CN109627329A

CN109627329A - 一种人免疫球蛋白制备时去除和灭活病毒的方法

Info

Publication number: CN109627329A
Application number: CN201811618946.9A
Authority: CN
Inventors: 黄琰; 卢杨利; 寇鹏; 王焰
Original assignee: RONGSHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd CHENGDU
Current assignee: RONGSHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd CHENGDU
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-04-16

Abstract

本发明提供了一种人免疫球蛋白制备时去除和灭活病毒的方法，其特征在于，它包括如下步骤：a.溶解：血浆蛋白加入注射用水中，2‑8℃搅拌至其溶解，调节pH至3.8‑4.9；b.辛酸钠沉淀：加入辛酸钠，并调pH至5.2±0.1，沉淀杂蛋白和非脂包膜病毒；c.深滤：用深滤板过滤，将沉淀下来的杂蛋白和病毒去除；d.辛酸钠病毒灭活：将步骤c中的滤液补加辛酸钠至10‑16mM，并调节pH值，使pH≤5.1，孵放灭活。本发明在沉淀步骤中使用辛酸钠配合合适的pH值(5.2±0.1)，可以有效去除非脂包膜病毒。本发明在辛酸钠沉淀后，再加入适量的辛酸钠，配合合适的pH值，可以有效灭活脂包膜病毒。

Description

一种人免疫球蛋白制备时去除和灭活病毒的方法

技术领域

本发明涉及生物制品病毒灭活领域，特别涉及辛酸钠在制备人免疫球蛋白过程中灭活病毒的方法。

背景技术

人免疫球蛋白制品，是在人血浆中使用低温乙醇蛋白分离法或经批准的其它分离法分离纯化的免疫球蛋白组分，经病毒去除和灭活处理制成。

病毒去除和灭活是保证免疫球蛋白制品安全的关键步骤。传统的病毒去除和灭活方法，例如S/D法、低pH孵放法，都存在着一定的局限性，如处理时间较长，对制品的收率和生物活性造成一定的影响。

辛酸钠作为白蛋白稳定剂和某些血浆蛋白的沉淀剂被长期应用于血液制品领域，其对人体的安全性及耐受性已毋庸置疑。20世纪70年代，研究人员就已经发现辛酸盐对病毒有杀灭能力，在低pH条件下，辛酸盐呈最大的非离子化形式，从而能达到快速灭活病毒的效果。

但目前对辛酸钠在人免疫球蛋白灭活过程中的应用尚不成熟。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种人免疫球蛋白制备时去除和灭活病毒的方法，它包括如下步骤：

a.溶解：血浆蛋白加入注射用水中，2-8℃搅拌至其溶解，调节pH至3.8-4.9；

b.辛酸钠沉淀：加入辛酸钠，并调pH至5.2±0.1，沉淀杂蛋白和非脂包膜病毒；

c.深滤：用深滤板过滤，将沉淀下来的杂蛋白和病毒去除；

d.辛酸钠病毒灭活：将步骤c中的滤液补加辛酸钠至10-16mM，并调节pH值，使pH≤5.1，孵放灭活。

前述的方法中，步骤a所述血浆蛋白为Cohn组分I+II+III。

前述的方法中，步骤b中所加辛酸钠的终浓度为20-25mM。

前述的方法中，步骤b中加入辛酸钠、调pH后，还要搅拌和静置。

前述的方法中，步骤c所述深滤前还要加入硅藻土和/或珍珠岩混合搅拌。

前述的方法中，步骤d中补加辛酸钠，使滤液辛酸钠终浓度上升至10-16mM。

前述的方法中，步骤d的孵放时间≥1min。

进一步地，步骤d的孵放时间≥1h。

前述的方法中，步骤d的孵放温度为20-30℃。

前述的方法中，步骤d的pH值为4.1-5.0。

本发明的方法，在沉淀步骤中使用辛酸钠配合合适的pH值(5.2±0.1)，可以有效去除非脂包膜病毒。

本发明的方法，在辛酸钠沉淀后，再加入适量的辛酸钠，配合合适的pH值，可以有效灭活脂包膜病毒。

本发明的方法，在达到去除/灭活病毒的目的后，还能保证免疫球蛋白产品的效价、纯度、外观等等一系列标准。

本发明在制备人免疫球蛋白过程中的病毒去除/灭活中，具有较高的应用价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是12mM辛酸钠、pH≤5.0灭活脂包膜病毒的动力学曲线

