SK288128B6 - Process for purifying immunoglobulin G (IgG), liquid immunoglobulin product and use thereof for the preparation of a medicament - Google Patents

Abstract

A process for purifying immunoglobulin G (IgG), from a crude plasma protein fraction, which comprises preparing IgG supernatant by precipitating of a high portion of non-IgG proteins, filtering the supernatant by means of an anion exchange resin and a cation exchange resin connected in series, washing out protein contaminants and eluting IgG, performing a dia/ultrafiltration on the IgG-containing eluate, inactivating viruses in the eluate, performing further filtration of the eluate by means of an anion exchange resin and subsequently a cation exchange resin, eluting contaminants and subsequently eluting IgG and performing dia/ultrafiltration on the resulting eluate for concentrating IgG until the conductivity is less then or equal to 1 mS/cm, wherein all steps are performed by using suitable buffers and without denaturating any of the components. In addition, disclosed is a liquid IgG product having a purity of more than 98 %, a content of IgG monomers and dimmers of more than 98.5 %, a content of IgA of less than 6 mg IgA/l, and containing IgG1, IgG2, IgG3 a IgG4, wherein the IgG concentration is 1 to 20 % by weight. Also, proposed is a use of that product for the preparation of a medicament for the treatment of mammals including humans suffering from primary or secondary immune deficiency as well as from other diseases.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka spôsobu purifikácie imunoglobulínu G (IgG) z natívnej plazmy alebo z hrubej frakcie plazmatických proteínov. Vynález sa tiež týka kvapalného imunoglobulínového produktu a jeho použitia na lekárske účely.

Doterajší stav techniky

Ľudský normálny imunoglobulín na použitie v prevencii a liečbe infekčných ochorení bol zavedený ku koncu štyridsiatych rokov dvadsiateho storočia. Bolo preukázané, že ľudský normálny imunoglobulín pripravený spôsobom studenej etanolovej frakcionácie podľa Cohna a Oncleyho (Cohn E., et al., (1946), J Am Chem Soc, 71, 541 - 550) a následne tiež modifikáciou podľa Kistlera a Nitschmanna (Kistler P a Nitschmann HS (1952), Vox Sang, 7, 414 - 424) je účinný, ako aj bezpečný proti prenosu vírusovej infekcie, pokiaľ je podaný subkutánne alebo intramuskuláme.

Kongenitálne alebo získané celkové alebo čiastočné chýbanie imunoglobínov (primárny respektíve sekundárny syndróm imunodeficiencie) sa manifestujú mnohými bežnými aj závažnými infekciami, obzvlášť bakteriálneho pôvodu. Prevencie takýchto infekcií bolo predtým dosahované opakovanými intramuskulárnymi alebo subkutánnymi injekciami veľkého množstva ľudského normálneho imunoglobulínu, a to až niekoľkokrát týždne ako celoživotná liečba, ktorá je veľmi bolestivá, pokiaľ je liek podávaný intramuskuláme. Na začiatku šesťdesiatych rokov boli preto vykonané pokusy o intravenózne podanie ľudského normálneho imunoglobulínu. Klinické štúdie preukázali, že zhruba 5 % zdravých dobrovoľníkov a zhruba u 95 % pacientov s deficienciou imunoglobulínov dôjde k rozvoju okamžitých nežiaducich účinkov od dyspnoe až k cirkulačnému šoku a tieto nežiaduce účinky mali taký závažný charakter, že intravenózne podávanie imunoglobulínu muselo byť ukončené.

Dôvodom spomínaných nežiaducich účinkov sa ukázali byť agregáty imunoglobulínov, ktoré medzi inými účinkami silno aktivovali komplementový systém. Toto bolo obzvlášť vidno u pacientov s chýbajúcimi imunoglobulínmi. Obzvlášť závažné nežiaduce účinky anafylaktického charakteru môžu byť vidno u pacientov, u ktorých dôjde k rozvoju protilátok proti IgA. Následne bol vyvinutý spôsob zabránenia tvorby agregátov a/alebo eliminácie týchto agregátov počas postupu prípravy a zhruba pred dvadsiatimi rokmi bola testovaná prvá generácia imunoglobulínov na intravenózne podanie (IVIG) a tieto imunoglobulíny boli nájdené ako vhodné na toto použitie.

Pôvodným účelom IVIG bolo zmierniť infekčné epizódy u pacientov s kongenitálnym alebo získaným celkovým či čiastočným chýbaním imunoglobulínov a ďalej eliminovať diskomfort súvisiaci s podaním ľudského normálneho imunoglobulínu. Ďalšou výhodou IVIG je, že veľké dávky imunoglobulínu môžu byť podané počas krátkeho času, a týmto spôsobom je možno získať veľmi rýchlo dostatočne vysoké koncentrácie v krvi. Obzvlášť pri liečbe závažných bakteriálnych infekcií je dôležité ustanoviť rýchlo vysoké koncentrácie v miestach prebiehajúcej infekcie.

V posledných rokoch bolo ďalej preukázané, že IVIG sú účinné pri ďalších závažných ochoreniach, ktorých liečba môže byť inak ťažká, napríklad ide o krvácania spôsobené vymiznutím krvných doštičiek na podklade imunologických mechanizmov, tzv. idiopatickú trombocytopenickú purpuru (ITP), ďalej o niektoré vzácne ochorenia, ako sú napríklad Kawasakiho syndróm a celý rad autoimúnnych ochorení, ako je napríklad polyradikulitída (Guillan Barreho syndróm). Tiež pri ďalších ochoreniach, ktoré boli do súčasnosti predmetom klinických štúdií s IVIG. Mechanizmus účinku týchto ochorení bol objasnený iba čiastočne. Predpokladá sa, že účinok sa týka takzvaných imunomodulačných vlastností IgG, napríklad blokády Fcy-receptorov na fagocytámych bunkách, zvýšeného metabolizmu IgG, zníženie tvorby cytokínov a interferencie s predpokladanou sieťou idiotypov/antiidiotypov, obzvlášť dôležitých na neutralizáciu autoimúnnej reaktivity.

Prvá generácia IVIG bola pripravená pepsínovým štiepením východiskového materiálu (Cohnova frakcia II), účelom štiepenia bolo odstránenie imunoglobulínových agregátov. V tomto postupe neboli zahrnuté žiadne kroky na báze stĺpcovej chromatografie. Produkt musel byť lyofilizovaný, aby ostal stabilný po primerane dlhý čas a bol rozpustený tesne pred použitím.

Východiskovým materiálom pre IVIG bol ľudský normálny imunoglobulín, pri ktorom bolo preukázané, že je bezpečný s ohľadom na možný prenos vírusov, pokiaľ bol tento imunoglobulín používaný na intramuskuláme injekčné podanie. IVIG bol teda považovaný za bezpečný. Po niekoľkých rokoch klinického používania však bolo IVIG produktov niektorých výrobcoch prekvapivo preukázané, že spôsobujú prenos vírusu hepatitídy C. Štúdia vykonaná na účely objasnenia osudu vírusov počas výroby ľudského normálneho imunoglobulínu preukázali, že prestup vírusu frakcionačným postupom z plazmy do frakcie s ľudským normálnym imunoglobulínom je neveľký. Bezpečnosť ľudského normálneho imunoglobulínu na intramuskuláme použitie je pravdepodobne spôsobené faktom, že obsahuje ochranné imunoglobulíny. V kombinácii s malými injekčné poddávanými objemami a intramuskulámym spôsobom podávania môžu tieto ochranné imunoglo2

SK 288128 Β6 bulíny neutralizovať bežné vírusy v plazme a robiť ich neinfekčnými. Zvlášť pokiaľ sú podávané intravenózne veľké dávky imunoglobulínov, môžu sa objaviť vírusové infekcie, ako bolo opísané na začiatku deväťdesiatych rokov. Z tohto dôvodu bolo určené, že proces výroby by mal zahŕňať jeden alebo viacej dobre definovaných krokov na inaktiváciu vírusov a/alebo na ich odstránenie.

Druhá generácia IVIG založená na nenaštiepených a nemodifikovaných molekulách imunoglobulínu s nízkou antikomplementámou aktivitou a vyššou stabilitou bola zavedená uprostred osemdesiatych rokov, ale stále vo forme lyofilizovaného produktu. Tento IVIG bol purifikovaný niekoľkými chromatografickými krokmi. Produkty tohto typu v súčasnosti dominujú na trhu s IVIG. Prvá a druhá generácia IVIG sa tak objavujú ako lyofilizované prášky, ktoré sa rozpúšťajú tesne pred použitím.

Rozpúšťanie lyofilizovaných IVIG je pomalé (do 30 minút pre jednu fľaštičku). Často musí byť rozpustené pre jedného pacienta niekoľko fľaštičiek. Pretože je pre užívateľa vysoko prioritne mať IVIG v roztoku pripraveného na použitie, boli zavedené na trh tekuté produkty. Ešte dôležitejšie je, že stále existuje potreba zlepšenia postupu výroby, aby bolo možné získať vysoko purifikovaný, stabilný a plne natívny preparát IVIG s vyššou klinickou účinnosťou menším počtom nežiaducich liekových reakcií. Je teda potrebné získať ďalej rozvinutý a vylepšený postup purifikácie IgG z natívnej plazmy alebo plazmatické proteínové frakcie na účely získania tekutého IVIG produktu bez prítomnosti vírusu. Konečne, postup by mal byť navrhnutý takým spôsobom, aby mohol byť použitý pri výrobe vo veľkom meradle.

Purifikačný postup opísaný v predkladanej prihláške vedie k tvorbe tekutého imunoglobulínového produktu na intravenózne podanie, ktorý môže byť charakterizovaný ako vysoko purifikovaná, plne natívna, biologicky aktívna, podrobená dvojitej inaktivácii vírusov a stabilná nová generácia IVIG, ktorá neobsahuje žiadny detergent, polyetylén glykol (PEG) alebo albumín ako stabilizátor.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález sa týka zlepšeného purifikačného postupu a zlepšeného tekutého imunoglobulínového produktu, ktorý, inter alia, môže byť podaný intravenózne.

Imunoglobulínový produkt získaný spôsobom, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu, môže nazývaný IVIG tretej generácie. Postup je charakterizovaný nasledujúcimi podmienkami frakcionácie: neprebieha pepsínové štiepenie, agregáty a častice sú odstránené precipitáciou (krok, ktorý bol overený, že vedie k odstráneniu vírusov), ďalší purifikácie je dosiahnuté stĺpcovou ionexovou chromatografiou, ako vírus inaktivačný krok slúži S/D postup a preparát je formulovaný ako tekutý produkt.

V dôsledku zlepšenej čistoty produktu, ktorý možno získať postupom podľa vynálezu v porovnaní s predchádzajúcimi produktmi, nie je nevyhnutné pridávať stabilizátory, ako sú neiónové detergenty, PEG alebo albumín, pre vylúčenie agregácie IgG počas skladovaní IVIG ako tekutého produktu. Produkt, ktorý možno získať postupom podľa vynálezu, má vyššiu kvalitu ako produkty získané predchádzajúcimi postupmi a poskytuje lepšie klinické účinky a nechtiace nežiaduce účinky sa skutočne nevyskytujú.

Prvým aspektom predmetu vynálezu podľa hlavného uskutočnenia i) je spôsob purifikácie imunoglobulínu G (IgG) z hrubej frakcie plazmatických bielkovín obsahujúcich imunoglobulíny, ktorý zahŕňa kroky:

a) prípravu vodnej suspenzie hrubej frakcie plazmatických bielkovín obsahujúcich imunoglobulíny;

b) pridanie vo vode rozpustnej precipitačnej látky, ktorá významnejšie nespôsobuje denaturáciu bielkovín, k spomínanej suspenzii z kroku (a) v množstve dostatočnom na vyvolanie precipitácie veľkej časti bielkovín nepatriacich k imunoglobulínu G, agregovaných imunoglobulínov a častíc zahrajúcich vírusové častice bez spôsobenia významnejšie precipitácie monomémeho imunoglobulínu G, čím dochádza k tvorbe zmesi pevného precipitátu a tekutého supematantu;

c) získanie prečisteného supematantu obsahujúceho imunoglobulín G zo zmesi z kroku (b);

d) aplikáciu prečisteného supematantu obsahujúceho imunoglobulín G z kroku (c) na anexovú živicu a následne na katexovú živicu, kde anexová a katexová živica sú zapojené do série, použitý pufer pre anexovú aj katexovú chromatografiu je rovnaký, a pH spomínaného pufra je pod 6,0;

e) vymytie bielkovinových kontaminujúcich látok a bielkovinového precipitátu z katexovej živice z kroku (d) pomocou pufra majúceho pH a iónovú silu dostatočnú na odstránenie kontaminujúcich látok zo živice bez spôsobenia významnejšej elúcie imunoglobulínu G;

f) elúciu imunoglobulínu G z katexovej živice z kroku (e) pomocou významnejšie nedenaturujúceho pufra majúceho pH a iónovú silu dostatočnú na spôsobenie účinnej elúcie imunoglobulínu G, čím dochádza k získaniu eluátu, ktorý obsahuje imunoglobulín G;

g) prevedenie dia/ultrafiltrácie eluátu obsahujúceho imunoglobulín G z kroku f) na účely koncentrácie a/alebo dialýzy eluátu, a prípadné pridanie stabilizačnej látky;

h) pridanie virucídneho množstva látky inaktivujúcej vírusy k dia/ultrafiltrovanej a prípadne stabilizovanej frakcii z kroku g) za získania roztoku obsahujúceho imunoglobulín G, ktorý je významne bezpečný s ohľadom na prítomnosť vírusov;

i) aplikáciu roztoku obsahujúceho imunoglobulín G z kroku h) na anexovú a následne na katexovú živicu;

j) premytie katexovej živice z kroku i) pomocou pufra majúceho pH a iónovú silu dostatočnú na vymytie bielkovinových kontaminujúcich látok a látky inaktivujúcej vírusy zo živice bez spôsobenia významnejšej elúcie imunoglobulínu G;

k) elúciu imunoglobulínu G z katexovej živice z kroku j) pomocou významnejšie nedenaturujúceho pufra majúceho pH a iónovú silu dostatočnú účinnú elúciu imunoglobulínu G, za získania eluátu obsahujúceho imunoglobulín G; a

l) podrobenie eluátu obsahujúceho imunoglobulín G z kroku k) dia/ultrafiltrácii na účely zníženia iónovej sily a zakoncentrovanie imunoglobulínu G v roztoku, až na dosiahnutie vodivosti menšej alebo rovnajúcej sa 1 mS/cm.

