KR101917197B1 - 면역글로불린의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역글로불린의 정제방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획 I+II+III(fraction I+II+III) 또는 분획 II+III(fraction II+III)를 용해한 후, 카프릴산(caprylate)을 첨가하여 침전반응을 시켜 투석 농축시킨 다음, 음이온교환 수지 및 세라믹 재질의 양이온 교환수지 정제기법을 통해 바이러스 불활성화시 첨가되는 용매 및 세정제를 효과적으로 제거하고, 용출시 염 농도를 일정하게 유지함으로써 중합체의 함량을 낮게 유지시키는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 정맥주사용 면역글로불린의 제조방법은 분획 I+II+III 또는 분획 II+III를 출발물질로 하여 분획 Ⅱ를 제조하기 위한 침전 단계의 생략이 가능하고, 카프릴산 나트륨 1차 침전법과 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피 사용으로 폴리에틸렌 글리콜 처리법으로 제조함에 있어 발생하는 공정의 번거로움과 낮은 수율의 문제점을 해결하였다. 또한, 본 발명에 따른 면역글로불린의 정제방법을 이용하면, 불순물 및 혈전 생성물질을 제거효율을 높이고, 중합체 함량을 유지할 수 있으므로, 안정적이고 향상된 품질의 면역글로불린의 생산이 가능하다.

Description

면역글로불린의 정제방법{METHOD FOR PURIFYING IMMUNOGLOBULIN}

본 발명은 면역글로불린의 정제방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획 Ⅰ+II+III(fraction Ⅰ+II+III) 또는 분획 II+III(fraction II+III)를 용해한 후, 카프릴산(caprylate)을 첨가하여 침전반응을 시켜 투석 농축시킨 다음, 음이온교환 수지 및 세라믹 재질의 양이온 교환수지 정제기법을 통해 바이러스 불활성화시 첨가되는 용매 및 세정제를 효과적으로 제거하고, 용출시 염 농도를 일정하게 유지함으로써 중합체의 함량을 낮게 유지시키는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법에 관한 것이다

면역글로불린은 여러 가지 바이러스 및 세균에 대한 항체를 함유하고 있는 혈장 단백으로서 선천적인 항체 결핍자 또는 바이러스성이나 세균성 질환으로 말미암아 항체의 인위적인 보충을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 질환의 예방과 치료에 사용되는 약제이다.

이러한 면역글로불린을 약제로 사용하기 위해 콘 및 온클레이(Cohn & Oncley)에 따른 냉에탄올 분획법(Cohn E. et al., J. Am. Chem. Soc., 68:459, 1946) 및 키슬러 및 니츠만에 따른 변형법(Kistler P, Nitschmann HS, Vox Sang, 7:414. 1952)으로 피하 및 근육 주사용 면역글로불린이 제조되었다.

하지만, 근육 주사용 면역글로불린은 1) 투여량이 제한되어 대량 투여가 불가능하며, 2) 주사시 주사부위에 동통현상이 나타나고, 3) 항체능력을 가진 고유의 면역글로불린G(ImmunoglobulinG ; IgG) 함량이 적으며, 4) 주사부위의 단백분해효소에 의한 글로불린의 항체가가 감소되고, 5) 최대혈중농도 도달시간은 24시간 이상이 소요되는 문제점이 있다.

근육 주사의 문제점을 해결하기 위해 정맥 주사를 통한 면역글로불린의 투여가 시도되었으나, 면역글로불린 제제를 정맥으로 투여할 경우 항보체활성(Anticomplementary activity)이 있는 응집체(Aggregate)에 기인하는 부작용(Anaphylacticreaction)이 심각하여 호흡 곤란 현상에서부터 순환계 쇼크까지의 다양한 즉각적인 부작용이 나타났다. 상기의 증상은 주로 면역글로불린이 결핍된 환자들에게서 보였으며, 특히 심각한 과민성 증상의 부작용은 IgA에 대한 항체가 나타난 환자들에서 관찰되었다.

따라서, 상기 문제로 인해 정맥주사가 불가능함에 따라, 정맥주사용 제제의 개발이 요구되었으며, 제조 공정 동안에 이러한 응집체를 제거하고, 및/또는 응집체 형성을 방지할 수 있는 방법들이 개발되었다. 펩신(pepsin), 파페인(papain), 플라스민(Plasmin)등 단백분해 효소나 베타프로 피오락톤(β-propiolactone)등의 화학물질로 처리하고 구조를 변화시켜 응집체의 생성을 저지하거나 파괴하여 항보체 활성을 저하시켜 줌으로써 정맥주사가 가능하게 되었다.

제1세대 정맥주사용 면역글로불린(Intravenous Immunoglobulin; IVIG)은 면역글로불린 응집체를 제거하기 위해 출발물질(콘 분획 II)에 펩신을 처리하였다. 상기 공정에는 컬럼 크로마토그래피 단계가 포함되어 있지 않으며, 제조된 제품은 적당한 기간 동안 안정하게 유지되도록 동결건조시키고, 사용직전에 용해시켜 사용하였다. 하지만, 일부 제조사의 IVIG 제품에서 바이러스성 간염 C등의 바이러스의 감염을 유발시키는 것으로 밝혀졌으며, 이에 제조 공정에 하나 이상의 공지의 바이러스 비활성화 및/또는 제거 단계가 추가로 포함되었다. 이후, 낮은 항보체 활성과 좀더 높은 안정성을 가지는 제2세대 IVIG가 80년대 중반에 개시되었으며, 상기 IVIG는 여러 단계의 크로마토그래피 단계들을 거쳐 정제되었다.

이러한 제제들은 정맥 주사함에 따라 근육주사용 면역글로불린의 단점이었던 투여량의 제한, 주사부위의 동통 현상, 단백분해 효소에 의한 글로불린의 항체가 감소 등이 해결되었으며 최대 혈중농도 도달시간도 수시간 이내로 단축되었다.

