CN102250240A - 一种从血浆分离组分ⅰ+ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从血浆组分Ⅰ+Ⅲ中分离纯化人免疫球蛋白的方法，其目的在于提供一种高效率的回收高纯度的人免疫球蛋白的方法。本发明的技术方案包括以下步骤：a.组分Ⅰ+Ⅲ沉淀的充分溶解；b.辛酸沉淀，去除脂质及部分杂蛋白，制备IgG；c.上阴离子交换柱层析纯化；d.收集流穿液，纳米膜过滤，超滤浓缩，配制，除菌，分装。本发明的有益效果是：能够在室温操作，步骤简短，收率高，低能耗，高产出，适合大规模生产，充分实现了血浆的综合利用，不仅缩短整个生产工艺时间，而且降低成本，能产生非常可观的经济效益，两种不同机制病毒灭活/去除方法保证产品的安全性，又防止了对环境的污染，具有良好的经济和社会价值。

Description

一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物制药血液制品领域，具体涉及一种用正辛酸沉淀结合一步阴离子交换层析技术从血浆生产废弃组分Ⅰ+Ⅲ中分离纯化人免疫球蛋白的方法。

背景技术

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是人体对外来抗原（如细菌、病毒及其它毒素或异物）进行免疫应答的主要物质。血浆来源的人免疫球蛋白制品按注射途径分为：静脉注射人免疫球蛋白（Intravenous Immunoglobulin G，IVIG）和肌肉注射人免疫球蛋白，其主要成分为免疫球蛋白G（IgG），它是最重要的血浆蛋白之一，分子量150kDa，在血浆中的含量大概是6.6~14.5g/L。自20世纪80年代问世以来，已经成功用于免疫缺陷造成的感染性疾病的预防，治疗原发性免疫缺陷、感染性疾病、获得性免疫缺陷等疾病。

目前人免疫球蛋白的获取主要是从血浆及相关组分Ⅱ中纯化制备，由于原料血浆来源有限，人血浆来源的免疫球蛋白供不应求，同时由于原料的特殊性（为宝贵的人血）以及严格的血浆筛选（对混合血浆进行病毒抗体、特异性抗原及核酸的筛查）都使得血浆蛋白产品价格变得非常昂贵。

综上，目前人免疫球蛋白的制备主要存在以下问题：

1、目前国内外人免疫球蛋白的获取主要是从低温乙醇沉淀组分Ⅱ制备，经过纯化得到人免疫球蛋白。提取人免疫球蛋白后会产生组分Ⅰ+Ⅲ沉淀，被作为废物处理，鲜有从组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的制备方法。这主要是因为组分Ⅰ+Ⅲ中成分复杂，其主要成分有脂蛋白、纤维蛋白原、纤维结合蛋白、IgG、IgM、凝血因子Ⅷ等，同时也含有各种微量的其他蛋白，如IgA、凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、铜蓝蛋白等。组分Ⅰ+Ⅲ中的各类凝血因子，极容易在分离过程中活化，从而造成分离过程中成分不稳定，产生大量的沉淀或絮状。组分Ⅰ+Ⅲ中的脂蛋白也是难以彻底去除的物质，脂蛋白的残留将影响产品过滤以及后续步骤中所使用凝胶的寿命。将组分Ⅰ+Ⅲ溶解液进行非还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（见图2），可见组分Ⅰ+Ⅲ沉淀中蛋白质成分至少有十种之多，用Gel-Pro analyzer软件对各类条带进行面积积分分析，结果IgG含量20~30%，同时进行高效液相色谱法（HPLC）分析（见图3），IgG含量22.39%，其他各类杂蛋白含量有75%以上。从杂质含量占75%以上的组分Ⅰ+Ⅲ中提取适合临床使用的人免疫球蛋白，相对于从IgG含量超过70%的组分Ⅱ+Ⅲ或Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白则难度大很多。

