, jako virus inaktivační krok slouží S/D postup a preparát je formulován jako tekutý produkt.

V důsledku zlepšené čistoty produktu, který lze získat postupem dle vynálezu ve srovnání s předchozími produkty, není nezbytné přidávat stabilizátory, jako jsou neiontové detergenty, PEG nebo albumin, pro vyloučení agregace IgG během skladování IVIG jako tekutého produktu. Produkt, který lze získat postupem dle vynálezu, má vyšší kvalitu než produkty získané předchozími postupy a poskytuje lepší klinické účinky a nechtěné nežádoucí účinky se skutečně nevyskytují.

Detailní popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká způsobu purifikace imunoglobulinů, tj. IgG z nativní plazmy nebo z frakce plazmatických proteinů obsahující imunoglobulin, kterýžto způsob se skládá z kroků:

a) přípravy vodní suspenze hrubé frakce plazmatických proteinů obsahujících imunoglobuliny;

b) přidání ve vodě rozpustné, významně nedenaturační precipitační látky k řečené suspenzi z kroku (a) v množství dostatečném ke způsobení precipitace velké části proteinů nepatřících k imunoglobulinu G, agregátů imunoglobulinů a částic zahrnujících potenciálně infekční částice, jako jsou například virové částice, bez způsobení významné precipitace monomerického imunoglobulinu G, čímž dochází k tvorbě směsi pevného precipitátu a tekutého supernatantu;

c) získání supernatantu s přečištěným imunoglobulinem G ze směsi z kroku (b);

d) aplikace supernatantu obsahujícího přečištěný imunoglobulin G z kroku (c) na anexovou pryskyřici a následně na katexovou pryskyřici;

e) vymytí bílkovinných kontaminujících látek a precipitátů proteinů zkatexové pryskyřice pomocí pufru majícího pH a iontovou sílu, které jsou dostatečné k odstranění kontaminujících látek z pryskyřice bez způsobení významnější eluce imunoglobulinu G;

f) eluce imunoglobulinu G z katexové pryskyřice pomocí nedenaturačního pufru majícího pH a iontovou sílu, které jsou dostatečné k účinné eluci imunoglobulinu G, čímž dochází k získání eluátu obsahujícího imunoglobulin G;

g) provedení dia/ultrafiltrace eluátu obsahujícího imunoglobulin G z kroku (f) za účelem zakoncentrování a/nebo dialýzy eluátu a volitelně přidání stabilizační látky;

h) přidání viricidního množství inaktivující látky inaktivující viry k dia/ultrafiltrované a volitelně stabilizované frakci obsahující imunoglobulin G z kroku (g), což vede k získání roztoku obsahujícího imunoglobulin G významně bez přítomnosti virů;

i) aplikace roztoku obsahujícího imunoglobulin G z kroku (h) na anexovou pryskyřici a následně na katexovou pryskyřici;

j) promytí katexové pryskyřice pomocí pufru majícího pH a iontovou sílu, které jsou dostatečné k vymytí bílkovinných kontaminujících látek a látek inaktivujících viry z pryskyřice bez způsobení významnější eluce imunoglobulinu G;

k) eluce imunoglobulinu G z katexové piyskyřice z kroku (j) pomocí významněji nedenaturujícího pufru majícího pH a iontovou sílu, které jsou dostatečné k účinné eluci imunoglobulinu G, čímž dochází k získání eluátu obsahujícího imunoglobulin G; a

-3 CZ 297199 B6

1) podrobení eluátu obsahujícího imunoglobulin G z kroku (k) dia/ultrafiltrací za účelem získání roztoku o nižší iontové síle a zakoncentrování imunoglobulinů G, a úprava osmolality přidáním sacharidu.

Výchozí materiál předkládaného purifikačního postupu může být nativní plazmou, aleje s výhodou hrubou frakcí plazmatických proteinů obsahujících imunoglobulin. Výchozím materiálem pro purifíkační postup může být normální lidská plazma, nebo může tento materiál pocházet od dárců s vysokými titry specifických protilátek, jedná se například o hyperimunní plazmy. Předkládaná specifikace, termín plazmatická frakce obsahující imunoglobulin zahrnuje všechny možné výchozí materiály pro předkládaný postup, například kryoprecipitátu zbavenou plazmu, nebo kryoprecipitátu zbavenou plazmu, z které byly odstraněny různé plazmatické proteiny, jako jsou například Faktor IX a antitrombin, různé Cohnovy frakce a frakce získané precipitačními postupy za použití PEG (Polson et al., (1964), Biochem Biophys Acta, 82, 463-475; Polson a Ruiz-Bravo, (1972) Vox Sang, 23, 107-118) nebo za použití síranu amonného. V přednostní formě vynálezu jsou plazmatickou proteinovou frakcí Cohnovy frakce II a III, ale také mohou být použity Cohnova frakce II, nebo Cohnovy frakce I, II a III. Různé Cohnovy frakce jsou přednostně připraveny z plazmy za použití standardní Cohnovy frakcionace modifikované KistlerNitschmannem. Cohnovy frakce obsahují navíc k imunoglobulinům například fibrinogen, aglobuliny a β-globuliny, včetně různých lipoproteinů, které by měly být přednostně odstraněny následným purifikačním postupem. Filtrace může i nemusí být použita v závislosti na izolačním postupu použitém k získání Cohnových frakcí (tj. centrifugace nebo filtrace).

První krok postupu, který je předmětem vynálezu zahrnuje přípravu vodné suspenze frakce plazmatických proteinů obsahujících imunoglobulin, kde koncentrace IgG v suspenzi je dostatečně vysoká, takže během následného precipitačního kroku precipituje hlavní část non-IgG proteinů, obzvláště ty s vysokou molekulovou váhou, dále agregované imunoglobuliny a další agregované proteiny, stejně tak jako potenciálně infekční částice, a to bez významné precipitace monomerních IgG. Tohoto efektu je obecně dosaženo, pokud koncentrace IgG v pufrované a zfiltrované suspenzi je alespoň 4 g/1 před přidáním precipitační látky. Mělo by být bráno do úvahy, že vliv koncentrace bílkovin, stejně tak jako pH a teplota suspenze na precipitaci závisí na typu zvolené precipitační látky.

Je preferováno, aby frakce plazmatických proteinů byla suspendována ve vodě a/nebo v pufru při významně nedenaturující teplotě a pH. Termín „významně nedenaturující“ znamená, že nedochází k významné ireverzibilní ztrátě funkční aktivity IgG molekul, například ke ztrátě antigen vazebné aktivity a/nebo ztrátě biologické Fc-funkce (viz příklad 2).

Frakce plazmatických proteinů je suspendována ve vodě s alespoň jedním nedenaturačním pufrovým systémem v objemech od 6 do 9, přednostně od 7 do 8, násobku frakce plazmatických proteinů. Hodnota pH suspenze obsahující imunoglobuliny je přednostně udržována pod 6, jako například v rozmezí od 4,0 až do 6,0, přednostně 5,1 až 5,7, nejpřednostněji okolo 5,4, aby došlo k zajištění optimální rozpustnosti imunoglobulinů a k zajištění optimálního efektu následného PEG precipitačního kroku. Může být použit vhodný kyselý pufr, ale pufřový systém přednostně obsahuje alespoň jeden z následujících pufrů a kyselin: fosforečnan sodný, octan sodný, kyselina octová, HC1. Osoby znalé oboru ocení, že mohou být použity i jiné četné pufry.

Imunoglobulinová suspenze je přednostně udržována při studené teplotě, inter alia aby došlo k zabránění významné denaturaci proteinů a minimalizaci aktivity proteáz. Imunoglobulinová suspenze a voda, stejně tak jako přidaný pufrový systém mají přednostně stejnou teplotu v rozmezí 0-12 °C, přednostně 0-8 °C, nejpřednostněji 1-4 °C.

Suspenze etanolem precipitované pasty obsahuje relativně velká množství agregovaného proteinového materiálu. Suspenze obsahující imunoglobulin je volitelně zfiltrována za účelem odstranění například velkých agregátů, filtračních prostředků, pokud jsou přítomny a reziduální neroz

-4CZ 297199 B6 puštěné pasty. Filtrace je přednostně provedena pomocí hloubkových filtrů, například C150AF, AF 2000 nebo AF 1000 (Schenk), 30LA (Cuno), nebo podobné filtry. Odstranění velkých agregátů, filtračních prostředků, pokud jsou přítomny, a reziduální nerozpuštěné pasty může být provedeno také centrifugací.

Alespoň jedna ve vodě rozpustná významně nedenaturující precipitační látka je přidána k zfiltrované suspenzi obsahující imunoglobulin v množství dostatečném k vyvolání precipitace velké části vysoce molekulárních proteinů, lipoproteinů, agregovaných proteinů, mezi nimi i agregovaných imunoglobulinů. Jiný partikulární materiál, jako jsou například potenciálně infekční částice, například virové částice, jsou také precipitovány bez způsobení významné precipitace monomerního IgG. Termín „infekční částice“ v předkládaném kontextu zahrnuje například virové částice (jako jsou například viry hepatitidy, HIV 1 a HIV2) a bakterie.

Významně nedenaturující, ve vodě rozpustné proteiny precipitující látky jsou dobře známé v oblasti proteinové purifikace. Takové precipitační látky jsou používány pro frakcionaci bílkovin, která vede k částečné purifikaci proteinů ze suspenzí. Vhodné látky precipitující bílkoviny pro použití v postupu, který je předmětem předkládaného vynálezu, zahrnují formy PEG o různé molekulové váze, kyselinu kaprylovou a síran amonný. Osoby znalé oboru ocení, že jako alternativní prostředky precipitace mohou být použity některé jiné nedenaturační ve vodě rozpustné precipitační látky. Termín „přidání látky precipitující bílkoviny“ a varianty tohoto termínu zahrnují přidání jednoho nebo více typů látek precipitující bílkoviny.

Přednostní precipitační látkou je organická látka PEG, obzvláště PEG o molekulové váze v rozmezí 3000-800 Da, jako jsou například PEG 3350, PEG 4000, PEG 5000 a zejména PEG 6000 (čísla těchto specifických PEG sloučenin udávají jejich průměrnou molekulovou váhu). Výhodou použití látky PEG jako precipitační látky je fakt, že PEG nemá iontový charakter a stabilizuje bílkoviny, PEG je například dobře znám jako stabilizátor IVIG produktů. Precipitační krok také funguje jako krok odstraňující viry. PEG koncentruje a precipituje viry bez ohledu na jejich druh, velikost a povrch.

Podané množství látky precipitující bílkoviny je přidáno k zfíltrované suspenzi za účelem precipitace většiny vysoce molekulárních a agregovaných proteinů a částic, bez významnější precipitace monomerních IgG, za vzniku čistého roztoku supematantu. Látka precipitující bílkoviny může být přidána v pevné formě jako prášek nebo v koncentrovaném roztoku.

