KR101657690B1 - 혈장 유래 b형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법 - Google Patents

혈장 유래 b형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 B형 간염 사람 면역글로불린을 함유하는 혈장단백질 분획 Ⅱ(fraction Ⅱ)를 투석 농축시킨 다음, 음이온 교환수지 및 양이온 교환수지 정제기법을 통해 혈전 생성 물질 및 공정 중 불순물을 제거하는 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법을 이용하면, 불순물 및 혈전 생성물질을 제거효율을 높이고, 중합체 함량을 유지할 수 있으므로, 안정적이고 향상된 품질의 B형 간염 사람 면역글로불린의 생산이 가능하다.

Description

혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법{Methods for Preparing Hepatitis B immune globulin derived from plasma}
본 발명은 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린을 함유하는 혈장단백질 분획 Ⅱ (fraction Ⅱ)를 투석 농축시킨 다음, 음이온 교환수지 및 양이온 교환수지 정제기법을 통해 혈전 생성 물질 및 공정 중 불순물을 제거하고, 바이러스 불활성화시 첨가되는 용매 및 세정제를 효과적으로 제거하며, 극미세여과 및 안정제를 첨가하여 안정성이 뛰어난 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법에 관한 것이다.
면역글로불린은 여러 가지 바이러스 및 세균에 대한 항체를 함유하고 있는 혈장 단백으로서 선천적인 항체 결핍자 또는 바이러스성이나 세균성 질환으로 말미암아 항체의 인위적인 보충을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 질환의 예방과 치료에 사용되는 약제이다.
이러한 면역글로불린을 약제로 사용하기 위해 콘 및 온클레이(Cohn & Oncley)에 따른 냉에탄올 분획법(Cohn E. et al., J. Am. Chem . Soc ., 68:459, 1946) 및 키슬러 및 니츠만에 따른 변형법(Kistler P, Nitschmann HS, Vox Sang, 7:414. 1952)으로 피하 및 근육 주사용 면역글로불린이 제조되었다.
하지만, 근육 주사용 면역글로불린은 1) 투여량이 제한되어 대량 투여가 불가능하며, 2) 주사시 주사부위에 동통현상이 나타나고, 3) 항체능력을 가진 고유의 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG) 함량이 적으며, 4) 주사부위의 단백분해효소에 의한 글로불린의 항체가가 감소되고, 5) 최대혈중농도 도달시간은 24시간 이상이 소요되는 문제점이 있다.
근육 주사의 문제점을 해결하기 위해 정맥 주사를 통한 면역글로불린의 투여가 시도되었으나, 면역글로불린 제제를 정맥으로 투여할 경우 항보체활성(Anticomplementary activity)이 있는 응집체(Aggregate)에 기인하는 부작용(Anaphylacticreaction)이 심각하여 호흡 곤란 현상에서부터 순환계 쇼크까지의 다양한 즉각적인 부작용이 나타났다. 상기의 증상은 주로 면역글로불린이 결핍된 환자들에게서 보였으며, 특히 심각한 과민성 증상의 부작용은 Ig A에 대한 항체가 나타난 환자들에서 관찰되었다.
즉, 정맥주사용 제제를 개발하기 위해서는 혈액응고 인자(피브리노겐, 알부민, prekallikrein activator(PKA) 및 트랜스페린 등) 또는 IgA 및 IgE 등의 B형 간염 면역글로불린과 유사한 면역글로불린 등의 불순물을 제거하여 순도와 안정성을 높일 필요가 있다.
따라서, 상기 문제로 인해 정맥주사가 불가능함에 따라, 정맥주사용 제제의 개발이 요구되었으며, 제조 공정 동안에 이러한 응집체를 제거하고, 및/또는 응집체 형성을 방지할 수 있는 방법들이 개발되었다. 펩신(pepsin), 파페인(papain), 플라스민(Plasmin)등 단백분해 효소나 베타프로 피오락톤(β-propiolactone)등의 화학물질로 처리하고 구조를 변화시켜 응집체의 생성을 저지하거나 파괴하여 항보체 활성을 저하시켜 줌으로써 정맥주사가 가능하게 되었다.
제1세대 정맥주사용 면역글로불린(Intravenous Immunoglobulin; IVIG)은 면역글로불린 응집체를 제거하기 위해 출발물질(콘 분획 II)에 펩신을 처리하였다. 상기 공정에는 컬럼 크로마토그래피 단계가 포함되어 있지 않으며, 제조된 제품은 적당한 기간 동안 안정하게 유지되도록 동결건조시키고, 사용직전에 용해시켜 사용하였다. 하지만, 일부 제조사의 IVIG 제품에서 바이러스성 간염 C등의 바이러스의 감염을 유발시키는 것으로 밝혀졌으며, 이에 제조 공정에 하나 이상의 공지의 바이러스 비활성화 및/또는 제거 단계가 추가로 포함되었다. 이후, 낮은 항보체 활성과 좀더 높은 안정성을 가지는 제2세대 IVIG가 80년대 중반에 개시되었으며, 상기 IVIG는 여러 단계의 크로마토그래피 단계들을 거쳐 정제되었다.
이러한 제제들은 정맥 주사함에 따라 근육주사용 면역글로불린의 단점이었던 투여량의 제한, 주사부위의 동통 현상, 단백분해 효소에 의한 글로불린의 항체가 감소 등이 해결되었으며 최대 혈중농도 도달시간도 수시간 이내로 단축되었다.
그러나, 상기 정액주사용 면역글로불린은 구조를 변화시켜 항체능력을 가진 고유의 IgG는 거의 없어 보체결합능력이 저하되거나 없고, 혈중농도 반감기도 4-12일 정도로 짧아 질병의 예방과 치료에 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있다. 또한, 동결건조된 분말 형태로 제조된 상기 제1 및 2세대 IVIG는 추가로 용해시키는 작업이 필요하며, 용해속도가 느리기 때문에 액상 IVIG 제품들이 개발되었으며, 좀더 안정하고 순수한 IVIG 제품을 얻을 수 있도록 향상된 공정이 요구되었다.