Prednostné uskutočnenia tohto aspektu predmetu vynálezu zahrnujú predovšetkým ii) spôsob podľa uskutočnenia i), pri ktorom je frakcia plazmatických bielkovín obsahujúca imunoglobulín G vybraná zo skupiny tvorenej Cohnovou frakciou II; Cohnovými frakciami II a III; a Cohnovými frakciami I, II a III;

iii) spôsob podľa uskutočnenia i) alebo ii), pri ktorom je suspenzia v kroku (a) udržiavaná pri teplote od 0 °C do 12° C a pH pod 6,0;

iv) spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich uskutočnení, pri ktorom je bielkovinná precipitačná látka v kroku (b) vybraná zo skupiny tvorenej polyetylénglykolom (PEG), kyselinou kaprylovou a síranom amónnym;

v) spôsob podľa uskutočnenia iv), pri ktorom je bielkovinová precipitačná látka vybraná zo skupiny tvorenej PEG v rozmedzí molekulových hmotností 3000 až 8000 Da;

vi) spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich uskutočnení, pri ktorom sú anexová a katexová živica v kroku (i) zapojené do série;

vii) spôsob podľa uskutočnenia vi), pri ktorom je použitý pufer pre anexovú a katexovú chromatografiu rovnaký a pH tohto rovnakého pufra je pod 6,0;

viii) spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich uskutočnení, pri ktorom anexová živica v kroku (d) a/alebo kroku (i) obsahuje dietylaminoetylskupiny a/alebo katexová živica v kroku (d) a/alebo kroku (i) obsahuje karboxymetylové skupiny a živicami sú prednostne DEAE Sepharose FF a CM Sepharose FF;

ix) spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich uskutočnení, pri ktorom je použitý pufer v krokoch (b) až (1) acetátový pufer;

x) spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich uskutočnení, pri ktorom je látka inaktivujúca vírusy v kroku (h) zmesou aspoň jedného neiónového alebo iónového detergentu a aspoň jedného rozpúšťadla;

xi) spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich uskutočnení, pri ktorom je látka inaktivujúca vírusy v kroku (h) zmesou aspoň jedného významnejšie nedenaturujúceho detergentu a tri(n-butyl)fosfátového rozpúšťadla;

xii) spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich uskutočnení, pri ktorom sa v kroku a) vodná suspenzia hrubej frakcie plazmatických bielkovín obsahujúcich imunoglobulín pripraví tak, že koncentrácia IgG vo vodnej suspenzii je aspoň 4 g/1, pH suspenzie obsahujúcej imunoglobulín leží v rozmedzí 5,1 až 5,7 a suspenzia obsahujúca imunoglobulín sa ďalej filtruje pomocou hĺbkovej filtrácie; a v kroku b) uvedená rozpustná, v podstate bielkoviny nedenaturujúca precipitačná látka zvolí zo súboru zahrnujúceho PEG 3350, PEG 4000 alebo PEG 6000 a je pridaná v koncentrácii v rozmedzí 4 až 10 % hmotn. a inkubovaná počas 2 až 12 hodín pri teplote medzi 2 a 8 °C; a v kroku c) sa prečistený supernatant hĺbkovo filtruje na odstránenie väčších častíc a agregátov; a v kroku d) je uvedenou anexovou živicou živica DEAE Sepharose Fast Flow (DEAE) a uvedenou katexovou živicou je CM Sepharose Fast Flow (CM), pH uvedeného pufra je v rozmedzí 5,4 až 5,9 a vodivosť je v rozmedzí 1,0 až 1,4 mS/cm, pričom stĺpce DEAE a CM sa premyjú jedným objemom stĺpca premývacieho pufra a potom odpoja; a v kroku e) má pufer pH medzi 5,2 až 5,8; a v kroku f) sa elúcia uskutočňuje ako gradientový elučný stupeň od 125 mM do 350 mM chloridu sodného pri pH v rozmedzí 5,2 až 5,8; a v kroku g) sa eluát zo stupňa f) obsahujúci imunoglobulín G dia/ultrafiltruje na účely zahustenia a/alebo sa eluát dialyzuje na dosiahnutie zníženia vodivosti ultrafiltrovaného roztoku na hodnotu nižšiu ako 1,3 mS/cm, pričom pH sa udržiava v rozmedzí 4,0 až 6,0 a prípadne sa pridá stabilizujúce činidlo;

xiii) spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich uskutočnení, ktorý ďalej zahrnuje pridanie stabilizátora;

xiv) spôsob podľa uskutočnenia xiii), pri ktorom sa pridajú alkoholické cukry, cukry, aminokyseliny alebo organické činidlá;

Ďalším aspektom predmetu vynálezu v hlavnom uskutočnení xv) je kvapalný imunoglobulínový produkt majúci nasledujúce charakteristiky:

a) čistotu viacej ako 98 %,

b) obsah IgG monomérov a dimérov vyšší ako 98,5 %,

SK 288128 Β6

c) obsah IgA menší ako 6 mg IgA/1, a

d) obsah IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4, pričom koncentrácia IgG je 1 až 20 % hmotn.

Prednostné uskutočnenia tohto aspekt vynálezu zahŕňajú predovšetkým xvi) imunoglobulínový produkt podľa uskutočnenia xv), kde koncentrácia IgG je rovná 5, 10, 12, 14, 16, 18 alebo 20 % hmotn.;

xvii) imunoglobulínový produkt podľa niektorého z uskutočnení xv) alebo xvi), ktorý neobsahuje albumín ako stabilizátor;

xviii) imunoglobulínový produkt podľa niektorého z uskutočnení xv) až xvii) majúci vodivosť menšiu ako 1 mS/cm;

xix) imunoglobulínový produkt podľa niektorého z uskutočnení xv) až xviii), ktorý neobsahuje detergent, PEG alebo albumín ako stabilizačnú látku;

xx) imunoglobulínový produkt podľa niektorého z uskutočnení xv) až xix), ktorý obsahuje menej ako 4 mg/1 IgA;

xxi) imunoglobulínový produkt podľa niektorého z uskutočnení xv) až xx), ktorý obsahuje menej ako 3 mg/1 IgA;

xxii) imunoglobulínový produkt podľa niektorého z uskutočnení xv) až xxi), ktorý obsahuje medzi 55 a 65 % IgGl, medzi 30 a 40 % IgG2, medzi 2 a 5 % IgG3 a medzi 1 a 4 % IgG4;

xxiii) imunoglobulínový produkt podľa niektorého z uskutočnení xv) až xxii), ktorý obsahuje menej ako 1,5 % polymérov a agregátov;

xxiv) imunoglobulínový produkt podľa niektorého z uskutočnení xv) až xxiii), ktorý obsahuje menej ako 0,5 % polymérov a agregátov;

xxv) imunoglobulínový produkt podľa niektorého z uskutočnení xv) až xxiv) na okamžité intravenózne podanie;

xxvi) imunoglobulínový produkt podľa niektorého z uskutočnení xv) až xxv) na použitie v medicíne.

Konečne ešte ďalším aspektom predmetu vynálezu (uskutočnenie xxvii)) je použitie imunoglobulínového produktu podľa niektorého z uskutočnení xv) až xxvi) na prípravu lieku na liečbu cicavcov s PID (primárnou imunodeficienciou), SID (sekundárnou imunodeficienciou, ITP (idiopatickou trombocytopenickou purpurou, polyradikulitídou, periférnou polyneuropatiou, Kawasakiho chorobou, polymyositídou, závažnými chronickými autoimúnnymi ochoreniami, chronickými zápalovými demyelizačnými polyneuropatiami (CIDP), multifokálnou motorickou neuropatiou, roztrúsenou sklerózou, myasténiou gravis, Eaton-Lambertovým syndrómom, neuritídou optiku, epilepsiou, habiťuálnymi potratmi, primárnym antifosfolipidovým syndrómom, reumatoidnou artritídou, systémovým lupus, erytematózus, systémovou sklerodermiou, vaskulitídou, Wegenerovou granulomatózou, Sjógrenovým syndrómom, juvenilnou reumatoidnou artritídou, autoimúnnou neutropéniou, autoimúnnou anémiou, neutropéniou, Crohnovou chorobou, ulceróznou kolitídou, coeliakiou, astmou, syndrómom septického šoku, chronickým únavovým syndrómom, psoriázou, syndrómom toxického šoku, diabetom, sínusitídou, dilatačnou kardiomyopatiou, endokarditídou, aterosklerózou, a liečbu dospelých jedincov s AIDS a bakteriálnymi infekciami.

V uskutočnení vynálezu xxviii) je pri tomto použití cicavcom človek.

V ďalšom opise je vynález príležitostne objasňovaný v širšom kontexte ako zodpovedá rozsahu, ktorý je skutočne predmetom tohto vynálezu. Výslovne sa preto uvádza, že do rozsahu vynálezu patria len aspekty a uskutočnenia vynálezu i) až xxviii) explicitne uvedené skôr, a iba tie sú tiež predmetom pripojených patentových nárokov. Nasledujúci opis má len ilustratívny význam.

Východiskový materiál predkladaného purifikačného postupu môže byť natívnou plazmou, ale je výhodne hrubou frakciou plazmatických proteínov obsahujúcich imunoglobulín. Východiskovým materiálom pre purifikačný postup môže byť normálna ľudská plazma, alebo môže tento materiál pochádzať od darcov s vysokými titrami špecifických protilátok, ide napríklad o hyperimúnne plazmy. Predkladaná špecifikácia, termín „plazmatická frakcia obsahujúca imunoglobulín“ zahŕňa všetky možné východiskové materiály pre predkladaný postup, napríklad kryoprecipitátu zbavenú plazmu, alebo kryoprecipitátu zbavenú plazmu, z ktorej boli odstránené rôzne plazmatické proteíny, ako sú napríklad Faktor IX a antitrombín, rôzne Cohnove frakcie a frakcie získané precipitačnými postupmi s použitím PEG (Polson et al., (1964), Biochem Biophys Acta, 82, 463 - 475; Polson a Ruiz-Bravo, (1972) Vox Sang, 23, 107 - 118) alebo s použitím síranu amónneho. V prednostnej forme vynálezu sú plazmatickou proteínovou frakciou Cohnove frakcie I, II a III, ale tiež môžu byť použité Cohnove frakcie I, II a III. Rôzne Cohnove frakcie sú prednostne pripravené z plazmy s použitím štandardnej Cohnovej fŕakcionácie modifikovanej Kistler-Nitschmannom. Cohnove frakcie obsahujú navyše k imunoglobulínom napríklad fibrinogén, a-globulíny a β-globulíny vrátane rôznych lipoproteínov, ktoré by mali byť prednostne odstránené následným purifikačným postupom. Filtrácia môže aj nemusí byť použitá v závislosti od izolačného postupu použitom na získanie Cohnových frakcií (t. j. centrifugácia alebo filtrácia).

Prvý krok postupu, ktorý je predmetom vynálezu, zahŕňa prípravu vodnej suspenzie frakcie plazmatic5

SK 288128 Β6 kých proteínov obsahujúcich imunoglobulín, kde koncentrácia IgG v suspenzii je dostatočne vysoká, a tak počas následného precipitačného kroku precipituje hlavná časť non. IgG proteínov, zvlášť tie s vysokou molekulovou váhou, ďalej agregované imunoglobulíny a ďalšie agregované proteíny, rovnako tak ako potenciálne infekčné častice, a to bezvýznamné precipitácie mnomémych IgG. Tento efektu je všeobecne dosiahnutý, pokiaľ koncentrácia IgG v pufrovanej a sfiltrovanej suspenzii je aspoň 4 g/1 pred pridaním precipitačnej látky. Malo by byť brané do úvahy, že vplyv koncentrácie bielkovín, rovnako tak ako pH a teplota suspenzie na precipitáciu závisí od typu zvolenej precipitačnej látky.

Je preferované, aby frakcia plazmatických proteínov bola suspendovaná vo vode a/alebo v pufre pri významne nedenaturujúcej teplote a pH. Termín „významne nedenaturujúci“ značí, že nedochádza k významnej ireverzibilnej strate funkčnej aktivity IgG molekúl, napríklad ku strate antigén väzobnej aktivity a/alebo strate biologickej Fc-fúnkcie (pozri príklad 2).

Frakcia plazmatických proteínov je suspendovaná vo vode s aspoň jedným nedenaturačným pufrovým systémom v objemoch od 6 do 9, prednostne od 7 do 8, násobku frakcie plazmatických proteínov. Hodnota pH suspenzie obsahujúci imunoglobulíny je prednostne udržovaná pod 6, ako napríklad v rozmedzí od 4,0 až do 6,0, prednostne 5,1 až 5,7, najprednostnejšie okolo 5,4, aby došlo k zaisteniu optimálnej rozpustnosti imunoglobulínu a na zaistenie optimálneho efektu následného PEG precipitačného kroku. Môže byť použitý vhodný kyslý pufer, ale pufrový systém prednostne obsahuje aspoň jeden z nasledujúcich pufrov a kyselín: fosforečnan sodný, octan sodný, kyselina octová, HC1. Osoby poznajúci odbor ocenia, že môžu byť použité aj iné početné pufre.

Imunoglobulínová suspenzia je prednostne udržovaná pri studenej teplote, inter alia aby došlo k zabráneniu významnej denaturácii proteínov a minimalizácii aktivity proteáz. Imunoglobulínová suspenzia a voda, rovnako tak ako pridaný pufrový systém majú prednostne rovnakú teplotu v rozmedzí 0-12 °C, prednostne 0 - 8 °C, najprednostnejšie 1 - 4 °C.

Suspenzia etanolom precipitovanej pasty obsahuje relatívne veľké množstvá agregovaného proteínového materiálu. Suspenzia obsahujúca imunoglobulín je voliteľne sfiltrovaná na účely odstránenia napríklad veľkých agregátov, filtračných prostriedkov, pokiaľ sú prítomné a reziduálnu nerozpustenú pastu. Filtrácia je prednostne prevedená pomocou hĺbkových filtrov, napríklad C150AF, AF 2000 alebo AF 1000 (Schenk), 30LA (Cuno), alebo podobné filtre. Odstránenie veľkých agregátov, filtračných prostriedkov, pokiaľ sú prítomné, a reziduálne nerozpustené pasty môže byť prevedené tiež centrifúgáciou.