Pro PEG jako precipitační látku platí, že čím vyšší je molekulární váha sloučeniny, tím nižší je koncentrace PEG potřebná k vyvolání precipitace bílkoviny. Pokud je použit PEG 3350, PEG 4000, nebo přednostně PEG 6000, je koncentrace precipitační látky ve zfíltrované suspenzi s výhodou v rozmezí 3-15 % váhově, jako například 4-10 % (jako například zhruba 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %), kde 6 % je nejvíce preferováno. V precipitačním kroku pokračuje precipitační proces až do dosažení rovnováhy mezi pevnou a tekutou fází, například po dobu alespoň 2 hodin, jako například od zhruba 2 hodin do zhruba 12 hodin, přednostně okolo 4 hodin. Během precipitace je suspenze přednostně udržována při nízké teplotě (například méně než zhruba 12 °C, jako například méně než zhruba 10 °C, přednostně mezi 2 °C a 8 °C). Nejvhodnější teplota závisí na typu látky precipitující bílkoviny.

Po ukončení precipitace bílkoviny je přečištěný supernatant obsahující IgG, kteiý je téměř výhradně v monomemí formě, získán ze směsi pevného precipitátu a tekutého supematantu vzniklých během precipitace. Získání IgG může být provedeno konvenčními technikami separace tekutiny z pevné fáze, jako je například centrifugace a/nebo filtrace. Přednostně je používána centrifugace (například Westfalia) s rychlostí 1000-5000 g.

Volitelně je získaný, přečištěný supernatant obsahující IgG zfíltrován za účelem odstranění větších částic a agregátů. Tento postup je volitelně následován sterilní filtrací prováděnou za použití

-5 CZ 297199 B6 konvenčního sterilizačního filtru (jako je například 0,22 μπι filtr od společnosti Millipore nebo Sartorius), který eliminuje z roztoku například bakterie.

Přečištěný a volitelně zfiltrovaný supernatant obsahující IgG je podroben alespoň jednomu kroku, lépe dvěma krokům, ale volitelně více krokům anexové a katexové chromatografie za účelem odstranění non-IgG kontaminujících látek, například IgA, albuminu, stejně tak jako agregátů.

V přednostní formě vynálezu je přečištěný a volitelně zfiltrovaný supernatant obsahující IgG aplikován na anexovou pryskyřici a následně jsou připraveny dvě kolony o vhodných rozměrech naplněné katexovou pryskyřicí.

Pokud se provádí za účelem purifíkace IgG ionexová chromatografie, je preferováno, aby podmínky, například pH a iontová síla, byly zvoleny takovým způsobem, že hlavní podíl kontaminujících látek (například non-IgG proteinů, jako jsou například IgA, transferin, albumin a agregáty) v aplikovaném roztoku se váže na anexovou pryskyřici, zatímco nedochází k významné vazbě IgG. S ohledem na následnou katexovou chromatografií vedou zvolené přednostní podmínky k vazbě převážné většiny IgG molekul přítomných v roztoku, který je aplikován na katexovou pryskyřici. Bílkovinné kontaminující látky neadsorbované na anexovou pryskyřici a precipitační látka jsou odstraněny v následném promývání katexové pryskyřice.

V přednostní formě předkládaného postupu jsou anexová a katexová chromatografie zapojeny do série. V předkládaném kontextu znamená termín „zapojeny do série“, pokud je použit ve spojení s ionexovými pryskyřicemi, že proteiny procházející anexovou pryskyřicí jsou přímo aplikovány na katexovou pryskyřici bez změny pufru nebo jiných podmínek.

Existuje několik důvodů, proč je výhodné provést anexovou a katexovou chromatografíi v jednom kroku za použití dvou sériově zapojených chromatografických kolon, místo použití dvou nezávislých chromatografických kroků, například s různým složením pufrů. Použití dvou sériově zapojených chromatografických kolon činí celý postup praktičtější, například není potřeba mezikroku sbírání IgG obsahující frakce mezi dvěma ionexovými chromatografiemi za účelem úpravy pH a iontové síly. Navíc jsou pufry aplikovány na kolonu současně a obě kolony jsou ekvilibrovány stejným pufrem. Je však možné provést chromatografií ve dvou krocích, tj. anexovou a katexovou chromatografií nezapojené do série. Provedení chromatografie ve dvou krocích je však, jak je zmíněno výše, pracnější ve srovnání ionexovými chromatografiemi zapojenými do série.

Je současně předpokládáno, že vysoký stupeň čistoty, vysoký obsah IgG monomerů a dimerů a nízký obsah IgG v IVIG produktu, který je předmětem vynálezu, jsou částečně způsobeny použitím dvou sériově zapojených chromatografických kolon.

Jak bude známo osobám znalým oboru, mohou být ionexové pryskyřice založené na různých materiálech s ohledem na matrici, stejně tak jako na připojené nabité skupiny. Následující matrice mohou být například použity, v kterých zmíněné materiály mohou být více či méně zesíťovány: agaróza (jako například Sepharose CL-6B®, Sepharose Fast Flow®, a Sepharose High Performance®), celulóza (jako například DEAE Sephacel®), dextran (jako například Sephadex®) silika a syntetické polymery. U anexové pryskyřice mohou být nabité skupiny, které jsou kovalentně připojeny k matrici například diethylaminoethyl (DEAE), kvartémí aminoethyl (QAE), a kvartérní amonium (Q). U katexové pryskyřice mohou být nabité skupiny, které jsou kovalentně připojeny k matrici například karboxymethyl (CM), sulfopropyl (SP) a/nebo methyl sulfonát (S).

V přednostní formě předkládaného postupuje používanou anexovou pryskyřici DEAE Sepharose Fast Flow®, ale mohou být použity i jiné anexové pryskyřice. Přednostní katexová pryskyřice je CM Sepharoce Fast Flow®, ale mohou být použity i jiné katexové pryskyřice.

Použitý příslušný objem pryskyřice po naplnění kolony na ionexovou chromatografií odráží rozměry kolony, tj. průměr kolony a výšku sloupce, a liší se v závislosti například na množství IgG v aplikovaném roztoku a na vazebné kapacitě použité pryskyřice.

-6CZ 297199 B6

Před provedením ionexové chromatografíe je ionexová pryskyřice přednostně ekvilibrovaná pufrem, který umožňuje vazbu protiiontů na pryskyřici. Přednostně jsou anexová a katexová pryskyřice ekvilibrovány stejným pufrem, což usnadňuje celý postup, protože je potřeba připravit a použít pouze jeden pufr.

Pokud je například zvolenou anexovou pryskyřicí DEAE Sepharose FF® a katexovou pryskyřicí je CM Sepharose FF® a kolony jsou zapojeny do série, jsou potom kolony s výhodou ekvilibrovány nedenaturujícím kyselým pufrem majícím zhruba stejné pH a iontovou sílu jako IgG roztok, který má být aplikován. Pro ekvilibraci ionexové kolony je vhodný kterýkoli z celé řady pufrů, například octan sodný, fosforečnan sodný, tris(hydroxymethyl)amino-methan. Osoby znalé obou ocení, že pro ekvilibraci mohou být použity četné jiné pufry, pokud je pH a vodivost zhruba stejná jako aplikovaný roztok IgG. Přednostním pufrem pro ekvilibraci anexové a katexové kolony, jsou-li zapojeny do série, je sodno acetátový pufr s koncentrací octanu sodného v rozmezí 5-25 mM, jako například v rozmezí 10-20 mM, přednostně okolo 15 mM. Je preferováno, aby pH sodno-acetátového pufru používaného pro ekvilibraci bylo v rozmezí od 5,0 až do 6,0, jako například od 5,4 do 5,9, přednostně okolo 5,7. Vodivost je v rozmezí 1,0-1,4 mS/cm, přednostně okolo 1,2 mS/cm. Vhodné acetátové pufiy mohou být připraveny z trihydrátu octanu sodného a z ledové kyseliny octové.

Před aplikací přečištěného volitelně zfíltrovaného supernatantu obsahujícího IgG na ionexovou kolonu jsou koncentrace pufru a pH řečeného supernatantu přednostně upraveny, pokud je to nezbytné, na hodnoty významně ekvivalentní koncentraci a pH použitého ekvilibračního pufru.

Po aplikaci supernatantu obsahujícího IgG na kolony zapojené do série, jsou tyto kolony přednostně promyty (iniciální promytí) jedním objemem kolony promývacího pufru za účelem zajištění, že roztok obsahující IgG je kvantitativně přenesen z anexové kolony na kolonu katexovou. Následně je odpojena anexová a katexová kolona a katexová kolona je přednostně promyta za účelem odstranění proteinových kontaminujících látek z kolony za pomoci pufru majícího pH a iontovou sílu dostatečnou, aby došlo k významné eluci všech kontaminujících látek z katexové kolony bez způsobení významné eluce IgG.

Iniciální promytí je s výhodou prováděno za pomoci ekvilibračního pufru, ačkoli mohou být pro promytí použity i jiné pufry o podobné koncentraci a pH. Pro vymytí kontaminujících látek je preferováno použití acetátového pufru. Hodnota pH pufru může být 5,0 až 6,0, jako například v rozmezí 5,2 až 5,8, například 5,4.

Eluce IgG z katexové pryskyřice je přednostně provedena za pomoci významněji nedenaturujícího pufru majícího pH a iontovou sílu dostatečnou ke způsobení účinné eluce IgG, čímž dochází k získání IgG obsahujícího eluátu. V tomto kontextu znamená účinná eluce alespoň 75 %, například alespoň 80 %, nebo lépe 85 % z IgG proteinů aplikovaných na anexovou a katexovou kolonu zapojené do série, které jsou eluovány z katexové pryskyřice. Eluce je s výhodou provedena jako gradientový eluční krok. V postupu, který je předmětem předkládaného vynálezu je preferovaným použitým pufrem octan sodný mající pH v rozmezí 5,0-6,0, například 5,2-5,8, přednostně okolo 5,4, a koncentraci v rozmezí 5-40 mM, jako například v rozmezí 10-25 mM, přednostně okolo 15 mM.

Je preferováno, aby koncentrace solí elučního pufru byla dostatečně vysoká k vymytí IgG z pryskyřice. K eluci IgG z pryskyřice je však předpokládáno použití vyššího pH a nižší koncentrace solí. V přednostní formě předkládaného postupuje eluce prováděna jako kontinuální gradientová eluce s koncentracemi chloridu sodného v rozmezí 50-500 mM, přednostně od zhruba 125 mM do zhruba 350 mM chloridu sodného.