이에 대하여 독일특허 제 2,604,759호 및 미국특허 제 4.124,576호 등에 소개된 방법(제3세대 IVIG)은 상기 정맥 주사용 감마글로불린과는 달리 폴리에틸렌글리콜 등 비이온성 계면활성제를 사용하여 항체 능력을 가진 고유의 IgG를 얻는 방법이 개발됨으로써 보체결합 능력이 있고 혈중농도 반감기가 일정도로 길어져서 질병의 예방과 치료에 좋은 효과를 거둘 수가 있게 되었으나, 폴리에틸렌글리콜 처리로 제조된 이들 제제도 항보체 활성이 있는 응집체를 완전히 제거하기가 어려워(항보체가가 0.02 단위/mg 정도를 나타냄) 부작용의 발생 소지가 남아있는 문제점이 있다.
또한, 한국공개특허 제1983-0007083호 역시, 사람 혈장으로부터 분리된 콘(cohn) 분획 Ⅱ 또는 분획 Ⅱ＋Ⅲ로부터 폴리에틸렌글리콜 처리를 통해 정맥주사용 면역글로불린을 제조하였으나, 공정이 복잡하며 수율이 낮은 문제점이 있다.
한편, B형 간염 바이러스(HBV)는 헤파드나바이러스(Hepadnaviridae) 패밀리에 속하는 DNA 게놈을 갖는 바이러스로서, 급성 및 만성 간염을 유발한다. B형 간염 바이러스(HBV)는 서로 유전자 염기서열이 약 8% 이상 다른 8개의 유전자형으로 분류하거나 B형 간염 바이러스(HBV) 표면항원(HBsAg) 두 곳의 항원결정부위 (d/y, w/r)를 중심으로 4종의 혈청형(adw, adr, ayw, ayr 등)으로 구분한다. 전 세계 인구 중의 약 3.5억 명이 B형 간염 바이러스(HBV) 만성 감염자이며, 특히 한국 및 중국은 만성 감염자가 약 5~8%에 이르며, B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 이 지역의 간질환 및 간암의 주원인이다. 현재는 백신의 개발로 어느 정도 예방이 가능해졌지만 아직도 B형 간염 바이러스에 의한 만성 간염 환자가 상당수 존재하고 있는 현실이다. B형 간염 바이러스(HBV)의 만성 감염은 간염, 간경변 뿐만 아니라 간암을 유발하며 만성 감염자가 비감염자에 비해 간암 발생빈도가 약 300배 높게 나타나는데, WHO의 조사에 따르면 약 80%의 간암은 만성 B형 간염이 원인이라고 알려져 있다..
현재 알려진 B형 간염 치료제는 뉴클레오사이드 유사체(nucleoside analogue)인 라미부딘(lamivudine)과 아데포비어(adefovir dipivoxil)등이 있으며, 이들은 B형 간염 바이러스(HBV) 중합효소(HBV polymerase)의 역전사효소(reverse transcriptase)를 저해함으로써 B형 간염 바이러스(HBV)의 DNA 복제를 저해한다. 하지만, 3년 투약 시 약 75%의 환자에서 내성 바이러스가 발생하여 치료 효과가 저하되는 문제점이 있어, 바이러스 복제 저해제를 단독으로 사용하여 B형간염을 치료하는 것은 불가능하게 되어 이에 대한 대안으로 인터페론 제제와의 병용 치료를 시도하는데, 심각한 부작용으로 인해 현재는 사용하고 있지 않다.
유사한 치료 목적으로 면역글로불린의 일종으로, B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 항체를 역가가 높은 혈액에서 분리 및 정제한 B형 간염 사람 면역글로불린 (hepatitis B immune globulin; HBIG) 제제를 고려하는데 상기의 HBIG 제제의 항체는 혈장으로부터 분리정제 하여 제조하기 때문에 원료 혈장 확보, 바이러스 감염의 우려, 낮은 활성, 고비용 등의 문제점이 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 기존의 문제를 해결하기 위하여 노력한 결과, 혈장에서 분리한 분획 Ⅱ를 투석/농축시킨 다음, 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하되, 양이온교환 크로마토그래피 및 용출시 염 농도를 조절함으로써, 혈장 내 존재하는 혈전생성물질이 효율적으로 제거되고, 제품의 안정성이 향상되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 순도가 높고 안정성이 뛰어난 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은
(a) B형 간염을 앓았거나, B형 간염백신 추가면역을 받은 건강한 공혈자로부터 채장된 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린을 함유하는 혈장단백질 분획 Ⅱ (fraction Ⅱ)를 용해시킨 다음, 여과하여 분획 Ⅱ 용액을 수득하는 단계;
(b) 상기 수득된 분획 Ⅱ 용액을 투석 및/또는 농축시킨 다음, 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계;
(c) 바이러스 불활성화를 위하여 상기 수득된 분획에 용매 및 세정제를 처리한 후, 용매 및/또는 세정제, 및 혈전 생성물질을 제거하기 위하여 양이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(d) 상기 양이온교환 크로마토그래피 용출액을 투석 및/또는 농축시키는 단계; 및
(e) 상기 투석 및/또는 농축된 용액을 여과하여 B형 간염 사람 면역글로불린을 수득하는 단계;
를 포함하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법을 제공한다
상기 (e) 단계 이후 안정제를 첨가한 뒤, 역가를 조정하고 세균여과하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 “혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린”은 Human Hepatitis B immunoglobulin을 의미하는 것으로, B형 간염을 앓았거나, 혈장분획제제를 제조할 목적으로 B형 간염백신 추가면역을 받은 건강한 공혈자로부터 채장된 항 B 형 간염 면역글로불린-지 함유 혈장으로부터 제조된 B형 간염 사람 면역글로불린으로 바람직하게는 헤파빅일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린을 함유하는 혈장단백질"이라 함은 인간 혈장 또는 인간 태반 유래 혈장에서 Factor IX 및 항트롬빈과 같은 다양한 혈장 단백질이 제거된 무-저온침전물(cryoprecipitate-free) 혈장, 다양한 콘(Cohn) 분획 및 암모늄 설페이트 또는 PEG(Polson et al., Biochem Biophys Acta, 82:463, 1964); Polson and Ruiz-Bravo, Vox Sang, 23:107. 1972)에 의한 침전법을 통해 얻어지는 분획들을 포함한다. 바람직하게 혈장 단백질 분획은 콘 분획 Ⅱ 이나, 콘 분획 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ 또는 콘 분획 Ⅱ+Ⅲ도 마찬가지로 사용될 수 있다.
본 발명에서는 인간 혈장으로부터 얻어진 분획 Ⅱ(fraction Ⅱ)를 사용하였으며, 통상적인 콘 혈장 분획법에 따라서 제조되었다. 분획 Ⅱ에 포함된 다양한 리포프로테인류, 피브리노겐, α-글로불린, β-글로불린 및 다양한 응고인자들을 제거하기 위한 후속 정제공정을 수행하였다.