그러나, 상기 정액주사용 면역글로불린은 구조를 변화시켜 항체능력을 가진 고유의 IgG는 거의 없어 보체결합능력이 저하되거나 없고, 혈중농도 반감기도 4 내지 12일 정도로 짧아 질병의 예방과 치료에 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있다. 또한, 동결건조된 분말 형태로 제조된 상기 제1 및 2세대 IVIG는 추가로 용해시키는 작업이 필요하며, 용해속도가 느리기 때문에 액상 IVIG 제품들이 개발되었으며, 좀더 안정하고 순수한 IVIG 제품을 얻을 수 있도록 향상된 공정이 요구되었다.

이에 대하여 독일특허 제 2,604,759호 및 미국특허 제 4.124,576호 등에 소개된 방법(제3세대 IVIG)은 상기 정맥 주사용 감마글로불린과는 달리 폴리에틸렌글리콜 등 비이온성 계면활성제를 사용하여 항체 능력을 가진 고유의 IgG를 얻는 방법이 개발됨으로써 보체결합 능력이 있고 혈중농도 반감기가 일정도로 길어져서 질병의 예방과 치료에 좋은 효과를 거둘 수가 있게 되었으나, 폴리에틸렌 글리콜처리로 제조된 이들 제제도 항보체 활성이 있는 응집체를 완전히 제거하기가 어려워(항보체가가 0.02단위/mg 정도를 나타냄) 부작용의 발생 소지가 남아있는 문제점이 있다.

또한, 한국공개특허 제1983-0007083호 역시, 사람 혈장으로부터 분리된 콘(cohn) 분획 II 또는 분획 II＋III로 부터 폴리에틸렌글리콜 처리를 통해 정맥주사용 면역글로불린을 제조하였으나, 공정이 복잡하며 수율이 낮은 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 기존의 문제를 해결하기 위하여 노력한 결과, 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획 Ⅰ+II+III(fraction Ⅰ+II+III) 또는 분획 II+III(fraction II+III)을 출발물질로 하여 카프릴산 나트륨 침전법과 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피를 사용하여 면역글로불린을 정제하면,

기존 폴리에틸렌 글리콜 처리법으로 제조함에 있어 발생하는 공정의 번거로움과 낮은 수율의 문제점을 해결할 수 있으며, 분획 Ⅱ를 제조하기 위한 침전 Ⅰ+III, 침전 II 단계의 생략이 가능하여 정맥주사용 면역글로불린의 제조과정이 매우 용이하다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 안정적이고 고순도의 면역글로불린을 생산하기 위해 불순물 및 혈전생성물질을 효율적으로 제거할 수 있는 면역글로불린의 정제방법을 제공하는데 있다.

상기목적을 달성하기 위해서, 본 발명은

(a) 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획 Ⅰ+II+III(fraction Ⅰ+II+III) 또는 분획 II+III(fraction II+III)를 용해시킨 다음, 침전제를 첨가하여 침전반응을 수행하는 단계;

(b) 상기 침전물을 제거하고 면역글로불린이 포함된 상층액을 여과시킨 다음, 여과액을 농축하고 음이온교환 크로마토그래피를 수행하고, 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계;

(c) 바이러스 불활성화를 위하여 상기 수득된 분획에 용매/세정제를 처리한 후, 상기 용매/세정제를 제거하기 위하여 양이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;

(d) 상기 양이온교환 크로마토그래피 용출액을 투석 및/ 또는 농축시키고, 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계; 및

(e) 상기 수득된 분획을 바이러스 필터에 여과하고 투석 및/또는 농축하여 정제된 면역글로불린을 수득하는 단계;

를 포함하는 면역글로불린의 정제방법을 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 정맥주사용 면역글로불린의 제조과정을 나타낸 모식도.
도 2는 제조 단계별 면역글로불린의 순도(Thrombin/IgG)를 측정한 결과.
도 3은 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 FXI(Human Coagulation Factor XI)의 농도를 SDS-PAGE로 측정한 결과.

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 "면역글로불린을 함유하는 혈장단백질"이라 함은 인간 혈장 또는 인간 태반 유래 혈장에서 Factor IX 및 항트롬빈과 같은 다양한 혈장 단백질이 제거된 무-저온침전물(cryoprecipitate-free) 혈장, 다양한 콘(cohn) 분획 및 암모늄 설페이트 또는 PEG(Polson et al., Biochem Biophys Acta, 82:463, 1964); Polson and Ruiz-Bravo, Vox Sang, 23:107. 1972)에 의한 침전법을 통해 얻어지는 분획들을 포함한다. 바람직하게 혈장 단백질 분획은 콘 분획 Ⅱ, 콘 분획 Ⅰ+II+III 또는 콘 분획 II+III가 사용될 수 있다.

본 발명에서는 인간 혈장으로부터 얻어진 분획Ⅰ+II+III 또는 분획 II+III 사용하였으며, 통상적인 콘 혈장 분 획법에 따라서 제조되었다. 분획 Ⅰ+II+III 또는 분획 II+III에 포함된 다양한 리포프로테인류, 피브리노겐, α-글로불린, β-글로불린 및 다양한 응고인자들을 제거하기 위한 후속 정제공정을 수행하였다.

본 발명에서는, 인간혈장은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), C형 간염바이러스(HCV), B형 간염바이러스(HBV) 및 파보바이러스 B19(parvovirus B19)에 대한 핵산증폭검사(NAT; Nucleic Acid Amplification Test) 및 혈청학적 검사를 포함하는 바이오테스트(Biotest)를 거쳐 승인된 미국 유래 혈장을 사용하였으며, -20℃ 이하에서 보관되어 있던 혈장을 1 내지 6℃의 자켓식 반응기(jacketed vessel)에서 12 내지 72시간 동안 반응시켜 녹였다.

상기 조건에서 혈장이 녹으면서 피브리노겐(fibrinogen) 및 응고인자(coagulation factors)이 포함된 동결침강혈장(cryoprecipitate)이 생성되는데, 원심분리를 통해 동결침강혈장을 제거시키고, 동결침강혈장이 제거된 냉동 결핍성 혈장(cryopoor plasma)을 회수하였다. 그 후 침전과 여과 과정을 반복하여 최종적으로 분획 Ⅰ+II+III를 수득하였다.