Eluce může být provedena také krokovým gradientem. Je předpokládáno, že eluce může být provedena také jako eluce konstantní koncentrací solí, ve které eluční pufr aplikovaný na katexovou

-7CZ 297199 B6 kolonu má pouze jednu koncentraci na rozdíl od gradientově eluce. Pokud je provedena eluce konstantní koncentrací solí, může být tato koncentrace solí s výhodou v rozmezí od zhruba 350 mM do zhruba 500 mM chloridu sodného. Výhodou gradientově eluce ve srovnání s elucí konstantní koncentrací solí je fakt, že eluce je účinnější při použití gradientu solí, a další výhodou 5 je, že eluát má nižší iontovou sílu, což je výhodné, protože vysoká iontová síla je kritická pro stabilitu IgG. Eluční pufr může dále obsahovat látku stabilizující bílkoviny, jako jsou například látky zmíněné níže. Pro eluci IgG mohou být použity různé další pufrové systémy, jak bude oceněno osobami znalými oboru.

K IgG frakci je okamžitě po eluci nebo během této eluce přidána přednostně alespoň jedna látka stabilizující bílkovinu. Látky stabilizující bílkoviny jsou známé osobám znalým oboru a zahrnují například různé cukerné alkoholy a sacharidy (jako jsou například sorbitol, mannóza, glukóza, trealóza, maltóza), bílkoviny (jako je například albumin), aminokyseliny (jako je například lysin, glycin) a organické látky (jako je například PEG). Zvolený intermediární stabilizátor může být 15 s výhodou takový, který může být v následném kroku odstraněn z roztoku obsahujícího IgG.

Vhodné koncentrace protein stabilizující látky v roztoku obsahujícím IgG závisí na použité specifické látce. V přednostní formě vynálezu je stabilizační látkou sorbitol, přednostně ve finální koncentraci v rozmezí 2-15 % (w/v) sorbitolu, např. zhruba 2-5 %.

Následně po eluci zkatexové kolony je eluát přednostně odsolen (tj. dialyzován) a s výhodou zakoncentrován. Změna pufru a koncentrace IgG může být provedena kombinací dia/ultrafiltračního postupu. Termín „dia/ultrafiltrace“ znamená, že dialýza a zakoncentrování diafiltrací a respektive ultrafiltrací jsou provedeny v jednom kroku. Je předpokládáno, že diafiltrace a ultra25 filtrace mohou být provedeny jako dva oddělené kroky. Avšak za účelem zabránění ztráty produktu je v současnosti preferováno provést dialýzu a zakoncentrování způsobem diafiltrace a ultrafiltrace v jednom kroku.

Membrány použité pro dia/ultrafiltraci mají s výhodou cutoff nominální váhy v rozmezí 30 10 000-100 000 Da. Přednostním typem membrány pro předkládaný postup je polysulfonová membrána s cutoff nominální váhy 30 000 Da od společnosti Millipore. Použity mohou být i jiné ultrafiltrační membrány ze srovnatelného materiálu a o stejné porozitě.

Rozsah koncentrací se může významně lišit. Roztok je zakoncentrován z původní koncentrace 35 10g/l na zhruba 100 g/1, přednostně na zhruba 50 g/1. Po zakoncentrování je koncentrát IgG s výhodou dialyzován proti pufru s nízkou iontovou silou. Kromě odstranění iontů solí jsou v tomto kroku z roztoku odstraněny také kontaminující látky o nízké molekulové váze a je umožněna výměna pufru pro další purifikační krok. Přednostním pufrem pro diafiltraci je 15 mM octan sodný, pH 5,4, obsahující 2,5 % (w/v) sorbitolu. Výměna pufru je prováděna až do snížení vodi40 vosti na hodnotu menší než zhruba 1,5 mS/cm, přednostně na méně než zhruba 1,3 mS/cm.

Během dia/ultrafiltrace je pH přednostně udržováno v rozmezí 4,0-6,0, přednostně 5,1-5,7, nejpřednostněji zhruba 5,4.

Po dia/ultrafiltraci je s výhodou v roztoku upravena koncentrace protein stabilizující látky, pokud 45 je to nezbytné, na finální optimální koncentraci charakteristickou pro specifickou použitou protein stabilizující látku. Pokud je použit sorbitol, je jeho koncentrace upravena přednostně na zhruba 10 % hmotnostně.

Je preferováno, aby byl za účelem odstranění agregátů před následným krokem stabilizovaný 50 protein zfiltrován pomocí filtru s průměrem pórů v rozmezí 0,2-1,0 pm, přednostně zhruba

0,45 pm. V tomto stadiu má roztok obsahující IgG vzhled čirého roztoku o příslušném objemu a vysoké stabilitě jako výsledek vysoké čistoty, nízké iontové síly, kyselého pH, relativně vysoké koncentrace IgG a přidané stabilizační látky.

-8CZ 297199 B6

V postupu výroby IVIG produktu jsou zahrnuty alespoň dva kroky definované a validované pro odstranění a inaktivaci viru. Těmito kroky je přednostně precipitace pomocí PEG jako obecného kroku k odstranění viru a S/D postup jako krok inaktivující viry s lipidovým obalem. Kromě přísných požadavků na bezpečnost výchozího materiálu vůči virům je podle mezinárodních směrnic a podle dobře známé kapacity mnohočetného purifikačního postupu nezbytné snižovat přítomnost virů a zahrnují dvou nezávislých kroků snižujících přítomnost virů, které jsou namířeny proti obaleným i neobaleným virům; lék podle předkládaného vynálezu je z hlediska přítomnosti virů významně bezpečný.

Infekční viry s lipidovým obalem, které mohou být stále přítomny v roztoku obsahujícím IgG, jsou přednostně inaktivovány v tomto stadiu postupem přidání viricidního množství látky inaktivující viry do roztoku obsahujícího IgG. Za „viricidní množství“ látky inaktivující viry je považováno množství, které vede ke vzniku roztoku, v kterém jsou virové částice významně neinfekční a tímto je definován „roztok obsahující IgG bez přítomnosti viru“. Toto „viricidní množství“ závisí na použité látce inaktivující viry stejně tak jako na podmínkách, jako je například inkubační doba, pH, teplota, obsah lipidů a koncentrace bílkovin.

Termín „látka inaktivující viry“ znamená takovou látku nebo způsob, který může být použit za účelem inaktivace virů s lipidovým obalem stejně tak jako virů bez lipidového obalu. Termín „látka inaktivující viry“ zahrnuje podle vhodnosti kombinaci takových látek a/nebo způsobů, stejně tak jako pouze použití pouze jednoho typu takové látky nebo způsobu.

Přednostními látkami inaktivujícími viry jsou detergenty a/nebo rozpouštědla, nejpřednostněji směsi detergent/rozpouštědlo. Mělo by být rozuměno, že látka inaktivující viiy je volitelně směs jednoho nebo více detergentů s jedním nebo více rozpouštědly. Inaktivace pomocí rozpouštědla/detergentu (S/D) je běžně používaný krok pro inaktivaci virů s lipidovým obalem (např. HIV1 aHIV2, virus hepatitidy C a hepatitidy non A, non B a non C, HTLV1 a 2, herpetické viry, včetně CMV a viru Ebstein Barrové) v krevních produktech. Pro inaktivaci virů může být použita celá řada detergentů a rozpouštědel. Detergent může být vybrán ze skupiny tvořené neiontovými i iontovými detergenty a měl by být významně nedenaturující. Přednostně je neiontový detergent používán za účelem usnadnění následné eliminace detergentů z IgG preparátu následným krokem. Vhodné detergenty jsou popsány například Shanbromem et al., v patentech US 4 314 997 a US 4 315 919. Přednostními detergenty jsou detergenty prodávané pod obchodním názvem Triton X-100 a Tween 80. Přednostními rozpouštědly pro použití látek inaktivujících viry jsou di nebo trialkylfosfáty, jak je popsáno například Neurathem a Horowitzem v patentu US 4 764 369. Přednostním rozpouštědlem je tri(n-butylfosfát) (TNBP). Obzvláště přednostní látkou inaktivující viry pro použití v předkládaném vynálezu je směs TNBP a Tween 80, ale alternativně mohou být použity i jiné kombinace. Přednostní směs je přidána v takovém objemu, že koncentrace TNBP v roztoku obsahujícím IgG je v rozmezí 0,2-0,6 % hmotn., přednostně zhruba 0,3 % hmotn.. Koncentrace Tween 80 v roztoku obsahujícím IgG je v rozmezí 0,8-1,5 % hmotnostně, přednostně v koncentraci zhruba 1 % hmotnostně.

Krok inaktivace viru je prováděn za podmínek vedoucích k inaktivaci viru, což má za následek vznik roztoku významně bez přítomnosti viru. Tyto podmínky obecně zahrnují teplotu 4-30 °C, jako například 19-28 °C, 23-27 °C, přednostně okolo 25 °C, a účinnou inkubační dobu zjištěnou z validačních studií. Obecně je dostatečná k zajištění dostatečné inaktivace viru inkubační doba 1-24 hodin, přednostně 4-12 hodin, jako například okolo 6 hodin. Příslušné podmínky (teplota a inkubační časy) však závisí na použité látce inaktivující viry, pH, a koncentraci bílkovin a obsahu lipidů v roztoku.

Je předpokládáno, že za účelem přípravy produktu bez přítomnosti viru mohou být použity i jiné způsoby pro odstranění a inaktivaci viru, jako je například přidání methylenové modři s následnou inaktivaci zářením ultrafialovým světlem nebo nanofiltrací.

-9CZ 297199 B6

Po reakci s rozpouštědlem/detergentem, je roztok s výhodou naředěn pomocí pufru. Roztok obsahující IgG významně bez přítomnosti virů je volitelně zfíltrován, přednostně přes hloubkový filtr, jak je popsáno výše v dřívějším kroku předkládaného postupu a/nebo přes sterilní filtr.

Po inaktivaci viru a přednostně i filtraci je provedena ionexová chromatografie za účelem odstranění látky inaktivující viry a proteinových kontaminujících látek. Tento krok je přednostně proveden, jak je popsáno výše v předkládaném postupu v předcházejícím kroku, pomocí ionexové chromatografie s výjimkami, že objem anexové kolony je zhruba poloviční než objem katexové kolony, a že promytí před elucí IgG je důkladnější, a je použito alespoň šest objemů pufru. Navíc v přednostní formě vynálezu je ekvilibračním pufrem octan sodný o koncentraci v rozmezí zhruba 5-25 mM, přednostně 15mM, a pH v rozmezí zhruba 5,0-5,8, přednostně 5,4. Jak je zmíněno výše obsah octanu sodného a pH roztoku obsahujícího IgG jsou přednostně upraveny na stejnou koncentraci a pH, jako má ekvilibrační pufr. Navíc v přednostní formě vynálezu je přidána k získanému eluátu látka stabilizující bílkovinu, přednostně maltóza, ve finální koncentraci v rozmezí 1-5 %, přednostně zhruba 2,5 % hmotnostně.