본 발명에서, 인간 혈장은 바람직하게는 혈장분획제제 제조용 원료로 사용할 목적으로 건강한 사람에게 B형 간염백신으로 추가면역을 실시하여 혈장 내 항 B 형 간염 면역 글로불린-지의 수치를 향상시킨 뒤, 성분채혈(apheresis)을 통해 혈장부분만을 취하여 동결한 것으로, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), C형 간염바이러스(HCV) 및 B형 간염바이러스(HBV) 에 대한 핵산증폭검사(NAT; Nucleic Acid Amplification Test) 및 혈청학적 검사를 포함하는 바이오테스트(Biotest)를 거쳐, -20℃ 이하에서 보관되어 있던 혈장을 1 내지 6℃의 자켓식 반응기(jacketed vessel)에서 12 내지 72시간 동안 반응시켜 녹였다.
상기 조건에서 혈장이 녹으면서 피브리노겐(fibrinogen) 및 응고인자(coagulation factors)가 포함된 동결침강혈장(cryoprecipitate)이 생성되는데, 원심분리를 통해 동결침강혈장을 제거시키고, 동결침강혈장이 제거된 냉동 결핍성 혈장(cryopoor plasma)을 회수하였다. 그 후 침전과 여과 과정을 반복하여 최종적으로 분획 Ⅱ(fraction Ⅱ)를 수득하였다.
혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린이 포함된 혈장을 분리하기 위한 여과과정은 필터 보조제를 첨가하여 혼합시킨 다음 필터 프레스를 사용하여 상층액과 침전물을 분리하였으며, 상기 필터 보조제는 Celite(STD), Harbolite(Expanded perlite product) 등을 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 혈장단백질 분획 Ⅱ의 용해는 혈장단백질분획 부피의 2 내지 10배가 되도록 염화나트륨(sodium chloride) 용액을 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 한다.
혈장 단백질 분획은 실질적으로 비-변성 온도 및 pH에서 물 및/또는 완충액에 현탁액화(용해)되는 것이 바람직하다. "실질적으로 비변성"은 상기 언급된 조건이 면역글로불린분자들의 기능성 활성의 실질적으로 비가역적인 손실, 예컨대, 항원결합 활성 및/또는 생물학적 Fc-작용의 손실을 야기시키지 않는 것을 의미한다.
유리하게는, 혈장 단백질 분획은 플라즈마 단백질 분획 부피의 2 내지 10, 바람직하게는 3 내지 5배의 부피로 하나 이상의 비변성 완충제로 산성화된 물에 용해시키며, B형 간염 사람 면역글로불린-함유 현탁액의 pH는 B형 간염 사람 면역글로불린의 최적의 용해도를 보장할 수 있도록, pH 6.0 이하, 바람직하게는 4.0 내지 6.0, 더욱 바람직하게는 4.5 내지 5.5, 가장 바람직하게는 4.8 내지 5.2가 되도록 유지한다. 산성 완충액으로 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 인산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 아세트산, 염산, 물(증류수) 등을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 염화나트륨 용액을 사용하였다.
혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 현탁액은 단백질 변성을 방지하고 프로테아제 활성을 최소화 할 수 있도록 낮은 온도에서 유지시키며, 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 현탁액과 물 또는 첨가되는 완충액은 바람직하게 -12 내지 10℃, 더 바람직하게는 -12 내지 0℃, 가장 바람직하게는 -12 내지 -8℃ 범위를 유지하도록 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 여과는 분획 Ⅱ 용액을 수득하기 위한 단계로서, 청정여과(clarifying filtration)인 것을 특징으로 하며, pH가 4.5 내지 5.5가 되도록 조절하여 수행되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 pH가 4.8 내지 5.2가 되도록 한다.
본 발명에서는, 분획 Ⅱ를 10℃ 이하의 자켓식 반응기(jacketed vessel)로 옮기고, 분획 Ⅱ 부피 4배의 0.6% 염화나트륨(sodium chloride) 용액을 첨가하여 용해시킨 다음, 용해된 용액에 pH가 5.0±0.2가 되도록 1 M의 아세트산(acetic acid)을 첨가하였다. 그 다음, 용액을 심층여과 카트리지를 사용해 청정여과(clarifying filtration)하여 분획 Ⅱ 용액(fraction Ⅱ solution)을 수득하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 투석 및/또는 농축은 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF) 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하며, 투석농축액의 삼투압이 10mOsmol/kg 이하까지 수행한 다음, pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 5.95 내지 6.35가 되도록 조절한다.
투석여과(diafiltration)는 투석(dialysis)과 한외여과(ultrafiltration)를 같이 수행하는 것으로, 용매와 분자크기가 다른 2가지 이상의 용질이 함유된 유체로부터 일부 용질만 제거하는 방법으로서 고분자 물질의 정제에 효과적이며, 일반 투석법에 비하여 시간과 경비가 절감되는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/ Diafiltration; UF/DF) 시스템을 사용하여 10 mOsmol/kg 이하로 분획 Ⅱ 용액을 여과하였으며, 여과액에 1M 아세트산나트륨(sodium acetate)을 5.0±1.0 mM이 되도록 첨가하고 pH를 6.15±0.20으로 조절하여 투석 및/또는 농축된 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린이 포함된 수용액을 수득하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 pH 5.5 내지 7.0, 바람직하게는 pH 6.15±0.20, 유속 30 내지 150cm/hr의 조건에서 수행하며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.0 내지 2.0 로딩볼륨(Loading Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 한다.
음이온교환 크로마토그래피 단계에서 사용하는 음이온교환수지는 디에틸아미노에틸(DEAE) 계열의 음이온교환 수지를 사용할 수 있으며, 이때 사차 암모니움(Quaternary ammonium)기들로 치환된 음이온교환 수지를 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 강염기성의 사차 암모니움기를 가지는 그룹이나 또는 약염기성의 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹을 가지는 음이온 교환수지 중에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다.
예를 들면, 강염기성의 음이온교환 그룹으로는 Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE(S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel SuperQ-5PW 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 공지된 음이온교환수지를 사용할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 수지의 적절한 부피는 컬럼 치수, 즉, 컬럼의 직경과 수지의 높이에 의해 반영되고, 예컨대, 적용되는 용액의 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 용액양과 사용되는 수지의 결합 성능에 따라 달라진다. 이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 전에, 이온 교환 수지는 바람직하게는 완충액으로 평형화시켜, 수지가 그의 짝 이온과 결합할 수 있도록 한다.