2、国内有通过低温乙醇法从组分Ⅰ+Ⅲ或组分Ⅲ中提取人免疫球蛋白，从而提高收率的方法。例如吕勇等（CN 101648998A）利用低温乙醇法，将组分Ⅰ+Ⅲ沉淀溶解后，用8~9%乙醇沉淀压滤组分Ⅰ后，再用13-15%乙醇沉淀压滤组分Ⅲ，最后用17~19%乙醇沉淀分离组分Ⅱ，最后将组分Ⅱ溶解、超滤、纯化、配制获得免疫球蛋白制品，其产品符合《中国药典》（三部）的要求。但是此工艺采用三次低温乙醇沉淀法从组分Ⅰ+Ⅲ中提纯人免疫球蛋白，步骤繁多，同时在组分Ⅰ+Ⅲ中仍采取低温乙醇法分离免疫球蛋白，收率低，生产环境要求低温，能耗较高。乙醇类的化学物质容易破坏IgG的生物学功能，用该方法制备的IgG容易形成聚集体。该工艺需将组分Ⅱ通过加温至51-53℃ 3小时进行提纯，由于免疫球蛋白的耐热性与其纯度有关，一般纯度越高，其耐热性就越差，因此该方法也不能最大程度的保留人免疫球蛋白天然的理化性质和生物学活性。同时，由于组分Ⅲ为血浆分离中病毒较为集中的组分，因此病毒灭活显得尤为重要，而该工艺只采用一种病毒灭活方式，尚不能完全灭活/去除病毒。

3、层析法近年来越来越广泛的应用于血浆蛋白的分离纯化，在人免疫球蛋白的制备中，应用较多的是离子交换层析法，但多采用阳离子与阴离子结合或两步阴离子交换柱层析，否则纯化效果难于达到要求。

4、用辛酸或辛酸盐沉淀非IgG类杂蛋白来达到分离IgG的技术尚不成熟，目前处于研究阶段，国内外还未见用辛酸沉淀组分Ⅰ+Ⅲ进行纯化免疫球蛋白的报道。因此，研究开发辛酸沉淀法提高人免疫球蛋白分离制备过程中的收率，特别是从血浆分离组分废弃物FⅠ+Ⅲ中回收IgG，对于增加市场供应、缓解国内血浆供应紧张的局面具有极大的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从血浆生产废弃组分Ⅰ+Ⅲ中高效率的回收高纯度的人免疫球蛋白的方法，该方法用辛酸沉淀组分Ⅰ+Ⅲ中的非IgG杂蛋白、结合一步阴离子交换层析技术，分离纯化人免疫球蛋白IgG。

本发明所述的从血浆组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法，其分离纯化步骤包括：将组分Ⅰ+Ⅲ沉淀用醋酸醋酸钠缓冲液充分溶解；用正辛酸沉淀非IgG的杂蛋白，制备IgG；采用阴离子交换柱层析获得高纯IgG；纳米膜过滤，超滤脱盐浓缩，配制，除菌，分装。

   上述用于溶解组分Ⅰ+Ⅲ沉淀的醋酸醋酸钠缓冲液的优选含量为0.02mol/L， pH为4.5，离子强度为1.4mS/cm。

    上述醋酸醋酸钠缓冲液用量一般为组分Ⅰ+Ⅲ沉淀重量的3倍。

上述用正辛酸沉淀非IgG的杂蛋白过程中，采用喷淋方式加入正辛酸，同时快速搅拌，使溶解液中的正辛酸能均匀分布。

上述用正辛酸沉淀非IgG的杂蛋白过程中，加入至溶液中的正辛酸终浓度的范围为80~120mmol/L， 优选90~110mmol/L。

上述正辛酸加入速度为20ml/min。

上述正辛酸沉淀非IgG的杂蛋白过程在常温条件下完成。

    上述所用正辛酸，为分析纯正辛酸，辛酸含量超过99%。

上述用正辛酸沉淀沉淀非IgG的杂蛋白过程同时完成灭活脂包膜病毒功能。

上述阴离子交换柱层析中，所选用的阴离子交换层析凝胶特点为：强阴离子交换Q（季铵乙基）基团，基质为交联琼脂糖凝胶，凝胶优选大孔径（粒径为120~165um）。

本发明是选用的阴离子交换层析凝胶，其主要离子交换集团交联度较小、空隙大，在pH5.4~6.0的环境下，优化上柱条件，根据杂质蛋白质的等电点不同，调整pH值和电导率的变化，使各种蛋白质所带电荷不同，与离子交换树脂的结合力大小不同，达到多种蛋白质分离纯化的效果，同时IgM等大分子杂质容易进入离子交换剂的内部，提高大分子的实际吸附载量，因此本发明仅采用一步阴离子交换柱层析完成纯化，该一步阴离子交换层析法，能代替文献报道中两步离子交换层析才能达到的提高产品纯度的效果。

