CN104447987A - 辛酸法血浆免疫球蛋白分离工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用辛酸（辛酸钠）的血浆免疫球蛋白的分离工艺，该分离工艺以低温乙醇法为基础，在组分II沉淀分离纯化过程中使用辛酸（辛酸钠），分离后的超滤中，提高蛋白质溶液的温度，达到病毒灭活的效果，结合现有的低pH孵放灭活，实现了不增加新的工艺操作步骤的低温乙醇法血浆免疫球蛋白的双灭活制备。

Description

辛酸法血浆免疫球蛋白分离工艺

技术领域

本专利技术属于血液制品的生产工艺。使用辛酸（辛酸钠）实现了不增加新的工艺操作步骤的低温乙醇法分离血浆免疫球蛋白的病毒双灭活生产。

背景技术

由Cohn等于1942年完善的低温乙醇法是当今血液制品行业使用最广泛的血浆蛋白质分离方法。该方法通过调节蛋白溶液的蛋白浓度、离子强度、温度、乙醇浓度及pH,形成不同种类的蛋白质组分沉淀，实现血浆蛋白质的次序分离。该方法目前普遍运用于人血白蛋白、免疫球蛋白类产品、凝血因子类产品的生产中。除人血白蛋白的生产以外，常规要求产品生产采用两步病毒灭活的双灭活生产工艺。

美国拜耳公司的发明专利《用辛酸钠作分离剂的低温白蛋白分级分离法》（ZL95109051.8）通过将辛酸钠在较低温度加至末次组分沉淀制备的上清液中，可以制备高度稳定的人血白蛋白溶液。该分离工艺中，辛酸钠在25-35摄氏度温度下加入，辛酸钠的浓度控制为0.06M,反应液的pH控制为5.3-5.6。

同为血浆蛋白质，自然我们就考虑到将辛酸（辛酸钠）法分离工艺引入到血浆免疫球蛋白的分离制备中。一篇辛酸（辛酸钠）灭活的免疫球蛋白的技术报道引起了我们的注意。

武汉生物制品研究所有限责任公司发明专利《一种球蛋白溶液的病毒灭活方法》（ZL200910062779.9）提供了一种球蛋白溶液的病毒灭活方法，通过对病毒灭活时的条件如温度、pH值、辛酸盐浓度、蛋白质浓度、孵放时间进行研究，提供了具有实用价值的辛酸钠灭活病毒时的各种参数的最佳配比。该专利提供的辛酸钠病毒灭活球蛋白的工艺参数为：辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比mmol/g为14～16∶1，pH为4.3-5.5，温度30±1℃，恒温90分钟。该法对脂包膜病毒和非脂包膜病毒都有灭活效果，一般灭活系数大于4.5log。

到目前为止，没有将辛酸（辛酸钠）应用到免疫球蛋白分离制备工艺之中的成熟技术。本发明将辛酸（辛酸钠）成功的应用到血浆免疫球蛋白的分离制备工艺中，由此，在没有增加新的工艺操作步骤的情况下，实现了血浆免疫球蛋白低温乙醇法工艺的双病毒灭活生产。

本发明将美国拜耳公司发明专利《用辛酸钠作分离剂的低温白蛋白分级分离法》（ZL95109051.8）中的血浆蛋白质辛酸钠分离技术与《一种球蛋白溶液的病毒灭活方法》（ZL200910062779.9）中的辛酸钠病毒灭活技术结合起来，研究了完整的血浆免疫球蛋白的低温乙醇分离制备，在没有增加新的工艺步骤的情况下，实现了血浆免疫球蛋白低温乙醇法工艺的双病毒灭活生产。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术的不足，采用辛酸（辛酸钠）分离血浆免疫球蛋白，不增加生产工艺，对工艺时间也没有影响。该发明的血浆免疫球蛋白分离工艺由下列操作步骤组成：

1）融浆投料，温度不高于35℃，持续时间不超过4小时。

2）制备组分I+Ⅱ+Ⅲ的工艺参数为：pH为6.5至7.8、乙醇含量为15%至24%、温度控制为-6.0℃至-2.5℃，蛋白质浓度范围为：4.0%至7.8%。

3）制备组分I+Ⅲ，将上述组分I+Ⅱ+Ⅲ用8-14倍体积的注射用水溶解，调节参数为：pH为5.0至5.6、乙醇含量为15%至24%、温度控制为-1.0℃至4.5℃，静置时间2至24小时。

4）制备组分Ⅱ，以上述分离组分I+Ⅲ的上清液为原料，按照每1升体积加入10-25mL 1mol/L的氯化钠溶液调节离子强度，工艺参数为：pH为7.0至7.8、乙醇含量为25%至34%、温度控制为-10.0℃至-5.5℃，静置时间2至24小时。