Přednostním způsobem eliminace látky inaktivující viry je ionexová chromatografie. Avšak za užitečné jsou považovány i jiné metody, jako je například olejová extrakce a alternativní chromatografické metody. Příslušný způsob závisí na použité látce inaktivující viry. Odstranění rozpouštědla/detergentu může být tedy dosaženo vazbou IgG k pryskyřici a následně vymytím inaktivující látky pufrem. Vhodnou metodou je katexová chromatografie. V přednostní formě předkládaného vynálezu je navíc ke katexové chromatografií prováděna také chromatografie anexová za účelem zlepšení kvality a celkové čistoty finálního produktu předkládaného postupu.

Po ionexové chromatografií je eluát obsahující IgG přednostně oddialyzován a zakoncentrován, čímž je účinně snížen obsah zbývajících bílkovinných komponent. Toto může být s výhodou provedeno dia/ultrafiltrací, jak je popsáno výše. Pufrem použitým pro diafiltraci je octan sodný, přednostně v koncentraci od zhruba 4 do 10 mM, přednostně 7,5 mM, a pH v rozmezí od zhruba 4,0 do 6,0, přednostně zhruba 5,1-5,7, jako například 5,4. Alternativně mohou být použity pro diafiltraci i jiné pufry, jako je například fosforečnan sodný nebo kyseliny. V diafiltraci je pokračováno, dokud vodivost je menší nebo rovna 1 mS/cm. Roztok obsahující IgG je volitelně dále sterilně zfíltrován.

Pokud je to požadováno, je purifíkovaný roztok obsahující IgG, který je významně zbaven látky inaktivující viry, podroben dalším postupům za účelem vytvoření vhodného preparátu ve formě tekutého produktu, který může být použit například intravenózně, subkutánně, nebo intramuskulárně.

Z praktického pohledu je preferováno, aby obsah tekutého preparátu imunoglobulinového produktu byl stejný pro skladování i pro použití. Finální koncentrace IgG v produktu je přednostně v rozmezí 0,25-20 % hmotnostně (což odpovídá 2,5-200 g IgG/1), jako například 1-20 % hmotnostně, tj. 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %.

Je známo, že vysoká koncentrace bílkovin vede k vyšší stabilitě IgG. Na druhou stranu vysoké koncentrace IgG znamenají, že maximální infuzní rychlost při podání IgG pacientovi intravenózně musí být poměrně nízká, aby byly vyloučeny transfuzní problémy vyplývající z vysokého osmotického tlaku produktu. V současnost doporučovaná koncentrace pro intravenózní podání podle Evropského Lékopisu (Ph. Eur.) je 5 % (w/v). Na druhou stranu koncentrovaný produkt (například 10 % a více) je výhodný pro intramuskulámí nebo subkutánní podání.

Ačkoli to není preferováno, je zřejmé, že mohou být také použity i produkty, které lze získat různými kroky, například lyofílizované produkty místo tekutých produktů, ačkoli tyto produkty jsou méně výhodné než použití imunoglobulinových produktů ve formě připravených tekutých preparátů. Druhá forma bude detailněji popsána v následujícím.

-10CZ 297199 B6

Tekuté imunoglobulinové produkty jsou nej stabilnější při iontové síle významně nižší než je iontová síla plazmy, tj. vodivost je přednostně nižší než 1,0 mS/cm, přednostně okolo 0,8 mS/cm.

Hodnota pH má vliv na stabilitu IgG a na rychlost infuze. Tekuté imunoglobulinové produkty jsou nej stabilnější za kyselých podmínek, tj. pod izoelektrickým bodem IgG, při pH 6,4-8,5. Čím více se blíží hodnota pH hodnotě fyziologického pH (7,1-7,3), tím vyšší infuzní rychlost může být použita. V důsledku požadované stability bude pH imunoglobulinového produktu, který je předmětem vynálezu, přednostně v rozmezí 5,1-5,7, jako například mezi 5,2 a 5,6, jako například okolo 5,4.

Imunoglobulinový produkt může dále obsahovat látky stabilizující bílkoviny, jak je popsáno výše. Navíc mohou být jako stabilizační látky použity také cukerné alkoholy a sacharidy (jako například sorbitol, mannóza, glukóza, trealóza, maltóza), také proteiny (jako například albumin), aminokyseliny (jako například lysin, glycin) a organické látky (jako například PEG a Tween 80). Vhodné koncentrace stabilizačních látek v roztoku obsahujícím IgG závisí na použité specifické látce, jak je popsáno výše.

Purifikovaný roztok IgG je, pokud je to požadováno, upraven, aby se získal stabilní a izotonický roztok. Termín „izotonický roztok“ znamená, že roztok má stejný osmotický tlak jako plazma. Jak je zmíněno výše, je iontová síla imunoglobulinového produktu, který je předmětem vynálezu, a který je v tekuté formě, významně nižší, než je iontová síla v plazmě. Z tohoto důvodu je preferováno, aby byly ke zvýšení osmolality roztoku použity mono a disacharidy, protože nezvyšují iontovou sílu. V přednostní formě předkládaného vynálezu je přidána maltóza v koncentraci zajišťující, že roztok je izotonický. Maltóza současně funguje jako látka stabilizující imunoglobuliny. Toto je přednostně provedeno přidáním maltózy, aby finální koncentrace byla v rozmezí zhruba 5 % až 15 % (w/v), přednostně 10 % (w/v). Alternativně mohou být použity i jiné sacharidy, jako je například mannóza a glukóza.

Přednostní finální podmínky imunoglobulinového produktu jsou kompromisem mezi stabilitou a fyziologicky přijatelnými podmínkami s ohledem na například pH, iontovou sílu a tonicitu. Imunoglobulinový roztok musí navíc splňovat požadavky testů kontrolujících kvalitu, jak je specifikováno v Monografii č. 918, Evropský Lékopis, 1997.

Hlavními výhodami produktu získaného způsobem, který je předmětem vynálezu je fakt, že pokud je produkt formulován v tekutém preparátu, je připraven k okamžitému použití, kdy produkt je současně velmi stabilní, vysoce purifikovaný, má zhruba normální zastoupení podtříd IgG a má extrémně nízký obsah IgA stejně tak jako IgM, a protilátkové a biologické aktivity prokázané Fc funkcí.

Navíc neobsahuje prakticky žádné agregáty imunoglobulinů a/nebo jiných plazmatických bílkovin měřených jako polymery vyšší než dimery, a má nízkou antikomplementámí aktivitu a má velmi vysoký obsah IgG monomerů a dimerů. Monomerní IgG tvoří alespoň 90 %, což je považováno jako ideální. V důsledku vysoké stability je možné zamezit přidávání stabilizačních látek, jako jsou například albumin, glycin, detergenty nebo PEG. Produkt je konečně zbaven virů, protože postup zahrnuje použití dobře definovaných a validovaných kroků snižujících přítomnost virů, které jsou zaměřeny na odstranění a/nebo inaktivaci virů s lipidovým obalem i virů bez lipidového obalu.

Cílem validace kroku snižujícího přítomnost virů v přípravě produktu je zajistit důkaz, že postup výroby vede k účinné inaktivaci/odstranění virů, o kterých je známo, že kontaminují výchozí materiál, nebo které by mohly tento materiál kontaminovat. Validační studie zahrnují opatrné přidání viru před zahájením kroků přípravy produktu, které mají být validovány a měření rozsahu odstranění/inaktivace viru po ukončení kroku nebo kroků přípravy produktu. GMP omezení zabraňuje virové kontaminaci zařízení používaných při přípravě. Proto by validace měla být prováděna v oddělené laboratoři vybavené pro virologické práce ve zmenšením měřítku původního

-11 CZ 297199 B6 postupu a prováděné personálem se zkušenostmi ve virologii spolu s inženýry zaměřenými na přípravu produktu. Množství viru přidaného k výchozímu materiálu zamýšleného k použití v krocích přípravy produktu, které mají být validovány, by mělo být co největší, aby bylo možno určit kapacitu zkoumaného kroku přípravy dostatečně inaktivovat/odstraňovat viry. Avšak virus by měl být přidán v takovém množství, aby nebylo významně narušeno složení výrobního materiálu. Objem vzorku obsahujícího virus by měl být přednostně stejný nebo nižší než 10 %.

Kvantitativní stanovení bezinfekčnosti by mělo být provedeno podle principů GLP a může zahrnovat tvorbu plaků, detekci dalších cytopatických efektů, jako jsou například syncytia nebo tvorba ložisek, konečnou titraci (např. stanovení TCID₅₀), detekci syntézy virových antigenů, nebo další způsoby. Tyto způsoby by měly mít dostatečnou citlivost a reprodukovatelnost, a měly by být prováděny v dostatečném opakování a kontrolách, aby byla zajištěna dostatečná statistická přesnost výsledků.

Krok přípravy produktu je typicky podnícen množstvím 5 log viru, a pokud je získáno snížení v řádu 4 log či více, ukazuje to na jasný efekt snížení konkrétního testovaného viru, který je předmětem zkoumání. Podobně snížení v řádu 4,5 log, 5 log nebo dokonce 5,5 log indikuje jasný efekt snížení konkrétního testovaného viru, který je předmětem zkoumání, a tento krok může být klasifikován jako validovaný krok vedoucí ke snížení přítomnosti viru.

Virové validační studie by měly být prováděny sviry napodobujícími viry, které kontaminují produkt, tak těsně, jak je to jen možné, a za druhé by měly reprezentovat co nej širší rozmezí íyzikálně-chemických vlastností za účelem otestování obecné schopnosti systému eliminovat viry.

Virové validační studie by měly být prováděny ve shodě s CPMP směrnicí pro virové validační studie: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses (CPMP/BWP/268/95) a směrnicí pro medicinální produkty derivované z plazmy (CPMP/BWP/269/95).

Validační studie, které jsou předmětem předkládaného vynálezu jsou prezentovány v příkladu 5.

Produkt, který je předmětem předkládaného vynálezu má více než 95% čistotu, přednostně více než 98%. Vysoký stupeň čistoty je, inter alia, způsobem faktem, že produkt, který je předmětem předkládaného vynálezu, je získán alespoň jedním, přednostně dvěma, volitelně sériově zapojenými kroky anexové-katexové chromatografíe. V tomto kontextu stojí za zmínku, že bylo možné získat vysoký výtěžek navzdory velkému počtu použitých kroků postupu přípravy, ve výrobním měřítku alespoň 3,5 g IgG proteinu na kg čerstvé zmrazené plazmy.