图2是12mM辛酸钠，pH 5.0、5.2、5.4灭活PRV病毒的动力曲线

具体实施方式

本部分通过实施例和实验例的方式进一步对本发明进行说明。

涉及到的主要试剂盒仪器：

辛酸钠、硅藻土、珍珠盐、NaOH；培养液为MEM细胞培养液，血清为小牛血清；pH计、HPLC仪等。

用于病毒灭活的生物制品材料是按照《医学生物制品学》(人民卫生出版社，第二版，第1194页)所记载的方法制备的Cohn组分I+II+III。

指示病毒的培养和病毒滴度检测方法根据国家药品监督管理局制定的《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》予以选择，采用96孔细胞病变法观察细胞病变，Karber法计算病毒滴度。

实施例1一种利用辛酸钠在制备人免疫球蛋白过程中去除/灭活病毒的方法

1.Cohn组分溶解

取Cohn组分I+II+III，加入注射用水中，2℃搅拌至其溶解，调节pH至3.8。通常情况下，注射用水用量为：注射用水与Cohn组分I+II+III的体积质量比为10∶1。

2.辛酸钠沉淀

加入辛酸钠，使其终浓度为20～25mM，搅拌30min，用0.5M NaOH调整溶液pH至5.1，18℃搅拌反应2h，静置2h。取悬液。

3.深滤

在上一步的悬液，每1L分别加入10g硅藻土，搅拌30分钟；按每10Kg组分I+II+III使用1平方米50P滤板进行过滤，进液压力不得大于0.3MPa。然后进行过滤，收集滤液，经检测滤液中剩余辛酸钠浓度为5～8mM。

4.辛酸钠病毒灭活

滤液补加辛酸钠，使滤液中的辛酸钠终浓度提高至13mM，用HCl将pH调至4.9，在20℃条件下孵放1h。

实施例2一种利用辛酸钠在制备人免疫球蛋白过程中去除/灭活病毒的方法

1.Cohn组分溶解

取Cohn组分I+II+III，加入注射用水中，4℃搅拌至其溶解，调节pH至4.3。通常情况下，注射用水用量为：注射用水与Cohn组分I+II+III的体积质量比为12∶1。

2.辛酸钠沉淀

加入辛酸钠，使其终浓度为20～25mM，搅拌30min，用0.5M NaOH调整溶液pH至5.2，20℃搅拌反应2h，静置2h。取悬液。

3.深滤

在上一步的悬液，每1L分别加入10g硅藻土，搅拌30分钟；按每10Kg FI+II+III使用1平方米50P滤板进行过滤，进液压力不得大于0.3MPa。然后进行过滤，收集滤液，经检测滤液中剩余辛酸钠浓度为5～8mM。

4.辛酸钠病毒灭活

滤液补加辛酸钠，使滤液中的辛酸钠终浓度提高至10mM，用HCl将pH调至5.0，在25℃条件下孵放1h。

实施例3一种利用辛酸钠在制备人免疫球蛋白过程中去除/灭活病毒的方法

1.Cohn组分溶解

取Cohn组分I+II+III，加入注射用水中，8℃搅拌至其溶解，调节pH至4.9。通常情况下，注射用水用量为：注射用水与Cohn组分I+II+III的体积质量比为15∶1。

2.辛酸钠沉淀

加入辛酸钠，使其终浓度为20～25mM，搅拌30min，用0.5M NaOH调整溶液pH至5.3，22℃搅拌反应2h，静置2h。取悬液。

3.深滤

4.辛酸钠病毒灭活

滤液补加辛酸钠，使滤液中的辛酸钠终浓度提高至16mM，用HCl将pH调至5.1，在30℃条件下孵放1h。

下面将以实验例的方式进一步说明本发明的方法确实可以有效去除和灭活病毒。

实验例中涉及的指示病毒有：VSV(水泡性口炎病毒)滴度为7.60TCID₅₀/ml、PRV(伪狂犬病病毒)滴度为8.50TCID₅₀/ml、Sindbis(辛德毕斯病毒)滴度为6.75TCID₅₀/ml、PPV(猪细小病毒)滴度为7.25TCID₅₀/ml，其中PPV属于非脂包膜病毒，其余属于脂包膜病毒。