Aspoň jedna vo vode rozpustná významne nedenaturujúca precipitačná látka je pridaná k sfiltrovanej suspenzii obsahujúcej imunoglobulín v množstve dostatočnom na vyvolanie precipitácie veľkej časti vysoko molekulárnych proteínov, lipoproteínov, agregovaných proteínov, medzi nimi aj agregovaných imunoglobulínov. Iný partikulámy materiál, ako sú napríklad potenciálne infekčné častice, napríklad vírusové častice, sú tiež precipitované bez spôsobenia významnej precipitácie monomémeho IgG. Termín „infekčná častica“ v predkladanom kontexte zahŕňa napríklad vírové častice (ako sú napríklad vírusy hepatitídy, HIV 1 a HIV 2) a baktérie.

Významne nedenaturujúci, vo vode rozpustné proteíny precipitujúcej látky sú dobre známe v oblasti proteínovej purifikácie. Také precipitačné látky sú používané na frakcionáciu bielkovín, ktorá vedie k čiastočnej purifikácii proteínov zo suspenzií. Vhodné látky precipitujúcej bielkoviny na použitie v postupe, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu, zahŕňajú formy PEG s rôznou molekulovou váhou, kyselinu kaprylovú a síran amónny. Osoby poznajúce odbor ocenia, ako alternatívne prostriedky precipitácie môžu byť použité niektoré iné nedenaturačné vo vode rozpustné precipitačné látky. Termín „pridanie látky precipitujúcej bielkoviny“ a varianty tohto termínu zahŕňajú pridanie jedného alebo viacej typov látok precipitujúcich bielkoviny.

Prednostnou precipitačnou látkou je organická látka PEG, zvlášť PEG s molekulovou váhou v rozmedzí 3000 - 8000 Da, ako sú napríklad PEG 3350, PEG 4000, PEG 5000 a najmä PEG 6000 (čísla týchto špecifických PEG zlúčenín, udávajú ich priemernú molekulovú váhu). Výhodou použitia látky PEG ako precipitačnej látky je fakt, že PEG nemá iónový charakter a stabilizuje bielkoviny, PEG je napríklad dobre známy ako stabilizátor IVIG produktov. Precipitačný krok tiež funguje ako krok odstraňujúci vírusy. PEG koncentruje a precipituje vírusy bez ohľadu na ich druh, veľkosť a povrch.

Podané množstvo látky precipitujúcej bielkoviny je pridané k sfiltrovanej suspenzii na účely precipitácie väčšiny vysoko molekulárnych a agregovaných proteínov a častíc, bezvýznamnejšej precipitácie monomérnych IgG, za vzniku čistého roztoku supematantu. Látka precipitujúca bielkoviny môže byť pridaná v pevnej forme ako prášok alebo v koncentrovanom roztoku.

Pre PEG ako precipitačnú látku platí, že čím vyššia je molekulárna váha zlúčeniny, tým nižšia je koncentrácia PEG potrebná na vyvolanie precipitácie bielkoviny. Pokiaľ je použitý PEG 3350, PEG 4000, alebo prednostne PEG 6000, je koncentrácia precipitačnej látky vo sfiltrovanej suspenzii výhodne v rozmedzí 3 až 15 % váhovo, ako napríklad 4 - 10 % (ako napríklad zhruba 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %), kde 6 % je najviac preferované.

V precipitačnom kroku pokračuje precipitačný proces až do dosiahnutia rovnováhy medzi pevnou a teku6

SK 288128 Β6 tou fázou, napríklad počas aspoň 2 hodín, ako napríklad od zhruba 2 hodín do zhruba 12 hodín, prednostne okolo 4 hodín. Počas precipitácie je suspenzia prednostne udržovaná pri nízkej teplote (napríklad menej ako zhruba 12 °C, ako napríklad menej ako zhruba 10 °C, prednostne medzi 2 °C a 8 °C). Najvhodnejšia teplota závisí od typu látky precipitujúcej bielkoviny.

Po ukončení precipitácie bielkoviny je prečistený supematant obsahujúci IgG, ktorý je takmer výhradne v monomémej forme, získaný zo zmesi pevného precipitátu a tekutého supematantu vzniknutých v priebehu precipitácie. Získanie IgG môže byť uskutočnené konvenčnými technikami separácie tekutiny z pevnej fázy, ako je napríklad centrifiigácia a/alebo filtrácia. Prednostne je používaná centrifugácia (napríklad Westfalia) s rýchlosťou 1000 - 5000 g.

Voliteľne je získaný, prečistený supematant obsahujúci IgG sfiltrovaný na účely odstránenia väčších častíc a agregátov. Tento postup je voliteľne nasledovaný sterilnou filtráciou prevádzanou s použitím konvenčného sterilizačného filtra (ako je napríklad 0,22 um filter od spoločnosti Millipore alebo Sartorius), ktorý eliminuje z roztoku napríklad baktérie.

Prečistený a voliteľne sfiltrovaný supematant obsahujúci IgG je podrobený aspoň jednému kroku, lepšie dvom krokom, ale voliteľne viacej krokom anexovej a katexovej chromatografie na účely odstránenia nonIgG kontaminujúcich látok, napríklad IgA, albumínu, rovnako tak ako agregátov. V prednostnej forme vynálezu je prečistený a voliteľne sfiltrovaný supematant obsahujúci IgG aplikovaný na anexovu živicu a následne sú pripravené dve kolóny s vhodnými rozmermi, ktoré sú naplnené katexovou živicou.

Pokiaľ sa prevádza na účely purifikácie IgG ionexová chromatografia, je preferované, aby podmienky, napríklad pH a iónová sila, boli zvolené takým spôsobom, že hlavný podiel kontaminujúcich látok (napríklad non-IgG proteínov, ako sú napríklad IgA, transferín, albumín a agregáty) v aplikovanom roztoku sa viaže na anexovú živicu, zatiaľ čo nedochádza k významnej väzbe IgG. S ohľadom na následnú katexovú chromatografiu vedú zvolené prednostné podmienky na väzbu prevažne väčšiny IgG molekúl prítomných v roztoku, ktorý je aplikovaný na katexovú živicu. Bielkovinné kontaminujúce látky neabsorbované na anexovú živicu a precipitačná látka sú odstránené v následnom premievaní katexovej živice.

V prednostnej forme predkladaného postupu sú anexová a katexová chromatografia zapojené do série. V predkladanom kontexte značí termín „zapojené do série“, pokiaľ je použitý v spojení s ionexovými živicami, že proteíny prechádzajúce anexovou živicou sú priamo aplikované na katexovú živicu bez zmeny pufra alebo iných podmienok.

Existuje niekoľko dôvodov, prečo je výhodné previesť anexovú a katexovú chromatografiu v jednom kroku s použitím dvoch sériovo zapojených chromatografických kolón, namiesto použitia dvoch nezávislých chromatografických krokov, napríklad s rôznym zložením pufrov. Použitie dvoch sériovo zapojených chromatografických kolón robia celý postup praktickejší, napríklad nie je treba medzikroku zbierania IgG obsahujúce frakcie medzi dvomi ionexovými chromatografiami na účely úpravy pH a iónovej sily. Navyše sú pufre aplikované na kolónu súčasne a obe kolóny sú ekvilibrované rovnakým pufrom. Je ale možné previesť chromatografiu v dvoch krokoch, t. j. anexovú a katexovú chromatografiu, ktoré nie sú zapojené do série. Prevedenie chromatografie v dvoch krokoch je ale, ako je spomínané, prácnejšie v porovnaní s ionexovými chromatografiami, ktoré sú zapojené do série.

Je súčasne predpokladané, že vysoký stupeň čistoty, vysoký obsah IgG monomérov a dimérov a nízky obsah IgA v IVIG produkte, ktorý je predmetom vynálezu, sú čiastočne spôsobené použitím dvoch sériovo zapojených chromatografických kolón.

Ako bude známe osobám, ktoré poznajú odbor, môžu byť ionexové živice založené na rôznych materiáloch s ohľadom na matrici, rovnako tak ako na pripojené nabité skupiny. Nasledujúce matrice môžu byť viacej alebo menej zosieťované: agaróza (ako napríklad Sepharose CL-6B®, Sepharose Fast Flow®, a Sepharose High Performance®), celulóza (ako napríklad DEAE Sephacel®), dextrán (ako napríklad Sephadex®) silika a syntetické polyméry. U anexovej živice môžu byť nabité skupiny, ktoré sú kovalentne pripojené k matrici napríklad diétylaminoetyl (DEAE), kvartémy aminoetyl (QAE), a kvartéme amónium (Q). U katexovej živice môžu byť nabité skupiny, ktoré sú kovalentne pripojené k matrici napríklad karboxymetyl (CM), sulfopropyl (SP) a/alebo metyl sulfonát (S). V prednostnej forme predkladaného postupuje používanou anexovú živicou DEAE Sepharose Fast Flow®, ale môžu byť použité aj iné anexové živice. Prednostná katexová živica je CM Sepharose Fast Flow®, ale môžu byť použité aj iné katexové živice.

Použitý príslušný objem živice po naplnení kolóny na ionexová chromatografiu odráža rozmery kolóny, t. j. priemer kolóny a výšku stĺpca, a líši sa v závislosti napríklad od množstva IgG v aplikovanom roztoku a na väzbovej kapacite použitej živice.

Pred prevedením ionexovej chromatografie je ionexová živica prednostne ekvilibrovaná pufrom, ktorý umožňuje väzbu protiiónov na živicu. Prednostne sú anexové a katexové živice ekvilibrované rovnakým pufrom, čo uľahčuje celý postup, pretože je treba pripraviť a použiť jeden pufer.

Pokiaľ napríklad je napríklad zvolenou anexovou živicou DEAE Sepharose FF^(R) a katexovou živicou je CM Sepharose FF^(R) a kolóny sú zapojené do série, sú potom kolóny výhodne ekvilibrované nedenaturujúcim kyslým pufrom majúcim zhruba rovnaké pH a iónovú silu ako IgG roztok, ktorý má byť aplikovaný. Pre ek7 vilibráciu ionexovej kolóny je vhodný ktorýkoľvek z celého radu pufrov, napríklad octan sodný, fosforečnan sodný, tris(hydroxymetyl)amino-metán. Osoby, ktoré poznajú odbor, ocenia, že na ekvilibráciu môžu byť použité početné iné pufre, pokiaľ je pH a vodivosť zhruba rovnaká ako aplikovaný roztok IgG. Prednostným pufrom na ekvilibráciu anexovej a katexovej kolóny, ak sú zapojené do série, je sodno acetátový pufer s koncentráciou octanu sodného v rozmedzí 5-25 mM, ako napríklad v rozmedzí 10-20 mM, prednostne okolo 15 mM. Je preferované, aby pH sodno acetátového pufra používaného na ekvilibráciu bolo v rozmedzí od 5,0 až do 6,0, ako napríklad od 5,4 do 5,9, prednostne okolo 5,7. Vodivosť je v rozmedzí 1,0 až 1,4 mS/cm, prednostne okolo 1,2 mS/cm. Vhodné acetátové pufre môžu byť pripravené z trihydrátu octanu sodného a z ľadovej kyseliny octovej.

Pred aplikáciou prečisteného voliteľne sfiltrovaného supematantu obsahujúceho IgG na ionexovú kolónu sú koncentrácie pufra a pH uvedeného supematantu prednostne upravené, pokiaľ je to nutné, na hodnoty významne ekvivalentnej koncentrácii a pH použitého ekvilibračného pufra.

Po aplikácii supematantu obsahujúceho IgG na kolóny zapojené do série, sú tieto kolóny prednostne premyté (iniciálne premytie) jedným objemom kolóny premývacieho pufra na účely zaistenia, že roztok obsahujúci IgG je kvantitatívne prenesený z anexovej kolóny na kolónu katexovú. Následne je odpojená anexová a katexová kolóna a katexová kolóna je prednostne premytá na účely odstránenia proteínových kontaminujúcich látok z kolóny pomocou pufra majúceho pH a iónovú silu dostatočnú, aby došlo k významnej elúcii všetkých kontaminujúcich látok z katexovej kolóny bez spôsobenia významnej elúcie IgG.

Iniciálne premytie je výhodne prevádzané pomocou ekvilibračného pufra, aj keď môžu byť na premytie použité aj iné pufre s podobnou koncentráciou a pH. Na vymytie kontaminujúcich látok je preferované použitie acetátového pufra. Hodnota pH pufra môže byť 5,0 až 6,0, ako napríklad v rozmedzí až 5,8, napríklad 5,4.

Elúcia IgG z katexovej živice je prednostne prevedená pomocou významnejšie nedenaturujúceho pufra majúceho pH a iónovú silu dostatočnú na spôsobenie účinnej elúcie IgG, čím dochádza k získaniu IgG obsahujúceho eluátu. V tomto kontexte značí účinná elúcia aspoň 75 %, napríklad aspoň 80 %, alebo lepšie 85 % z IgG proteínov aplikovaných na anexovú a katexovú kolónu, ktoré sú zapojené do série, ktoré sú eluované z katexovej živice. Elúcia je výhodne prevedená ako gradientový elučný krok. V postupe, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu, je preferovaným použitým pufrom octan sodný, majúci pH v rozmedzí 5,0 - 6,0, napríklad 5,2 - 5,8, prednostne okolo 5,4 a v koncentrácii v rozmedzí 5-40 mM, ako napríklad v rozmedzí 10 až 25 mM, prednostne okolo 15 mM.

Je preferované, aby koncentrácia solí elučného pufru bola dostatočne vysoká na vymytie IgG zo živice. K elúcii IgG zo živice je ale predpokladané použitie vyššieho pH a nižšej koncentrácie solí. V prednostnej forme predkladaného postupu je elúcia prevádzaná ako kontinuálna gradientová elúcia s koncentráciami chloridu sodného v rozmedzí 50 - 500 mM, prednostne od zhruba 125 mM do zhruba 350 mM chloridu sodného.