본 발명에서는, 음이온교환 수지로 DEAE 세파로스 젤을 사용하였으며, 컬럼 완충액으로는 인산나트륨 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 등 당업계에 공지된 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer), 세척버퍼(wash buffer) 및 용출버퍼(elution buffer)를 사용할 수 있다.
음이온교환 크로마토그래피에서 컬럼은 10mM의 완충용액, 바람직하게는 인산나트륨 완충액(sodium phosphate buffer) 또는 아세트산 나트륨 완충액(sodium acetate buffer)으로 pH 5.5 내지 7.0, 바람직하게는 pH가 6.15±0.2가 되도록 평형화시켰으며, 이동상의 유속은 30 내지 150cm/hr으로 조절하였다. 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.0 내지 2.0 로딩볼륨(Loading Volume; LV)으로 회수하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 미흡착액을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린이 포함된 용액의 잠재적 지질외피바이러스(lipid enveloped virus) 등의 바이러스를 불활성시키고, 불활성화 이후, 불활성화를 위해 사용된 물질을 제거하기 위한 단계로서, 바이러스-비활성화제, 바람직하게는 용매 및/또는 세정제, 가장 바람직하게는 용매-세정제 혼합물을 이용한 용매 및 세정제 처리(Solvent & Detergent Treatment)가 이용될 수 있다.
상기 (c) 단계를 통해 HIV1 및 HIV2, 간염 타입 C 및 non A-B-C, HTLV1 및 2, 헤르페스 바이러스군, CMV 및 엡스타인 바 바이러스 등의 잠재적 지질외피바이러스들이 불활성화되어, 최종 제품의 안전성이 제고될 수 있다.
상기 (c) 단계에서 사용될 수 있는 용매 및 세정제는 바이러스, 특히 지질외피바이러스를 불활성화시킬 수 있는 특성을 가진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용가능하다. 세정제는 비이온성 및 이온성 세정제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 실질적으로 비변성인 것이 바람직하다. 특히, 제거의 용이성 측면에서, 비이온성 세정제가 바람직하며, 용매는 미국등록특허 제4,764,369 호에 개시된 바와 같이 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP : Tri-n-butyl phosphate)이 가장 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명을 수행하는 데 특히 바람직한 바이러스-비활성화제는 TNBP 및 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80), 트리톤 X-100 및 트리톤 X-45 중에서 선택되는 하나 이상인 것의 혼합물이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 용매/세정제 혼합물은 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 함유 용액 중 TNBP 농도가 0.2 내지 0.6 중량% 이내, 바람직하게는 0.24 내지 0.36 중량%가 되도록 첨가되며, 트윈 80의 농도는 0.8 내지 1.5중량% 범위 이내, 바람직하게는 0.8 내지 1.2중량%의 농도가 되도록 첨가한다.
바이러스-비활성화 단계는 지질외피바이러스를 비활성화시켜, 실질적으로 바이러스 위험성이 없는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 함유 용액을 생성시키는 조건 하에서 수행된다. 상기 조건에서 반응온도는 바람직하게는 4 내지 30℃, 더 바람직하게는 19 내지 28℃, 가장 바람직하게는 24 내지 26℃이며, 반응시간은 바람직하게는 1 내지 24시간, 더 바람직하게는 4 내지 12시간, 가장 바람직하게는 약 8시간이며, 바이러스 비활성화를 보장하기에 충분하다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 pH 5.0 내지 6.5, 바람직하게는 5.6 내지 6.0의 조건에서 수행하는 것을 특징으로 한다. 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린을 흡착시킨 후 평형 버퍼(equilibration buffer)로 세척한다. 상기 조건에서 세척에 이용되는 평형 버퍼는 컬럼 볼륨의 3배 이상, 바람직하게는 5배 이상의 부피를 사용하여 세척할 수 있으며, 세척 후 흡착부피의 0.5 내지 1.5배 이상의 용출버퍼(elution buffer)로 B형 간염 사람 면역글로불린을 용출한다.
양이온교환 수지는 세파덱스(Sephardex) 계열의 양이온교환 수지, 세파로즈(Sepharose) 계열의 양이온교환 수지, 하이퍼셀(HyperCell) 또는 소스(Source) 등을 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며 다른 당업계에 공지된 양이온교환 수지를 사용할 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게 세파덱스(Sephardex) 계열의 양이온교환 수지를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 양이온교환수지로 CM-세파덱스 겔을 사용하였으며, 컬럼 완충액으로는 인산나트륨 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 등 당업계에 공지된 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer), 세척버퍼(wash buffer) 및 용출버퍼(elution buffer)를 사용하였다.
양이온교환 수지로부터 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린의 용출은 B형 간염 사람 면역글로불린의 효율적인 용리를 야기시키기에 충분한 pH 및 이온 세기를 갖는 실질적으로 비-변성 완충액으로 수행하여 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 함유 용출액을 회수한다. '효율적인 용리'는 양이온교환 수지에 로딩된 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 용액의 75% 이상, 80% 이상 등, 예컨대, 85% 이상 등이 양이온 교환수지로부터 용출되는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 양이온교환 수지에서 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린을 치환하기에 충분할 정도로 높은 용출 완충액의 염 농도에서 수행될 수 있으며, 500 내지 1,500 mM의 염농도, 바람직하게는 800 내지 1,200mM의 염 농도에서 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 투석 및/또는 농축은 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF) 시스템을 이용하며, 삼투압 10 mOsmol/kg 이하, pH 3.5 내지 4.5, 바람직하게는 pH 3.8±0.2에서 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 양이온교환 크로마토그래피 용출액에서 저분자 이온을 제거하기 위해 투석여과를 수행하였으며, UF/DF 시스템의 삼투압이 10mOsmol/kg 이하가 되도록 하였다. 그 후, 여과액에 염산(HCl)을 첨가하여 pH를 3.8±0.2로 조절하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 여과는 나노여과(nanofiltration) 시스템을 이용하며, 1.5 내지 2.5 bar 압력 조건에서 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계를 마친 후 안정화제를 첨가하여 정맥주사용 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제를 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
나노여과를 수행한 후, 추가로 첨가될 수 있는 하나 이상의 단백질 안정화제로는 당업계에 공지된 다양한 슈가 알콜, 당류(소르비톨, 만노스, 글루코스, 트레할로스, 말토즈), 단백질(알부민 등), 아미노산(리신, 글리신 등) 및 유기 작용제(PEG 및 Tween 80 등)가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계 후, 추가 첨가되는 안정화제는 슈가 알콜, 말토스, 소르비톨, 만노스, 글루코스, 트레할로스, 알부민, 리신, 글리신 PEG 및 Tween 80 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 말토즈를 사용한다.