Srovnávací studie, které byly provedeny (příklad 2), prokázaly, že imunoglobulinový produkt, který je možno získat postupem podle vynálezu, má ideální funkční vlastnosti, jako jsou například výrazné vazebné aktivity vůči antigenů a vysoká Fc funkce. Předkládaný přednostní lék vyvinutý předkládajícími vynálezci je váhově 5% roztokem imunoglobulinů. Testy stability dosud prokázaly stabilitu při skladování při 4 °C po dobu více než jeden rok, tzn. že imunoglobulinový produkt nevytváří agregáty a ani nedochází k fragmentaci imunoglobulinů G, ke ztrátě požadované biologické aktivity, nebo ke zvýšení nežádoucích aktivit, např. antikomplementámí aktivity a preklikreinové aktivity, jak je měřeno in vitro.

Na základě předkládaného vynálezu je možno získat IgG produkt, který má více než 95%, jako například alespoň 96%, nebo alespoň 97%, například alespoň 98%, přednostně alespoň 99%, nej přednostněji alespoň 99,5% čistotu. IgG produkt by měl obsahovat méně než 6 mg IgA/1, jako například méně než 4 mg IgA/1, přednostně méně než 3 mg IgA/1, nej přednostněji méně než 2 mg IgA/1.

Mělo by být zdůrazněno, že jiné produkty obsahují stabilizační látky ve formě detergentů, PEG nebo albuminu. V přednostní formě vynálezu neobsahuje produkt, který je předmětem předklá

-12CZ 297199 B6 daného vynálezu, žádnou z řečených stabilizačních látek, místo nich byl zvolen dobře tolerovaný sacharid.

Produkt, který je předmětem předkládaného vynálezu má jako jednu ze svých charakteristik velmi nízký obsah polymerů a agregátů. V přednostní formě vynálezu obsahuje produkt, který je předmětem předkládaného vynálezu méně než 1,5 % polymerů a agregátů, jako například méně než 1 %, například méně než 0,5 %, nebo méně než 0,25 % polymerů a agregátů. Obsah IgG monomerů a dimerů je alespoň 95 %, jako například alespoň 96 %, nebo alespoň 97 %, například alespoň 98 %, přednostně alespoň 98,5 %, nebo 99 %. Obsah monomerního IgG v produktu je alespoň 90 %.

Klinická studie prokázaly klinický efekt produktu, který je předmětem předkládaného vynálezu, kterýžto efekt je srovnatelný s registrovanými IVIG produkty. Produkt byl velmi dobře tolerován pacienty a obrat imunoglobulinů v cirkulaci byl určen na čtyři týdny. V předkládaných klinických studiích byl přesvědčivě prokázán imunomodulační efekt IVIG, SSI (data jsou prezentována v příkladu 3).

Indikacemi pro IVIG jsou primární hypo/agamaglobulinémie zahrnující běžnou variabilní imunodefícienci, Wiskott-Aldrichův syndrom a těžká kombinovaná imunodeficience (SCID), sekundární hypo/agamaglobulinémie u pacientů s chronickou lymfatickou leukémií (CLL) a mnohočetným myelomem, děti s AIDS a bakteriálními infekcemi, akutní a chronická idiopatická trombocytopenická purpura (ITP), alogenní transplantace kostní dřeně (BMT), Kawasakiho nemoc a syndrom Guillan-Barré.

Neurologie: Chronická zánětlivá demyelinizační polyneuropatie (CIDP), multifokální motorická neuropatie, roztroušená skleróza, myasténia gravis, Eaton-Lambertův syndrom, neuritida optiku, epilepsie.

Gynekologie: Habituální potraty, primární antifosfolipidový syndrom.

Revmatologie: Revmatoidní artritida, systémový lupus eiytematosus, systémová sklerodermie, vaskulitida, Wegenerova granulomatóza, Sjogrenův syndrom, juvenilní revmatoidní artritida.

Hematologie: Autoimunní neutropenie, autoimunní hemolytická anémie, neutropenie.

Gastrointestinální: Crohnova choroba, ulcerózní kolitida, celiakie.

Další: Astma, syndrom septického šoku, chronický únavový syndrom, psoriáza, syndrom toxického šoku, diabetes, sinusitis, dilatační kardiomyopatie, endokarditis, ateroskleróza, dospělí s AIDS a bakteriálními infekcemi.

Kromě zmíněných indikací pro léčbu pomocí IVIG produktů je považováno několik závažných autoimunních onemocnění, která běžně odpovídají na kortikosteroidní a imunosupresivní léčbu, za cílová onemocnění pro léčbu produktem, který je předmětem předkládaného vynálezu. Mezi tyto patří několik neurologických onemocnění, jako je například polyradikuloneuritis a některé imunitně podmíněné periferní polyneuropatie, ale také některá chronická zánětlivá revmatická a vaskulární onemocnění, jako je například systémová vaskulitida postihující malé cévy, polymyositida a další.

Odlišným způsobem účinku produktu, který je předmětem předkládaného vynálezu může být eliminace infekčních antigenů u chronických infekcí a zvýšení metabolismu IgG.

Vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které nejsou zamýšleny jako omezující.

-13 CZ 297199 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výrobní kroky purifikace imunoglobulinu (s výjimkou kroku 5 jsou všechny kroky prováděny při teplotě 5±3 °C)

Krok 1: Příprava Cohnovy frakce II + III ve formě pasty

Pasta tvořená Cohnovou frakcí II+III je připraven z lidské plazmy standardním způsobem Cohnovy frakcionace (Cohn E., et al., (1946) J. Am. Chem. Soc., 459-475) podle modifikace Kistler-Nitschmanna (Kistler P a Nitschmann HS, (1952), Vox Sang, 7, 414-424). Po odstranění kryoprecipitátu, pokud je požadováno, i po adsorpci určitých plazmatických proteinů (jako například Faktoru IX a antitrombinu) na například ionexový materiál a/nebo matrici tvořenou Heparin Sepharosou®, je zahájena etanolová precipitace.

Přesné podmínky (pH, koncentrace etanolu, teplota, koncentrace bílkoviny) pro získání pasty tvořené frakcí II—III jsou uvedeny na obrázku na straně 266 v publikaci Hams JR (ed), Blood Separation and Plasma Fractionation, Wiley-Liss, New York, 1991. Pasta je izolována filtrací protlačením přes filtr.

Krok 2: Extrakce imunoglobulinů z pasty tvořené Cohnovou frakcí II+III:

Ze 140 kg pasty tvořené frakcí II+III zahrnující 30 kg filtrátu (Schenk, Německo) (odpovídá výchozímu objemu plazmy okolo 1150 kg) je extrakce dosaženo zaprvé přidáním 525 kg 2,33 mM sodnofosfátového/acetátového pufru, pH 4,0 při pomalém promíchávání po dobu

1.5 hodiny, s následným po sobě jdoucím dvojím přidáním 350 kg vody pro injekce (WFI) s promícháváním po dobu 1,5 hodiny po každém přidání. Nakonec je přidáno okolo 280 kg

21.5 mM sodnofosfátového/acetátového pufru, pH 7,0, čímž dojde k úpravě pH suspenze na hodnotu 5,4.

Suspenze je zfiltrována přes hloubkový filtr (C-150AF, Schenk, Německo). Filtrát obsahuje kromě jiných bílkovin imunoglobuliny.

Krok 3: Precipitace agregátů bílkovin a odstranění virů pomocí PEG 6000:

K filtrátu z kroku 2 je přidán PEG 6000 (Měrek, Německo) do finální koncentrace 6 % hmotn. Po čtyřhodinové precipitaci je PEG suspenze zcentrifugována v průtokové centrifuze (Westfalia BKA28, Německo) za účelem získání čirého supematantu a zfiltrována přes hloubkový filtr (50LA a 90LA, Cuno, Francie) a následně sterilně zfiltrována pře 0,22 pm filtr (Durapore, Millipore, USA). Hodnota pH zfiltrovaného PEG supematantu je upravena pufrem přidáním 1 dílu 0,45 M sodnoacetátového pufru, pH 5,7, k 29 dílům supematantu, což vede k dosažení pH 5,7.

Krok 4: Purifikace anexovou a katexovou chromatografíí zapojených do série (I):

Dvě chromatografické kolony jsou naplněny 56 1 DEAE Sepharosy FF® (Pharmacia, Biotech, Švédsko) a 56 1 CM Sepharosy FF® (Pharmacia, Biotech, Švédsko). Kolony jsou zapojeny do série, takže tekutina protéká nejprve přes DEAE Sepharosu a následně přes CM Sepharosu. Sorbenty jsou ekvilibrovány 15 mM sodnoacetátovým pufrem, pH 5,7. Poté je na tyto dvě kolony zapojené do série nanesen roztok z kroku 3.

Během ionexové chromatografíe se většina kontaminujících bílkovin z naneseného vzorku váže na DEAE Sepharosu. Zatímco IgG protéká DEAE Sepharosou bez vazby na tento sorbent,

-14CZ 297199 B6 v průběhu chromatografíe na CM Sepharose dochází k vazbě IgG. Po nanesení roztoku a po promytí jedním objemem kolony ekvilibračního pufru je DEAE kolona odpojena od CM kolony. Poté je CM kolona promyta třemi objemy 15 mM sodnoacetátového pufru, pH 5,4 a poté je IgG eluováno pomocí gradientu NaCl od 125 mM do 350 mM, v 15 mM sodnoacetátového pufru, pH 5,4. Eluovaná IgG frakce je sbírána do sorbitolu o finální koncentraci 2,5 % hmotnostně.

Krok 5: Podrobení IgG frakce postupu rozpouštědlo/detergent (S/D):

Eluovaná IgG frakce je zakoncentrována a odsolena ultra/diafiltrací na koncentraci přibližně 50 g IgG/litr. Použitou membránou je polysulfonová membrána, cutoff nominální váhy 30 kDa (Millipore). Diafiltrace je provedena proti 15 mM sodnoacetátovému pufru, pH 5,4, obsahujícím

2,5 % hmotn sorbitolu, a v diafiltraci je pokračováno až do dosažení vodivosti menší než 1,4 mS/cm. Obsah IgG v roztoku je určen spektrofotometricky měřením při 280 nm (A₂go). Koncentrace sorbitolu je upravena na 10 % hmotn. a roztok je zfiltrován přes 0,45 pm filtr (Pall Corporation, UK). Poté jsou přidány Tween 80 a TNBP do finální koncentrace 1 % a respektive 0,3 % hmotn. pro následný postup S/D. S/D postup pokračuje po dobu alespoň 6 hodin při teplotě 25 °C.