면역글로불린이 포함된 혈장을 분리하기 위한 여과과정은 필터 보조제를 첨가하여 혼합시킨 다음 필터 프레스를 사용하여 상측액과 침전물을 분리하였으며, 상기 필터 보조제는 Celpure 300, Celpure 1000를 사용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ 또는 분획 Ⅱ+Ⅲ의 용해는 분획 Ⅰ+II+III 또는 분획 II+III : 증류수가 1 : 6 내지 1 : 10이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하며, 상기 증류수는 주사용 증류수를 사용할 수 있다.

혈장 단백질 분획은 실질적으로 비-변성 온도 및 pH에서 물 및/또는 완충액에 현탁액화(용해)되는 것이 바람직하다. “실질적으로 비변성”은 상기 언급된 조건이 면역글로불린분자들의 기능성 활성의 실질적으로 비가역적인 손실, 예컨대, 항원결합 활성 및/또는 생물학적 Fc-작용의 손실을 야기시키지 않는 것을 의미한다.

유리하게는, 혈장 단백질 분획은 플라즈마 단백질 분획 부피의 6 내지 10, 바람직하게는 7 내지 8배의 부피로 하나 이상의 비변성 완충제로 산성화된 물에 용해시키며, 면역글로불린-함유 현탁액의 pH는 면역글로불린의 최적의 용해도를 보장할 수 있도록, 바람직하게는 pH 6.0 이하로, 더 바람직하게는 4.0 내지 6.0으로, 가장 바람직하게는 4.1 내지 4.3이 되도록 유지한다. 산성 완충액으로 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 인산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 아세트산, 염산, 물(증류수) 등을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 증류수 또는 주사용 증류수를 사용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 침전 반응을 통해 면역글로불린이 포함된 상층액과 기타 물질을 분리하는 단계이다.

상기 침전제는 다양한 분자량을 가지는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 카프릴산 및 황산암모늄에서 선택된 하나 이상의 물질을 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 비변성 수용성 단백질 침전제를 침전법의 수단으로 사용할 수도 있다. 바람직하게는 카프릴산을 사용할 수 있다.

상기 (a) 단계에 따른 침전반응은 침전제가 5 내지 26mM, 바람직하게는 19 내지 21mM이 되도록 첨가한 다음 pH가 4 내지 6, 바람직하게는 4.5 내지 5.5가 되도록 조절한다. pH 조절은 아세트산 또는 수산화나트륨을 첨가할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 통상적으로 pH 조절을 위해 사용될 수 있는 다른 물질이 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

침전제는 침전 반응은 고체상과 액상 사이에서 평형이 이루어질 때까지, 약 1시간 동안, 바람직하게는 50분에서 1시간 10분 동안 수행된다. 침전 반응 전반에 걸쳐, 현탁액은 저온에서, 바람직하게는 2 내지 6℃에서 유지되며, 가장 적절한 온도는 단백질 침전제의 특성에 따라 조절할 수 있다.

침전 반응으로 침전된 침전물에는 다량의 응집된 단백질 물질이 포함되며, 상층액에는 면역글로불린이 포함되어 있으므로, 상층액만 취해 면역글로불린을 정제할 수 있으며, 면역글로불린-함유 상층액은 큰 응집체, 필터보조제, 잔류 비-용해된 페이스트 등을 제거하기 위해 여과 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 여과는 바람직하게 심층필터(depth filter)를 사용하며, C150 AF, AF 2000 또는 AF 1000(SChenk), 30 LA(Cuno) 또는 유사한 필터류를 이용하여 수행된다. 경우에 따라, 응집체, 필터 보조제, 잔류 비-용해된 단백질 물질의 제거는 또한 원심분리법에 의해 수행될 수도 있다.

본 발명에서는, 분획 Ⅰ+II+III 페이스트로부터 면역글로불린을 추출하기 위해 분획 Ⅰ+II+III 페이스트 : 증류수가 1 : 6 내지 10이 되도록 증류수 또는 WFI(주사용 증류수)를 첨가하여 추출된 단백농도가 15㎎/㎖가 되도록 하고, 1M 아세트산(acetic acid)를 사용하여 pH가 4.2±0.1이 되도록 조절한 다음, 분획 Ⅰ+II+III 페이스트를 추출하였다.

상기 추출액에 카프릴산(caprylate)의 농도가 20±1.0mM이 되도록 1M의 카프릴산 나트륨(sodium caprylate)용액을 첨가한 다음, 1M 아세트산(acetic acid) 또는 0.5M 수산화나트륨(NaOH)를 사용하여 pH가 5.1±0.1이 되도록 조절하고, 4℃에서 1시간±10분 동안 침전반응을 수행하였으며, 상층액을 회수하여 심층필터를 통해 면역글로불린 용액을 여과하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 면역글로불린을 농축시키고, 불순물을 제거하는 단계로서, 이 단계를 통해 면역글로불린의 농도를 10 내지 50, 바람직하게는 20 내지 30㎎/㎖으로 조정하며, 음이온교환 크로마토그래피를 pH 5.0 내지 6.0, 유속 95 내지 145cm/hr의 조건에서 수행하고, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.6 내지 2.0 로딩볼륨(Loading Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게 상기 pH는 5.4 내지 5.8, 가장 바람직하게 5.5 내지 5.7이 되도록 조절한다.

농축된 면역글로불린 함유 용액은 침전제 및 면역글로불린 A(IgA), 알부민, 응집체를 포함하는 다른 혈장 단백질을 제거하기 위해 하나 이상의 단계에 음이온 및 양이온교환 크로마토그래피를 적용시킬 수 있으며, 본 발명에서는 농축된 면역글로불린 함유 용액 속에 포함되어 있는 카프릴산 및 다른 혈장 단백질을 제거하기 위해 음이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.

음이온교환 크로마토그래피 단계에서의 음이온교환 수지는 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 사차 암모니움(Quaternary ammonium)기들로 치환된 것들을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 강염기성의 사차 암모니움기를 가지는 그룹이나 또는 약염기성의 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹을 가지는 음이온 교환수지 중에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다.

예를 들면, 강염기성의 음이온교환 수지로는 Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE(S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel SuperQ-5PW 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 공지된 음이온교환 수지를 사용할 수 있다.