    装柱方法如下：先把凝胶搅拌悬浮后转入到层析柱内，搅拌均匀，静置过夜，移除上清。柱头冲洗干净后，把上柱头移动到层析柱正上方，旋转柱头高度调节把手，使上柱头接近凝胶平衡液上液面，缓缓下降，使上柱头内的空气排尽。打开上柱头阀门，并用管道连接至空气陷阱的出液端，用力旋转柱头高度调节把手，把凝胶压实。其最后体积为自然沉降体积的85%，向层析柱内加入1%柱体积浓度为1%的丙酮溶液，以2L/min的流速用注射用水冲洗层析柱来测量理论塔板数及不对称因子，从而确保装柱有最好的柱效。

阴离子交换层析柱上柱条件的优化：使用3~5倍柱体积的pH5.6的0.02mol/L醋酸醋酸钠缓冲液进行柱子的平衡，流速控制在1~2cm/min。因为目标蛋白IgG等电点为pH5.0~9.5，如果平衡液的pH过高，则造成目标蛋白吸附到层析柱上，从而降低层析柱收率；而平衡液的pH过低，则造成杂质蛋白不能有效吸附到层析柱上，从而降低产品纯度。用0.02mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液平衡层析柱，能保证在FⅠ+Ⅲ充分溶解的前提下，不影响层析柱对蛋白质的吸附效果。如果醋酸醋酸钠缓冲液浓度过高，则会影响层析柱对杂蛋白的吸附能力，而醋酸醋酸钠缓冲液浓度过低，则使FⅠ+Ⅲ沉淀溶解不充分。

阴离子交换柱层析中最佳流穿流速为1~2cm/min。

本发明所述的从血浆组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法，包括以下具体操作步骤：

a. 组分Ⅰ+Ⅲ沉淀的溶解：将沉淀用pH为4.3~5.0的0.02mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液充分溶解；

b.正辛酸沉淀制备IgG：上述溶解液中加入0.3mol/L NaOH溶液，调pH至4.5±0.05，搅拌1小时混匀后，以20ml/min的速度、喷淋方式缓慢加入正辛酸，同时快速搅拌，使溶解液中的正辛酸能均匀分布，至溶液中正辛酸终浓度为80~120mmol/L时停止加入辛酸，快速搅拌2小时，沉淀非IgG的杂蛋白，同时灭活脂包膜病毒；

c.上阴离子交换柱层析获得高纯IgG：将上述步骤溶液离心或压滤，去除沉淀，留取上清液；上清溶液用0.3mol/L NaOH调整溶液pH至5.4~6.0，经0.2um滤器过滤后，上预先平衡的阴离子交换层析柱，进一步纯化分离；

d. 收集流穿液，纳米膜过滤，超滤浓缩，配制，除菌，分装：上述流穿液用0.3mol/L HCl调整pH至4.0~4.5，经预过滤后，进行纳米膜过滤，除去包括细小病毒在内的潜在病毒；过滤后制品用0.01mol/L醋酸溶液进行超滤脱盐，使制品pH维持在4.0~4.5，电导率小于1mS/cm后，进行浓缩，达到蛋白含量50g/L以上，加入0.2mol/L甘氨酸作为保护剂，除菌、分装。

本发明中层析纯化蛋白的优化操作过程如下：首先将阴离子交换层析柱用pH5.6的0.02mol/L 醋酸钠缓冲液平衡3个柱体积，然后将样品上柱，流速为1~2cm/min，使大分子的杂质结合到柱子上，收集流穿液，将结合在层析介质上的杂质蛋白用2mol/L NaCl洗脱处理5个柱体积，使交换介质再生，用注射用水处理2个柱体积，用0.1mol/L NaOH冲洗2个柱体积，再次用注射用水处理2个柱体积，最后用20%乙醇保存。

本发明的有益效果如下：

1、本发明用辛酸沉淀、结合一步阴离子交换层析技术从血浆生产废弃组分Ⅰ+Ⅲ中分离纯化人免疫球蛋白，能够在室温操作，步骤简短，收率高，低能耗，高产出，适合大规模生产，充分实现了血浆的综合利用，不仅缩短整个生产工艺时间，而且降低成本，产生非常可观的经济效益，又防止了对环境的污染，具有良好的经济和社会价值。

2、本发明人经充分研究确认，辛酸沉淀杂蛋白的效果依赖于加入辛酸的速度，辛酸的加入量（即终浓度）、pH值、缓冲液离子强度、蛋白含量等因素的相互结合，才能达到完全沉淀杂蛋白，而IgG不会共沉的最佳状态，从而筛选确定了最佳工艺条件。本发明中采用喷淋方式并缓慢加入正辛酸，可防止发生副反应。