Elúcia môže byť prevádzaná tiež krokovým gradientom. Je predpokladané, že elúcia môže byť prevádzaná tiež ako elúcia konštantnou koncentráciou solí, v ktorom elučný pufer aplikovaný na katexovú kolónu má iba jednu koncentráciu na rozdiel od gradientovej elúcie. Pokiaľ je prevádzaná elúcia konštantnou koncentráciou solí, môže byť táto koncentrácia solí výhodne v rozmedzí od zhruba 350 mM do zhruba 500 mM chloridu sodného. Výhodou gradientovej elúcie v porovnaní s elúciou konštantnou koncentráciou solí je fakt, že elúcia je účinnejšia pri použití gradientu solí, a ďalšou výhodou je, že eluát má nižšiu iónovú silu, čo je výhodné, pretože vysoká iónová sila je kritická pre stabilitu IgG. Elučný pufer môže ďalej obsahovať látku stabilizujúcu bielkoviny, ako sú napríklad látky spomínané neskôr. Na elúciu IgG môžu byť použité rôzne ďalšie pufrové systémy, čo bude ocenené osobami, ktoré poznajú odbor.

K IgG frakcii je okamžite po elúcii alebo počas tejto elúcie prednostne aspoň jedna látka stabilizujúca bielkovinu. Látky stabilizujúce bielkoviny sú známe osobám poznajúcim odbor a zahŕňajú napríklad rôzne cukrové alkoholy a sacharidy (ako sú napríklad sorbitol, manóza, glukóza, trealóza, maltóza), bielkoviny (ako sú napríklad albumín), aminokyseliny (ako je napríklad lyzín, glycín) a organické látky (ako je napríklad PEG). Zvolený intermediálny stabilizátor môže byť výhodne taký, ktorý môže byť v následnom kroku odstránený z roztoku obsahujúceho IgG.

Vhodné koncentrácie proteín stabilizujúce látky v roztoku obsahujúcom IgG závisia od použitej špecifickej látky.

V prednostnej forme vynálezu je stabilizačnou látkou sorbitol, prednostne vo finálej koncentrácii v rozmedzí 2 - 15 % (w/v) sorbitolu, napríklad zhruba 2-5 %.

Následne po elúcii z katexovej kolóny je eluát prednostne odsolený (t. j. dialyzovaný) a výhodne zakoncentrovaný. Zmena pufra a koncentrácie IgG môže byť prevádzaná kombináciou dia/ultrafiltračného postupu. Termín „dia/ultrafiltrácie“ značí, že dialýza a zakoncentrovanie diafiltráciou a respektíve ultrafiltráciou sú prevedené v jednom kroku. Je predpokladané, že diafiltrácia a ultrafiltrácia môžu byť prevedené ako dva oddelené kroky. Ale na účely zabránenia straty produktu je v súčasnosti preferované previesť dialýzu a zakoncentrovanie spôsobom diafiltrácie a ultrafiltrácie v jednom kroku.

Membrány použité na dia/ultrafiltráciu majú výhodne cutoff nominálne váhy v rozmedzí 10 000 až 100 000 Da. Prednostným typom membrány na predkladaný postup je polysulfónová membrána s cutoff no8

SK 288128 Β6 minálnej váhy 30 000 Da od spoločnosti Millipore. Použité môžu byť aj iné ultrafiltračné membrány z porovnateľného materiálu a s rovnakou pórovitosťou.

Rozsah koncentrácií sa môže významne líšiť. Roztok je zakoncentrovaný z pôvodnej koncentrácie 10 g/1 na zhruba 100 g/1, prednostne na zhruba 50 g/1. Po zakoncentrovaní je koncentrát IgG výhodne dialyzovaný proti pufru s nízkou iónovou silou. Okrem odstránenia iónov solí sú v tomto kroku z roztoku odstránené tiež kontaminujúce látky s nízkou molekulovou váhou a je umožnená výmena pufra na ďalší purifíkačný krok. Prednostným pufrom na diafiltráciu je 15 mM octan sodný, pH 5,4, obsahujúci 2,5 % (w/v) sorbitolu. Výmena pufra je prevádzaná až do zníženia vodivosti na hodnotu menšiu ako zhruba 1,5 mS/cm, prednostne na menej ako zhruba 1,3 mS/cm. Počas dia/ultrafiltrácie je pH prednostne udržované v rozmedzí 4,0 - 6,0, prednostne 5,1 - 5,7, najprednostnejšie zhruba 5,4.

Po dia/ultrafiltrácii je výhodne v roztoku upravená koncentrácia proteín stabilizujúcej látky, pokiaľ je to nutné, na finálnu optimálnu koncentráciu charakteristickú pre špecifickú použitú proteín stabilizujúcu látku. Pokiaľ je použitý sorbitol, je jeho koncentrácia upravená prednostne na zhruba 10 % váhovo.

Je preferované, aby bol na účely odstránenia agregátov pred následným krokom stabilizovaný proteín sfiltrovaný pomocou filtra s priemerom pórov v rozmedzí 0,2 - 1,0 um, prednostne zhruba 0,45 um. V tomto štádiu má roztok obsahujúci IgG vzhľad číreho roztoku s príslušným objemom s vysokou stabilitou ako výsledok vysokej čistoty, nízkej iónovej sily, kyslého pH, relatívne vysokej koncentrácie IgG a pridanej stabilizačnej látky.

V postupe výroby IVIG produktu sú zahrnuté aspoň dva kroky definované a validované na odstránenie a inaktiváciu vírusu. Týmito krokmi je prednostne precipitácia pomocou PEG ako všeobecného kroku na odstránenie vírusu a S/D postup ako krok inaktivujúci vírusy s lipidovým obalom. Okrem prísnych požiadaviek na bezpečnosť východiskového materiálu vzhľadom na vírusy je podľa medzinárodných smerníc a podľa dobre známej kapacity veľanásobného purifikačného postupu nutné znižovať prítomnosť vírusov a zahrnutie dvoch nezávislých krokov znižujúcich prítomnosť vírusov, ktoré sú namierené proti obaleným aj neobaleným vírusom; liek podľa predkladaného vynálezu je z hľadiska prítomnosti vírusov významne bezpečný.

Infekčné vírusy s lipidovým obalom, ktoré môžu byť stále prítomné v roztoku obsahujúcom IgG, sú prednostne inaktivované v tomto štádiu postupom pridania virucídneho množstva látky inaktivujúcej vírusy do roztoku obsahujúceho IgG. Za „vírucídne množstvo“ látky inaktivujúcej vírusy je považované množstvo, ktoré vedie k vzniku roztoku, v ktorom sú vírusové častice významne neinfekčné a týmto je definovaný „roztok obsahujúci IgG bez prítomnosti vírusu“. Toto „vírucídne množstvo“ závisí od použitej látky inaktivujúcej vírusy rovnako tak ako od podmienok, ako je napríklad inkubačný čas, pH, teplota, obsah lipidov a koncentrácie bielkovín.

Termín „látka inaktivujúca vírusy“ značí takú látku alebo spôsob, ktorý môže byť použitý na účely inaktivácie vírusov s lipidovým obalom rovnako tak ako vírusov bez lipidového obalu. Termín „látka inaktivujúca vírusy“ zahŕňa podľa vhodnosti kombináciu takých látok a/alebo spôsobov, rovnako tak ako iba použitie iba jedného typu takej látky alebo spôsobu.

• Prednostnými látkami inaktivujúce vírusy sú detergenty a/alebo rozpúšťadlá, najprednostnejšie zmesi detergent/rozpúšťadlo. Malo by sa poznať, že látka inaktivujúca vírusy je voliteľne zmesou jedného alebo viacerých detergentov s jedným alebo viacerými rozpúšťadlami. Inaktivácia pomocou rozpúšťadla/detergentu (S/D) je bežne používaný krok na inaktiváciu vírusov s lipidovým obalom (napr. HIV1 a HIV2, vírus hepatitídy C a hepatitídy non A, non B a non C.HTLVl a 2, herpetické vírusy vrátane CMV a vírusu Ebstein Barrovej) v krvných produktoch. Na inaktiváciu vírusov môže byť použitý celý rad detergentov a rozpúšťadiel. Detergent môže byť vybraný zo skupiny tvorenej neiónovými aj iónovými detergentmi a mal by byť významne nedenaturujúci. Prednostne je neiónový detergent používaný na účely uľahčenia nasledujúcej eliminácie detergentu z IgG preparátu nasledujúcim krokom. Vhodné detergenty sú opísané z IgG preparátu nasledujúcim krokom. Vhodné detergenty sú opísané napríklad Shanbromem et al., v patentoch US Patent 4314997 a US Patent 4315919. Prednostnými detergentmi sú detergenty predávané pod obchodným názvom Triton X-100 a Tween 80. Prednostnými rozpúšťadlami na použitie látok inaktivujúcich vírusy sú di- alebo trialkylsosfáty, ako je opísané napríklad Neurathom a Horowitzom v patente US Patent 476369. Prednostným rozpúšťadlom je tri(n-butylfosfát) (TNBP). Zvlášť prednostnou látkou inaktivujúcu vírusy na použitie v predkladanom vynáleze je zmes TNBP a Tween 80, ale alternatívne môžu byť použité aj iné kombinácie. Prednostná zmes je pridaná v takom objeme, že koncentrácia TNBP v roztoku obsahujúcom IgG je v rozmedzí 0,2 - 0,6 % váhovo, prednostne zhruba 0,3 % váhovo. Koncentrácia Tween 80 v roztoku obsahujúcom IgG je v rozmedzí 0,8 - 1,5 % váhovo, prednostne v koncentrácii zhruba 1 % váhovo.

Krok inaktivácie vírusu je prevádzaný za podmienok vedúcich k inaktivácii vírusu, čo má za následok vznik roztoku významne bez prítomnosti vírusu. Tieto podmienky všeobecne zahŕňajú teplotu 4-30 °C, ako napríklad 19-28 °C, 23 - 27 °C, prednostne okolo 25 °C, a účinnou inkubačným časom zisteným z validačných štúdií. Všeobecne je dostatočný na zaistenie dostatočnej inaktivácie vírusu v inkubačnom čase 1-24 hodín, prednostne 4-12 hodín, ako napríklad okolo 6 hodín. Príslušné podmienky (teplota a inkubačné časy) však závisia od použitej látky inaktivujúcej vírusy, pH a koncentráciu bielkovín a obsahu lipidov v roztoku.

SK 288128 Β6

Je predpokladané, že na účely prípravy produktu bez prítomnosti vírusu môžu byť použité aj iné spôsoby na odstránenie a inaktiváciu vírusu, ako je napríklad pridanie metylénovej modrej s následnou inaktiváciou žiarením ultrafialovým svetlom alebo nanofiltráciou.

Po reakcii s rozpúšťadlom/detergentom, je roztokom výhodne nariedený pomocou pufra. Roztok obsahujúci IgG významne bez prítomnosti vírusov je voliteľne sfiltrovaný, prednostne cez hĺbkový filter, ako je opísané v predošlom kroku predkladaného postupu a/alebo cez sterilný filter.

Po inaktivácii vírusu a prednostne aj filtrácii je prevedená ionexová chromatografia na účely odstránenia látky inaktivujúcej vírusy a proteínových kontaminujúcich látok.

Tento krok je prednostne prevedený, ako je opísané v predkladanom postupe v predchádzajúcom kroku, pomocou ionexovej chromatografie s výnimkami, že objem anexovej kolóny je zhruba polovičný ako objem katexovej kolóny, a že premytie pred elúciou IgG je dôkladnejšie, a je použité aspoň šesť objemov pufra. Navyše v prednostnej forme vynálezu je ekvilibračným pufrom octan sodný s koncentráciou v rozmedzí zhruba 5-25 mM, prednostne 15 mM, a pH v rozmedzí zhruba 5,0 - 5,8, prednostne 5,4. Ako je spomínané, obsah octanu sodného a pH roztoku obsahujúceho IgG sú prednostne upravené na rovnakú koncentráciu a pH, ako má ekvilibračný pufer. Navyše v prednostnej forme vynálezu je pridaná k získanému eluátu látka stabilizujúca bielkovinu, prednostne maltóza, vo finálnej koncentrácii v rozmedzí 1 - 5 %, prednostne zhruba 2,5 % váhovo.

Prednostným spôsobom eliminácie látky inaktivujúcej vírusy je ionexová chromatografia. Ale za užitočné sú považované aj iné metódy, ako je napríklad olejová extrakcia a alternatívne chromatografické metódy. Príslušný spôsob závisí od použitej látky inaktivujúcej vírusy. Odstránenie rozpúšťadla/detergentu môže byť teda dosiahnuté väzbou IgG k živici a následne vymytím inaktivujúcej látky pufrom. Vhodnou metódou je katexová chromatografia. V prednostnej forme predkladaného vynálezu je navyše ku katexovej chromatografii prevádzaná tiež chromatografia anexová na účely zlepšenia kvality a celkovej čistoty finálneho produktu predkladaného postupu.

Po ionexovej chromatografii je eluát obsahujúci IgG prednostne oddialyzovaný a zakoncentrovaný, čím je účinne znížený obsah ostávajúcich bielkovinných komponentov. Toto môže byť výhodne prevedené dia/ultrafiltráciou, ako je opísané. Pufrom použitým pre diafíltráciu je octan sodný, prednostne v koncentrácii od zhruba 4 do 10 mM, prednostne 7,5 mM, a pH v rozmedzí od zhruba 4,0 do 6,0, prednostne zhruba 5,1 až 5,7, ako napríklad 5,4. Alternatívne môžu byť použité pre diafíltráciu aj iné pufre, ako je napríklad fosforečnan sodný alebo kyseliny. V diafiltrácii je pokračované, dokiaľ vodivosť je menšia alebo rovnajúca sa 1 mS/cm. Roztok obsahujúci IgG je voliteľne ďalej sterilné sfiltrovaný.

Pokiaľ je to požadované, je purifikovaný roztok obsahujúci roztok IgG, ktorý je významne zbavený látky inaktivujúcej vírusy, podrobený ďalším postupom na účely vytvorenia vhodného preparátu vo forme tekutého produktu, ktorý môže byť použitý napríklad intravenózne, subkutánne, alebo intramuskuláme.

Z praktického pohľadu je preferované, aby obsah tekutého preparátu imunoglobulínového produktu bol rovnaký na skladovanie aj na použitie. Finálna koncentrácia IgG v produkte je prednostne v rozmedzí 0,25 až 20 % váhovo (čo odpovedá 2,5 - 200 g IgG/1), ako napríklad 1 - 20 % váhovo, t. j. 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %.