음이온교환 크로마토그래피에 사용되는 수지의 적절한 부피는 컬럼 치수, 즉, 컬럼의 직경과 수지의 높이에 의해 반영되고, 예컨대, 적용되는 용액의 면역글로불린 용액양과 사용되는 수지의 결합 성능에 따라 달라진다. 음이온교환 크로마토그래피를 수행하기 전에, 음이온교환 수지는 바람직하게는 완충액으로 평형화시켜, 수지가 그의 짝 이온과 결합할 수 있도록 한다.

본 발명에서는, 음이온교환 수지로 Q 세파로스 FF(Q sepharose Fast Flow)를 사용하였으며, 컬럼 완충액으로는 인산나트륨 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 등 당업계에 공지된 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer), 세척버퍼(wash buffer) 및 용출버퍼(elution buffer)를 사용할 수 있다.

음이온교환 크로마토그래피에서를 위한 컬럼은 25±0.5mM 아세트산 나트륨(NaOAc) 완충액으로 pH가 5.6±0.1이 되도록 평형화시켰으며, 이동상의 유속은 120±25 cm/hr으로 조절하였다. 농축된 면역글로불린 용액의 로딩 양은 90.0±20 mg/mLr이 되도록 컬럼에 로딩하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 면역글로불린이 포함된 용액의 잠재적 지질외피바이러스(lipid enveloped virus) 등의 바이러스를 불활성시키고, 불활성화 이후, 불활성화를 위해 사용된 물질을 제거하기 위한 단계로서, 바이러스-비활성화제, 바람직하게는 용매 및/또는 세정제, 가장 바람직하게는 용매-세정제 혼합물을 이용한 용매 및 세정제 처리(Solvent ＆ Detergent Treatment)가 이용될 수 있다.

상기 (c) 단계를 통해 HIV1 및 HIV2, 간염 타입 C 및 non A-B-C, HTLV1 및 2, 헤르페스 바이러스군, CMV 및 엡스타인 바 바이러스 등의 잠재적 지질외피바이러스들이 불활성화되어, 최종 제품의 안전성이 제고될 수 있다.

상기 (c) 단계에서 사용될 수 있는 용매 및 세정제는 바이러스, 특히 지질외피바이러스를 불활성화시킬 수 있는 특성을 가진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용가능하다. 세정제는 비이온성 및 이온성 세정제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 실질적으로 비변성인 것이 바람직하다. 특히, 제거의 용이성 측면에서, 비이온성 세정제가 바람직하며, 용매는 미국등록특허 제4,764,369 호에 개시된 바와 같이 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP : Tri-n-butyl phosphate)이 가장 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명을 수행하는 데 특히 바람직한 바이러스-비활성화제는 TNBP 및 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80), 트리톤 X-100 및 트리톤 X-45 중에서 선택되는 하나 이상인 것의 혼합물이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 용매/세정제 혼합물은 면역글로불린 함유 용액 중 TNBP 농도가 0.2 내지 0.6 중량% 이내, 바람직하게는 0.24 내지 0.36 중량%가 되도록 첨가되며, 트윈 80의 농도는 0.8 내지 1.5중량% 범위 이내, 바람직하게는 0.8 내지 1.2중량%의 농도가 되도록 첨가한다.

바이러스-비활성화 단계는 지질외피바이러스를 비활성화시켜, 실질적으로 바이러스 위험성이 없는 면역글로불린 함유 용액을 생성시키는 조건 하에서 수행된다. 상기 조건에서 반응온도는 바람직하게는 4 내지 30℃, 더 바람직하게는 19 내지 28℃, 가장 바람직하게는 24 내지 26℃이며, 반응시간은 바람직하게는 1 내지 24시간, 더 바람직하게는 4 내지 12시간, 가장 바람직하게는 약 8시간이며, 바이러스 비활성화를 보장하기에 충분하다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 pH 4.5 내지 5.5, 유속 110 내지 130cm/hr의 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게 상기 pH는 4.9 내지 5.1이 되도록 조절하여 수행된다. 양이온교환 수지에 로딩되는 면역글로불린은 양이온교환 수지 ㎖당 90 내지 130㎎, 더 바람직하게는 수지 ㎖당 95 내지 105 ㎎이다. 면역글로불린을 흡착시킨 후 평형 버퍼(equilibration buffer)로 세척한다. 상기 조건에서 세척에 이용되는 평형 버퍼는 컬럼 볼륨의 3배 이상, 바람직하게는 5배 이상의 부피를 사용하여 세척할 수 있으며, 세척 후 컬럼부피의 8배 이상의 용출버퍼(elution buffer)로 면역글로불린을 용출한다.

양이온교환 수지는 세파덱스(Sephardex), 세파로즈(Sepharose), 하이퍼셀(HyperCell) 또는 소스(Source) 등을 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며 다른 당업계에 공지된 양이온교환 수지를 사용할 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게 세라믹 계열의 양이온교환 수지를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 양이온교환수지로 세라믹 계열인 CM 하이퍼 D겔을 사용하였으며, 컬럼 완충액으로는 인산나트륨 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 등 당업계에 공지된 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer), 세척버퍼(wash buffer) 및 용출버퍼(elution buffer)를 사용하였다.

양이온교환 수지로부터 면역글로불린의 용출은 면역글로불린의 효율적인 용리를 야기시키기에 충분한 pH 및 이온 세기를 갖는 실질적으로 비-변성 완충액으로 수행하여 면역글로불린 함유 용출액을 회수한다. '효율적인 용리'는 양이온교환 수지에 로딩된 면역글로불린 용액의 75% 이상, 80% 이상 등, 예컨대, 85% 이상 등이 양이온 교환수지로부터 용출되는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 양이온교환 수지에서 면역글로불린을 치환하기에 충분할 정도로 높은 용출 완충액의 염 농도에서 수행될 수 있으며, 400 내지 600 mM의 염농도, 바람직하게는 500mM의 염 농도에서 수행될 수 있다.

본 발명에 있어, 상기 (d) 단계는 최종적으로 불순물을 한번 더 제거하는 단계이다.