3、按照1L血浆产出80g组分Ⅰ+Ⅲ沉淀，该沉淀溶解后至少含有蛋白质5.5g，其中IgG含量约占20%左右。本发明工艺能回收组分Ⅰ+Ⅲ中80%以上的IgG，计算出该发明工艺能提高IgG收率约1.06g/L血浆，而国内IgG产率4~6g/L血浆，因此该工艺能提高现有收率17.7~26.5%，有效地降低血液制品生产中原料血浆的成本，提高血浆的综合利用。

4、本工艺使用一种Q（季铵乙基）大孔径琼脂糖与丙烯酰胺基质的阴离子交换凝胶，其主要离子交换集团交联度较小、空隙大，在pH5.4~6.0的环境下，IgM等大分子杂质容易进入离子交换剂的内部，在适宜的平衡条件下，提高大分子的实际吸附载量，因此该阴离子交换层析法有效的提高了产品的纯度，只采用一步阴离子交换层析，就能获得纯度98%以上的终产品。

5、本发明工艺步骤中采用辛酸沉淀法粗制IgG，辛酸不仅能够沉淀杂蛋白和脂类，而且在20℃，pH＜6.0，蛋白含量＞3.7g/L的条件下，1小时就能够灭活脂包膜病毒。同时工艺中采用35nm纳米膜加上15nm纳米膜双步过滤去除细小病毒在内的脂包膜和非脂包膜病毒，两种不同机制的病毒灭活/去除步骤，能最大程度灭活/去除病毒污染，最大程度的保证制品的安全性。

本发明工艺生产的静注人免疫球蛋白质量检测项目均符合《中国药典》（三部）2010版规定的质量标准。其中SDS-PAGE检测纯度达到99%，见图4：从左向右依次为：溶解，溶解，辛酸后，辛酸后，M（SM1811），成品，成品；HPLC检测单体加二聚体含量达99%（见图5）以上，均高于《中国药典》（三部）2010版的质量标准，并符合欧洲药典标准（见表1）。

 

表1 本发明静注人免疫球蛋白质量检测指标对比

附图说明

图1为实施例工艺流程图；

图2为血浆分离组分FⅠ+Ⅲ沉淀溶解液非还原SDS-PAGE图；

图3为血浆分离组分FⅠ+Ⅲ沉淀溶解液HPLC图；

图4为本发明工艺生产的静注人免疫球蛋白SDS-PAGE图；

图5为本发明工艺生产的静注人免疫球蛋白HPLC图；

图6为不同浓度辛酸沉淀杂蛋白后上清非还原SDS-PAGE图；

图7为对比例SDS-PAGE图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1: 

本发明是由以下步骤实现的：

a．组分Ⅰ+Ⅲ沉淀的溶解：

醋酸醋酸钠缓冲液的配制：取6.9mL冰乙酸、10.88g醋酸钠，配制成10L含量为0.02mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液，并调整pH为4.5；

将组分Ⅰ+Ⅲ沉淀用3倍重量的7℃的醋酸醋酸钠缓冲液充分溶解；

b．样品充分溶解后，升温至20℃，以0.6L/min的流速加入0.3mol/L NaOH溶液，调pH至4.5±0.05，搅拌1小时混匀后，以20ml/min的速度喷淋方式加入正辛酸，使溶解液中的正辛酸能均匀分布，至溶液中辛酸终浓度为100mmol/L，停止加入辛酸，剧烈搅拌以利于辛酸充分混匀，搅拌2小时，沉淀非IgG的杂蛋白，同时灭活脂包膜病毒；

c．将上述步骤溶液以4000rpm转速，18℃离心30分钟，弃沉淀，将上清液用0.3mol/L NaOH调pH至5.6，用0.45um滤器过滤，调整溶液电导1~2mS/cm，准备上阴离子交换层析柱进行纯化；

阴离子交换层析柱上柱条件的优化： 

       使用3~5倍柱体积的pH5.6的0.02mol/L醋酸醋酸钠缓冲液进行柱子的平衡。因为目标蛋白IgG等电点为pH5.0~9.5，如果平衡液的pH过高，则造成目标蛋白吸附到层析柱上，从而降低层析柱收率；而平衡液的pH过低，则造成杂质蛋白不能有效吸附到层析柱上，从而降低产品纯度。用0.02mol/L醋酸醋酸钠缓冲液平衡层析柱，能保证在FⅠ+Ⅲ充分溶解的前提下，不影响层析柱对蛋白质的吸附效果。如果醋酸醋酸钠缓冲液浓度过高，则会影响层析柱对杂蛋白的吸附能力，而醋酸醋酸钠缓冲液浓度过低，则使FⅠ+Ⅲ沉淀溶解不充分。