상기 안정화제는 최종 농도가 90 내지 110ｇ/ℓ가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하며, 안정화제를 첨가한 후, pH를 3.5 내지 4.5로 조절하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 pH 3.6 내지 4.0이 되도록 산, 바람직하게는 황산 또는 염산을 첨가함으로써 이루어질 수 있다.
나노여과는 중요한 바이러스 제거단계로, 본 발명에서 투석 농축된 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 용액을 2.0±0.5 bar 압력보다 크지 않게 폴 DVD 프리필터(Pall DVD pre-filter) 및 DV20 바이러스 필터를 통해 여과시켜 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 용액 속에 포함된 바이러스를 제거하였다. 그 다음, 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린의 안정화를 위해 나노여과된 여과액에 말토즈(maltose)를 최종 농도가 90 내지 110ｇ/ℓ가 되도록 첨가하고 혼합시켰으며, 안정화된 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 용액의 pH가 3.0 내지 4.6, 바람직하게는 3.6 내지 4.0이 되도록 염산을 추가해 조절하고, 0.2 μm 필터를 이용해 멸균시켜 보관하였다.
상기 멸균된 정맥주사용 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제는 단백질 농도(정제된 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린)가 전체 부피의 1 내지 20중량%이 되도록 희석시키거나 농축시키는 것을 특징으로 하며, 본 발명에서는 단백질 농도가 40 내지 60ｇ/ℓ, 바람직하게는 45 내지 55ｇ/ℓ, 더 바람직하게는 49.5 내지 50.5ｇ/ℓ이 되도록 WFI로 희석하거나 한외여과로 농축시킨 다음, 역가를 200IU/mL 이상으로 조정한 후, 말토즈(maltose)를 최종 농도가 90 내지 110ｇ/ℓ가 되도록 첨가하고 완전히 혼합시킨 뒤, 안정화된 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 pH를 측정하고 pH가 4.2±0.2이 되도록 염산을 추가 첨가해 조절함으로서 정맥주사용 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 최종 제형을 제조하였다.
본 발명의 일실시예에서, 제조 단계별 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 불순물(혈액응고 인자(피브리노겐, 알부민, prekallikrein activator(PKA) 및 트랜스페린 등) 및 B형 간염 면역글로불린 유사 단백질(IgA 및 IgE))의 농도를 측정한 결과, 대부분의 불순물이 정제공정을 거치면서 제거된 것을 확인할 수 있었다 (표 1 및 표 2).
본 발명에 따른 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법을 이용하면, 불순물 및 혈전 생성물질을 제거효율을 높이고, 중합체 함량을 유지할 수 있으므로, 안정적이고 향상된 품질의 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린의 생산이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 정맥주사용 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
정맥주사용 B 형 간염 사람 면역글로불린 제제 제조
1-1 : 혈장(plasma)준비
혈장은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), C형 간염바이러스(HCV) 및 B형 간염바이러스(HBV)에 대한 핵산증폭검사(NAT; Nucleic Acid Amplification Test) 및 혈청학적 검사를 포함하는 바이오테스트(Biotest)가 이루어지고 FDA에서 승인된 혈장을 사용하였다.
본 발명에서는 적십자 유래 혈장(Batch No. 600A9008)를 사용하였으며 혈장은 사용하기 전까지 -20℃ 이하에서 보관하였다. 혈장이 담겨져 있는 병은 커틀 기기(bottle cutting machine)로 오픈하고, 1 내지 6℃의 자켓식 반응기(jacketed vessel)에서 12 내지 72시간 동안 반응시켜 혈장을 녹였다.
상기 조건에서 혈장이 녹으면서 피브리노겐(fibrinogen) 및 응고인자(coagulation factors)이 포함된 동결침강혈장(cryoprecipitate)이 생성되는데, 원심분리(조건 설명)를 통해 동결침강혈장을 제거시키고, 동결침강혈장이 제거된 냉동 결핍성 혈장(cryopoor plasma)을 회수하였다.
1-2 : 침전(precipitation) Ⅰ 단계
상기 냉동 결핍성 혈장에서 응고인자를 추가로 제거하기 위해, 침전(precipitation) Ⅰ 단계를 수행하였다.
최종 에탄올 농도가 -3±1℃에서 8 ± 0.8%가 되도록 실시예 1-1에서 회수한 냉동 결핍성 혈장에 96% 에탄올(ethanol)을 첨가한 후(첨가 I), 아세테이트 버퍼(acetate buffer)를 사용하여 pH가 7.2±0.2가 되도록 조절하였다. 원심분리(조건)를 통해 침전물을 제거하고, 상층액(Addition Ⅰ supernatant)을 회수하였으며, 추후 총 생균측정(total viable count)을 하기 위해 일부를 샘플링하여 보관하였다.
1-3 : 침전 Ⅱ+Ⅲ 단계 및 여과(filtration)
실시예 1-2에서 회수한 상층액에 포함된 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 (Hepabig, HBIG)을 침전시키기 위해 침전 Ⅱ+Ⅲ 단계를 수행하였다.
최종 에탄올 농도가 -5±1.0℃에서 20±2%가 되도록 실시예 1-2에서 회수한 상층액에 96% 에탄올(ethanol)을 첨가한 후(첨가 II+III), 아세테이트 버퍼(acetate buffer)를 사용하여 pH가 6.9±0.1이 되도록 조절하였다.
그 후, 혈장 ㎏ 당 필터 보조제(Celite(STD), Harbolite(Expanded perlite product)) 0.0284㎏씩 첨가하고 30±10분 동안 혼합시켰다. 혼합물을 2 내지 8℃로 유지시킨 콜드룸(cold room)안에서 필터 프레스(filter press, DG800K)를 사용하여 상측액과 침전물을 분리시켰다.
상층액은 여액(supernatant) I+Ⅱ+Ⅲ (또는 Ⅱ+Ⅲ)으로 명명하고, 침전물은 분획(fraction) I+Ⅱ+Ⅲw (또는 Ⅱ+Ⅲw)로 명명하였다 (w; wash). 분획 I+Ⅱ+Ⅲw (또는 Ⅱ+Ⅲw)는 즉시 사용하거나 -20℃ 이하에서 보관한다.