Krok 6: Odstranění S/D pomocí ionexové chromatografíe (II):

Dvě do série zapojené kolony naplněné 28 1 DEAE a 56 1 CM Sepharosy FF jsou ekvilibrovány 15 mM acetátu sodného, pH 5,4. IgG frakce podrobená postupu S/D z kroku 5 je naředěna 5 díly 15 mM acetátového pufru, pH 5,4, zfiltrována přes hloubkový filtr (Cuno 90LA), následně sterilně zfíltrována (Satobran, Sartorius) a nanesena na dvě kolony zapojené do série. Ionexová chromatografíe a následná eluce IgG z CM kolony jsou provedeny přesně tak, jak je popsáno v kroku 4, s výjimkou, že CM kolona je výrazně promývána 6 objemy pufru za účelem odstranění látek z postupu S/D. Eluovaná IgG frakce je sbírána do maltózy (Měrek, Německo) ve finální koncentraci 2,5 % hmotnostně.

Krok 7: Finální koncentrace a příprava imunoglobulinu pro intravenózní podání:

Eluovaná IgG frakce z kroku 6 je podrobena ultrafíltraci a odsolení diafiltraci proti 7,5 mM acetátu sodnému obsahujícímu 2,5 % hmotn. maltózy, pH 5,4, až do dosažení finální vodivosti menší než 1 mS/cm. Použitou membránou je polysulfonová membrána s cutoff nominální váhy 100 kDa, což umožňuje eliminaci bílkovin s nižší molekulovou hmotností. Finální koncentrace IgG je upravena na 50 g/1 a koncentrace maltózy činí finálně 10 % (w/v). Finální preparát upravený maltózou je zfiltrován přes sterilní filtr (Sartopure GF2, Sartorius) a asepticky plněn.

Příklad 2

Výsledky analytické studie produktu získaného předkládaným postupem ve srovnání s jinými IVIG produkty

-15 CZ 297199 B6

	Gammonativ	Octagam	Gammagard	IVIG, SSI
	lyofílizovaný	tekutý	lyofílizovaný	tekutý
Čistota	45,4 %’	99,1 %	94,6%¹	99,8 %
Albumin	50 mg/ml²	malé množství	3 mg/ml²	nedetekovatelný
Obsah monomerů+dimerů	98,3 %³	96,8 %	9Ť6³	99,3 %
polymery + agregáty	0,8 %³	1,6%	méně než 0,1 %³	méně než 0,1 %
ACA	26%	30%	34%	32%
PAK	méně než 8,5 IE/ml	méně než 8,5 IE/ml	méně než 8,5 IE/ml	méně než 8,5 IE/ml
Hemaglutinin, 3% roztok
anti A více než 1:2	negativní	negativní	negativní	negativní
anti B více než 1:2	negativní	negativní	negativní	negativní
Fc funkce	169%	121 %	132 %	178 %
Rozložení podtříd
IgGl	60,0 %	61,9%	67,7 %	56,6 %
IgG2	35,8 %	33,1 %	27,2 %	39,4 %
lgG3	3,5 %	3,6 %	4,4 %	2,6 %
IgG4	0,7 %	1,4 %	0,6 %	1,5%
IgA	2,96 mg/1	54,7 mg/1	0,85 mg/1	1,36 mg/1
IgM	0,28 mg/1	39,1 mg/1	0,99 mg/1	0,16 mg/1
Tween 80	méně než 20 ppm	méně než 20 ppm	neurčeno	méně než 20 ppm
TNBP	2,0 ppm	1,5 ppm	1,5 ppm	b* PP^m
PEG	0,01 mg/ml	0,01 mg/ml	1,6 mg/ml⁴	0,02 mg/ml
pH	6,7	5,7	6,7	5,6
Koncentrace celkové bílkoviny	97 g/1	45 g/1	50 g/1	51 g/1
Maltóza nebo glukóza	20 mg/ml	92 mg/ml	15 mg/ml	88 mg/ml

1: bez korekce na HSA; 2: deklarováno výrobcem; 3: korigováno na HSA; 4: použito jako stabilizační látka.

Čistota (bílkovinné složení)

Lékopisnými požadavky na čistotu preparátu IVIG je 95 % IgG, kdy není přítomno více než 5 % kontaminujících bílkovin. Čistota má velký význam z několika důvodů. Z racionálního důvodu ío by měla být přítomna pouze bílkovina, která má požadovanou funkci. Ostatní kontaminující bílkoviny mohou být potencionálně škodlivé, například mohou způsobovat nechtěné nežádoucí účinky a/nebo ovlivňovat stabilitu produktu.

Čistota může být analyzována například pomocí elektroforetických technik, jak je detailně 15 popsáno v Evropském Lékopise, 1997, strany 964-965, kde jsou bílkoviny separovány na celulóze acetátovém gelu. Z praktických důvodů je však použit gel agarózový. Po elektroforéze je gel fixován, vysušen a obarven. Bílkovinné proužky jsou nakonec monitorovány skenováním. Z výše uvedené tabulky je zřejmé, že produkt, kterýje předmětem vynálezu, je skutečně čistý (99,8 %).

-16CZ 297199 B6

Albumin

Obsah albuminu byl analyzován zkříženou imunoelektroforézou přesně tak, jak je popsáno C. B. Laurellem (Anal Biochem (1965), 10, 358-361). Pět ul produktu bylo analyzováno proti protilátkám proti lidskému albuminu (DAKO A/S, Dánsko, č. A0001 (1/100)). Z důvodů vysoké čistoty nebyl v analyzovaném produktu, který je předmětem vynálezu, detekován žádný albumin.

Obsah IgG monomerů a dimerů

Obsah IgG monomerů a dimerů může být analyzován gelovou permeační chromatografíí a monitorován integrací ploch vrcholu monomeru a dimerů z chromatogramu, cf. Ph. Eur. Výsledky různých analýz jsou vyjmenovány ve výše uvedené tabulce a z těchto výsledků vyplývá, že suma ploch monomeru a dimerů tvoří 99,3 % celkové plochy chromatogramu (z čehož monomerní IgG tvoří 92 %) pro produkt, který je předmětem vynálezu.

Obsah polymerů a agregátů

O přítomnosti polymerů a agregátů je známo, že může způsobit závažné nežádoucí účinky, často příznaky podobné příznakům chřipky. Z důvodů velmi vysokého stupně čistoty dosaženého velmi šetrným výrobním postupem neobsahuje imunoglobulinový produkt získaný postupem, který je předmětem vynálezu, prakticky žádné polymery a agregáty.

Polymery mohou být analyzovány gelovou permeační chromatografíí. Jakýkoli bílkovinný vrchol s retenčním časem kratším než je retenční čas pro dimerický IgG je považován za polymemí, jak je popsáno v Evropském Lékopise.

Podle Evropského Lékopisu a také jiných směrnic by měl být obsah bílkovinných agregátů přednostně nižší než 3 %. Produkt, který je předmětem předkládaného postupu, neobsahuje měřitelné agregáty a je tedy považován, že obsahuje méně než 0,1 % polymerů a agregátů.

Antikomplementámí aktivita (ACA) a aktivita prekalikreinového aktivátoru (PAK)

ACA a PAK jsou měřeny, jak je popsáno v Evropském Lékopise.

ACA by měla být přednostně co nejnižší. Podle Evropského Lékopisu by měla být konsumpce komplementu nižší nebo rovna 50 %. Konsumpce komplementu měřeného vzorku produktu, který je předmětem předkládaného vynálezu je okolo 30%, tj. hodnota srovnatelná s jinými analyzovanými produkty. Mělo by být poznamenáno, že přítomnost albuminu má tendenci potlačovat konsumpci komplementu (pozorování vynálezců).

PAK, pokud je přítomna ve významném množství, je podkladem nežádoucích hypotenzivních účinků produktu. Z tohoto důvodu by měla být PAK v imunoglobulinovém produktu přednostně co nejnižší. Podle Evropského Lékopisu by měla být pod 35 IU/ml, pokud je měřena způsobem popsaným v tomto dokumentu. PAK produktu, který je předmětem vynálezu, stejně tak jako ostatních analyzovaných produktů je menší, než je hladina kvantitativní detekce metod, tj. pod 8,5/ml.

Hemaglutininy

IgM frakce plazmatických imunoglobulinů zahrnuje hemaglutininy, což jsou protilátky proti krevním antigenům typu A a B. Pokud má příjemce krev typu A a B může přítomnost takových protilátek způsobit nechtěné nežádoucí účinky v důsledku možné hemolytické reakce.

-17CZ 297199 B6

Podle požadavků Lékopisu musí být obsah hemaglutininů nižší než množství způsobující hemaglutinaci A/B erytrocytů v poměru imunoglobulinového produktu 1:64. Všechny analyzované produkty splňují tento požadavek.

Fc funkce

Zachované aktivity vazby antigenu jsou nezbytné pro biologické funkce IVIG. Toto platí také pro imunomodulační aktivity. Na druhou stranu je zachovaná Fc funkce nezbytná pro úěinek IVIG na různé fagocytující buňky a pro aktivaci komplementového systému. Fc funkce může být demonstrována za použití různých technik, ale akceptovaná metodika popsaná v Evropském Lékopise měří potenciál protilátek aktivovat komplement v preparátu proti antigenu zarděnek. Aktivita je porovnána s aktivitou referenčního preparátu (BRP, Evropský Lékopis) imunoglobulinů nastaveného na 100 %. Produkt splňuje test, pokud je relativní aktivita vyšší než 60 % referenčního preparátu. Zdá se, že Fc funkce produktu, který je předmětem vynálezu, je velmi dobře zachována, zejména ve srovnání s dalším analyzovaným tekutým produktem, nej pravděpodobněji v důsledku šetrného purifikačního postupu.

Rozložení podtříd

Rozložení IgG podtříd je měřeno standardní Manciniho imunodifuzní metodou přesně tak, jak je popsáno A. Ingildem (Scand J. Immunol, (1983), 17, 41). Koncentrace jsou určeny za pomoci WHO referenčního séra (67/97). Je požadováno, že rozložení podtříd by mělo být v rozmezí normální lidské plazmy s mediánem koncentrací v rozmezí 3,7-10,2 g IgG/1 séra, 1,1-5,9 g IgG2/l séra, 0,15-1,3 g IgG3/l séra a 0,06-1,9 IgG4/l séra (R. Djurup et al. Scand J. Clin. Lab Invest 48, 77-83). Z tohoto důvodu je rozložení podtříd ve všech produktech přijatelné.

Obsah IgA

O přítomnosti IgA je známo, že může potenciálně způsobovat senzibilizaci IgA defícientních příjemců. Pokud IgA defícientní příjemce obdrží imunoglobulinový preparát obsahující IgA, může být IgA považováno za cizí antigen a výsledkem může být u příjemce indukce protilátek proti IgA. Pokud je preparát obsahující IgA aplikován infuzí podruhé, může dojít k vyvolání anafylaktické reakce. Z tohoto důvodu je nezbytné, aby imunoglobulinový preparát obsahoval co nejnižší množství IgA. IgA a IVIG produktu může být monitorován pomocí ELISA techniky, kde například je k vyvázání IgA použita polyklonální protilátka anti-IgA a značená protilátka anti-IgA je použita pro detekci navázaného IgA. Standardy jsou vytvořeny ředěním kalibrátoru (č. X908, DAKO A/S, Dánsko) s deklarovaným obsahem IgA.