Je známe, že vysoká koncentrácia bielkovín vedie k vyššej stabilite IgG. Na druhú stranu vysoké koncentrácie IgG značia, že maximálna infuzna rýchlosť pri podaní IgG pacientovi intravenózne musí byť pomerne nízka, aby boli vylúčené transfúzne problémy vyplývajúce z vysokého osmotického tlaku produktu. V súčasnosti odporúčaná koncentrácia na intravenózne podanie podľa Európskeho Liekopisu (Ph. Eur.) je 5 % (w/v). Na druhú stranu koncentrovaný produkt (napríklad 10 % a viacej) je výhodný na intramuskuláme alebo subkutánne podanie.

Aj keď to nie je preferované, je zrejmé, že môžu byť tiež použité aj produkty, ktoré možno získať rôznymi krokmi, napríklad lyofilizované produkty namiesto tekutých produktov, aj keď tieto produkty sú menej výhodné ako použitie imunoglobulínových produktov vo forme pripravených tekutých preparátov. Druhá forma bude detailnejšie opísaná v nasledujúcom.

Tekuté imunoglobulínové produkty sú najstabilnejšie pri iónovej sile významne nižšej, ako je iónová sila plazmy, t. j. vodivosť je prednostne nižšia ako 1,0 mS/cm, prednostne okolo 0, 8 mS/cm.

Hodnota pH má vplyv na stabilitu IgG a na rýchlosť infúzie. Tekuté imunoglobulínové produkty sú najstabilnejšie za kyslých podmienok, t. j. pod izoelektrickým bodom IgG, pri pH 6,4 - 8,5. Čím viacej sa blíži hodnota pH hodnote fyziologického pH (7,1 - 7,3), tým vyššia infúzna rýchlosť môže byť použitá. V dôsledku požadované stability bude pH imunoglobulínového produktu, ktorý je predmetom vynálezu, prednostne v rozmedzí 5,1 - 5,7, ako napríklad medzi 5,2 a 5,6, ako napríklad okolo 5,4.

Imunoglobulínový produkt môže ďalej obsahovať látky stabilizujúce bielkoviny, ako je opísané. Navyše môžu byť ako stabilizačné látky použité tiež cukrové alkoholy a sacharidy (ako napríklad sorbitol, manóza, glukóza, trealóza, maltóza), tiež proteíny (ako napríklad albumín), aminokyseliny (ako napríklad lyzín, glycín) a organické látky (ako napríklad PEG a Tween 80). Vhodné koncentrácie stabilizačných látok v roztoku obsahujúcom IgG závisí od použitej špecifickej látky, ako je opísané.

SK 288128 Β6

Purifikovaný roztok IgG je, pokiaľ je to požadované, upravený, aby sa získal stabilný a izotonický roztok. Termín „izotonický roztok“ značí, že roztok má rovnaký osmotický tlak ako plazma. Ako je zmienené, je iónová sila imunoglobulínového produktu, ktorý je predmetom vynálezu, a ktorý je v tekutej forme, významne nižší, ako je iónová sila v plazme. Z tohto dôvodu je preferované, aby boli na zvýšenie osmolality roztoku použité mono a disacharidy, pretože nezvyšujú iónovú silu. V prednostnej forme predkladaného vynálezu je pridaná maltóza v koncentrácii zaisťujúcej, že roztok je izotonický. Maltóza súčasne funguje ako látka stabilizujúca imunoglobulíny. Toto je prednostne prevedené pridaním maltózy, aby finálna koncentrácia bola v rozmedzí pridaním zhruba 5 % až 15 % (w/v), prednostne 10 % (w/v). Alternatívne môžu byť použité aj iné sacharidy, ako je napríklad manóza a glukóza.

Prednostné finálne podmienky imunoglobulínového produktu sú kompromisom medzi stabilitou a fyziologicky prijateľnými podmienkami s ohľadom na napríklad pH, iónovú silu a tonicitu. Imunoglobulínový roztok musí navyše spĺňať požiadavky testov kontrolujúcich kvalitu, ako je špecifikované v Monografii č. 918, Európsky Liekopis, 1997.

Hlavnými výhodami produktu získaného spôsobom, ktorý je predmetom vynálezu, je fakt, že pokiaľ je produkt formulovaný v tekutom preparáte, je pripravený na okamžité použitie, kedy produkt je súčasne veľmi stabilný, vysoko purifikovaný, má zhruba normálne zastúpenie podtried IgG a má extrémne nízky obsah IgA rovnako tak, ako IgM, a protilátkové a biologické aktivity preukázané Fc funkcií.

Navyše neobsahuje prakticky žiadne agregáty imunoglobulínov a/alebo iných plazmatických bielkovín meraných ako polyméry vyššie ako diméry, a má nízku antikomplementámu aktivitu a má veľmi vysoký obsah IgG monomérov a dimérov. Monoméme IgG tvoria aspoň 90 %, čo je považované ako ideálne. V dôsledku vysokej stability je možné zamedziť pridávaním stabilizačných látok, ako je napríklad albumín, glycín, detergenty alebo PEG. Produkt je konečne zbavený vírusov, pretože postup zahŕňa použitie dobre definovaných a validovaných krokov znižujúcich prítomnosť vírusov, ktoré sú zamerané na odstránenie a/alebo inaktiváciu vírusov s lipidovým obalom aj vírusov bez lipidového obalu.

Cieľom validácie kroku znižujúceho prítomnosť vírusov v príprave produktu je zaistiť dôkaz, že postup výroby vedie k účinnej inaktivácii/odstráneniu vírusov, o ktorých je známe, že kontaminujú východiskový materiál, alebo ktoré by mohli tento materiál kontaminovať. Validačné štúdia zahŕňajú opatrné pridanie vírusu začatím krokov prípravy produktu, ktoré majú byť validované a meranie rozsahu odstránenia/inaktivácie vírusu po ukončení kroku alebo krokov prípravy produktu. GMP obmedzenie zabraňuje vírusovej kontaminácii zariadení používaných pri prípravy produktu. GMP obmedzenie zabraňuje vírusovej kontaminácii zariadení používaných pri príprave. Preto by validácia mala byť prevádzaná v oddelenom laboratóriu vybavenom pre virologické práce v zmenšenom meradle pôvodného postupu a prevádzaná personálom so skúsenosťami vo virológii spoločne s inžiniermi zameranými na prípravu produktu. Množstvo vírusu pridaného k východiskovému materiálu zamýšľaného na použitie v krokoch prípravy produktu, ktoré majú byť validované, by malo byť čo najväčšie, aby bolo možno určiť kapacitu skúmaného kroku prípravy dostatočne inaktivovať/odstraňovať vírusy. Ale vírus by mal byť pridaný v takom množstve, aby nebolo významne narušené zloženie výrobného materiálu. Objem vzorky, ktorý obsahuje vírus by mal byť prednostne rovnaký alebo nižší ako 10 %.

Kvantitatívne stanovenie bezinfekčnosti by malo byť prevedené podľa princípov GLP a môže zahŕňať tvorbu plakov, detekciu ďalších cypatických efektov, ako sú napríklad syncýtia alebo tvorba ložísk, konečnú titráciu (napr. stanovenie TCID₅₀), detekciu syntézy vírusových antigénov, alebo ďalšie spôsoby. Tieto spôsoby by mali mať dostatočnú citlivosť a reprodukovateľnosť, a mali by byť prevádzané v dostatočnom opakovaní a kontrolách, aby bola zaistená dostatočná štatistická presnosť výsledkov.

Krok prípravy produktu je typicky podnietený množstvom 6 log vírusu, a pokiaľ je získané zníženie v rádu 4 log alebo viacej, ukazuje to na jasný efekt zníženia konkrétneho testovaného vírusu, ktorý je predmetom skúmania. Podobne zníženie v rádu 4,5 log, 5 log alebo dokonca 5,5 log indikuje jasný efekt zníženia konkrétneho testovaného vírusu, ktorý je predmetom skúmania, a tento krok môže byť klasifikovaný ako validový krok vedúci k zníženiu prítomnosti vírusu.

Vírusové validačné štúdiá by mali byť prevádzané s vírusmi napodobňujúcimi vírusy, ktoré kontaminujú produkt, tak tesne, ako je to jen možné, a za druhé by mali reprezentovať čo najširšie rozmedzie fýzikálnochemických vlastností na účely otestovania všeobecnej schopnosti systému eliminovať vírusy.

Vírusové validačné štúdia by mali byť prevádzané v zhode s CPMP smernicou pre vírusové validačné štúdia: The Desing, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses (CPMP/BWP/268/95) a smernicou pre medicinálne produkty derivované z plazmy (CPMP/BWP/269/95).

Validačné štúdia, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu sú prezentované v príklade 5.

Produkt, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu má viacej ako 95 % čistotu, prednostne viacej ako 98 %. Vysoký stupeň čistoty je, inter alia, spôsobený faktom, že produkt, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu, je získaný aspoň jedným, prednostne dvoma, voliteľne sériovo zapojenými krokmi anexovejkatexovej chromatografie. V tomto kontexte stojí za zmienku, že bolo možné získať vysoký výťažok napriek veľkému počtu použitých krokov postupu prípravy, vo výrobnom meradle aspoň 3,5 g IgG proteinu na kg čerstvej zmrazenej plazmy.

Porovnávacie štúdie, ktoré boli prevedené (Príklad 2), preukázali, že imunoglobulínový produkt, ktorý je možno získať postupom podľa vynálezu, má ideálne funkčné vlastnosti, ako sú napríklad výrazné väzbové aktivity proti antigénu a vysoká Fc funkcia. Predkladaný prednostný liek vyvinutý predkladajúcimi vynálezcami je váhovo 5 % roztokom imunoglobulínov. Testy stability dosiaľ preukázali stabilitu pri skladovaní pri 4 °C počas viacej ako jeden rok, tzn. že imunoglobulínový produkt nevytvára agregáty a ani nedochádza k fragmentácii imunoglobulínov G, ku strate požadovanej biologickej aktivity, alebo ku zvýšeniu nežiaducich aktivít, napr. antikomplementáme aktivity a preklikreinové aktivity, ako je zmerané in vitro.

Na základe predkladaného vynálezu je možné získať IgG produkt, ktorý má viacej ako 95 %, ako napríklad aspoň 96 %, alebo aspoň 97 %, napríklad aspoň 98 %, prednostne aspoň 99 %, najprednostnejšie aspoň 99,5 % čistotu. IgG produkt by mal obsahovať menej ako 6 mg IgA/1, ako napríklad menej ako 4 mg IgA/1, prednostne menej ako 3 mg IgA/1, najprednostnejšie menej ako 2 mg IgA/1.

Malo by byť zdôraznené, že iné produkty obsahujú stabilizačné látky vo forme detergentov, PEG alebo albumínu. V prednostnej forme vynálezu neobsahuje produkt, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu, žiadnu zo spomínaných stabilizačných látok, namiesto nich bol zvolený dobre tolerovaný sacharid.

Produkt, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu, má ako jednu zo svojich charakteristík veľmi nízky obsah polymérov a agregátov. V prednostnej forme vynálezu obsahuje produkt, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu menej ako 1,5 % polymérov a agregátov, ako napríklad menej ako 1 %, napríklad menej ako 0,5 %, alebo menej ako 0,25 % polymérov a agregátov. Obsah IgG monomérov a dimérov je aspoň 95 %, ako napríklad aspoň 96 % alebo aspoň 97 %, napríklad aspoň 98 %, prednostne 98,5 %, alebo 99 %. Obsah monomémeho IgG v produktu je aspoň 90 %.

Klinické štúdie preukázali klinický efekt produktu, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu, ktorého efekt je porovnateľný s registrovanými IVIG produktmi. Produkt bol veľmi dobre tolerovaný pacientmi a obrat imunoglobulínov v cirkulácii bol určený na štyri týždne. V predkladaných klinických štúdiách bol presvedčivo preukázaný imunomodulačný efekt IVIG, SSI (dáta sú prezentované v príklade 3).

Indikáciami pre IVIG sú primáme hypo/agamaglobulinémie zahŕňajúci bežnú variabilnú imunodeficienciu, Wiskott-Aldrichov syndróm a ťažká kombinovaná imunodeficiencia (SCID), sekundárna hypo/agamaglobulinémia u pacientov s chronickou lymfatickou leukémiou (CLL) a veľanásobným myelómom, deti s AIDS a bakteriálnymi infekciami, akútna a chronická idiopatická trombocytopenická purpur (ITP), alogénna transplantácia kostnej drene (BMT), Kawasakiho choroba a syndróm Guillan-Barré.

Neurológia: Chronická zápalová demyelizačná polyneuropatia (CIDP), multifokálna motorická neuropatia, roztrúsená skleróza, myasténia gravis, Eaton-Lambertov syndróm, neurititída optika, epilepsia.

Gynekológia: Habituálne potraty, primárny antifosfolipidový syndróm.

Reumatológia: Reumatoidná artritída, systémový lupus erytematozus, systémová sklerodermia, vaskulitída, Wegenerova granulomatóza, Sjôgrenov syndróm, juvenilná reumatoidná artritída.

Hematológia: Autoimúnna neutropénia, autoimúnna hemolytická anémia, neutropénia.

Gastrointestinálna: Crohnova choroba, ulcerózna kolitída, coeliakia.

Ďalšie: Astma, syndróm septického šoku, chronický únavový syndróm, psoriáza, syndróm toxického šoku, diabetes, sinuzítis, dilatačná kardiomyopatia, endokarditis, ateroskleróza, dospelí s AIDS a bakteriálnymi infekciami.

Okrem spomínaných indikácií na liečbu pomocou IVIG produktov je považované niekoľko závažných autoimúnnych ochorení, ktorá bežne zodpovedajú na kortikosteroidnú a imunopresívnu liečbu, za cieľové ochorenie na liečbu produktom, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu. Medzi tieto patrí niekoľko neurologických ochorení, ako je napríklad polyradikuloneuritis a niektoré imunitné podmienené periférne polyneuropatie, ale tiež niektoré chronické zápalové reumatické a vaskuláme ochorenia, ako je napríklad systémová vaskulitída postihujúca malé cievy, polymyozitída a ďalší.

Odlišným spôsobom účinku produktu, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu môže byť eliminácia infekčných antigénov u chronických infekcií a zvýšenie metabolizmu IgG.