流穿IgG条件的研究：

用pH5.6的0.02mol/L醋酸醋酸钠缓冲液将阴离子交换层析柱平衡3~5个柱体积，然后将样品上柱，流速为1.5cm/min，使大分子的杂质结合到柱子上，收集流穿液。

当流速为1cm/min左右，不仅大分子会结合到柱子上，也会有IgG被吸附，影响收率；当流速大于2cm/min，大分子等杂质不能完全吸附到柱子上，影响流穿液的纯度。因此流穿流速为1~2cm/min。最佳流穿流速为1.5cm/min。

将结合在层析介质上的杂质蛋白用2mol/L NaCl洗脱处理5个柱体积，使交换介质再生，用注射用水处理2个柱体积，用0.1mol/L NaOH冲洗2个柱体积，再次用注射用水处理2个柱体积，最后用20%乙醇保存；

d．上述流穿液用0.3mol/L HCl调整pH4.5，经0.1μm滤膜预过滤后，用Millipore viresolve Pro（商品名） 30nm纳米膜和15nm纳米膜两步过滤，除去包括细小病毒在内的潜在病毒，过滤后制品用10倍体积0.01mol/L醋酸溶液进行超滤脱盐，使制品pH维持在4.0~4.5，电导率小于1mS/cm后，进行浓缩，达到蛋白含量50g/L以上，配制时加入0.2mol/L甘氨酸作保护剂，进行除菌分装。

本实施例IgG纯度和收率见表2：

实施例2：

本发明工艺具体实施步骤如下：

a．组分Ⅰ+Ⅲ沉淀溶解于7℃ 3倍沉淀量的0.02mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液中，室温下充分溶解； 

b．将样品充分溶解后，不调pH，升温至20℃，充分搅拌混匀后，缓慢加入正辛酸使溶液中辛酸终浓度为110mmol/L，并进行剧烈搅拌，以利于辛酸充分混匀，搅拌2小时；

c、用20℃注射用水600㎏，以20㎏/min的流速对压滤机滤板冲洗，然后用常温压缩空气吹干滤板，平衡后压滤，获得澄清滤液，其中IgG纯度在65%以上；将上述滤液用0.3mol/L NaOH调pH至5.8，用0.45um滤芯过滤，调整溶液电导1~2mS/cm，准备上阴离子交换层析柱进行纯化；

将阴离子交换层析柱用pH5.8的0.02mol/L醋酸醋酸钠缓冲液平衡3~5个柱体积，然后将样品上柱，流速为1~2cm/min，使大分子的杂质结合到柱子上，收集流穿液。将结合在层析介质上的杂质蛋白用2mol/L NaCl洗脱处理5个柱体积，使交换介质再生，用注射用水处理2个柱体积，用0.1mol/L NaOH冲洗2个柱体积，再次用注射用水处理2个柱体积，最后用20%乙醇保存；

d．上述流穿液用0.3mol/L HCl调整pH4.5，经0.1μm滤膜预过滤后，用Millipore viresolve Pro 20nm纳米膜过滤，除去包括细小病毒在内的潜在病毒，过滤后制品用10倍体积含40mmol/L HAC的注射用水进行超滤脱盐，超滤膜包截留相对分子质量为10kD，使制品pH维持在4.5，电导率小于1ms/cm后，进行浓缩，达到蛋白含量50g/L以上，配制时加入0.2mol/L甘氨酸做保护剂，进行除菌分装。

本实施例IgG收率见表3：

	多聚体含量（%）	IgG含量（%）
			溶解	51.5%	21%
辛酸沉淀后	23.5%	75%
			上层析柱后	0.2%	99%

         IgG收率为90% 。

实施例3: 

本发明工艺具体实施步骤如下：

步骤a组分Ⅰ+Ⅲ沉淀溶解于3倍沉淀量pH为4.5 、浓度0.02mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液中，室温下充分溶解；