투석 및/또는 농축시 중합체 함량을 유지하기 위하여 양이온교환 크로마토그래피 용출액의 염 농도를 50 내지 150mM로 유지시킨 상태에서 수행되는 것이 바람직하다. 단백질 용출단계에서 낮은 염을 유지하는 용출방법을 통해 면역글로불린의 중합체 함량을 최소화하여 향상된 품질의 면역글로불린을 정제할 수 있다. 본 발명에서는 양이온교환수지 용출액은 중합체 함량 유지를 위해 100mM 이하의 염농도를 유지하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 투석 및/또는 농축은 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF) 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하며, 삼투압 10 mOsmol/kg 이하에서 수행한 다음, pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 것을 특징으로 한다. 즉, 양이온교환 크로마토그래피에서 용출된 용출액은 투석되고 농축되며, 투석여과(diafiltration) 및 한외여과에 의한 투석 및 농축이 한 단계로 수행된다. 투석/한외여과에 사용되는 막은 유리하게는 50,000 Da 범위의 공식 중량 컷오프를 갖는다.

본 발명에서는 양이온교환 크로마토그래피 용출액에서 저분자 이온을 제거하기 위해 투석여과를 수행하였으며, UF/DF 시스템의 삼투압이 10mOsmol/kg 이하가 되도록 하였다. 투석 및/또는 농축된 면역글로불린은 굴절계(T/S meter)의 시험결과 1.5±0.1로 농축된 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 pH 5.5 내지 6.5, 유속 90 내지 150cm/hr의 조건에서 수행하며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 0.8 내지 1.2 로딩볼륨(Loding Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게 상기 pH는 5.78 내지 6.30, 가장 바람직하게 6.0 내지 6.2가 되도록 조절하며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획은 바람직하게 0.96 내지 1.04 로딩볼륨(Loding Volume; LV)으로 회수할 수 있다.

또한, 상기 (d) 단계에서 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획의 pH는 4.0 내지 5.5가 되도록 조절하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 pH가 4.3 내지 4.7이 되도록 산, 바람직하게는 1M 황산, 염산 또는 아세트산을 첨가함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명에서는, 음이온교환 수지로 프랙토겔 EMD TMAE (Fractogel EMD TMAE)를 사용하였으며, 컬럼에 충진시킨 후, 20±1.0mM 아세트산 나트륨(NaOAc) 완충액으로 pH가 6.1±0.05가 되도록 평형화시켰으며, 이동상의 유속은 120±30 cm/hr 조절하였다. 투석 및/또는 농축된 면역글로불린 용액의 로딩 양은 110.0±10 mg/mLr이 되도록 컬럼에 로딩하였으며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.0±0.04 로딩볼륨으로 회수한 다음, 1M 아세트산을 첨가하여 pH를 4.5±0.2로 조정하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 여과는 나노여과(nanofiltration) 또는 한외여과/투석여과 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하며, 상기 나노여과는 2.0 내지 3.0 bar 압력 조건에서 수행하며, 한외여과/투석여과는 삼투압 10mOsmol/kg 이하에서 수행한 다음, pH를 4.5 내지 5.5로 조절하는 것을 특징으로 한다.

나노여과는 중요한 바이러스 제거단계로, 2차 음이온교환 크로마토그래피에 붙지 않은 분획을 2.5±0.5 bar 압력보다, 바람직하게는 2.5±0.2 bar 압력보다 크지 않게 폴 DVD 프리필터(Pall DVD pre-filter) 및 DV20 바이러스 필터를 통해 여과시켜 면역글로불린 용액 속에 포함된 바이러스를 제거하였으며, 그 후, 저분자 이온을 제거하기 위해 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF) 시스템을 사용하여 10mOsmol/kg 이하)로 투석여과를 수행하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계를 마친 후 안정화제를 첨가하여 정맥주사용 면역글로불린을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 추가 첨가되는 안정화제는 슈가 알콜, 말토스, 소르비톨, 만노스, 글루코스, 트레할로스, 알부민, 리신, 글리신 PEG 및 Tween 80 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 글리신을 사용한다.

상기 안정화제는 200 내지 300mM이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하며, 안정화제를 첨가한 후, pH를 4.5 내지 5.5로 조절하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 pH가 4.7 내지 4.9가 되도록 산, 바람직하게는 황산 또는 염산을 첨가함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명에서는, 면역글로불린의 안정화를 위해 투석 및/또는 농축된 면역글로불린 용액에 글리신(glycine)을 최종 농도가 250±50mM이 되도록 첨가하고 완전히 섞어준 후, pH가 4.8±0.1이 되도록 0.5N 염산을 추가해 조절하고, 0.2 μm 필터를 이용해 멸균시켜 보관하였다.

상기 멸균된 정맥주사용 면역글로불린 제제는 단백질 농도(정제된 면역글로불린)가 전체 부피의 1 내지 30중량%이 되도록 희석시키거나 농축시키는 것을 특징으로 하며, 본 발명에서는 단백질 농도가 40 내지 60ｇ/ℓ, 바람직하게는 45 내지 55ｇ/ℓ, 더 바람직하게는 49.5 내지 50.5ｇ/ℓ이 되도록 WFI로 희석하거나 한외여과로 농축시킨 다음, 글리신(glycine)을 최종 농도가 250±50mM이 되도록 첨가하고 완전히 혼합시키고 pH가 4.8±0.1이 되도록 염산을 추가해 조절하여 정맥주사용 면역글로불린 제제의 최종 제형 제조하였다.

본 발명은 다른 관점에서 본 발명의 제조방법으로 제조된 정맥주사용 면역글로불린에 관한 것이다.

본 발명의 실시예에서, 제조 단계별 면역글로불린 용액의 순도(Thrombin/IgG) 및 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 FXI(Human Coagulation Factor XI)의 농도를 측정한 결과, 순도 99% 이상의 면역글로불린 용액을 정제한 것을 확인하였으며(도 2), 혈전응고제인 FXI도 대부분 제거된 것을 확인할 수 있었다 (표 2 및 도 3).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1 : 정맥주사용 면역글로불린 제조

1-1 : 혈장(plasma)준비

혈장은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), C형 간염바이러스(HCV), B형 간염바이러스(HBV) 및 파보바이러스 B19(parvovirus B19)에 대한 핵산증폭검사(NAT; Nucleic Acid Amplification Test) 및 혈청학적 검사를 포함하는 바이오테스트(Biotest)가 이루어지고 FDA에서 승인된 혈장을 사용한다.