Vynález je ďalej ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré nie sú myslené ako obmedzujúce.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Výrobné kroky purifikácie imunoglobulínu (s výnimkou kroku 5 sú všetky kroky uskutočňované pri teplote 5 ± 3 °C)

Krok 1: Príprava Cohnove frakcie II + III vo forme pasty

Pasta tvorená Cohnovou frakciou II + III je pripravená z ľudskej plazmy štandardným spôsobom Cohnove frakcionácie (Cohn E., et al., (1946) J Am Chem Soc, 459 - 475) podľa modifikácie Kistler-Nitschmanna (Kistler P a Nitschmann HS, (1952), Vox Sang, 7, 414 - 424). Po odstránení kryoprecipitátu, pokiaľ je požadované, aj po adsorpcii určitých plazmatických proteínov (ako napríklad Faktoru IX a antitrombínu) napríklad ionexový materiál a/alebo matrici, ktorá je tvorená Heparin Sepharosou®, je začatá etanolová precipitácia.

Presné podmienky (pH, koncentrácie etanolu, teplota, koncentrácia bielkoviny) na získanie pasty tvorenej frakciou II -III sú uvedené na obrázku na strane 266 v publikácii Hams JR (ed), Blood Separation and Plasma Fractionation, Wiley-Liss, New York, 1991. Pasta je izolovaná filtráciou pretlačením cez filter.

Krok 2: Extrakcia imunoglobulínov z pasty tvorenej Cohnovou frakciou II + III:

Zo 140 kg pasty tvorenej frakciou II + III zahŕňajúcej 30 kg filtrátu (Schenk, Nemecko) (zodpovedá východiskovému objemu plazmy okolo 1150 kg) sa extrakcia dosiahne prvý raz pridaním 525 kg 2,33 mM sodnofosfátového/acetátového pufra, pH 4,0 pri pomalom miešaní počas 1,5 hodiny, s nasledujúcim po sebe idúcim dvojitom pridaní 350 kg vody pre injekcie (WFI) s miešaním počas 1,5 hodiny po každom pridaní. Nakoniec je pridané okolo 280 kg 21,5 mM sodnofosfátového/acetátového pufra, pH 7,0, čím dôjde k úprave pH suspenzie na hodnotu 5,4.

Suspenzia je sfiltrovaná cez hĺbkový filter (C-150AF, Schenk, Nemecko). Filtrát obsahuje okrem iných bielkovín imunoglobulíny.

Krok 3: Precipitácia agregátov bielkovín a odstránenie vírusov pomocou PEG 6000:

K filtrátu z kroku 2 je pridaný PEG 6000 (Merck, Nemecko) do finálnej koncentrácie 6 % váhovo. Po štvorhodinovej precipitácií je PEG suspenzia scentrifugovaná v prietokovej centrifúge (Westfalia BKA28, Nemecko) na účely získania číreho supematantu a sfiltrovaná cez hĺbkový filter (50LA a 90LA, Cuno, Francie) a následne sterilné sfiltrovaná cez 0,22 um filter (Durapore, Millipore, USA). Hodnota pH sfiltrovaného PEG supematantu je upravená pufrom pridaním 1 dielu 0,45 M sodnoacetátového pufra, pH 5,7, k 29 dielom supematantu, čo vedie k dosiahnutiu pH 5,7.

Krok 4: Purifikácia anexovou a katexovou chromatografiou zapojených do série (I):

Dve chromatografické kolóny sú naplnené 56 1 DEAE Sepharosy FF® (Pharmacia, Biotech, Švédsko) a 56 1 CM Sepharosy FF® (Pharmacia, Biotech, Švédsko). Kolóny sú zapojené do série, a preto tekutiny pretekajú najprv cez DEAE Sepharosu a následne cez CM Sepharosu. Sorbenty sú ekvilibrovabé 15 mM sodnoacetátovým pufrom, pH 5,7. Potom je na tieto dve kolóny zapojené do série nanesený roztok z kroku 3.

Počas ionexovej chromatografíe sa väčšina kontaminujúcich bielkovín z nanesenej vzorky viaže na DEAE Sepharosu. Zatiaľ čo IgG preteká DEAE Sepharosou bez väzby na tento sorbent, v priebehu chromatografie na CM Sepharose dochádza k väzbe IgG. Po nanesení roztoku a po premytí jedným objemom kolóny ekvilibračného pufra je DEAE kolóna odpojená od CM kolóny. Potom je CM kolóna premytá tromi objemami 15 mM sodnoacetátového pufra, pH 5,4 a potom je IgG eluované pomocou gradientu NaCl od 125 mM do 350 mM, v 15 mM sodnoacetátovom pufri, pH 5,4. Eluovaná IgG frakcia je zbieraná do sorbitolu s finálnou koncentráciou 2,5 % váhovo.

Krok 4: Podrobenie IgG frakcie postupu rozpúšťadlo/detergent (S/D):

Eluovaná IgG frakcia je zakoncentrovaná a odsolená ultra/diafiltráciou na koncentráciu približne 50 g IgG/liter. Použitou membránou je polysulfónová membrána, cutoff nominálne váhy 30 kDa (Millipore). Diafiltrácia je prevedená proti 15 mM sodnoacetátovovému pufru, pH 5,4, obsahujúcom 2,5 % váhovo sorbitolu, a v diafiltrácii je pokračované až do dosiahnutia vodivosti menšej ako 1,4 mS/cm. Obsah IgG v roztoku je určený spektrofotometricky meraním pri 280 nm (A₂8o). Koncentrácia sorbitolu je upravená na 10 % váhovo a roztok je sfiltrovaný cez 0,45 um filter (Pall Corporation, UK). Potom sú pridané Tween 80 a TNBP do finálnej koncentrácie 1 % a respektíve 0,3 % váhovo pre následný postup S/D. S/D postup pokračuje počas aspoň 6 hodín pri teplote 25 °C.

Krok 6: Odstránenie S/D pomocou ionexovej chromatografíe (II):

Dve do série zapojené kolóny naplnené 281 DEAE a 56 1 CM Sepharosy FF sú ekvilibrované 15 mM acetátu sodného, pH 5,4. IgG frakcia podrobená postupu S/D z kroku 5 je nariedená 5 dielmi 15 mM acetátového pufra, pH 5,4, sfiltrovaná cez hĺbkový filter (Cuno 90LA), následne sterilné sfiltrovaná (Satobran, Sartorius) a nanesená na dve kolóny zapojené do série. Ionexová chromatografia a následná elúcia IgG z Cm kolóny sú prevedené presne tak, ako je opísané v kroku 4, s výnimkou, že CM kolóna je výrazne premývaná 6 objemami pufra na účely odstránenia látok z postupu S/D. Eluovaná IgG frakcia je zbieraná do maltózy (Merck, Nemecko) vo finálnej koncentrácii 2,5 % váhovo.

Krok 7: Finálna koncentrácia a príprava imunoglobulínu na intravenózne podanie:

Eluovaná IgG frakcia z kroku 6 je podrobená ultrafiltrácii a odsoleniu diafiltráciou proti 7,5 mM acetátu sodnému obsahujúcom 2,5 % váhovo maltózy, pH 5,4, až do dosiahnutia finálnej vodivosti menšej ako 1 mS/cm. Použitou membránou je polysulfónová membrána s cutoff nominálnej váhy 100 kDa, čo umožňuje elimináciu bielkovín s nižšou molekulovou váhou. Finálna koncentrácia IgG je upravená na 50 g/1 a koncentrácia maltózy činí finálne 10 % (w/v). Finálny preparát upravený maltózou je sfiltrovaný cez sterilný filter (Sartpure GF2, Sartorius) a aseptický naplnený.

Príklad 2

Výsledky analytickej štúdie produktu získaného predkladaným postupom v porovnaní s inými produktmi

	Gammonatív	Octagam	Gammagard	IVIG, SSI
	Lyofilizovaný	tekutý	lyofilizovaný	tekutý
Čistota	45,4 %	99,1 %	94,6 %	99,8 %
Albumín	50 mg/ml	malé množstvo	3 mg/ml	nedetekov.
Obsah monomérov + + dimérov	98,3 %	96,8 %	97,6 %	99,3 %
polyméry + agregáty	0,8 %	1,6%	menej ako 0,1 %	menej ako 0,1 %
ACA	26%	30%	34%	32%
PAK	menej ako 8,5	menej ako 8,5	menej ako 8,5	menej ako 8,5
	IE/ml	IE/ml	IE/ml	IE/ml
Hemaglutinín, 3 % roztok
anti A viacej ako 1 : 2	negatívne	negatívne	negatívne	negatívne
anti B viacej ako 1 : 2	negatívne	negatívne	negatívne	negatívne
Fc funkcia	169%	121 %	132 %	178 %
Rozloženie podtried
IgGl	60,0 %	61,9%	67,7 %	56,6 %
IgG2	35,8 %	33,1 %	27,2 %	39,4 %
IgG3	3,5 %	3,6 %	4,4 %	2,6 %
IgG4	0,7 %	1,4%	0,6 %	1,5 %
IgGA	2,96 mg/1	54,7 mg/1	0,85 mg/1	1,36 mg/1
IgM	0,28 mg/1	39,1 mg/1	0,99 mg/1	0,16 mg/1
Tween 80	menej ako 20 ppm	menej ako 20 ppm	neurčené	menej ako 20 ppm
TNBP	2,0 ppm	1,5 ppm	1,5 ppm	1,5 ppm
PEG	0,01 mg/ml	0,01 mg/ml	1,6 mg/ml	0,02 mg/ml
PH	6,7	5,7	6,7	5,6
Koncentrácia celkovej bielkoviny	97 g/1	45 g/1	50 g/1	51 g/1
Maltóza alebo glukóza	20 mg/ml	92 mg/ml	15 mg/ml	88 mg/ml

1: bez korekcie na HSA; 2: deklarované výrobcom; 3: korigované na HSA; 4: použité ako stabilizačná látka Čistota (bielkovinové zloženie)

Liekopisnými požiadavkami na čistotu preparátu IVIG je 95 % IgG, keď nie je prítomné viacej ako 5 % kontaminujúcich bielkovín. Čistota má veľký význam z niekoľkých dôvodov. Z racionálneho dôvodu by mala byť prítomná iba bielkovina, ktorá má požadovanú funkciu. Ostatné kontaminujúce bielkoviny môžu byť potenciálne škodlivé, napríklad môžu spôsobovať nechcené nežiaduce účinky a/alebo ovplyvňovať stabilitu produktu.

Čistota môže byť analyzovaná napríklad pomocou aaaelektroforetických techník, ako je detailne opísané v Európskom Liekopise, 1997, strany 964 - 965, kde sú bielkoviny separované na celulóza acetátovom géli. Z praktických dôvodov je ale použitý gél agarózový. Po elektroforéze je gél fixovaný, vysušený a ofarbený. Bielkovinové prúžky sú nakoniec monitorované skenovaním. Z uvedenej tabuľky je zrejmé, že produkt, ktorý je predmetom vynálezu, je skutočne čistý (99,8 %).

Albumín

Obsah albumínu bol analyzovaný skríženou imunoelektroforézou presne tak, ako je opísané C. B Laurellom (Anál Biochem (1965), 10, 358 - 361). Päť ul produktu bolo analyzovaných proti protilátkam proti ľudskému albumínu (DÁKO A/S, Dánsko, č. A0001 (1/100)). Z dôvodov vysokej čistoty nebol v analyzovanom produkte, ktorý je predmetom vynálezu, detekovaný žiadny albumín.

SK 288128 Β6

Obsah IgG mnonomérov a dimérov

Obsah monomérov a dimérov môže byť analyzovaný gélovou permeačnou chromatografiou a monitorovaný intergráciou plôch vrcholu monoméru a diméru z chromatogramu, cf. Ph. Eur. Výsledky z rôznych analýz sú vymenované v uvedenej tabuľke a z týchto výsledkov vyplýva, že suma plôch monoméru a diméru tvorí 99,3 % celkovej plochy chromatogramu (z čoho monomémy IgG tvorí 92 %) pre produkt, ktorý je predmetom vynálezu.

Obsah polymérov a agregátov

O prítomnosti polymérov a agregátov je známe, že môže spôsobiť závažné nežiaduce účinky, často príznaky podobné príznakom chrípky. Z dôvodov veľmi vysokého stupňa čistoty dosiahnutého veľmi šetrným výrobným postupom neobsahuje imunoglobulínový produkt získaný postupom, ktorý je predmetom vynálezu, prakticky žiadne polyméry a agregáty.

Polyméry môžu byť analyzované gélovou permeačnou chromatografiou. Akýkoľvek bielkovinový vrchol s retenčným časom kratším, ako je retenčný čas pre dimerický IgG je považovaný za polymémy, ako je opísané v Európskom Liekopise.

Podľa Európskeho Liekopisu a tiež iných smerníc by mal byť obsah bielkovinných agregátov prednostne nižší ako 3 %. Produkt, ktorý je predmetom predkladaného postupu, neobsahuje merateľné agregáty a je teda považovaný, že neobsahuje menej ako 0,1 % polymérov a agregátov.

Antikomplementáma aktivita (ACA) a aktivita prkalikreinového aktivátoru (PAK)

ACA P AK sú merané, ako je opísané v Európskom Liekopise.

ACA by mala byť prednostne čo najnižšia. Podľa Európskeho Liekopisu by mala byť konzumpcia komplementu nižšia alebo rovnajúca sa 50 %. Konzumpcia komplementu meranej vzorky produktu, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu je okolo 30 %. t. j. hodnota porovnateľná s inými analyzovanými produktmi. Malo by byť poznamenané, že prítomnosť albumínu má tendenciu potlačovať konzumpciu komplementu (pozorovanie vynálezcov).

P AK, pokiaľ je prítomná vo významnom množstve, je podkladom nežiaducim hypotenzívnych účinkov produktu. Z tohto dôvodu by mala byť PAK v imunoglobulínovom produkte prednostne čo najnižšia. Podľa Európskeho Liekopisu by mala byť pod 35 IU/ml, pokiaľ je meraná spôsobom opísaným v tomto dokumente. PAK produktu, ktorý je predmetom vynálezu, rovnako tak ako ostatných analyzovaných produktov je menšia, ako je hladina kvantitatívnej detekcie metód, t. j. pod 8,5/ml.

