CN113801221B - 一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法，包括如下步骤：（1）制备抗海蛇毒血清层析流穿液，包括：获得血浆；胃蛋白酶消化；硫酸铵第一次沉淀；硫酸铵第二次沉淀；板框压滤；明矾吸附；板框压滤；上清液超滤浓缩脱盐；离子交换柱层析；收集层析流穿液；（2）控制纳米膜过滤的环境温度为20‑28℃，将层析流穿液配制成一定浓度、一定处方的溶液；（3）按照步骤（2）的条件进行纳米膜过滤。本发明对抗海蛇毒血清工艺过程的层析流穿液进行纳米膜过滤除病毒，多次试验获得最佳条件，增加纳米膜过滤的通量，大大降低生产成本，提高抗海蛇毒血清制品去除病毒效率，加快纳米膜过滤在抗海蛇毒血清生产中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法。
背景技术
毒蛇咬伤常见于亚热带和热带地区。在亚洲、非洲、拉丁美洲和大洋洲的农村地区，毒蛇咬伤是特别突出的公共卫生问题，我国的蛇伤发病呈现出逐年增多的趋势。
海蛇毒，成分复杂，含有多种蛋白，主要包括磷脂酶A2、三指毒素、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、血管内皮生长因子、蛇毒因子、蛋白酶抑制剂、磷脂酶B等。海蛇毒的组成成分与海蛇咬伤后的临床症状有直接关系，包括肌肉麻痹、呼吸麻痹、肌肉损伤等。
世界卫生组织(WHO)强调抗蛇毒血清是蛇伤的唯一有效的解毒药（WHO:Guidelines for the management of snakebites）。抗蛇毒血清是治疗毒蛇咬伤的高效、特效药物，一般认为在被毒蛇咬伤后应立即注射同种蛇毒抗血清以达到最佳中和治疗效果。在明确毒蛇种类后，采取相应的救治措施，迅速使用抗蛇毒血清中和体内蛇毒，防治可能发生的并发症。由于毒蛇咬伤如不及时有效救治常致人死亡，针对本文所述海蛇毒，应用抗海蛇毒血清进行治疗。
抗海蛇毒血清是利用脱毒的海蛇毒素免疫马匹，所得血浆经胃蛋白酶消化、硫酸铵沉淀、明矾沉淀、超滤等纯化步骤得到的马抗海蛇毒免疫球蛋白。为了生产出治疗海蛇毒中毒的特效药抗海蛇毒血清，需要对海蛇毒进行实验鉴定，以便更好的对海蛇毒进行质控。
由于抗海蛇毒血清为来源于马血浆的制品，为提高生物制品的安全性，CFDA（中华人民共和国国家食品药品监督管理总局）要求生产工艺具有一定的去除/灭活部分病毒能力，生产过程中应用特定的去除/灭活病毒方法。目前国内外对人血液成分及血液制品的病毒灭活与去除方法有详细的研究，但至今FDA（美国食品药品监督管理局）、EMEA（中东、非洲;和欧洲药品审评局）和CFDA没有传统生产工艺抗血清的具体法规可依。鉴于动物来源的制品存在人畜共患病毒，因此有必要对采集的马血浆在生产过程中进行可能存在的病毒灭活/去除处理并进行工艺验证。可借鉴人源血液制品的病毒灭活/去除方法，如（1）膜过滤法，即根据膜孔径大小去除病毒，不影响制品质量，可去除脂包膜病毒和非脂包膜病毒，成本较高；（2）巴氏加热法，采用60℃，10h加热处理，能有效灭活HBV、HCV、HIV等病毒，但可能导致对制品中某些成分的不良影响甚至破坏，且耗时长，故不适合大规模生产应用；（3）低pH孵放法，低pH可使病毒表面的细胞抗原电荷发生改变，蛋白质的空间结构发生不可逆的变性，从而使病毒丧失与细胞受体结合的能力，不能侵染细胞，能灭活几种脂包膜病毒，一般采用pH＜4，30-37℃ 20 h。方法较简便，可作为生产过程终端处理，但长时间低pH条件下，对产品有一定的影响；（4）有机溶剂/去污剂（S/D）法，操作简单、经济、适用面广，特别是对血液制品效果良好。如磷酸三丁脂（TNBP）和非离子化的去污剂；Triton X-100或吐温-80结合可以灭活脂包膜病毒，但对非脂包膜病毒无效。
本发明针对膜过滤法去除病毒，膜的孔径为20 nm，可去除脂包膜病毒和非脂包膜病毒，如辛德毕斯病毒（Sindbis virus，Sindbis）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine ViralDiarrhea Virus，BVDV）、甲型肝炎病毒 （Hepatitis A virus, HAV）、人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)等，不影响制品质量，蛋白回收率高，且未引入其他病毒灭活方法相关的有机试剂杂质，无需去除有机物的步骤。但是，膜过滤法去除病毒的纳米膜成本非常高，1平方米的纳米膜需数万元，需要摸索一个最优条件，提高纳米膜的过滤通量，即提高单位膜面积可有效过滤蛋白的总量，最大程度降低生产成本。《一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法》（CN102250240B），《一种静注免疫球蛋白的生产工艺》（CN108101981B），均为人来源血液制品IgG病毒去除相关专利，其工艺为低温乙醇沉淀法，且其为待除病毒的目标蛋白为IgG（150kD）。目前，国内外还没有见到马血来源的抗血清（F (ab’)2）约（100kD）用纳米膜的方法除病毒的报道。