본 발명에서는 미국 유래 혈장(Batch No. 600B0491)를 사용하였으며 혈장은 사용하기 전까지 -20℃ 이하에서 보관하였다. 혈장이 담겨 있는 병은 커틀 기기(bottle cutting machine)로 오픈하고, 1 내지 6℃의 자켓식 반응기(jacketed vessel)에서 12 내지 72시간 동안 반응시켜 혈장을 녹였다.

상기 조건에서 혈장이 녹으면서 피브리노겐(fibrinogen) 및 응고인자(coagulation factors)이 포함된 동결침강혈장(cryoprecipitate)이 생성되는데, 원심분리를 통해 동결침강혈장을 제거시키고, 동결침강혈장이 제거된 냉동 결핍성 혈장(cryopoor plasma)을 회수하였다.

1-2 : 침전(precipitation) Ⅰ

최종 에탄올 농도가 -3±1℃에서 8 ± 0.8%가 되도록 실시예 1-1에서 회수한 냉동 결핍성 혈장에 96% 에탄올(ethanol)을 첨가한 후, 아세테이트 버퍼(acetate buffer)를 사용하여 pH가 7.2±0.2이 되도록 조절하였다. 침전 Ⅰ의 회수는 공정산물의 소요량에 따라 실시여부가 달라지며, 본 발명에서는 침전 Ⅰ 공정은 실시하였으나 원심분리를 통한 침전물 제거는 실시하지 않았다.

1-3 : 침전(precipitation) II+III 및 여과(filtration)

침전 Ⅰ 공정 이후, 결핍성 혈장에 포함된 면역글로불린(Immunoglpbulin)을 추가로 침전시키기 위해, 침전 II+III 단계를 수행하였다.

침전 Ⅰ 단계를 거친 결핍성 혈장에 최종 에탄올 농도가 -5±1.0℃에서 20±2%가 되도록 96% 에탄올(ethanol)을 추가로 첨가한 후, 아세테이트 버퍼(acetate buffer)를 사용하여 pH가 6.9±0.1이 되도록 조절하였다.

그 후, 혈장 1㎏ 당 필터 보조제(Celpure 300, Celpure 1000) 0.0284㎏씩 첨가하고 30±10분 동안 혼합시켰다. 혼합물을 2 내지 8℃로 유지시킨 콜드룸(cold room)안에서 필터 프레스(filter press, 기기정보)를 사용하여 상측액과 침전물을 분리시켰다.

상층액은 상층액(supernatant) Ⅰ+II+III (또는 II+III)으로 명명하고, 침전물은 분획(fraction) Ⅰ+II+IIIw (또는 II+IIIw)로 명명하였다 (w; wash). 분획 Ⅰ+II+IIIw (또는 II+IIIw)는 즉시 사용하거나 -20℃ 이하에서 보관한다.

1-4 : 분획 Ⅰ+II+III 페이스트(fraction Ⅰ+II+III paste)의 추출, 카프릴산(caprylate) 침전, 여과 및 농축

실시예 1-3에서 수득한 분획 Ⅰ+II+III 페이스트로부터 면역글로불린을 추출하기 위해 분획 Ⅰ+II+III 페이스트 : 증류수가 1 : 6 내지 10이 되도록 증류수 또는 WFI(주사용 증류수)를 첨가하여 추출된 단백농도가 15㎎/㎖가 되도록 하고, 1M 아세트산(acetic acid)를 사용하여 pH가 4.2±0.1이 되도록 조절한 다음, 2 내지 8℃의 온도에서 11±0.5 시간 동안 분획 Ⅰ+II+III 페이스트를 추출하였다.

추출액에 카프릴산(caprylate)의 농도가 20±1.0mM이 되도록 1M의 카프릴산 나트륨(sodium caprylate)용액을 첨가한 다음, 1M 아세트산(acetic acid) 또는 0.5M 수산화나트륨(NaOH)를 사용하여 pH가 5.1±0.1이 되도록 조절하고, 4℃에서 1시간±10분 동안 침전반응을 수행하였다. 그 후, 상층액을 회수하고 농축시키기 위해 심층여과 카트리지(depth filter cartridges; Ahlstrom-924 filter, Ahlstrom-950 filter를 사용해 면역글로불린 용액을 수득하였다. 상기 수득액을 농축하여 28±2㎎/㎖으로 농축하였다.

1-5 : 1차 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)

실시예 1-4에서 수득한 농축된 면역글로불린 용액 속에 포함되어 있는 카프릴산 및 다른 혈장 단백질을 제거하기 위해 음이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.

음이온교환수지는 Q 세파로스 FF(Q sepharose FF; GE Healthcare, Catalog No. 17-0510)을 컬럼에 충진한 후 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer; 25±0.5mM 아세트산 나트륨(NaOAc), pH 5.6)를 사용하여 pH가 5.6±0.1이 되도록 평형화시켰다. 이후 실시예 1-4에서 수득한 농축된 면역글로불린 용액을 25℃이상에서 유속 120±25 cm/hr이 되도록 컬럼에 로딩하였으며, 로딩 양은 90.0±20 mg/mLr이 되도록 하였다. 그 후, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.6 내지 2.0 로딩볼륨(Loding Volume; LV)으로 회수하였다.

1-6 : 용매 및 세정제 처리(solvent/detergent Treatment)

면역글로불린이 포함된 용액의 잠재적 지질외피바이러스(lipid enveloped virus)를 불활성화시키기 위해 용매 및 세정제를 처리하는 단계를 수행하였다.

먼저, 실시예 1-5에서 회수한 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획에 아세트산을 첨가하여 pH가 5.0±0.1이 되도록 조절하였으며, 트리(엔-부틸)-포스페이트(Tri(n-butyl)-phosphate; TNBP) 및 폴리소어베이트 80(Polysorbate 80 ; Tween 80)를 각각 0.3±0.06% 및 1±0.2% 의 농도가 되도록 첨가한 후, 20분 내지 30분 동안 200±50 RPM으로 교반하였다. 용액 안의 TNBP 및 Tween 80가 균일하게 혼합되었는지 일부를 샘플링하여 확인하였으며, 그 후로 25±1.0℃에서 8시간 동안 200±50 RPM으로 지속적으로 교반하였다.