实验例中涉及的细胞株：ST、BHK-21、Vero、PK-15均购自ATCC。

实验例1Cohn组分I+II+III辛酸钠沉淀去除PPV效果的验证

1.方法

1.1辛酸钠沉淀

1)20mM辛酸钠沉淀：

测Cohn组分I+II+III的pH为4.54，取45ml，加入5ml PPV混匀，测得pH为5.07，取5ml编号A样，0.45μm滤器除菌用于CPE检测。加入2M辛酸钠母液450μl至其终溶度为20mM，搅拌30min，测溶液pH为4.69，加0.5M NaOH 550μl调pH至5.23。20.0℃±2℃搅拌2h，然后室温静置2h。

2)25mM辛酸钠沉淀：

测Cohn组分I+II+III的pH为4.54，取45ml，加入5ml PPV混匀，测得pH为5.08，取5ml编号B样，0.45μm滤器除菌用于CPE检测。加入2M辛酸钠母液562.5μl至其终溶度为20mM，搅拌30min，测溶液pH为4.67，加0.5M NaOH 550μl调pH至5.23。20.0℃±2℃搅拌2h，然后室温静置2h。

1.2辛酸钠过滤

1)A样分别加0.45g硅藻土和0.45g珍珠岩，振荡5min以上，安装Q47mm 50P过滤板，用100ml注射用水冲洗后，过滤A样，进液压力不大于0.3MPa。

2)B样分别加0.45g硅藻土和0.45g珍珠岩，振荡5min以上，安装Q47mm 50P过滤板，用100ml注射用水冲洗后，过滤B样，进液压力不大于0.3MPa。

3)过滤后沉淀用45ml细胞培养液重悬，上清和沉淀溶解液分别用0.2μm和0.45μm滤器过滤，取样-70℃保存待测。

1.3滴度检测

用ST细胞制成96孔板，分别加样观察细胞病变。各样本以Karber法计病毒滴度。

2.结果

结果如表1所示，上清样均检测到病毒滴度，但病毒滴度并不高，大部分病毒富集到沉淀中，过滤前混合样品病毒滴度减去过滤后上清病毒滴度均大于4.0logs。说明该步辛酸钠沉淀杂蛋白的同时，对非脂包膜病毒起到了明显的去除效果。

表1.辛酸钠沉淀对病毒的去除作用

样品名称	PPV滴度(TCID<sub>50</sub>/ml)
		PPV	7.25
A	6.5
		A上清	2.25
A沉淀	4.5
		B	6.375
B上清	2.125
		B沉淀	4.0

实验例2不同辛酸钠浓度(3～12mM)、20～25℃、1h对指示病毒的灭活效果

1.方法

取已过滤除菌的人免疫球蛋白原液(不含辛酸钠)添加辛酸钠和HCl进行孵放，设定如表2所示的不同的辛酸钠浓度、温度、pH、灭活时间等参数。所有样本均检测病毒残余滴度，最低检测限为不大于1.5logTCID₅₀/ml。

2.结果

如表2所示，3mM辛酸钠、20℃、1h不能完全灭活VSV；6mM、20℃、1h能完全灭活用于研究的脂包膜病毒；12mM、25℃、1h能完全灭活用于研究的脂包膜病毒。

表2.不同浓度辛酸钠对指示病毒的灭活作用

注：ND表示检测不到(低于最低检测限)；-表示未检测

实验例3不同pH条件下，6mM、12mM辛酸钠浓度、20℃、25℃、pH4.5～6.5、1h对脂包膜指示病毒的灭活效果

1.方法

取已过滤除菌的人免疫球蛋白原液(不含辛酸钠)按实验例1的方法加入不同的指示病毒，然后添加辛酸钠和HCl进行孵放，设定如表3所示的不同的辛酸钠浓度、温度、pH、灭活时间等参数。所有样本均检测病毒残余滴度，最低检测限为不大于1.5logTCID₅₀/ml。

2.结果

如表3所示，pH≥5.5都不能灭活用于研究的脂包膜病毒；其中一次试验出现20℃、6mM、pH≤5.0、1h条件不能灭活VSV病毒；将灭活温度和辛酸钠浓度分别提高到25℃和12mM、pH≤5.0、1h完全能灭活用于研究的三种脂包膜病毒。

表3.6mM、12mM辛酸钠，20℃、25℃、pH4.5～6.5、1h对脂包膜指示病毒的灭活作用

注：ND表示检测不到(低于最低检测限)；-表示未检测

以上实验初步确立了IVIG中辛酸钠灭活脂包膜病毒的条件，即：IVIG浓度50±5％(g/L)，辛酸钠浓度12mM、pH≤5.0(加入辛酸钠后)、20～25℃、1h。