纳米膜过滤可同时除去脂包膜和非脂包膜病毒，且不影响制品的质量，但是成本高昂。本领域亟需研发一种低成本的抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法，为了解决上述纳米膜成本高昂的问题，通过大量试验，得到一个最优的条件，提高纳米膜对抗蛇毒血清工艺样品的过滤通量，即提高单位膜面积可有效过滤蛋白的总量，大大降低生产成本，对提高抗海蛇毒血清制品去除病毒效率，加快纳米膜过滤在抗海蛇毒血清生产中的应用具有重要意义。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤的最优条件，包括如下步骤：
（1）制备抗海蛇毒血清层析流穿液，包括：获得血浆；胃蛋白酶消化；硫酸铵第一次沉淀；硫酸铵第二次沉淀；板框压滤；明矾吸附；板框压滤；上清液超滤浓缩脱盐；离子交换柱层析；收集层析流穿液；
（2）控制纳米膜过滤的环境温度为20-28℃，将层析流穿液配制成一定浓度、一定处方的溶液，该溶液组成为8-12mM 磷酸盐缓冲液，1.5-4.5g/L 甘氨酸，2-10mM 氯化钠；所述溶液的pH值为6.5-7.5；控制蛋白浓度为20-40g/L；
（3）按照步骤（2）的条件进行纳米膜过滤。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述上清液超滤浓缩脱盐所用超滤溶液的溶液构成为8-12mM 磷酸盐缓冲液，pH 6.5-7.5，更优选为9-11mM 磷酸盐缓冲液，pH6.8-7.2。超滤是将蛋白的溶液组成置换成为超滤的溶液一致的成分，可去除溶液组分中其他有机试剂和无机试剂，以及部分小分子蛋白。另外层析后收集流穿液，流穿液组成基本和超滤溶液一致。因此，控制超滤溶液和层析平衡液保持一致，直接影响纳米膜过滤的溶液构成。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述离子交换柱层析采用的层析平衡液的溶液构成为8-12mM 磷酸盐缓冲液，pH 6.5-7.5，更优选为9-11mM 磷酸盐缓冲液，pH6.8-7.2。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述胃蛋白酶消化的pH值为3.0-4.0。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述硫酸铵第一次沉淀采用的硫酸铵浓度为3~15%；所述硫酸铵第二次沉淀采用的硫酸铵浓度为20~40%。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述明矾吸附采用的明矾浓度为0.2~10%。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述的纳米膜过滤的最佳环境温度为21-23℃。温度对纳米膜过滤有较大影响，温度过低，样品粘度高，过滤速度减慢，温度过高，可能影响蛋白的结构，容易形成大分子多聚体，影响纳米膜过滤效率。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述蛋白浓度更优选为25-35 g/L。蛋白浓度在纳米膜过滤参数中是重要因素，蛋白浓度过低，可能过滤速度衰减较慢，但纳米膜过滤的时间将很长（一般控制在10小时内），可能长达20-30小时，对于工业化生产来说时间成本较高，且有细菌等微生物污染的风险。若蛋白浓度过高，可能导致高浓度蛋白将纳米膜孔堵塞，影响过滤速度。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述的溶液组成更优选为9-11mM 磷酸盐缓冲液，2-3g/L 甘氨酸，5-8mM 氯化钠。甘氨酸可以起到稳定蛋白结构的作用，磷酸盐为溶液提供一定的缓冲能力，适量的磷酸盐缓冲液和氯化钠可以提供一定的离子强度，有利于蛋白维持其构象，能够提高纳米膜的过滤速率。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述溶液pH值更优选为6.8-7.2。在磷酸盐提供缓冲能力的前提下，控制pH值，可使蛋白保持较天然的空间结构，保持蛋白的抗海蛇毒素功能（中和毒素），并有利于提升纳米膜过滤的效率。