Hemaqlutiníny

IgM frakcie plazmatických imunoglobulínov zahŕňa hemaglutiníny, čo sú protilátky proti krvným antigénom typu A a B. Pokiaľ má príjemca krv typu A a B môže prítomnosť takých protilátok spôsobiť nechcene nežiaduce účinky v dôsledku možnej hemolytickej reakcie.

Podľa požiadaviek Liekopisu musí byť obsah hemaglutinínov nižší ako množstvo spôsobujúce hemaglutináciu A/B erytrocytov v pomere imunoglobulínového produktu 1 : 64. Všetky analyzované produkty spĺňajú túto požiadavku.

Fc funkcia

Zachované aktivity väzby antigénu sú nevyhnutné pre biologické funkcie IVIG. Toto platí tiež pre imunomodulačné aktivity. Na druhú stranu je zachovaná Fc funkcia nevyhnutná pre účinok IVIG na rôzne fagocytujúce bunky a pre aktiváciu komplementového systému. Fc funkcia môže byť demonštrovaná s použitím rôznych techník, ale akceptovaná metodika opísaná v Európskom Liekopise meria potenciál protilátok aktivovať komplement v preparáte proti antigénu šarlachu. Aktivita je porovnaná s aktivitou referenčného preparátu (BRP, Európsky Liekopis) imunoglobulínov nastaveného na 100 %. Produkt spĺňa test, pokiaľ je relatívna aktivita vyššia ako 60 % referenčného preparátu. Zdá sa, že Fc funkcia produktu, ktorý je predmetom vynálezu, je veľmi dobre zachovaná, najmä v porovnaní s ďalším analyzovaným tekutým produktom, najpravdepodobnejšie v dôsledku šetriaceho purifikačného postupu.

Rozloženie podtried

Rozloženie IgG podtried je merané štandardnou Manciniho imunodifúznou metódou presne tak, ako je opísané A. Ingildom (Scand J Immunol, (1983), 17,41). Koncentrácie sú určené pomocou WHO referenčného séra (67/97). Je požadované, že rozloženie podtried by malo byť v rozmedzí normálnej ľudskej plazmy s mediánom koncentrácií v rozmedzí 3,7 - 10,2 g IgGl séra, 1,1 - 5,9 g IgG2/l séra, 0,15 - 1,3 g IgG3/l séra a 0,06 - 1,9 IgG4/l séra (R. Djurup et al. Scand J Clin Lab Invest 48, 77 - 83). Z tohto dôvodu je rozloženie podtried vo všetkých produktoch prijateľné.

SK 288128 Β6

Obsah IgA

O prítomnosti IgA je známe, že môže potenciálne spôsobovať senzibilizáciu IgA deficientných príjemcov. Pokiaľ IgA deficientný príjemca dostane imunoglobulínový preparát obsahujúci IgA, môže byť IgA považované za cudzí antigén a výsledkom môže byť u príjemcu indukcia protilátok proti IgA. Pokiaľ je preparát obsahujúci IgA aplikovaný infúziou druhýkrát, môže dôjsť k vyvolaniu anafylaktickej reakcie. Z tohto dôvodu je nevyhnutné, aby imunoglobulínový preparát obsahoval čo najnižšie množstvo IgA. IgA v IVIG produkte môže byť monitorovaný pomocou ELISA techniky, kde napríklad je na vyvážanie IgA použitá polyklonálna protilátka anti-IgÁ a označená protilátka anti-IgA je použitá na detekciu naviazaného IgA. Štandardy sú vytvorené riedením kalibrátoru (č. X908, DÁKO A/S, Dánsko) s deklarovaným obsahom IgA.

Produkt postupu opísaného v príklade 1 obsahuje menej ako 2 mg IgA/1, čo je znateľne menej, ako je obsah IgA v ďalšom analyzovanom tekutom produkte. Fyzikálno-chemické podobnosti medzi IgG a IgA sťažujú oddeliť od seba tieto imunoglobulíny počas purifikačného postupu. Ale dva anexové/katexové chromatografické kroky znižujú obsah IgA na veľmi nízku úroveň.

Obsah IgM

IgM v imunoglobulínovom preparáte môže byť monitorované pomocou ELISA techniky, kde napríklad je na vyvážanie IgM použitá polyklonálna protilátka anti-IgM a značená protilátka anti-IgM je použitá na detekciu. Štandardy sú vytvorené riedením kalibrátora (č. X908, DÁKO A/S, Dánsko) s deklarovaným obsahom IgM. Z tabuľky je zrejmé, že produkt, ktorý je predmetom vynálezu obsahuje veľmi nízke množstvo IgM a znateľne menej IgM ako je obsah IgM v ďalšom analyzovanom tekutom produkte.

Tween 80, TNBP a PEG

Tween 80, TNBP a PEG sú merané štandardnými postupmi. Všeobecne by mal byť obsah týchto aditívnych látok čo najnižší.

pH pH analyzovaných tekutých produktov je kyslé, pH 5,6 - 5,7, zatiaľ čo analyzované lyofilizované produkty sú po rozpustení neutrálne s pH 6,7.

Celková koncentrácia bielkoviny

Podľa Európskeho Liekopisu by mala byť koncentrácia bielkoviny aspoň 50 g/1 ± 10 %; všetky produkty spĺňajú túto požiadavku. Koncentrácia bielkoviny je meraná metódou podľa Kjeldahla.

Stabilizačné látky maltóza a glukóza

Sacharidy sú bežne používané ako stabilizačné látky imunoglobulinových produktov, majú dobré stabilizačné vlastnosti a sú rýchlo vylúčené. Obsah maltózy, sacharózy a glukózy je určený pomocou komerčného kitu (Boehringer Manheim, Nemecko) s maltózou ako referenčnou látkou.

Je zrejmé, že dva lyofilizované produkty stabilizované albumínom a albumín, rovnako tak ako PEG, tiež obsahujú sacharidovú stabilizačnú látku v koncentráciách od 15 mg/ml do 20 mg/ml. Produkt, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu a ďalší tekutý produkt sú veľmi podobne stabilizované, t. j. obsahujú okolo 9 %, 88 mg/ml a 92 mg/ml maltózy. Čo sa týka obsahov polymérov a agregátov ako parametrov stability, má produkt, ktorý je predmetom vynálezu väčšiu stabilitu ako druhý analyzovaný tekutý produkt, aj keď sa ich zloženie javí ako veľmi podobné.

Príklad 3

Výsledky klinických štúdií

Klinické štúdie s produktom, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu, ktorý je tiež nazývaný ako IVIG, SSI, sú prevádzané v zhode so smernicami ICH a CPMP/3 88/95.

Boli vyšetrované farmakokinetiká, účinok a bezpečnosť. Klinické štúdie dosial zahŕňali štyri skupiny pacientov: pacientov so syndrómom primárnej imunodeficiencie (15 pacientov), pacientov so syndrómom sekundárnej imunodeficiencie (6 pacientov), pacientov s idiopatickou trombocytopenickou purpurou (15 pacientov) a pacientov s chronickou zápalovou demyelinizačnou polyneuropatiou (5 pacientov).

Pacienti so syndrómom primárnej a sekundárnej imunodeficiencie boli liečení 0,2 - 0,4 g/kg s intervalom 2-5 týždňov. Pacienti s idiopatickou trombocytopenickou purpurou boli liečení 400 mg/kg za deň počas 5 dní aíebo 1000 mg/kg za deň počas 2 dní.

Ako parametre bezpečnosti boli stanovené u všetkých pacientov sérové transaminázy, sérový kreatinín a vírusové markery. U piatich pacientov s idiopatickou trombocytepnickou purpurou boli počas 24 mesiacov sledované vírusové markery a markery poškodenia ľadvín a pečene.

Farmakokinetiká

Ti/2 bol zmeraný na 30,5 dňa (medián). To je v zhode s výsledkami ďalších IVIG liekov.

SK 288128 Β6

Účinok

U pacientov so syndrómom primárnej a sekundárnej imunodeficiencie boli registrované retrospektívne pre 6-mesačné obdobie, v ktorom boli pacienti liečení inými registrovanými IVIG liekmi, dni chorobnosti, hospitalizácie, dni na antibiotickej terapii, dni s horúčkou a počet zápalov pľúc. V nasledujúcom 6-mesačnom období, v ktorom boli pacienti liečení tekutým imunoglobulínom SSI boli registrované rovnaké parametre. Záverom je, že tekutý imunoglobulín SSI je rovnako účinný v profylaxii/prevencii infekcií u pacientov so syndrómom primárnej a sekundárnej imunodeficiencie ako ďalšie IVIG preparáty.

U 80 % pacientov s idiopatickou trombocytepnickou purpurou došlo k zvýšeniu počtu krvných doštičiek z menej ako 30 x 10⁹/l pred liečbou tekutým imunoglobulínom SSI na viacej ako 50 x 10⁹/l po liečbe. Zvýšenie počtu krvných doštičiek a trvanie remisie u individuálneho pacienta bolo v prípadoch, keď bolo možné porovnanie, rovnaké ako po podaní rovnakej dávky iných IVIG preparátov. Jeden pacient, ktorý bol liečený IVIG po prvýkrát, bol refraktómy na testovaný liek. Taká reakcia na IVIG nie je vzácna, a preto neprekvapuje. Analýza detailov vzostupu krvných doštičiek a trvanie tohto vzostupu prebieha.

Záverom je, že tekutý imunoglobulín SSI je rovnako účinný liečbe nízkeho počtu krvných doštičiek u pacientov s idiopatickou trombocytepnickou purpurou ako ďalšie IVIG preparáty.

Podľa klinikov a pacientov trpiacich chronickou zápalovou demyelinizačnou polyneuropatiou sú IVIG SSI rovnako účinné ako IVIG podávané pred klinickou štúdiou. IVIG SSI boli pacientmi tolerované rovnako dobre, ako boli tolerované ďalšie IVIG produkty.

Bezpečnosť

Okrem jednej závažnej nežiaducej udalosti, splenektómie, ktorá bola posúdená výskumným pracovníkom, že nemá vzťah k testovanému lieku, boli registrované iba mierne nežiaduce účinky. Týmito nežiaducimi účinkami boli hlavne bolesti hlavy, horúčka a zvracanie. Dosiaľ neboli opísané počas infuznej liečby IVIG SSI abnormálne vitálne znaky. Nebola registrovaná žiadna vírusová sérokonverzia. Nebolo hlásené žiadne poškodenie ľadvín alebo pečene, ani prípady anafylaktického šoku.

Klinické štúdie preukázali, že tekutý IVIG SSI je dobre tolerovaný. Častosť vedľajších účinkov, stupeň a ich typ sa nelíšili od skúseností s inými IVIG preparátmi.

Príklad 4

Výsledky stabilitnej štúdie pre tekutý IVIG

Na účely testovania, či tekutý IVIG preparát je stabilný po dlhší čas, bola uskutočnená štúdia na stabilitu tohto preparátu za reálnych podmienok v reálnom čase. V štúdiu bol použitý celkový počet štyroch po sebe idúcich šarží IVIG produktu (250 ml v každej vzorke), ktoré boli skladované pri teplote 2 °C - 8 °C počas 12 mesiacov. Vzorky zo štyroch šarží boli analyzované v čase 0, po 6 mesiacoch skladovania a po 12 mesiacoch skladovania. Výsledky štúdie sú uvedené ako priemery zo štyroch šarží.

	0 mesiacov skladovania	6 mesiacov skladovania	12 mesiacov skladovania
Vzhľad	mierne opalescentný	mierne opalescentný	mierne opalescentný
	a bezfarebný	a bazfarebný	a bezfarebný
Obsah Monomérov+ dimérov	100%	99,6 %	99,5 %
polyméry+ agregáty	menej ako 0,1 %	menej ako 0,1 %	menej ako 0,1 %
ACA PAK	39,7 % menej ako 8,5 IE/ml	38,2 % menej ako 8,5 IE/ml	37,3 % menej ako 8,5 IE/ml
Rozloženie podtried
IgGl	59,2 %	57,7 %	57,1 %
IgG2	36,4 %	38,1 %	38,6 %
IgG3	2,7 %	2,6 %	2,5 %
IgG4	1,8%	1,6%	1,7 %
pH	5,5	5,5	5,5
Zloženie bielkovín (%IgG)	99,8 %	99,7 %	99,1 %
celková koncentrácia bielkovín	48,8 g/1	48,3 g/1	49,2 g/1
Osmolalita	348 mOsm/kg	347 mOsm/kg	350 mOsm/kg

SK 288128 Β6

Všetky spomínané testy boli uskutočnené v zhode s Európskym Liekopisom, ako je uvedené v príklade 2.

Pozorovanie, že obsah monomérov a dimérov je konštantný počas 12 mesiacov ukazuje, že vo vzorke nevznikajú polyméry. O prítomnosti imunoglobulínových polymérov je známe, že okrem iných spôsobujú závažne nežiaduce účinky, často príznaky podobné chrípke. Kvôli veľmi vysokej stabilite imunoglobulínového produktu získaného postupom, ktorý je predmetom vynálezu, neobsahuje produkt prakticky žiadne polyméry a agregáty dokonca ani po dlhšom čase skladovania.

Počas sledovania nebolo pozorované zvýšenie ACA, aj keď do tejto stabilnej štúdie boli úmyselne zahrnuté šarže s viacej vyššou ACA. Pokiaľ bolo pozorované zvýšenie ACA, môže to ukazovať, že počas skladovania došlo k vytvoreniu agregátov. Preto konštantná ACA počas sledovania ukazuje, že nedošlo k tvorbe žiadnych agregátov.

Výsledky ďalej ukazujú, že počas sledovania produktu nedošlo k rozvoju prekalikreinovej aktivity, pretože sa PAK aktivita nezvýšila. Malo by však byť poznamenané, že zmerané hodnoty sú pod hladinou kvantitatívnej detekcie.

Parameter Fc funkcie ukazuje, že počas skladovania je zachovaná prítomnosť intaktných funkčných IgG. Z tohto dôvodu nie sú vo vzorkách prítomné proteázy, pretože proteázy by degradovali bielkoviny a tým znížili Fc funkciu. K denaturácii IgG molekúl nedošlo, pretože denaturácia by znížila aktivitu viazať antigén.