步骤b缓慢加入正辛酸使溶液中辛酸终浓度为90mmol/L，通过该步骤使溶液中IgG纯度达到65%，并去除脂包膜病毒；

步骤c用20℃注射用水600㎏，以20㎏/min的流速对压滤机滤板冲洗，然后用常温压缩空气吹干滤板，平衡后压滤，获得澄清滤液；将滤液用0.3mol/L NaOH调整pH至5.4；用0.45um滤器过滤，调整溶液电导1.5mS/cm，以流穿流速为1.5cm/min上阴离子交换层析柱进行纯化；

d．上述流穿液用0.3mol/L HCl调整pH4.5，经0.1μm滤膜预过滤后，用Millipore viresolve Pro（商品名） 30nm纳米膜和15nm纳米膜两步过滤，除去包括细小病毒在内的潜在病毒，过滤后制品用10倍体积0.01mol/L醋酸溶液进行超滤脱盐，使制品pH维持在4.0~4.5，电导率小于1mS/cm后，进行浓缩，达到蛋白含量50g/L以上，配制时加入0.2mol/L甘氨酸作保护剂，进行除菌分装。

IgG收率为91.56% 。

实施例4: 

本发明工艺具体实施步骤如下：

步骤a组分Ⅰ+Ⅲ沉淀溶解于3倍沉淀量的0.02mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液中，室温下充分溶解；

步骤b缓慢加入正辛酸使溶液中辛酸终浓度为80mmol/L，通过该步骤使溶液中IgG纯度达到60%以上，并去除脂包膜病毒；

步骤c用20℃注射用水600㎏，以20㎏/min的流速对压滤机滤板冲洗，然后用常温压缩空气吹干滤板，平衡后压滤，获得澄清滤液；将滤液用0.3mol/L NaOH调整pH至6.0；

其余条件同实施例1。

IgG收率为85% 。

实施例5: 

本发明工艺具体实施步骤如下：

步骤a组分Ⅰ+Ⅲ沉淀溶解于3倍沉淀量的0.02mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液中，室温下充分溶解；

步骤b缓慢加入正辛酸使溶液中辛酸终浓度为120mmol/L，；

步骤c将上述步骤溶液以4000rpm转速，18℃离心30分钟，弃沉淀，留上清；将上清液用0.3mol/L NaOH调整pH至6.0；

其余条件同实施例2。

IgG收率为85% 。

实施例6.

辛酸终浓度的研究测试：

组分Ⅰ+Ⅲ沉淀溶解于3倍沉淀重量的0.02mol/L（pH4.5）的醋酸醋酸钠缓冲液中充分溶解，升温至20℃，分成六份（即六个样品），分别在六份样品内加入正辛酸至终浓度分别为50，80，90，110，120，160 mmol/L，搅拌2小时后，离心，弃沉淀，留上清。分别检测六份样品的蛋白含量、计算收率（见表4），并进行非还原SDS-PAGE检测.

（如图6：从左向右依次为：溶解，样品1，样品2，样品3，样品4，样品5，样品6）。

 

表4

本实施例结果表明：

当辛酸终浓度低于80mmol/L，组分Ⅰ+Ⅲ中杂蛋白去除不完全，IgG纯度不高，样品中IgG纯度只有20~40%；当辛酸终浓度高于120mmol/L，在完全沉淀杂蛋白同时IgG会共沉，样品中IgG纯度已经达到75%，但是由于IgG共沉淀，样品蛋白含量降低，从而影响IgG收率。

 

对比例. 

   低温乙醇法

将组分Ⅰ+Ⅲ沉淀用15倍的（5℃）0.04M磷酸氢二钠溶液低温搅拌充分溶解，加入0.5M HAc调节pH4.9~5.0，降温加入95%乙醇至浓度8.5%，继续搅拌，降温至-1.8~2.2℃，继续搅拌反应2.5h，再用13~15%乙醇沉淀压滤组分Ⅲ，最后用17~19%乙醇沉淀分离组分Ⅱ，将组分Ⅱ溶解，再超滤脱醇浓缩。

通过双缩脲法检测低温乙醇沉淀后蛋白含量，发现蛋白发生共沉，蛋白含量降低一倍。用非还原SDS-PAGE检测低温乙醇法沉淀杂蛋白的效果，结果发现，低温乙醇沉淀后蛋白种类与溶液蛋白种类完全一致，未起到沉淀组分Ⅰ的效果。因此，用低温乙醇法纯化人免疫球蛋白，收率提高效果差，溶液后蛋白含量5.12mg/mL，两次低温乙醇沉淀后，样品蛋白含量2.1mg/mL，蛋白量损失41%，也不能有效起到纯化的作用。见图7：从左向右依次为：溶解，第一次加入乙醇后，第二次加乙醇后，FⅡ溶解，M（SM1811）。