5）纯化组分Ⅱ，以上述制备分离的组分Ⅱ为原料，用8-14倍的注射用水溶解，以辛酸（辛酸钠）与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比mmol/g为14～16∶1加入辛酸（辛酸钠），调节溶解所得的溶液pH为3.5至4.8。分离除去杂蛋白、硅藻土等，得人免疫球蛋白溶液。

6）进入超滤罐后的蛋白药液，升温至温度30±1℃，恒温90分钟。后进行超滤，用分子截流量为50kD的超滤膜，第一次超滤的浓缩过程中降温至8-10℃，后加入等体积的注射用水，连续超滤6-10次。超滤完成后，用注射用水调配蛋白溶液，使其蛋白质含量为52±10g/L，并调节pH为3.5至4.8。

7）低pH病毒灭活，将经除菌过滤并密封好的人免疫球蛋白置于恒温为23-25℃条件下，静置21天。每7天取样1次，测定pH和蛋白质含量，应无明显变化。

8）二次超滤配制，低pH病毒灭活完成后，对蛋白质溶液进行二次超滤，调节蛋白质的体积。按照终体积的10%加入麦芽糖，确保蛋白质含量不低于50克/L,调节pH至适当范围。用无菌操作工艺灌装-轧盖即得。

本发明的辛酸（辛酸钠）法血浆免疫球蛋白生产工艺适用于的血浆免疫球蛋白产品品种包括有：人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、巨细胞病毒人免疫球蛋白、带状疱疹人免疫球蛋白、Ro（D）人免疫球蛋白、静注人免疫球蛋白（pH4），也包括由上述产品改变剂型、规格或使用途径的其他品种。

有益效果

本发明将辛酸（辛酸钠）成功的应用到血浆免疫球蛋白的分离制备工艺中，由此，在没有增加新的工艺步骤的情况下，实现了不增加新的工艺操作步骤的血浆免疫球蛋白低温乙醇法工艺的双病毒灭活生产。由于辛酸钠法同时可以灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒，弥补了传统免疫球蛋白低pH孵放病毒灭活只对非脂包膜病毒有效的不足。

附图说明

图1 为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

以下参考具体实施例，对本发明做进一步的说明。

实施例1:以血浆为原料的辛酸法免疫球蛋白低温乙醇分离工艺

1）融浆投料，温度不高于35℃，持续时间不超过4小时。

2）制备组分I+Ⅱ+Ⅲ的工艺参数为：pH为6.5至7.8、乙醇含量为18%、温度控制为-5.0℃℃，蛋白质浓度范围为：6.0%。

3）制备组分I+Ⅲ，将上述组分I+Ⅱ+Ⅲ用14倍体积的注射用水溶解，调节参数为：pH为5.3、乙醇含量为22%、温度控制为﹣2. 5℃，静置时间8小时。

4）制备组分Ⅱ，以上述分离组分I+Ⅲ的上清液为原料，按照每1升体积加入15mL 1mol/L的氯化钠溶液调节离子强度，工艺参数为：pH为7.2、乙醇含量为28%、温度控制为-6.5℃，静置时间24小时。

5）纯化组分Ⅱ，以上述制备分离的组分Ⅱ为原料，用8-14倍的注射用水溶解，以辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比mmol/g为14∶1加入辛酸钠，调节溶解所得的溶液pH为3. 8。分离除去杂蛋白、硅藻土等，得人免疫球蛋白溶液。

6）进入超滤罐后的蛋白药液，升温至温度30±1℃，恒温90分钟。后进行超滤，用分子截流量为50kD的超滤膜，第一次超滤的浓缩过程中降温至8-10℃，后加入等体积的注射用水，连续超滤8次。超滤完成后，用注射用水调配蛋白溶液，使其蛋白质含量为52±10g/L，并调节pH为3.5至4.8。

7）低pH病毒灭活，将经除菌过滤并密封好的人免疫球蛋白置于恒温为23-25℃条件下，静置21天。每7天取样1次，测定pH和蛋白质含量，应无明显变化。

8）二次超滤配制，低pH病毒灭活完成后，对蛋白质溶液进行二次超滤，调节蛋白质的体积。按照终体积的10%加入麦芽糖，确保蛋白质含量不低于50克/L,调节pH至适当范围。用无菌操作工艺灌装-轧盖即得。

9）生产其他免疫球蛋白品种，其区别在于超滤后的配制及二次配制使用的不同辅料，并参照药典标准，控制相关质量指标。这些免疫球蛋白包括有：人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、巨细胞病毒人免疫球蛋白、带状疱疹人免疫球蛋白、Ro（D）人免疫球蛋白、静注人免疫球蛋白（pH4）。