1-4 : 침전 Ⅲ 단계 및 여과(filtration)
혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린이 포함된 분획 I+Ⅱ+Ⅲw (또는 Ⅱ+Ⅲw)에서 추가로 알부민(albumin), 지단백(lipoprotein), 트롬빈(thrombin) 및 다른 원하지 않는 단백질(other unwanted proteins)을 제거하기 위해 침전 Ⅲ 단계를 수행하였다.
실시예 1-3에서 회수한 분획 I+Ⅱ+Ⅲw (또는 Ⅱ+Ⅲw)를 차가운 증류수(cold distilled water)에 녹인 후, 추후 총 생균측정(total viable count)을 하기 위해 일부를 샘플링하여 보관하였다. 상기 증류수에 녹인 분획 I+Ⅱ+Ⅲw (또는 Ⅱ+Ⅲw)에 최종 에탄올 농도가 -5±1.0℃에서 18±1.8%이 되도록 96% 에탄올을 첨가하였으며(첨가 III), -6℃로 미리 준비해둔 아세테이트 버퍼(acetate buffer)를 사용하여 pH가 5.2±0.1이 되도록 조절하였다.
혼합물을 필터 프레스(filter press, DG800K)를 사용하여 상측액과 침전물을 분리시켰다. 상층액은 여과액(filtrate) I+Ⅲ (또는 Ⅲ)로 명명하고, 침전물은 분획 I+Ⅲ (또는 Ⅲ)로 명명하였다. 분획 I+Ⅲ (또는 Ⅲ)는 폐기하고, 여과액 I+Ⅲ (또는 Ⅲ)는 추후 총 생균측정(total viable count)을 하기 위해 일부를 샘플링하여 보관하였다.
1-5 : 침전 Ⅱ 단계 및 여과(filtration)
실시예 1-4의 여과액 I+Ⅲ (또는 Ⅲ)에서 B형 간염 사람 면역글로불린을 침전시키기 위해 침전 Ⅱ단계를 수행하였다.
최종 에탄올 농도가 -10±2.0℃에서 25±2.5%가 되도록 여과액 I+Ⅲ (또는 Ⅲ)에 96% 에탄올(ethanol)을 첨가하고, 1M 소듐 바이카보네이트(중탄산나트륨; sodium bicarbonate)를 사용하여 pH가 7.4±0.2가 되도록 조절하였다.
혼합물을 필터 프레스(filter press, DG800K)를 사용하여 상측액과 침전물을 분리시켰다. 침전물을 분획 Ⅱ(fraction Ⅱ)로 명명하였으며, 추후 박테리아 엔도톡신, 단백질 함량 및 구성을 측정하기 위해 일부를 샘플링하여 보관하였다.
1-6 : 분획 Ⅱ 용해(dissolution) 및 청정여과(clarifying filtration)
혈장에서 분리한 B형 간염 사람 면역글로불린의 함량을 높이고 혈전생성 물질을 제거하기 위한 분리 정제 과정을 수행하였다.
먼저, 실시예 1-5에서 분리한 B형 간염 사람 면역글로불린이 포함된 분획 Ⅱ를 용해시켜 투석과정에 적합한 조건을 가지도록 조절하였다. 분획 Ⅱ는 10℃ 이하의 자켓식 반응기(jacketed vessel)로 옮기고, 분획 Ⅱ 볼륨 4배의 0.6% 염화나트륨(sodium chloride) 용액을 첨가하여 용해시켰으며, 단백질 함량 및 구성을 측정하기 위해 일부 샘플링하여 보관하였다.
그 다음, 1 M의 아세트산(acetic acid)을 사용하여 용해된 용액의 pH가 5.0±0.2가 되도록 조절한 후, 용액을 심층여과 카트리지(depth filter cartridges; BecodiskBP01)를 사용해 청정여과(clarifying filtration)하여 분획 Ⅱ 용액(fraction Ⅱ solution)을 수득하였다.
1-7 : 투석여과 ( diafiltration )
실시예 1-6에서 수득한 B형 간염 사람 면역글로불린이 포함된 분획 Ⅱ 용액에서 에탄올과 저분자 이온을 제거하고, 음이온교환 크로마토그래피 과정에 적합한 조건을 가지도록 pH를 조절하였다.
B형 간염 사람 면역글로불린이 포함된 분획 Ⅱ 용액은 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; Millipore Pellicon2(50K)) 시스템을 사용하여 10mOsmol/kg 이하로 투석여과를 수행하였으며, 수득된 여과액은 추후 단백질 함량, 구성 및 생균을 측정하기 위해 일부를 샘플링하여 보관하였다.
상기 여과액에 0.5M 인산나트륨(sodium phosphate)을 10.0±1.0 mM이 되도록 첨가하고 pH를 6.15±0.2로 조절하여 투석 및/또는 농축된 B형 간염 사람 면역글로불린 용액을 수득하였다.
1- 8 :음이온교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)
실시예 1-7에서 수득한 투석 및/또는 농축된 B형 간염 사람 면역글로불린 용액 속에 포함된 폴리머(polymer) 및 다른 혈장 단백질을 제거하기 위해 음이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.
음이온교환수지는 DEAE 세파로스 젤(DEAE Sepharose gel; GE Healthcare, Catalog No. 17-0709)을 컬럼에 충진한 후 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer)를 사용하여 pH가 6.15±0.2가 되도록 평형화시켰다. 이후 실시예 1-7에서 수득한 투석 및/또는 농축된 B형 간염 사람 면역글로불린 용액을 유속 50±10 cm/hr이 되도록 컬럼에 로딩하였으며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.5 로딩볼륨(Loading Volume; LV)으로 회수하였다.
1-9 : 바이러스 불활성화를 위한 용매 및 세정제 처리(solvent/detergent Treatment)
B형 간염 사람 면역글로불린이 포함된 용액의 잠재적 지질외피바이러스(lipid enveloped virus)를 불활성시키기 위해 용매 및 세제를 처리하는 단계를 수행하였다.
먼저, 실시예 1-8에서 회수한 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획에 염산(HCl) 또는 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 pH가 5.0±0.2가 되도록 조절하였으며, 트리(엔-부틸)-포스페이트(Tri(n-butyl)-phosphate; TNBP) 및 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80 ; Tween 80)을 각각 0.3±0.06% 및 1±0.2%의 농도가 되도록 첨가한 후, 20분 내지 30분 동안 200±50 RPM으로 교반하였다. 용액 안의 TNBP 및 Tween 80가 균일하게 혼합되었는지 일부를 샘플링하여 확인하였으며, 그 후로 25±1.0℃에서 8시간 동안 200±50 RPM으로 지속적으로 교반하였다. 교반이 완료된 다음 B형 간염 사람 면역글로불린이 포함된 용액은 하드파이프 라인을 통해 바이러스 안전영역(viral secure area ; VSA)인 다른 탱크로 옮겼다.