1-7 : 양이온교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)

용매/세정제 처리된 면역글로불린 용액에서 TNBP, Tween 80 및 응고인자 등이 다른 불순물을 제거하기 위해 양이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.

양이온교환 수지는 세라믹 재질인 CM 하이퍼 D 겔(Pall Corporation ; Catalog No. 20050)을 컬럼에 충진한 후 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer; 25±0.5mM 아세트산 나트륨(NaOAc))를 사용하여 pH가 5.0±0.1이 되도록 평형화시켰다. 이후 실시예 1-6에서 용매/세정제 처리된 면역글로불린 용액을 20±2℃에서 유속 120±10cm/hr이 되도록 컬럼에 로딩하였으며, 로딩 양은 100.0±5 mg/mLr이 되도록 하였다. 또한, 컬럼 부피의 5배 이상의 세척버퍼로 세척한 후, 컬럼 부피의 8배 이상의 용출 버퍼(용출버퍼 조성 : 20mM NaOAc pH 4.5 w/ 0.5M NaCl)를 사용하여 면역글로불린을 용출시켰다.

1-8 : 투석여과(diafiltration)

양이온교환 크로마토그래피 용출액에서 저분자 이온을 제거하기 위해 투석여과를 수행하였다.

실시예 1-7에서 수득한 용출액은 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; Millipore Pellicon2(50K)) 시스템을 사용하여 10mOsmol/kg 이하로 투석여과를 수행하였으며, UF/DF 시스템은 중합체 함량을 유지하기 위하여 양이온교환 크로마토그래피 용출액을 계산된 투석농축액에 첨가하여 100mM 염화나트륨 이하의 농도를 유지시키면서 연속적으로 진행하였다.

1-9 : 2차 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)

실시예 1-8에서 수득한 투석 및/또는 농축된 면역글로불린 용액 속에 포함되어 있는 폴리머 및 다른 혈장 단백질을 제거하기 위해 2차 음이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.

음이온교환수지는 프랙토겔 EMD TMAEQ (Fractogel EMD TMAE; Merck-Millipore, Cat No. 116887)을 컬럼에 충진한 후 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer; 20±0.5mM 아세트산 나트륨(NaOAc), pH 6.1)를 사용하여 pH가 6.1±0.1이 되도록 평형화시켰다. 이후 실시예 1-8에서 수득한 농축된 면역글로불린 용액을 20±2℃에서 유속 120±30 cm/hr이 되도록 컬럼에 로딩하였으며, 로딩 양은 110.0±10 mg/mLr이 되도록 하였다. 그 후, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.0±0.04 로딩볼륨(Loding Volume; LV)으로 회수한 다음, 염산을 첨가하여 pH를 4.5±0.1로 조정하였다.

1-10 : 나노여과(nanofiltration) 및 투석여과(diafiltration)

나노여과는 중요한 바이러스 제거단계로, 실시예 1-9에서 투석 농축된 면역글로불린 용액을 2.0±0.5 bar 압력보다 크지 않게 프리필터(FlorodyneⅡ prefilter, AB1DJL7PH4 )로 여과하고, 2.0±0.5 bar 압력 조건하에서 바이러스 필터(DV20, AB3DV207PH4)를 통해 여과시켜 면역글로불린 용액 속에 포함된 바이러스를 제거하였다.

그 후, 저분자 이온을 제거하기 위해 한외여과/투석여과 (Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF) 시스템을 사용하여 10mOsmol/kg 이하로 투석여과를 수행하였다.

1-11 : 안정제(stabilizer) 추가 및 최종 제형 제조

면역글로불린의 안정화를 위해 투석 및/또는 농축된 면역글로불린 용액에 글리신(glycine)을 최종 농도가 250±50mM이 되도록 첨가하고 완전히 섞어준 후, 안정화된 면역글로불린 용액의 pH를 측정하고 pH가 4.8±0.1이 되도록 0.5N 염산을 추가해 조절하였다. 그 다음, 여과액을 0.2 μm 필터를 이용해 멸균시키고, 스테인레스 스틸 저장탱크로 옮겨 보관하였다.

정맥주사용 면역글로불린 제제의 최종 제형은 단백질 농도가 50±0.5ｇ/ℓ가 되도록 WFI로 희석하거나 한외여과로 농축시킨 다음, 글리신(glycine)을 최종 농도가 250±50mM이 되도록 첨가하고 완전히 혼합시켰으며, 그 후, 안정화된 면역글로불린 제제의 pH를 측정하고 pH가 4.8±0.1이 되도록 염산을 추가해 조절하였다.

면역글로불린 제제는 pH 조정후 멸균시키며, 충전을 위해 충전룸으로 옮겨 제품을 제조한 뒤 2 내지 8℃에 보관하였다.

실시예 2 : 제조 단계별 면역글로불린 용액 내 Thromboembolic risk 측정 (Generated Thrombin/IgG)

상기 실시예 1의 제조단계별로 샘플링한 면역글로불린 제제의 순도(Thrombin/IgG)를 측정하였다.

2-1. 실험 방법

본 발명에서 상기 실시예 1의 제조 단계별 면역글로불린 용액 내 Thromboembolic risk 측정은 FDA 산하 6개 분석기관의 하나인 CBER (Center for Biologics Evaluation and Research)의 Thrombin Generation protocol(CBER Thrombin Generation protocol 01 Experiment (100916)a)에 따라 실시하였다.

2-2. 실험 결과

본 발명의 면역글로불린 정제 공정은 콘 혈장분획 방법과 이온 크로마토그래피의 정제기법을 동반하고 있으며, 도 2 및 표 1에서 보는 바와 같이, 카프릴산 침전공정과 크로마토그래피 정제기법 중 양이온 교환수지 크로마토그래피 및 2차 음이온 교환수지 크로마토그래피에서 혈전 생성 물질로 야기되는 Generated thrombin의 양이 효과적으로 제거되는 것을 확인할 수 있었다.