10）根据产品使用的情况，可以继续调整不同规格、剂型和使用途径的药物产品，比如由肌肉注射的剂型调整为静脉注射的剂型，由液体注射剂调整为冻干制剂或外用局部制剂。

实施例2: 以组分沉淀I+Ⅱ+Ⅲ为原料的辛酸法免疫球蛋白低温乙醇分离工艺

1）制备组分I+Ⅲ，将组分I+Ⅱ+Ⅲ用14倍体积的注射用水溶解，调节参数为：pH为5. 5.6、乙醇含量为24%、温度控制为-3.5℃，静置时间2至24小时。

2）制备组分Ⅱ，以上述分离组分I+Ⅲ的上清液为原料，按照每1升体积加入10mL 1mol/L的氯化钠溶液调节离子强度，工艺参数为：pH为7.1、乙醇含量为25%、温度控制为-6.5℃，静置时间2小时。

3）纯化组分Ⅱ，以上述制备分离的组分Ⅱ为原料，用8-14倍的注射用水溶解，以辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比mmol/g为16∶1加入辛酸钠，调节溶解所得的溶液pH为3.8。分离除去杂蛋白、硅藻土等，得人免疫球蛋白溶液。

4）进入超滤罐后的蛋白药液，升温至温度30±1℃，恒温90分钟。后进行超滤，用分子截流量为50kD的超滤膜，第一次超滤的浓缩过程中降温至8-10℃，后加入等体积的注射用水，连续超滤6-10次。超滤完成后，用注射用水调配蛋白溶液，使其蛋白质含量为52±10g/L，并调节pH为4.3。

5）低pH病毒灭活，将经除菌过滤并密封好的人免疫球蛋白置于恒温为23-25℃条件下，静置21天。每7天取样1次，测定pH和蛋白质含量，应无明显变化。

6）二次超滤配制，低pH病毒灭活完成后，对蛋白质溶液进行二次超滤，调节蛋白质的体积。按照终体积的10%加入麦芽糖，确保蛋白质含量不低于50克/L,调节pH至适当范围。用无菌操作工艺灌装-轧盖即得。

7）生产其他免疫球蛋白品种，其区别在于超滤后的配制及二次配制使用的不同辅料，并参照药典标准，控制相关质量指标。这些免疫球蛋白包括有：人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、巨细胞病毒人免疫球蛋白、带状疱疹人免疫球蛋白、Ro（D）人免疫球蛋白、静注人免疫球蛋白（pH4）。

8）根据产品使用的情况，可以继续调整不同规格、剂型和使用途径的药物产品，比如由肌肉注射的剂型调整为静脉注射的剂型，由液体注射剂调整为冻干制剂或外用局部制剂。

Claims (1)

1.辛酸法血浆免疫球蛋白分离工艺，其特征在于工艺由下列操作步骤组成：

1）融浆投料，温度不高于35℃，持续时间不超过4小时；

2）制备组分I+Ⅱ+Ⅲ的工艺参数为：pH为6.5至7.8、乙醇含量为15%至24%、温度控制为-6.0℃至-2.5℃，蛋白质浓度范围为：4.0%至7.8%；

3）制备组分I+Ⅲ，将上述组分I+Ⅱ+Ⅲ用8-14倍体积的注射用水溶解，调节参数为：pH为5.0至5.6、乙醇含量为15%至24%、温度控制为-1.0℃至4.5℃，静置时间2至24小时；

4）制备组分Ⅱ，以上述分离组分I+Ⅲ的上清液为原料，按照每1升体积加入10-25mL 1mol/L的氯化钠溶液调节离子强度，工艺参数为：pH为7.0至7.8、乙醇含量为25%至34%、温度控制为-10.0℃至-5.5℃，静置时间2至24小时；

5）纯化组分Ⅱ，以上述制备分离的组分Ⅱ为原料，用8-14倍的注射用水溶解，以辛酸（辛酸钠）与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比mmol/g为14～16∶1加入辛酸（辛酸钠），调节溶解所得的溶液pH为3.5至4.8；分离除去杂蛋白、硅藻土等，得人免疫球蛋白溶液；

6）进入超滤罐后的蛋白药液，升温至温度30±1℃，恒温90分钟；后进行超滤，用分子截流量为50kD的超滤膜，第一次超滤的浓缩过程中降温至8-10℃，后加入等体积的注射用水，连续超滤6-10次；超滤完成后，用注射用水调配蛋白溶液，使其蛋白质含量为应为52±10g/L，并调节pH为3.5至4.8；

7）低pH病毒灭活，将经除菌过滤并密封好的人免疫球蛋白置于恒温为23-25℃条件下，静置21天；每7天取样1次，测定pH和蛋白质含量，应无明显变化；

8）二次超滤配制，低pH病毒灭活完成后，对蛋白质溶液进行二次超滤，调节蛋白质的体积；按照终体积的10%加入麦芽糖，确保蛋白质含量不低于50克/L,调节pH至适当范围；用无菌操作工艺灌装-轧盖即得。