Ako bude zrejmé osobe znalej odboru, môžu existovať rozdiely v stabilite rôznych podtried IgG. Ako môže byť zrejmé z predložených výsledkov, sú počas skladovania zachované všetky podtriedy, čo ukazuje na to, že produkt je stabilný. To je ďalej podporené nálezom, že bielkovinové zloženie IgG vo vzorkách s približne rovnakou koncentráciou celkovej bielkoviny je takmer nezmenené počas sledovania, čo ukazuje, že nedochádza k degradácii IgG. To značí, že produkt, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu je stabilný a môže byť skladovaný počas aspoň 12 mesiacov pri teplote 2 - 8 °C bez zmien charakteristík, a týmto je demonštrovaná účinnosť a bezpečnosť.

Príklad 5

Validované kroky znižujúci prítomnosť vírusov v predkladanom postupe prípravy IVIG

Odstránenie vírusu oddeľovacím krokom

Precipitácia vírusu prítomného v imunoglobulínovom roztoku polyetylén glykolom.

Validačné štúdiá na prítomnosť vírusu boli prevedené s použitím dvoch neobalených vírusov a bolo získané nasledujúce zníženie prítomnosti vírusu:

odstránenie 6,3 logio vírusu hepatitídy A (HAV) odstránenie 7,2 logio vírusu polyomyelitídy

Validačné štúdiá na prítomnosť vírusu boli prevedené s použitím dvoch obalených vírusov a bolo získané nasledujúce zníženie prítomnosti vírusov: odstránenie 7,6 logio vírusu HIV odstránenie 7,5 logio vírusu BVDV Inaktivácia vírusu postupom S/D

Reakcia imunoglobulínového roztoku s 1 % roztokom Tween 80 + 0,3 % TNBP, pri teplote 25 °C počas viac ako 6 hodín.

Validačné štúdiá na prítomnosť vírusu boli prevedených s použitím štyroch obalených vírusov a bolo získané nasledujúce zníženie prítomnosti vírusov: inaktivácia 7,4 logio vírusu HIV inaktivácia 5,3 logio vírusu Sindbis inaktivácia 4,1 logio vírusu BVDV inaktivácia 5,1 logio vírusu PRV

Celkom 8 validačných štúdií bolo prevedené na dvoch rôznych krokoch postupu, ktorý je predmetom predkladaného postupu. PEG precipitačný krok bol validovaný ako krok odstraňujúci vírusy s použitím 4 rôznych vírusov, dvoch malých neobalených vírusov, vírusu HAV a vírusu polimyelitídy, a dvoch obalených vírusov. Vírusu BVDV a vírusu hepatitídy C.

Tieto štúdiá preukázali, že všetky štyri vírusy boli účinne odstránené PEG precipitáciou. PEG precipitačný krok je preto validovaný ako krok účinne odstraňujúci vírusy. S/D postup bol validovaný s použitím 4 rôznych obalených vírusov. Z výsledkov validačných štúdií je zrejmé, že S/D postup účinne inaktivuje všetky štyri vírusy. S/D postup je preto validovaný ako krok účinne inaktivujúci vírusy. U oboch krokov znižujúcich prítomnosť vírusov v postupe prípravy IVIG, teda odstránení PEG precipitáciou a inaktivácie S/D postupom, bolo preukázané, že každý účinne odstraňuje a inaktivuje štyri rôzne vírusy. Kumulatívne faktory zníženia prítomnosti vírusu HIV a BVDV počas postupu sú 15, respektíve 11,6. Týmto môže byť predkladaný postup považovaný za bezpečný z hľadiska prítomnosti vírusov.

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob purifikácie imunoglobulínu G (IgG) z hrubej frakcie plazmatických bielkovín obsahujúcich imunoglobulíny, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky:

   a) prípravu vodnej suspenzie hrubej frakcie plazmatických bielkovín obsahujúcich imunoglobulíny;

   b) pridanie vo vode rozpustnej precipitačnej látky, ktorá významnej nespôsobuje denaturáciu bielkovín, k spomínanej suspenzii z kroku (a) v množstve dostatočnom k vyvolaniu precipitácie veľkej časti bielkovín nepatriacich k imunoglobulínu G, agregovaných imunoglobulínov a častíc zahŕňajúcich vírusové častice bez spôsobenia významnejšie precipitácie monomémeho imunoglobulínu G, čím dochádza k tvorbe zmesi pevného precipitátu a tekutého supematantu;

   c) získanie prečisteného supematantu obsahujúceho imunoglobulín G zo zmesi z kroku (b);

   d) aplikáciu prečisteného supematantu obsahujúceho imunoglobulín G z kroku (c) na anexovú živicu a následne na katexovú živicu, kde anexová a katexová živica sú zapojené do série, použitý pufer pre anexovú aj katexovú chromatografiu je rovnaký, a pH spomínaného pufra je pod 6,0;

   e) vymytie bielkovinných kontaminujúcich látok a bielkovinného precipitátu z katexovej živice z kroku (d) pomocou pufra majúceho pH a iónovú silu dostatočnú na odstránenie kontaminujúcich látok zo živice bez spôsobenia významnejšej elúcie imunoglobulínu G;

   f) elúciu imunoglobulínu G z katexovej živice z kroku (e) pomocou významnejšie nedenaturujúceho pufra majúceho pH a iónovú silu dostatočnú na spôsobenie účinnej elúcie imunoglobulínu G, čím dochádza k získaniu eluátu, ktorý obsahuje imunoglobulín G;

   g) prevedenie dia/ultrafiltrácie eluátu obsahujúceho imunoglobulín G z kroku f) na účely koncentrácie a/alebo dialýzy eluátu, a prípadné pridanie stabilizačnej látky;

   h) pridanie virucídneho množstva látky inaktivujúcej vírusy k dia/ultrafiltrovanej a prípadne stabilizovanej frakcii z kroku g) za získania roztoku obsahujúceho imunoglobulín G, ktorý je významne bezpečný s ohľadom na prítomnosť vírusov;

   i) aplikáciu roztoku obsahujúceho imunoglobulín G z kroku h) na anexovú a následne na katexovú živicu;

   j) premytie katexovej živice z kroku i) pomocou pufra majúceho pH a iónovú silu dostatočnú k vymytiu bielkovinných kontaminujúcich látok a látky inaktivujúcej vírusy zo živice bez spôsobenia významnejšej elúcie imunoglobulínu G;

   k) elúciu imunoglobulínu G z katexovej živice z kroku j) pomocou významnejšie nedenaturujúceho pufra majúceho pH a iónovú silu dostatočnú účinnú elúciu imunoglobulínu G, za získania eluátu obsahujúceho imunoglobulín G; a

   l) podrobenie eluátu obsahujúceho imunoglobulín G z kroku k) dia/ultrafiltrácii na účely zníženia iónovej sily a zakoncentrovanie imunoglobulínu G v roztoku, až na dosiahnutie vodivosti menšej alebo rovnajúcej sa 1 mS/cm.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že frakcia plazmatických bielkovín obsahujúca imunoglobulín G je vybraná zo skupiny tvorenej Cohnovou frakciou II; Cohnovými frakciami II a III; a Cohnovými frakciami I, II a III.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že suspenzia v kroku (a) je udržiavaná pri teplote od 0 °C do 12 °C a pH pod 6,0.
4. 4. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že bielkovinová precipitačná látka v kroku (b) je vybraná zo skupiny tvorenej polyetylénglykolom (PEG), kyselinou kaprylovou a síranom amónnym.
5. 5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že bielkovinová precipitačná látka je vybraná zo skupiny tvorenej PEG v rozmedzí molekulových hmotností 3000 až 8000 Da.
6. 6. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že anexová a katexová živica v kroku (i) sú zapojené do série.
7. 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že použitý pufer pre anexovú a katexovú chromatografiu je rovnaký a pH spomínaného rovnakého pufra je pod 6,0.
8. 8. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že anexová živica v kroku (d) a/alebo kroku (i) obsahuje dietylaminoetylskupiny a/alebo katexová živica v kroku (d) a/alebo kroku (i) obsahuje karboxymetylové skupiny, živicami sú prednostne DEAE Sepharose FF a CM Sepharose FF.
9. 9. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že použitý pufer v krokoch (b) až (1) je acetátový pufer.
10. 10. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že látka inaktivujúca vírusy v kroku (h) je zmesou aspoň jedného neiónového alebo iónového detergentu a aspoň jedného rozpúšťadla.
11. 11. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že látka

    SK 288128 Β6 inaktivujúca vírusy v kroku (h) je zmesou aspoň jedného významnejšie nedenaturujúceho detergentu a tri(nbutyljfosfátového rozpúšťadla.
12. 12. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa v kroku a) vodná suspenzia hrubej frakcie plazmatických bielkovín obsahujúcich imunoglobulín pripraví tak, že koncentrácia IgG vo vodnej suspenzii je aspoň 4 g/1, pH suspenzie obsahujúcej imunoglobulín leží v rozmedzí 5,1 až 5,7 a suspenzia obsahujúca imunoglobulín sa ďalej filtruje pomocou hĺbkovej filtrácie; a v kroku b) uvedená rozpustná, v podstate bielkoviny nedenaturujúca precipitačná látka zvolí zo súboru zahrnujúceho PEG 3350, PEG 4000 alebo PEG 6000 a je pridaná v koncentrácii v rozmedzí 4 až 10 % hmotn. a inkubovaná počas 2 až 12 hodín pri teplote medzi 2 a 8 °C; a v kroku c) sa prečistený supernatant hĺbkovo filtruje na odstránenie väčších častíc a agregátov; a v kroku d) je uvedenou anexovou živicou živica DEAE Sepharose Fast Flow (DEAE) a uvedenou katexovou živicou je CM Sepharose Fast Flow (CM), pH uvedeného pufra je v rozmedzí 5,4 až 5,9 a vodivosť je v rozmedzí 1,0 až 1,4 mS/cm, pričom stĺpce DEAE a CM sa premyjú jedným objemom stĺpca premývacieho pufru a potom odpoja; a v kroku e) má pufer pH medzi 5,2 až 5,8; a v kroku f) sa elúcia uskutočňuje ako gradientový elučný stupeň od 125 mM do 350 mM chloridu sodného pri pH v rozmedzí 5,2 až 5,8; a v kroku g) sa eluát zo stupňa f) obsahujúci imunoglobulín G dia/ultrafiltruje na účely zahustenia a/alebo sa eluát dialyzuje na dosiahnutie zníženia vodivosti ultrafiltrovaného roztoku na hodnotu nižšiu ako 1,3 mS/cm, pričom pH sa udržiava v rozmedzí 4,0 až 6,0 a prípadne sa pridá stabilizujúce činidlp.
13. 13. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje pridanie stabilizátora.
14. 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že sa pridajú alkoholické cukry, cukry, aminokyseliny alebo organické činidlá.
15. 15. Kvapalný imunoglobulínový produkt majúci nasledujúce charakteristiky:

    a) čistotu viacej ako 98 %,

    b) obsah IgG monomérov a dimérov vyšší ako 98,5 %,

    c) obsah IgA menší ako 6 mg IgA/1, a

    d) obsah IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4, pričom koncentrácia IgG je 1 až 20 % hmotn.
16. 16. Imunoglobulínový produkt podľa nároku 15, kde koncentrácia IgG sa rovná 5, 10, 12, 14, 16, 18 alebo 20 % hmotn.
17. 17. Imunoglobulínový produkt podľa niektorého z nárokov 15 až 16, ktorý neobsahuje albumín ako stabilizátor.
18. 18. Imunoglobulínový produkt podľa niektorého z nárokov 15 až 17 majúci vodivosť menšiu ako 1 mS/cm.
19. 19. Imunoglobulínový produkt podľa niektorého z nárokov 15 až 18, ktorý neobsahuje detergent, PEG alebo albumín ako stabilizačnú látku.
20. 20. Imunoglobulínový produkt podľa niektorého z nárokov 15 až 19, ktorý obsahuje menej ako 4 mg/1 IgA.
21. 21. Imunoglobulínový produkt podľa niektorého z nárokov 15 až 20, ktorý obsahuje menej ako 3 mg/1 IgA.
22. 22. Imunoglobulínový produkt podľa niektorého z nárokov 15 až 21, ktorý obsahuje medzi 55 a 65 % IgG 1, medzi 30 a 40 % IgG2, medzi 2 a 5 % IgG3 a medzi 1 a 4 % IgG4.
23. 23. Imunoglobulínový produkt podľa niektorého z nárokov 15 až 22, ktorý obsahuje menej ako 1,5 % polymérov a agregátov.
24. 24. Imunoglobulínový produkt podľa niektorého z nárokov 15 až 23, ktorý obsahuje menej ako 0,5 % polymérov a agregátov.
25. 25. Imunoglobulínový produkt podľa niektorého z nárokov 15 až 24, na okamžité intravenózne podanie.
26. 26. Imunoglobulínový produkt podľa niektorého z nárokov 15 až 25 na použitie v medicíne.
27. 27. Použitie imunoglobulínového produktu podľa niektorého z nárokov 15 až 26 na prípravu lieku na liečbu cicavcov s PID (primárnou imunodeficienciou), SID (sekundárnou imunodeficienciou, ITP (idiopatickou trombocytepnickou purpurou, polyradikulitídou, periférnou polyneuropatiou, Kawasakiho chorobou, polymyositídou, závažnými chronickými autoimúnnymi ochoreniami, chronickými zápalovými demyelizačnými polyneuropatiami (CIDP), multifokálnou motorickou neuropatiou, roztrúsenou sklerózou, myasténiou gravis, Eaton-Lambertovým syndrómom, neuritídou optiku, epilepsiou, habituálnymi potratmi, primárnym antifosfolipidovým syndrómom, reumatoidnou artritídou, systémovým lupus, erytematózus, systémovou sklerodermiou, vaskulitídou, Wegenerovou granulomatózou, Sjôgrenovým syndrómom, juvenilnou reumatoidnou artritídou, autoimúnnou neutropéniou, autoimúnnou anémiou, neutropéniou, Crohnovou chorobou, ulceróznou kolitídou, coeliakiou, astmou, syndrómom septického šoku, chronickým únavovým syndrómom,

    SK 288128 Β6 psoriázou, syndrómom toxického šoku, diabetom, sínusitídou, dilatačnou kardiomyopatiou, endokarditídou, aterosklerózou, a liečbu dospelých jedincov s AIDS a bakteriálnymi infekciami.
28. 28. Použitie podľa nároku 27, kde cicavcom je človek.