Claims (10)

1.一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法，其特征在于用辛酸沉淀组分Ⅰ+Ⅲ中的非IgG杂蛋白，结合一步阴离子交换层析技术，分离纯化人免疫球蛋白IgG。

2.根据权利要求1所述的一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法，其特征在于分离纯化步骤包括：将组分Ⅰ+Ⅲ沉淀用醋酸醋酸钠缓冲液充分溶解；用正辛酸沉淀，去除脂质及部分杂蛋白，制备IgG；采用阴离子交换柱层析获得高纯IgG；过滤浓缩，配制，除菌，分装。

3.根据权利要求2所述的一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法，其特征在于溶解组分Ⅰ+Ⅲ沉淀的醋酸醋酸钠缓冲液含量为0.02mol/L，离子强度为1.4mS/cm，pH至4.5；醋酸醋酸钠缓冲液的用量为组分Ⅰ+Ⅲ沉淀重量的3倍。

4.根据权利要求2所述的一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法，其特征在于用正辛酸沉淀非IgG的杂蛋白过程中，采用喷淋方式加入正辛酸，同时快速搅拌，使溶解液中的正辛酸均匀分布；加入正辛酸的速度为20ml/min；溶液中正辛酸的终浓度为90-110mmol/L。

5.根据权利要求2所述的一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法，其特征在于所说的阴离子交换柱层析所选用的阴离子凝胶特点为：强阴离子交换Q季铵乙基基团，基质为交联琼脂糖凝胶，粒径为120~165um；仅采用一步阴离子交换柱层析完成纯化；层析过程中，最佳流穿流速为1~2cm/min。

6.根据权利要求2所述的一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法，其特征在于所说的层析纯化蛋白的操作过程如下：首先将阴离子交换层析柱用pH5.6的0.02mol/L 醋酸钠缓冲液平衡3个柱体积，然后将样品上柱，流速为1~2cm/min，使大分子的杂质结合到柱子上，收集流穿液，将结合在层析介质上的杂质蛋白用2mol/L NaCl洗脱处理5个柱体积，使交换介质再生，用注射用水处理2个柱体积，用0.1mol/L NaOH冲洗2个柱体积，再次用注射用水处理2个柱体积，最后用20%乙醇保存。

7.根据权利要求1或2所述的一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法，其特征在于包括以下具体操作步骤：

a. 组分Ⅰ+Ⅲ沉淀的溶解：将沉淀用pH为4.3~5.0的0.02mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液搅拌充分溶解；缓冲液用量为组分Ⅰ+Ⅲ沉淀重量的3倍；

b. 正辛酸沉淀制备IgG：上述溶解液中加入0.3mol/L NaOH溶液，调pH至4.5±0.05，搅拌1小时混匀后，以20ml/min的速度、喷淋方式缓慢加入正辛酸，同时快速搅拌，使溶解液中的正辛酸能均匀分布，至溶液中正辛酸的终浓度为90~110mmol/L时停止加入辛酸，快速搅拌2小时，沉淀非IgG的杂蛋白，同时灭活脂包膜病毒；

c.上阴离子交换柱层析获得高纯IgG：将上述步骤溶液离心或压滤，去除沉淀，留取上清液；上清液用0.3mol/L NaOH调整pH至5.4~6.0，经0.2um滤器过滤后，上预先平衡的阴离子交换层析柱，进一步纯化分离；

d. 收集流穿液，纳米膜过滤，超滤浓缩，配制，除菌，分装：上述流穿液用0.3mol/L HCl调整pH至4.0~4.5，经预过滤后，进行纳米膜过滤，除去包括细小病毒在内的潜在病毒；过滤后制品用0.01mol/L醋酸溶液进行超滤脱盐，使制品pH维持在4.0~4.5，电导率小于1mS/cm后，进行浓缩，达到蛋白含量50g/L以上，加入0.2mol/L甘氨酸作为保护剂，除菌、分装。