1- 10 :양이온교환 크로마토그래피( cation exchange chromatography)
용매/세제 처리된 B형 간염 사람 면역글로불린 용액에서 TNBP, Tween 80 및 응고인자 등이 다른 혈전생성물질을 제거하기 위해 양이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.
양이온교환수지는 CM-Sephadex C-50 (GE Healthcare)을 컬럼에 충진한 후 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer)를 사용하여 pH가 5.8±0.2가 되도록 평형화시켰다. 이후 실시예 1-9의 용매/세제 처리된 B형 간염 사람 면역글로불린 용액을 3±1 시간 동안 흡착하였다.. 그 후, 흡착부피의 2 내지 3배의 세척버퍼를 사용하여 7회 세척하였다. 세척한 후 용출 버퍼 (용출버퍼 조성: 1.0M NaCl)를 사용하여 B형 간염 사람 면역글로불린을 용출시켜 회수하였다.
1-11 : 투석여과 ( diafiltration )
양이온교환 크로마토그래피 용출액에서 저분자 이온을 제거하기 위해 투석여과를 수행하였다.
실시예 1-10에서 수득한 용출액은 한외여과/투석여과 (Ultrafiltration/Diafiltration) 시스템을 사용하여 10mOsmol/kg 이하로 투석여과를 수행하였으며, UF/DF 시스템은 중합체 함량을 유지하기 위하여 양이온교환 크로마토그래피 용출액을 계산된 투석농축액에 첨가하여 100mM 염화나트륨 이하의 농도를 유지시키면서 연속적으로 진행하였다.
수득된 여과액은 추후 단백질 함량, 구성 및 생균을 측정하기 위해 일부를 샘플링하여 보관하고, 남은 여과액에 염산(HCl)을 첨가하여 pH를 4.2±0.2로 조절하였다.
1-12 : 나노여과( nanofiltration ) 및 안정제(stabilizer) 추가
나노여과는 중요한 바이러스 제거단계로, 실시예 1-11에서 투석 농축된 B형 간염 사람 면역글로불린 용액을 프리필터(FlorodyneⅡ prefilter, AB1DJL7PH4) 등으로 여과하고, 2.0±0.5 bar 압력 조건하에서 바이러스 필터(DV20, AB3DV207PH4)를 통해 여과시켜 B형 간염 사람 면역글로불린 용액 속에 포함된 바이러스를 제거하였다.
B형 간염 사람 면역글로불린의 안정화를 위해 나노여과된 여과액에 말토즈(maltose)를 최종 농도가 10±1 중량% 가 되도록 첨가하고 완전히 섞어주었다. 안정화된 B형 간염 사람 면역글로불린 용액의 pH를 측정하고 pH가 3.8±0.2가 되도록 염산을 추가해 조절하였다.
그 다음, 여과액을 0.2 μm 필터를 이용해 멸균시키고, 스테인레스 스틸 저장탱크로 옮겨 보관하였다.
1-13 : 정맥주사용 B 형 간염 사람 면역글로불린 의 최종 제형 제조 및 무균 충전
정맥주사용 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 단백질 농도가 50±1ｇ/ℓ이 되도록 WFI로 희석하거나 한외여과로 농축시킨 다음, 말토스(maltose)를 최종 농도가 10±1 중량% 가 되도록 첨가하고 완전히 혼합시킨뒤, 역가를 200 IU/mL 이상으로 조정하였다. 그 후, 안정화된 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 pH를 측정하고 pH가 4.2±0.2가 되도록 염산을 추가해 조절하였다.
B형 간염 사람 면역글로불린 제제는 pH 조정후 멸균시키며, 충전을 위해 충전룸으로 옮겨 제품을 제조한 뒤 2 내지 8℃에 보관하였다.
제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 불순물의 농도 측정
혈전응고제의 제거 정도를 확인하기 위해, 상기 실시예 1의 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 피브리노겐, 알부민, 트랜스페린, IgA 및 IgE 농도를 ELISA kit(Assaypro, Korea)로 측정하였으며, PKA(prekallikrein activator) 활성은 실시예 1의 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 PKA의 활성을 칼리클레인(Kallikrein) 기질용액(S-2302. Sigma Aldrich)을 이용하여 280nm에서 분당 흡광도를 측정하여 계산하였다.
정제 공정 산물들의 불순물 함량
공정 설명 알부민 트랜스페린 IgA IgE PKA
(μg /mL) (μg /mL) (μg /mL) (μg /mL) (IU/mL)
음이온 교환
크로마토그래피
(AEX)		 로딩액 132.112 377.897 132.03 0.491 10.71
수집액 0.486 8.148 16.21 <0.016 <2.00
불순물 LRV
(-log removal value)		 2.26 1.49 0.73 >1.31 -
정제 공정 산물들의 불순물 함량
공정 설명 피브리노겐
(μg/mL)
양이온 교환
크로마토그래피
(CEX) 		로딩액 0.69
수집후 농축액 < 0.165
불순물 LRV
(-log removal value)		 >0.94
상기 표 1 및 표 2에서 분리정제 효율과 관련하여, PKA는 프리칼리클레인이 제12인자 등의 물질에 의해 활성화되어 칼리클레인으로 전환되는데 있어, 남아있는 프리칼리클레인의 활성 측정을 통해 제12인자 등의 불순물이 제거되었는지 여부를 확인할 수 있는 인자이며, 단위는 IU/ml이다. LRV는 log 단위의 해당 불순물의 제거값을 말하며, 산술적으로는 -log((수집액x1ml 당 불순물의 함량(mg))/(로딩액x1ml 당 불순물의 함량(mg)))을 의미한다.