제조 공정 단계별 산물 분석표

단계 (process)	비고	트롬빈(Thrombin) nM
1. 페이스트 추출 (paste extraction)		266.4
2. 카프릴산 침전(caprylate precipitation)		56.9
3. 1차 음이온 교환 크로마토그래피(1st AEX chromatography)	로딩부분	71.9
	통과액 부분	40.0
4. 양이온 교환 크로마토그래피(CEX chromatography)	로딩 부분	37.6
	용출 부분	29.4
5. 2차 음이온 교환 크로마토그래피(2nd AEX chromatography)	로딩 부분	25.5
	통과액 부분	7.4
6. 나노여과 (nanofilitration)		9.1
7. 농축 (concentration)		7.7
8. 크루드 용액 (crude solution)		14.5

이는 면역글로불린의 정맥주사로 야기될 수 있는 혈전생성을 최소화하여 혈전생성에 따른 혈전색전증을 효과적으로 방지하고, 이를 통해 면역글로불린의 안전성을 극대화할 수 있음을 보여준다.

실시예 3 : 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 FXI(Human Coagulation Factor XI)의 농도 측정

혈전응고제의 제거 정도를 확인하기 위해, 상기 실시예 1의 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 FXI(Human Coagulation Factor XI)의 농도를 ELISA( AssayMax Human Factor XI (FXI) ELISA Kit; ssaypro, Catalog No. EF1011-1) 및 SDS-PAGE로 측정하였다.

정제 공정 상물들의 FXI 함량

	단계 (process)	비고	FXI(EIA)
			(ng/mL)
1	페이스트 추출 (paste extraction)		732.77
2	카프릴산 침전 (caprylate precipitation)		1.76
3	1차 음이온 교환 크로마토그래피(1st AEX chromatography)	로딩부분	4.16
4		통과액 부분	1.02
5	양이온 교환 크로마토그래피(CEX chromatography)	로딩 부분	1.93
6		용출 부분	2.16
7	2차 음이온 교환 크로마토그래피 (2nd AEX chromatography)	로딩 부분	0.31
8		통과액 부분	2.67
9	나노여과 (nanofilitration)		6.46
10	농축 (concentration)		4.89
11	크루드 용액 (crude solution)		N.D

본 발명의 정제 공정의 산물들의 FXI 함량을 측정하기 위해 ELISA 및 SDS-PAGE으로 측정한 결과, 표 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, 카프릴산 침전, 양이온 교환수지 및 음이온 교환수지 크로마토그래피에서 FXI가 거의 제거되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 정맥주사용 면역글로불린의 제조방법은 분획 I+II+III 또는 분획 II+III를 출발물질로 하여 분획 Ⅱ를 제조하기 위한 침전 단계의 생략이 가능하고, 카프릴산 나트륨 1차 침전법과 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피 사용으로 폴리에틸렌 글리콜 처리법으로 제조함에 있어 발생하는 공정의 번거로움과 낮은 수율의 문제점을 해결하였다. 또한, 본 발명에 따른 면역글로불린의 정제방법을 이용하면, 불순물 및 혈전 생성물질을 제거효율을 높이고, 중합체 함량을 유지할 수 있으므로, 안정적이고 향상된 품질의 면역글로불린의 생산이 가능하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

1. 다음 단계를 포함하는 면역글로불린의 정제방법:
   (a) 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획 I+II+III(fraction I+II+III) 또는 분획 II+III(fraction II+III)를 용해시킨 다음, 침전제를 첨가하여 침전반응을 수행하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계의 침전반응에 의해 침전된 침전물을 제거하고 면역글로불린이 포함된 상층액을 여과시킨 다음, 여과액을 농축하고 음이온교환 크로마토그래피를 수행하고, 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계;
   (c) 바이러스 불활성화를 위하여 상기 수득된 분획에 용매/세정제를 처리한 후, 상기 용매/세정제를 제거하기 위하여 400 내지 600 mM의 염농도 조건에서 세라믹 양이온 수지를 이용한 양이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
   (d) 상기 양이온교환 크로마토그래피 용출액을 50 내지 150 mM 염농도 조건에서 염농도를 일정하게 유지하면서 투석, 농축, 또는 투석 및 농축시키고, 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계; 및
   (e) 상기 수득된 분획을 바이러스 필터에 여과하고 투석, 농축, 또는 투석 및 농축하여 정제된 면역글로불린을 수득하는 단계.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 분획 I+II+III 또는 분획 II+III의 용해는 분획 I+II+III 또는 분획 II+III : 증류수가 1 : 6 내지 1 : 10이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 침전제는 카프릴산(caprylate)인 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 침전반응은 침전제가 5 내지 26mM이 되도록 첨가한 다음, pH가 4.0 내지 6.0이 되도록 조절하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 pH 5.0 내지 6.0, 유속 95 내지 145cm/hr의 조건에서 수행하며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.6 내지 2.0 로딩볼륨(Loding Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 용매는 트리(엔-부틸)-포스페이트 (TNBP, Tri-n-butyl phosphate)인 것을 특징으로 하며, 세정제는 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100 및 트리톤 X-45 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 pH 4.5 내지 5.5, 유속 110 내지 130cm/hr의 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피에 흡착되는 면역글로불린의 흡착량은 양이온교환 수지 ㎖당 90 내지 130㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
10. 삭제
11. 삭제
12. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 투석, 농축, 또는 투석 및 농축은 한외여과/투석여과 (Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF) 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하며, 삼투압 10mOsmol/kg 이하에서 수행한 다음, pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
    
13. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 pH 5.5 내지 6.5, 유속 90 내지 150cm/hr의 조건에서 수행하며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 0.8 내지 1.2 로딩볼륨(Loding Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획의 pH는 4.0 내지 5.5가 되도록 조절하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 여과는 나노여과(nanofiltration) 또는 한외여과/투석여과 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 나노여과는 2.0 내지 3.0 bar 압력 조건에서 수행하며, 상기 한외여과/투석여과는 삼투압 10mOsmol/kg 이하에서 수행한 다음, pH를 4.5 내지 5.5로 조절하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계 이후, 안정화제를 첨가하여 정맥주사용 면역글로불린을 제조하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 안정화제는 슈가 알콜, 말토스, 소르비톨, 만노스, 글루코스, 트레할로스, 알부민, 리신, 글리신, PEG 및 Tween 80 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
19. 제17항에 있어서, 상기 안정화제는 200 내지 300mM이 되도록 첨가되는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
20. 제17항에 있어서, 상기 안정화제를 첨가한 후, pH를 4.5 내지 5.5로 조절하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.

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