8.根据权利要求1或2所述的一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法，其特征在于具体操作步骤如下：

a．将组分Ⅰ+Ⅲ沉淀用3倍重量的7℃ pH4.5的0.02mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液充分溶解；

b．样品充分溶解后，升温至20℃，以0.6L/min的流速加入0.3mol/L NaOH溶液，调pH至4.5±0.05，搅拌1小时混匀后，以20ml/min的速度喷淋方式加入正辛酸，使溶解液中的正辛酸能均匀分布，至溶液中辛酸终浓度为100mmol/L，停止加入辛酸，剧烈搅拌以利于辛酸充分混匀，搅拌2小时，沉淀非IgG的杂蛋白，同时灭活脂包膜病毒；

   c．将上述步骤溶液以4000rpm转速，18℃离心30分钟，弃沉淀，将上清液用0.3mol/L NaOH调pH至5.6，用0.45um滤器过滤，调整溶液电导1~2mS/cm，准备上阴离子交换层析柱进行纯化；

    用pH5.6的0.02mol/L醋酸醋酸钠缓冲液将阴离子交换层析柱平衡3~5个柱体积，然后将样品上柱，流速为2cm/min，使大分子的杂质结合到柱子上，收集流穿液；

d．上述流穿液用0.3mol/L HCl调整pH4.0~4.5，经0.1μm滤膜预过滤后，用Millipore viresolve Pro 30nm纳米膜和15nm纳米膜两步过滤，除去包括细小病毒在内的潜在病毒，过滤后制品用10倍体积0.01mol/L醋酸溶液进行超滤脱盐，使制品pH维持在4.0~4.5，电导率小于1mS/cm后，进行浓缩，达到蛋白含量50g/L以上，配制时加入0.2mol/L甘氨酸作保护剂，进行除菌分装。

9.根据权利要求1或2所述的一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法，其特征在于具体操作步骤如下：

a．组分Ⅰ+Ⅲ沉淀溶解于7℃ 3倍沉淀量的0.02mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液中，室温下充分溶解；

b．将样品充分溶解后，不调pH，升温至20℃，充分搅拌混匀后，缓慢加入正辛酸使溶液中辛酸终浓度为110mmol/L，并进行剧烈搅拌，以利于辛酸充分混匀，搅拌2小时；

c、用20℃注射用水600㎏，以20㎏/min的流速对压滤机滤板冲洗，然后用常温压缩空气吹干滤板，平衡后压滤，获得澄清滤液，其中IgG纯度在65%以上；将上述滤液用0.3M NaOH调pH至5.8，用0.45um滤芯过滤，调整溶液电导1~2mS/cm，准备上阴离子交换层析柱进行纯化；

将阴离子交换层析柱用pH5.8的0.02mol/L醋酸醋酸钠缓冲液平衡3~5个柱体积，然后将样品上柱，流速为1.5cm/min，使大分子的杂质结合到柱子上，收集流穿液；

d．上述流穿液用0.3mol/L HCl调整pH4.0~4.5，经0.1μm滤膜预过滤后，用Millipore viresolve Pro 20nm纳米膜过滤，除去包括细小病毒在内的潜在病毒，过滤后制品用10倍体积含40mmol/L HAc的注射用水进行超滤脱盐，超滤膜包截留相对分子质量为10kD，使制品pH维持在4.0~4.5，电导率小于1mS/cm后，进行浓缩，达到蛋白含量50g/L以上，配制时加入0.2mol/L甘氨酸做保护剂，进行除菌分装。

10.根据权利要求2所述的一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法，其特征在于所说的层析纯化蛋白的操作过程如下：

步骤a组分Ⅰ+Ⅲ沉淀溶解于3倍沉淀量、pH为4.5、0.02mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液中，室温下充分溶解；

步骤b缓慢加入正辛酸使溶液中辛酸终浓度为90mmol/L，通过该步骤使溶液中IgG纯度达到65%，并去除脂包膜病毒；

步骤c用20℃注射用水600㎏，以20㎏/min的流速对压滤机滤板冲洗，然后用常温压缩空气吹干滤板，平衡后压滤，获得澄清滤液；将滤液用0.3mol/L NaOH调整pH至5.4；用0.45um滤器过滤，调整溶液电导1.5mS/cm，以流穿流速为1.5cm/min上阴离子交换层析柱进行纯化；

d．上述流穿液用0.3mol/L HCl调整pH4.5，经0.1μm滤膜预过滤后，用Millipore viresolve Pro（商品名） 30nm纳米膜和15nm纳米膜两步过滤，除去包括细小病毒在内的潜在病毒，过滤后制品用10倍体积0.01mol/L醋酸溶液进行超滤脱盐，使制品pH维持在4.0~4.5，电导率小于1mS/cm后，进行浓缩，达到蛋白含量50g/L以上，配制时加入0.2mol/L甘氨酸作保护剂，进行除菌分装。

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