본 발명의 정제 공정의 산물들의 불순물(피브리노겐, 알부민, 트랜스페린, PKA, IgA 및 IgE) 함량을 측정한 결과, 표 1 및 표 2에 개시된 바와 같이, 음이온 교환수지 크로마토그래피 공정부터 불순물의 농도가 감소하기 시작하였고, 양이온 교환수지 크로마토그래피 공정의 용출액에서는 매우 낮은 농도로 불순물이 검출되었으며, 특히 피브리노겐, 알부민, 트랜스페린, PKA, IgA 및 IgE의 경우, 해당 공정을 거치면서 대부분이 제거되는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (19)

  1. 다음 단계를 포함하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법:
    (a) B형 간염을 앓았거나, B형 간염백신 추가면역을 받은 건강한 공혈자로부터 채장된 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린을 함유하는 혈장단백질을 에탄올 침전법으로 분리하여 수득한 분획 Ⅱ (fraction Ⅱ)를 용해시킨 다음, 여과하여 분획 Ⅱ 용액을 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득된 분획 Ⅱ 용액을 투석 및 농축시킨 다음, pH 5.95 내지 6.35에서 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계;
    (c) 바이러스 불활성화를 위하여 상기 수득된 분획에 용매 및 세정제를 처리한 후, 용매 및 세정제, 및 혈전 생성물질을 제거하기 위하여 pH 5.6 내지 6.0에서 양이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
    (d) 상기 양이온교환 크로마토그래피 용출액을 투석 및 농축시키는 단계;
    (e) 상기 투석 및 농축된 용액을 여과하여 정제된 B형 간염 사람 면역글로불린을 수득하는 단계
    (f) 상기 사람 면역글로불린에 안정화제를 첨가한 다음, pH를 3.5 내지 4.5로 조절하는 단계; 및
    (g) 상기 pH가 조절된 혼합액을 세균여과한 다음, pH를 4.0 내지 4.5로 조절하는 단계.

  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 분획 Ⅱ(fraction Ⅱ)의 용해는 혈장단백질 분획 부피의 2 내지 10배가 되도록 염화나트륨(sodium chloride) 용액을 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 여과는 청정여과(clarifying filtration)인 것을 특징으로 하며, pH가 4.5 내지 5.5가 되도록 조절하여 수행되는 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 투석 및 농축은 삼투압 10mOsmol/kg 이하에서 수행한 다음, pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 미흡착액을 회수하는 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 pH 5.95 내지 6.35, 유속 30 내지 150cm/hr의 조건에서 수행하며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.0 내지 2.0 로딩볼륨(Loading Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 디에틸아미노에틸(DEAE) 계열의 음이온교환 수지를 이용하는 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 용매는 트리(n-부틸)-포스페이트 (Tri(n-butyl)-phosphate; TNBP)인 것을 특징으로 하며, 세정제는 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100 및 트리톤 X-45 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 500 내지 1,500 mM의 염 농도 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 세파덱스(Sephadex) 계열의 양이온교환 수지를 이용하는 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 투석 및 농축은 삼투압 10mOsmol/kg 이하에서 수행한 하는 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 여과는 나노여과(nanofiltration) 시스템을 이용하며, 1.5 내지 2.5 bar 압력 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  14. 삭제
  15. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 슈가 알콜, 말토즈, 소르비톨, 만노스, 글루코스, 트레할로스, 알부민, 리신, 글리신, PEG 및 Tween 80 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 최종 농도가 90 내지 110ｇ/ℓ가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 혈장 유래 B형 간염 사람 면역글로불린 제제의 제조방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
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CN201680039211.3A CN107849086B (zh) 2015-06-05 2016-06-02 用于制备源自血浆的乙型肝炎免疫球蛋白的方法
EP16803742.2A EP3305800B1 (en) 2015-06-05 2016-06-02 Preparation method of plasma-derived hepatitis b human immunoglobulin agent
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019083318A3 (ko) * 2017-10-27 2019-07-04 주식회사 녹십자 개선된 면역글로불린의 정제방법
EP3543250A4 (en) * 2016-11-18 2020-07-01 Green Cross Corporation METHOD FOR REMOVING FXI IN PURIFYING PLASMA PROTEINS

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106459140B (zh) * 2014-03-11 2019-12-10 株式会社绿十字控股 用于纯化免疫球蛋白的方法
CN106414476B (zh) * 2014-03-11 2019-12-31 株式会社绿十字控股 用于纯化免疫球蛋白的方法
CN112574296B (zh) * 2020-12-30 2023-05-19 中国医学科学院输血研究所 一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090148435A1 (en) * 2007-10-30 2009-06-11 Genentech, Inc. Antibody purification by cation exchange chromatography
CN104001172A (zh) * 2014-06-12 2014-08-27 新疆德源生物工程有限公司 一种静脉注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2604759C2 (de) 1976-02-07 1983-06-01 SCHURA Blutderivate GmbH & Co KG, 4150 Krefeld Verfahren zur Gewinnung von iv-verträglichen &Gamma;globulinen
US4124576A (en) 1976-12-03 1978-11-07 Coval M L Method of producing intravenously injectable gamma globulin
JPS617561A (ja) 1984-06-20 1986-01-14 Toshiba Corp 表示素子用放電灯
DE3624258A1 (de) 1986-07-18 1988-01-21 Basf Ag Verfahren zur herstellung von chlorcarbonsaeurechloriden
EP0447585B2 (de) * 1990-03-22 2003-05-07 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur Herstellung eines intravenös verträglichen Immunglobulin-G-Präparates
DK1084147T3 (da) * 1998-06-09 2004-10-25 Statens Seruminstitut Fremgangsmåde til fremstilling af immunglobuliner til administration og andre immunglobulinprodukter
ES2421736T3 (es) * 1998-06-09 2013-09-05 Csl Behring Ag Procedimiento para la preparación de inmunoglobulinas para administración intravenosa y otros productos inmunoglobulínicos
CN104004090A (zh) * 2014-06-12 2014-08-27 新疆德源生物工程有限公司 一种人免疫球蛋白的制备方法
CN104231075B (zh) * 2014-09-02 2017-03-22 江西博雅生物制药股份有限公司 一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090148435A1 (en) * 2007-10-30 2009-06-11 Genentech, Inc. Antibody purification by cation exchange chromatography
CN104001172A (zh) * 2014-06-12 2014-08-27 新疆德源生物工程有限公司 一种静脉注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3543250A4 (en) * 2016-11-18 2020-07-01 Green Cross Corporation METHOD FOR REMOVING FXI IN PURIFYING PLASMA PROTEINS
WO2019083318A3 (ko) * 2017-10-27 2019-07-04 주식회사 녹십자 개선된 면역글로불린의 정제방법
US11535646B2 (en) 2017-10-27 2022-12-27 Green Cross Corporation Method for purification of immunoglobulin

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