作为本发明优选的技术方案，步骤（3）具体为：经0.1微米预过滤器预过滤后，将样品加至纳米膜过滤的容器中，通过氮气控制容器压力3bar，进行纳米膜过滤。更优选为，所述纳米膜过滤采用20nm纳米膜过滤9小时。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过大量试验，尝试不同溶液条件组合，筛选得到一个最优的处方和环境温度，提高纳米膜的对抗蛇毒血清工艺样品的过滤通量，即提高单位膜面积可有效过滤蛋白的总量，10小时内，每平方米膜面积可以过滤5.5kg以上蛋白量，蛋白回收率达到98%以上。
本发明创新点在于：
（1）通过纳米膜过滤去除病毒的方法应用于马血浆制品抗海蛇毒血清，既可去除病毒也不会引入多余的有机物等杂质，不影响制品的质量。
（2）通过试验得到最佳的纳米膜过滤的样品温度。
（3）由于纳米膜过滤的影响因素复杂，试验的数量较多，我们通过大量试验摸索获得一个最优条件，大幅度提高可过滤的蛋白量，降低生产的成本，加快纳米膜技术用于抗海蛇毒血清的产业化。
附图说明
图1为本发明实施例中工艺流程图。
具体实施方式
本发明通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。
实施例1 一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法
步骤如下：
一、按照本发明图1中工艺流程，进行抗海蛇毒血清层析流穿液的制备，具体包括如下步骤;
1、获得血浆；
2、胃蛋白酶消化（pH3.5）；
3、硫酸铵第一次沉淀（硫酸铵浓度为7%（质量体积比w/v））；
4、硫酸铵第二次沉淀（硫酸铵浓度为30%（w/v））；
5、板框压滤；
6、明矾吸附（明矾浓度为6%（w/v））；
7、板框压滤；
8、上清液超滤浓缩脱盐；该超滤步骤中，超滤溶液为9.5mM 磷酸盐缓冲液，pH 值为7.1；
9、离子交换柱层析；该层析步骤中，层析平衡液为9.5mM 磷酸盐缓冲液，pH值为7.1；
10、收集流穿液。
二、控制纳米膜过滤温度为23℃，将层析流穿液配制成一定浓度，一定处方的溶液，该溶液组成为9.5mM磷酸盐缓冲液，2.5 g/L 甘氨酸，7.5mM 氯化钠，控制pH 值为7.1；控制蛋白浓度为30g/L。
三、按照步骤二的优化条件进行纳米膜过滤
1、经0.1微米预过滤器预过滤后，将样品加至纳米膜过滤的容器中，通过氮气控制容器压力3bar，进行纳米膜过滤；
2、样品经20nm纳米膜过滤9小时后，样品过滤通量为每平方米的纳米膜，可过滤蛋白190L，即过滤通量190 L/m2膜，折合蛋白5.7kg/m2膜，通过测定纳米膜过滤前后蛋白浓度和体积，蛋白回收率为98.5%。生产规模层析流穿液约150L，蛋白浓度30g/L，折合蛋白4.5kg，仅用1平方米的纳米膜即可，且可有28.9%的过滤余量。
实施例2 一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法
步骤如下：
一、按照本发明图1中工艺流程，进行抗海蛇毒血清层析流穿液的制备，具体包括如下步骤;
1、获得血浆；
2、胃蛋白酶消化（pH4.0）；
3、硫酸铵第一次沉淀（硫酸铵浓度为15%（w/v））；
4、硫酸铵第二次沉淀（硫酸铵浓度为40%（w/v））；
5、板框压滤；
6、明矾吸附（明矾浓度为10%（w/v））；
7、板框压滤；
8、上清液超滤浓缩脱盐；该超滤步骤中，超滤溶液为9.5mM 磷酸盐缓冲液，pH 值为7.1；
9、离子交换柱层析；该层析步骤中，层析平衡液为9.5mM 磷酸盐缓冲液，pH值为7.1；
10、收集流穿液。
二、控制纳米膜过滤温度为20℃，将层析流穿液配制成一定浓度，一定处方的溶液，该溶液组成为8mM 磷酸盐缓冲液，1.5g/L 甘氨酸，2mM 氯化钠，控制pH 值为6.5；控制蛋白浓度为20g/L。
三、按照步骤二的优化条件进行纳米膜过滤
1、经0.1微米预过滤器预过滤后，将样品加至纳米膜过滤的容器中，通过氮气控制容器压力3bar，进行纳米膜过滤；
2、样品经20nm纳米膜过滤9小时后，样品过滤通量为每平方米的纳米膜，可过滤蛋白190L，即过滤通量190 L/m2膜，折合蛋白5.7kg/m2膜，通过测定纳米膜过滤前后蛋白浓度和体积，蛋白回收率为98.5%。生产规模层析流穿液约150L，蛋白浓度30g/L，折合蛋白4.5kg，仅用1平方米的纳米膜即可，且可有28.9%的过滤余量。
实施例3 一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法
步骤如下：
一、按照本发明图1中工艺流程，进行抗海蛇毒血清层析流穿液的制备，具体包括如下步骤;
1、获得血浆；
2、胃蛋白酶消化（pH3.0）；
3、硫酸铵第一次沉淀（硫酸铵浓度为3%（w/v））；
4、硫酸铵第二次沉淀（硫酸铵浓度为20%（w/v））；
5、板框压滤；
6、明矾吸附（明矾浓度为0.2%（w/v））；
7、板框压滤；
8、上清液超滤浓缩脱盐；该超滤步骤中，超滤溶液为9.5mM 磷酸盐缓冲液，pH 值为7.1；
9、离子交换柱层析；该层析步骤中，层析平衡液为9.5mM 磷酸盐缓冲液，pH值为7.1；
10、收集流穿液。