Produkt postupu popsaného v příkladu 1 obsahuje méně než 2 mg IgA/1, což je znatelně méně než je obsah IgA v dalším analyzovaném tekutém produktu. Fyzikálně-chemické podobnosti mez IgG a IgA činí obtížným oddělit od sebe tyto imunoglobuliny během purifikačního postupu. Avšak dva anexové/katexové chromatografické kroky snižují obsah IgA na velmi nízkou úroveň.

Obsah IgM

IgM v imunoglobulinovém preparátu může být monitorován pomocí ELISA techniky, kde například je k vyvázání IgM použita polyklonální protilátka anti-IgM a značená protilátka anti-IgM je použita pro detekci. Standardy jsou vytvořeny ředěním kalibrátoru (č. X908, DAKO A/S, Dánsko) s deklarovaným obsahem IgM. Z tabulky je patrné, že produkt, který je předmětem vynálezu obsahuje velmi nízké množství IgM a znatelně méně IgM než je obsah IgM v dalším analyzovaném tekutém produktu.

-18CZ 297199 B6

Tween 80, TNBP a PEG

Tween 80, TNBP a PEG jsou měřeny standardními postupy. Obecně by měl být obsah těchto aditivních látek co nejnižší.

PH pH analyzovaných tekutých produktů je kyselé, pH 5,6-5,7, zatímco analyzované lyofílizované produkty jsou po rozpuštění neutrální s pH 6,7.

Celková koncentrace bílkoviny

Podle Evropského Lékopisu by měla být koncentrace bílkoviny alespoň 50 g/1 + 10%; všechny produkty splňují tento požadavek. Koncentrace bílkoviny je měřena metodou podle Kjeldahla.

Stabilizační látky maltóza a glukóza

Sacharidy jsou běžně používány jako stabilizační látky imunoglobulinových produktů, mají dobré stabilizační vlastnosti a jsou rychle vyloučeny. Obsah maltózy, sacharózy a glukózy je určen za pomoci komerčního kitu (Boehringer Manheim, Německo) s maltózou jako referenční látkou.

Je zřejmé, že dva lyofílizované produkty stabilizované albuminem a albumin, stejně tak jako PEG, také obsahují sacharidovou stabilizační látku v koncentracích od 15 mg/ml do 20 mg/ml. Produkt, který je předmětem předkládaného vynálezu a další tekutý produkt jsou velmi podobně stabilizovány, tj. obsahují okolo 9 %, 88 mg/ml a 92 mg/ml maltózy. Co se týká obsahu polymerů a agregátů jako parametrů stability, má produkt, který je předmětem vynálezu větší stabilitu než druhý analyzovaný tekutý produkt, ačkoli se jejich složení jeví jako velmi podobné.

Příklad 3

Výsledky klinických studií

Klinické studie s produktem, který je předmětem předkládaného vynálezu, který je také nazýván jako IVIG, SSI, jsou prováděny ve shodě se směrnicemi ICH a CPMP/388/95.

Byly vyšetřovány farmakokinetika, účinek a bezpečnost. Klinické studie dosud zahrnovaly čtyři skupiny pacientů: pacienty se syndromem primární imunodeficience (15 pacientů), pacienty se syndromem sekundární imunodefícience (6 pacientů), pacienty s idiopatickou trombocytopenickou purpurou (15 pacientů) a pacienty s chronickou zánětlivou demyelinizační polyneuropatií (5 pacientů).

Pacienti se syndromem primární a sekundární imunodefícience byli léčeni 0,2-0,4 g/kg s intervalem 2-5 týdnů. Pacienti s idiopatickou trombocytopenickou purpurou byli léčeni 400 mg/kg za den po dobu 5 dnů nebo 1000 mg/kg za den po dobu 2 dnů.

Jako parametry bezpečnosti byly stanoveny u všech pacientů sérové transaminázy, sérový kreatinin a virové markéry. U pěti pacientů s idiopatickou trombocytopenickou purpurou byly po dobu 24 měsíců sledovány virové markéry a markéry poškození ledvin jater.

-19CZ 297199 B6

Farmakokinetika

Ti/2 byl změřen na 30,5 dne (medián). To je ve shodě s výsledky dalších IVIG léků.

Účinek

U pacientů se syndromem primární a sekundární imunodefícience byly registrovány retrospektivně pro 6-měsíční období, v kterém byli pacienti léčeni jinými registrovanými IVIG léky, dny nemocnosti, hospitalizace, dny na antibiotické terapii, dny s horečkou a počet zápalů plic. V následujícím 6-měsíčním období, v kterém byli pacienti léčeni tekutým imunoglobulinem SSI byly registrovány stejné parametry.

Závěrem je, že tekutý imunoglobulin SSI je stejně účinný v profylaxi/prevenci infekcí u pacientů se syndromem primární a sekundární imunodefícience jako další IVIG preparáty.

U 80 % pacientů s idiopatickou trombocytopenickou purpurou došlo ke zvýšení počtu krevních destiček z méně než 30 x 10⁹/l před léčbou tekutým imunoglobulinem SSI na více než 50 x 10⁹/l po léčbě. Zvýšení počtu krevních destiček a trvání remise u individuálního pacienta bylo v případech, kde bylo možné srovnání, stejné jako po podání stejné dávky jiných IVIG preparátů. Jeden pacient, který byl léčen IVIG poprvé byl refraktorní na testovaný lék. Taková reakce na IVIG není vzácná, a proto nepřekvapuje. Analýza detailů vzestupu krevních destiček a trvání tohoto vzestupu probíhá.

Závěrem je, že tekutý imunoglobulin SSI je stejně účinný při léčbě nízkého počtu krevních destiček u pacientů s idiopatickou trombocytopenickou purpurou jako další IVIG preparáty.

Podle kliniků a pacientů trpících chronickou zánětlivou demyelinizační polyneuropatií jsou IVIG SSI stejně účinné jako IVIG podávané před klinickou studií. IVIG SSI byly pacienty tolerovány stejně dobře jako byly tolerovány další IVIG produkty.

Bezpečnost

Kromě jedné závažné nežádoucí události, splenektomie, která byla posouzena výzkumným pracovníkem, že nemá vztah k testovanému léku, byly registrovány pouze mírné nežádoucí účinky. Těmito nežádoucího účinky byly hlavně bolesti hlavy, horečka a zvracení. Dosud nebyly popsány během infuzní léčby IVIG SSI abnormální vitální znaky. Nebyla registrována žádná virová serokonverze. Nebylo hlášeno žádné poškození ledvin nebo jater, ani případy anafylaktického šoku.

Klinické studie prokázaly, že tekutý IVIG SSI je dobře tolerován. Častost vedlejších účinků, stupeň a jejich typ se nelišily od zkušenosti s jinými IVIG preparátů.

Příklad 4

Výsledky stabilitní studie pro tekutý IVIG

Za účelem testování, zdali tekutý IVIG preparát je stabilní po delší dobu, byla provedena studie na stabilitu tohoto preparátu za reálných podmínek v reálném čase. Ve studii byl použit celkový počet čtyř po sobě jdoucích šarží IVIG produktu (250 ml v každém vzorku), které byly skladovány při teplotě 2 °C - 8 °C po dobu alespoň 12 měsíců. Vzorky ze čtyř šarží byly analyzovány v čase 0, po 6 měsících skladování a po 12 měsících skladování. Výsledky studie jsou uvedeny níže jako průměry ze čtyř šarží.

-20CZ 297199 B6

	0 měsíců skladování	6 měsíců skladování	12 měsíců skladování
Vzhled	mírně opalescentní a bezbarvý	mírně opalescentní a bezbarvý	mírně opalescentní a bezbarvý
Obsah monomerů + dimerů	100%	99,6 %	99,5 %
polymery + agregáty	méně než 0,1 %	méně než 0,1 %	méně než 0,1 %
ACA	39,7 %	38,2 %	37,3 %
PAK	méně než 8,5 IE/ml	méně než 8,5 IE/ml	méně než 8,5 IE/ml
Fc funkce	107 %	113 %	111 %
Rozložení podtříd
IgGl	59,2 %	57,7 %	57,1 %
lgG2	36,4 %	38,1 %	38,6 %
IgG3	2,7 %	2,6 %	2,5 %
IgG4	1,8 %	1,6 %	1,7 %
PH	5,5	5,5	5,5
Složení bílkovin (% IgG)	99,8 %	99,7 %	99,1 %
Celková koncentrace bílkovin	48,8 g/1	48,3 g/1	49,2 g/1
Osmolalita	348 mOsm/kg	347 mOsm/kg	350 mOsm/kg

Všechny výše zmíněné testy byly provedeny ve shodě s Evropským Lékopisem, jak je uvedeno v příkladu 2.

Pozorování, že obsah monomerů a dimerů je konstantní po dobu 12 měsíců ukazuje, že ve vzorku nevznikají polymery. O přítomnosti imunoglobulinových polymerů je známo, že mimo jiné způsobují závažné nežádoucí účinky, často příznaky podobné chřipce. Kvůli velmi vysoké stabilitě imunoglobulinového produktu získaného postupem, který je předmětem vynálezu, neobsahuje produkt prakticky žádné polymery a agregáty dokonce ani po delší době skladování.

Po dobu sledování nebylo pozorováno zvýšení ACA, ačkoli do této stabilitní studie byly úmyslně zahrnuty šarže se spíše vyšší ACA. Pokud bylo pozorováno zvýšení ACA, může to ukazovat, že během skladování došlo k vytvoření agregátů. Proto konstantní ACA po dobu sledování ukazuje, že nedošlo k tvorbě žádných agregátů.

Výsledky dále ukazují, že během sledování produktu nedošlo k rozvoji prokalikreinové aktivity, protože se PAK aktivita nezvýšila. Mělo by však být poznamenáno, že změřené hodnoty jsou pod hladinou kvantitativní detekce.

Parametr Fc funkce ukazuje, že během skladování je zachována přítomnost intaktních funkčních IgG. Z tohoto důvodu nejsou ve vzorcích přítomny proteázy, protože proteázy by degradovaly bílkoviny a tím snížily Fc funkci. K denaturaci IgG molekul nedošlo, protože denaturace by snížila aktivitu vázat antigen.