实验例4 12mM辛酸钠，20～25℃、1h、pH5.0～5.5对脂包膜病毒的灭活效果

1.方法

取已过滤除菌的人免疫球蛋白原液(不含辛酸钠)添加辛酸钠和HCl进行孵放，设定如表4所示的不同的辛酸钠浓度、温度、pH、灭活时间等参数。所有样本均检测病毒残余滴度，最低检测限为不大于1.5logTCID₅₀/ml。

2.结果

由表4可知，在pH≤5.2时，Sindbis病毒的残余滴度低于本试验设置的最低检测限，同样在pH≤5.1时，为PRV；在pH≤5.0时，为VSV病毒。因此从病毒安全性方面再次验证了我们的初步结论，即：IVIG浓度50±5％(g/L)，辛酸钠浓度12mM、pH≤5.0(加入辛酸钠后)、20～25℃、1h，可完全有效灭活IVIG中的VSV、PRV和Sindbis所代替的血源病毒。

表4. 12mM辛酸钠，20～25℃、1h、pH5.0～5.5对脂包膜病毒的灭活效果

注：ND表示检测不到(低于最低检测限)

实验例5pH≤5.0时辛酸钠灭活脂包膜病毒的动力学曲线

1.方法

取已过滤除菌的人免疫球蛋白原液(不含辛酸钠)添加辛酸钠和HCl进行孵放，选择0、1、2、3、5分钟灭活，其余灭活条件则按照实验例4中的最佳参数确定(即IVIG浓度50±5％(g/L)，辛酸钠浓度12mM、pH≤5.0(加入辛酸钠后)、20～25℃)。

检测样品的滴度，以灭活时间为横坐标，残余病毒滴度为纵坐标，绘制动力学曲线。

2.结果

从图1可看出三种指示病毒在1分钟以后，所有样品的残余滴度都低于最低检测限，说明该方法灭活脂包膜病毒速率极快，即在1分钟以内就可灭活用于研究的脂包膜病毒，这也是该方法最突出的优点之一。而我们之所以选用工艺条件为处理1h，是在考虑病毒安全性方面充分延长处理时间以保证其完全达到最大的灭活效果。

实验例6 5.0≤pH≤5.4时辛酸钠灭活脂包膜病毒的动力学曲线

1.方法

取已过滤除菌的人免疫球蛋白原液(不含辛酸钠)添加辛酸钠和HCl进行孵放，选择pH为5.0、5.2或5.4灭活，其余灭活条件则按照实验例2-4中的最佳参数确定(即IVIG浓度50±5％(g/L)，辛酸钠浓度12mM、时间1h、20～25℃)。

检测样品的滴度，绘制不同pH值下的灭活动力曲线。

2.结果

从图2可知，随着pH的上升，辛酸钠对PRV病毒灭活作用明显减弱。反之，当pH为5.0时，12mM辛酸钠、25℃、1h能非常迅速灭活IVIG中的PRV病毒。

实验例7辛酸钠处理样品前后的全检

1.样品

蓉生药业有限责任公司制剂车间的批号M200608029IgG F_II透析后溶解液。

2.方法和结果

取样品200ml添加辛酸钠至浓度12mM、pH≤5.0(加入辛酸钠后)、20～25℃、1h灭活病毒，然后用10倍注射用水透析，再加10％麦芽糖，最后除菌分装，在25±1℃条件下孵放21天。共分装50ml×3瓶，其中两瓶用作低pH孵放。按药典要求对低pH孵放前后样品进行全检，全部指标符合规定。检测参数和结果如表5所示。

由表5可知用该方法参与制备的人免疫球蛋白完全符合国家药典的规定。

表5.C-IVIG-M200608029低pH孵放前后全检项目

以上各实验例表明，本发明的方法在不影响人免疫球蛋白收率和质量的前提下，能快速、有效、安全地去除和灭活病毒。

Claims

1.一种人免疫球蛋白制备时去除和灭活病毒的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

c.深滤：用深滤板过滤，将沉淀下来的杂蛋白和病毒去除；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a所述血浆蛋白为Cohn组分I+II+III。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所加辛酸钠的终浓度为20-25mM。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中加入辛酸钠、调pH后，还要搅拌和静置。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c所述深滤前还要加入硅藻土和/或珍珠岩混合搅拌。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中补加辛酸钠，使滤液辛酸钠终浓度上升至10-16mM。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d的孵放时间≥1min。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤d的孵放时间之1h。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d的孵放温度为20-30℃。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d的pH值为4.1-5.0。