二、控制纳米膜过滤温度为28℃，将层析流穿液配制成一定浓度，一定处方的溶液，该溶液组成为12mM 磷酸盐缓冲液，4.5g/L 甘氨酸，10mM 氯化钠，控制pH 值为7.5；控制蛋白浓度为40g/L。
三、按照步骤二的优化条件进行纳米膜过滤
1、经0.1微米预过滤器预过滤后，将样品加至纳米膜过滤的容器中，通过氮气控制容器压力3bar，进行纳米膜过滤；
2、样品经20nm纳米膜过滤9小时后，样品过滤通量为每平方米的纳米膜，可过滤蛋白190L，即过滤通量190 L/m2膜，折合蛋白5.7kg/m2膜，通过测定纳米膜过滤前后蛋白浓度和体积，蛋白回收率为98.5%。生产规模层析流穿液约150L，蛋白浓度30g/L，折合蛋白4.5kg，仅用1平方米的纳米膜即可，且可有28.9%的过滤余量。
Claims (8)
1.一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备抗海蛇毒血清层析流穿液，包括：获得血浆；胃蛋白酶消化；硫酸铵第一次沉淀；硫酸铵第二次沉淀；板框压滤；明矾吸附；板框压滤；上清液超滤浓缩脱盐；离子交换柱层析；收集层析流穿液；
（2）控制纳米膜过滤的环境温度为20-28℃，将层析流穿液配制成一定浓度、一定处方的溶液，该溶液组成为8-12mM 磷酸盐缓冲液，1.5-4.5g/L 甘氨酸，2-10mM 氯化钠；所述溶液的pH值为6.5-7.5；控制蛋白浓度为20-40g/L；
（3）按照步骤（2）的条件进行纳米膜过滤，步骤（3）具体为：经0.1微米预过滤器预过滤后，将样品加至纳米膜过滤的容器中，通过氮气控制容器压力3bar，进行纳米膜过滤，所述纳米膜过滤采用20nm纳米膜过滤9小时。
2.根据权利要求1所述的一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法，其特征在于，步骤（1）中，所述上清液超滤浓缩脱盐所用超滤溶液为8-12mM 磷酸盐缓冲液，pH值为 6.5-7.5。
3.根据权利要求1所述的一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法，其特征在于，步骤（1）中，所述离子交换柱层析采用的层析平衡液为8-12mM 磷酸盐缓冲液，pH值为 6.5-7.5。
4.根据权利要求2或3所述的一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法，其特征在于，所述上清液超滤浓缩脱盐所用超滤溶液为9-11mM 磷酸盐缓冲液，pH值为 6.8-7.2；所述离子交换柱层析采用的层析平衡液为9-11mM 磷酸盐缓冲液，pH值为 6.8-7.2。
5.根据权利要求1所述的一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法，其特征在于，步骤（1）中，所述胃蛋白酶消化的pH值为3.0-4.0。
6.根据权利要求1所述的一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法，其特征在于，步骤（1）中，所述硫酸铵第一次沉淀采用的硫酸铵浓度为3~15%；所述硫酸铵第二次沉淀采用的硫酸铵浓度为20~40%。
7.根据权利要求1所述的一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法，其特征在于，步骤（1）中，所述明矾吸附采用的明矾浓度为0.2~10%。
8.根据权利要求1所述的一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法，其特征在于，步骤（2）中，所述控制纳米膜过滤的环境温度为21-23℃；所述溶液组成为9-11mM 磷酸盐缓冲液，2-3g/L 甘氨酸，5-8mM 氯化钠；所述溶液的pH值为6.8-7.2；所述控制蛋白浓度为25-35 g/L。
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| CN1709506A (zh) * | 2005-05-31 | 2005-12-21 | 李景玉 | 马抗血清的制备纯化工艺 |
| CN102250240A (zh) * | 2011-06-27 | 2011-11-23 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种从血浆分离组分ⅰ+ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法 |
| CN106119232A (zh) * | 2016-08-25 | 2016-11-16 | 浙江杭康药业有限公司 | 凝血酶的纯化工艺 |
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