Jak bude zřejmé osobě znalé oboru, mohou existovat rozdíly ve stabilitě různých podtříd IgG. Jak může být patrné z předložených výsledků, jsou během skladování zachovány všechny podtřídy, což ukazuje na to, že produkt je stabilní. To je dále podpořeno nálezem, že bílkovinné složení IgG ve vzorcích s přibližně stejnou koncentrací celkové bílkoviny je téměř nezměněno po dobu sledování, což ukazuje, že nedochází k degradaci IgG. To znamená, že produkt, který je předmětem předkládaného vynálezu je stabilní a může být skladován po dobu alespoň 12 měsíců při teplotě 2-8 °C bez významných změn charakteristik, a tímto je demonstrována účinnost a bezpečnost.

-21 CZ 297199 B6

Příklad 5

Validované kroky snižující přítomnost viru v předkládaném postupu přípravy IVIG

Odstranění viru oddělovacím krokem

Precipitace viru přítomného v imunoglobulinovém roztoku polyethylen glykolem.

Validační studie na přítomnost viru byly provedeny za použití dvou neobalených virů a bylo získáno následující snížení přítomnosti viru:

odstranění 6,3 logio viru hepatitidy A (HAV), odstranění 7,2 logio viru poliomyelitidy.

Validační studie na přítomnost viru byly provedeny za použití dvou obalených virů a bylo získáno následující snížení přítomnosti viru:

odstranění 7,6 logio viru HIV, odstranění 7,5 log₁₀ viru BVDV.

Inaktivace viru postupem S/D

Reakce imunoglobulinového roztoku s 1% roztokem Tween 80 + 0,3 % TNBP, při teplotě 25 °C po dobu delší než 6 hodin.

Validační studie na přítomnost viru byly provedeny za použití čtyř obalených virů a bylo získáno následující snížení přítomnosti viru:

inaktivace 7,4 logio viru HIV, inaktivace 5,3 logio viru Sindbis, inaktivace 4,1 logio viru BVDV, inaktivace 5,1 logio viru PRV.

Celkem 8 validačních studií bylo provedeno na dvou různých krocích postupu, který je předmětem předkládaného postupu. PEG precipitační krok byl validován jako krok odstraňující viry za použití 4 různých virů, dvou malých neobalených virů, viru HAV a viru poliomyelitidy, a dvou obalených virů. Viru BVDV a viru hepatitidy C. Tyto studie prokázaly, že všechny čtyři viry byly účinně odstraněny PEG precipitací. PEG precipitační krok je proto validován jako krok účinně odstraňující viry. S/D postup byl validován za použití 4 různých obalených virů. Z výsledků validačních studií je zřejmé, že S/D postup účinně inaktivuje všechny čtyři viry. S/D postup je proto validován jako krok účinně inaktivující viry. U obou kroků snižujících přítomnost virů v postupu přípravy IVIG, tedy odstranění PEG precipitací a inaktivace S/D postupem, bylo prokázáno, že každý účinně odstraňuje a inaktivuje čtyři různé viry. Kumulativní faktory snížení přítomnosti viru HIV a BVDV během postupu jsou 15, respektive 11,6. Tímto může být předkládaný postup považován za bezpečný z hlediska přítomnosti virů.

Claims

1. Způsob purifíkace imunoglobulinů G z hrubé frakce plazmatických bílkovin obsahujících imunoglobuliny, vyznačující se tím, že

a) připraví vodná suspenze hrubé frakce plazmatických bílkovin obsahujících imunoglobuliny;

b) do suspenze připravené v kroku (a) se přidá ve vodě rozpustná precipitační látka, která nezpůsobuje významnější denaturaci bílkovin, v množství dostatečném pro vyvolání precipitace velké části bílkovin nepatřících k imunoglobulinů G, agregovaných imunoglobulinů a částic zahrnujících potenciálně infekční částice, jakými jsou například virové částice, bez toho, že by došlo k významnější precipitaci monomemího imunoglobulinů G, čímž se vytvoří směs pevného precipitátu a tekutého supematantů;

c) ze směsi získané v kroku (b) se získá přečištěný supematant obsahující imunoglobulin G;

d) přečištěný supematant obsahující imunoglobulin G z kroku (c) se nanese na anexovou pryskyřici a následně na katexovou pryskyřici, přičemž anexová a katexová pryskyřice jsou zapojeny do série, pufr použitý pro anexovou i katexovou chromatografíí je stejný, a pH pufru je nižší než 6,0;

e) bílkovinné kontaminující látky a bílkovinný precipitát se eluuje zkatexové pryskyřice z kroku (d) pomocí pufru majícího pH a iontovou sílu dostatečnou pro odstranění kontaminujících látek z pryskyřice bez způsobení významnější eluce imunoglobulinů G;

f) imunoglobulin G se z katexové pryskyřice z kroku (e) eluuje pomocí významněji nedenaturujícího pufru majícího pH a iontovou sílu dostatečnou pro vyvolání účinné eluce imunoglobulinu G, čímž se získá eluát obsahující imunoglobulin G;

g) eluát obsahující imunoglobulin G z kroku (f) se podrobí dia/ultrafíltraci, čímž se eluát zahustí a/nebo dialyzuje, a případně se přidá stabilizační činidlo;

h) do dia/ultrafiltrované a případně stabilizované frakce z kroku (g) obsahující imunoglobulin G se přidá viricidní množství látky inaktivující viry, čímž se získá roztok obsahující imunoglobulin G, který je velmi odolný proti virům;

i) roztok obsahující imunoglobulin G z kroku (h) se aplikuje na anexovou a následně na katexovou pryskyřici;

j) katexová pryskyřice z kroku (i) se eluuje pomocí pufru majícího pH a iontovou sílu dostatečné pro vymytí bílkovinných kontaminujících látek a látky inaktivnější viry z pryskyřice bez způsobení významnější eluce imunoglobulinů G;

k) imunoglobulin G se z katexové pryskyřice z kroku (j) eluuje pomocí nevýznamně denaturujícího pufru majícího pH a iontovou sílu dostatečné pro způsobení účinné eluce imunoglobulinu G za vzniku eluátu obsahujícího imunoglobulinů G; a

l) eluát z kroku (k) se podrobí dia/ultrafíltraci, který sníží iontovou sílu a zahustí imunoglobulinu G v roztoku, a přidáním sacharidu se upraví osmolalita.

-23 CZ 297199 B6

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se frakce plazmatických bílkovin obsahující imunoglobulin G zvolí ze skupiny tvořené Cohnovou frakcí II; Cohnovými frakcemi II a III; a Cohnovými frakcemi I, II a III.

3. Způsob podle nároků la 2, vyznačující se tím, že se suspenze v kroku (a) udržuje při teplotě od 0 °C do 12 °C a suspenze v kroku (a) se udržuje při pH hodnotě nižší než 6,0.

4. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 3,vyznačující se tím, že se bílkovinná precipitační látka v kroku (b) zvolí ze skupiny tvořené polyethylenglykolem, kyselinou kaprylovou a síranem amonným.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se bílkovinná precipitační látka zvolí ze skupiny tvořené polyethylenglykolem, jehož molekulová hmotnost se pohybuje v rozmezí od 3000 do 8000.

6. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 5,vyznačující se tím, že anexová a katexová pryskyřice v kroku (i) jsou zapojeny do série.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že použitý pufr pro anexovou a katexovou chromatografií je stejný a pH uvedeného pufru je nižší než 6,0.

8. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že anexová pryskyřice v kroku (d) a/nebo kroku (i) obsahuje diethylaminoethylové skupiny a/nebo katexová pryskyřice v kroku (d) a/nebo kroku (i) obsahuje karboxymethylové skupiny.

9. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že pufrem použitým v krocích (b) až (1) je acetátový pufr, například acetátový pufr s pH 5,0 až 6,0 mající molaritu 5 mM až 25 mM.

10. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že látkou inaktivující viry v kroku (h) je směs alespoň jednoho neiontového nebo iontového detergentu a alespoň jednoho rozpouštědla.

11. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že látkou inaktivující viry v kroku (h) je směs alespoň jednoho nevýznamně denaturujícího detergentu a alespoň jednoho tri(nižší alkyl)fosfátového rozpouštědla.

12. Imunoglobulinový produkt připravítelný způsobem podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 11.

13. Imunoglobulinový produkt připravitelný způsobem podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8.

14. Imunoglobulinový produkt mající následující charakteristiky:

a) čistota vyšší než 98 %,

b) obsah IgG monomerů a dimerů vyšší než 98,5 %,

c) obsah IgA nižší než 4 mg IgA/1, a

d) obsah IgG 1, IgG2, IgG3 a IgG4.

15. Imunoglobulinový produkt podle nároku 14 prostý detergentu, polyethylenglykolu nebo albuminu jako stabilizátoru.

-24CZ 297199 B6

16. Imunoglobulinový produkt podle nároku 14 nebo 15, který obsahuje méně než 3 mg/1 IgA.

17. Imunoglobulinový produkt podle kteréhokoliv znároků 14 až 16, který obsahuje 55 % až 65 % IgGl, 30 % až 40 % IgG2, 2 % až 5 % IgG3 a 1 % a 4 % IgG4.

18. Imunoglobulinový produkt podle kteréhokoliv znároků 14 až 17, který obsahuje méně než 0,5 % polymerů a agregátů.

19. Imunoglobulinový produkt podle kteréhokoliv znároků 14 až 18, kterým je kapalný produkt.

20. Imunoglobulinový produkt podle kteréhokoliv z nároků 14 až 19 pro okamžité intravenózní podání.

21. Imunoglobulinový produkt podle kteréhokoliv z nároků 14 až 20 pro použití v medicíně.

22. Použití imunoglobulinového produktu podle kteréhokoliv znároků 14 až 21 pro přípravu léku pro léčbu savce s PID (primární imunodefícienci), SID (sekundární imunodeficienci), ITP (idiopatickou trombocytopenickou purpurou), polyradikulitidou, periferní polyneuropatií, Kawasakiho nemocí, polymyositidou, závažnými chronickými autoimunními onemocněními, chronickými zánětlivými demyelinizačními polyneuropatiemi (CIDP), multifokální motorickou neuropatií, roztroušenou sklerózou, myasténií gravis, Eaton-Lambertovým syndromem, neuritidou optiku, epilepsií, habituálními potraty, primárním antifosfolipidovým syndromem, revmatoidní artritidou, systémovým lupus erytematosus, systémovou sklerodermií, vaskulitidou, Wagenerovou granulomatózou, Sjogrenovým syndromem, juvenilní revmatoidní artritidou, autoimunní neutropenií, autoimunní hemolytickou anémií, neutropenií, Crohnovou chorobou, ulcerózní kolitidou, coeliakií, astmatem, syndromem septického šoku, chronickým únavovým syndromem, psoriázou, syndromem toxického šoku, diabetem, sinusitidou, dilatační kardiomyopatií, endokarditidou, aterosklerózou, a léčbu dospělých jedinců s AIDS a bakteriálními infekcemi.

23. Použití podle nároku 22, kde savcem je člověk.