CN104327171B - 一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，属于生物技术领域，生产方法包括：将破伤风杆菌培养液过滤，滤液经30KD的超滤滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20～1/10，洗涤浓缩液并收集；浓缩液经离子交换层析、疏水层析、一次膜过滤、脱毒、超滤和二次膜过滤得破伤风类毒素原液。本发明提供的一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法具有工艺简单、操作方便、生产效率高、成本低的优点，经本发明方法生产的破伤风类毒素成分更加单一、纯度更高，从而获得更好的免疫原性，降低接种副反应的发生。

Description

一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法。
背景技术
破伤风通常是致死性的感染性疾病，由产毒的破伤风梭状芽孢杆菌(破伤风杆菌，Clostridium tetani)引起。在全球许多地方，破伤风仍然是严重的公共卫生问题，尤其是热带发展中国家中最贫穷的一些地区，这些地区破伤风的发病率和死亡率主要由MNT所致。2002年，全世界因破伤风所致的死亡总人数约为213,000人，其中新生儿死于破伤风者约占18万人，孕产妇死于破伤风者可能高达15,000-30,000人。对疫苗覆盖率、生产卫生及监测改善的持续强调，以及高风险地区的特定措施，使得近年破伤风的发病率持续下降。尽管在破伤风预防及治疗上有所进步，但是每年仍有约58000例的新生儿及未知数量的新生儿母亲死于破伤风。2014年6月，仍有24个国家未消灭破伤风。因此，仍要维持消灭破伤风需要持续的免疫接种计划及改善的公共卫生措施。
由于破伤风疾病极高的病死率，以及对其治疗手段的局限，人们已经认识到通过免疫接种疫苗来预防破伤风疾病，是最好的控制该疾病的手段。含破伤风类毒素疫苗目前在全球范围内已被纳入儿童期免疫规划。接种首剂疫苗后的保护是不完全的，但完成两针接种后绝大多数受种者的抗毒素浓度都可达到保护性水平；接种第3针后几乎100％的受种者可获得免疫力。针对破伤风的免疫力是通过抗体介导的，取决于抗毒素中和破伤风痉挛毒素的能力。临床破伤风的恢复并不意味着未来对这种疾病就具备了保护能力；免疫力只能通过主动免疫和被动免疫获得。通过类毒素的注射，人体内产生了抗体，并在较长时间内保持一定的浓度，可以中和进入体内的破伤风毒素，不致发病。吸附破伤风疫苗的预防效果很好。使用该疫苗全程免疫后，所有被接种的血清中抗毒素都可达到保护水平以上，抗体可维持10-15年时间，保护率可达95％以上。
WHO控制破伤风的主要目标之一是要实现和保持3剂次DTP的高免疫覆盖率，并实现和保持适当水平的加强免疫。在国际国内市场上，破伤风类毒素有单价抗原疫苗(TT)、无细胞百白破联合疫苗、AC脑膜炎结合疫苗等。破伤风类毒素原液需求量巨大。
破伤风疫苗是用破伤风类毒素原液制成的。传统的类毒素原液生产工艺包括：在有利于产毒的液体培养基中培养产毒的破伤风杆菌，用过滤的方法收获毒素，经用甲醛脱毒制成类毒素，再经超滤浓缩、盐析和超滤脱盐等若干步骤进行纯化，最终除菌过滤制备类毒素原液。
此工艺虽然具有相对稳定的优点，但制备类毒素原液存有纯度偏低(颜色较深、杂蛋白含量偏高)、脱毒体积较大，操作不便，且脱毒过程中杂质容易与毒素蛋白交联，不易提纯。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，该方法具有工艺简单、操作方便、生产效率高、成本低的优点，经本发明方法生产的破伤风类毒素成分更加单一、纯度更高，从而获得更好的免疫原性，降低接种副反应的发生。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，它包括以下步骤：
S1.前处理：将破伤风杆菌培养液过滤，滤液经30KD的超滤滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20～1/10，洗涤浓缩液并收集；
S2.离子交换层析：将上述浓缩液上样于平衡好的Q-Sepharose Fast Flow层析柱，用15～25mmol/L PB、0.16mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱峰即为IEX毒素目标蛋白；
S3.疏水层析：向步骤S2中收集的洗脱液中加入等量15～25mmol/LPB、1.5～2.5mmol/L硫酸铵，并上样于平衡好的PhenylFF层析柱，使用PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰即为HIC毒素目标蛋白；
S4.一次膜过滤：用PBS缓冲液稀释HIC毒素目标蛋白至600～800Lf/ml，加入终浓度为20mmol/L的L-赖氨酸盐酸盐，调pH为7.0～7.4，再加入终浓度为0.25％的甲醛溶液，滤膜过滤除菌；
S5.脱毒：将一次除菌过滤后的毒素分别在2～8℃的温度下放置1d、室温下2d、35～40℃的温度下21天进行脱毒，即为脱毒液；
S6.超滤：脱毒液经30KD的超滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20～1/15，洗涤浓缩液并收集；
S7.二次膜过滤：将步骤S6的超滤液经滤膜过滤除菌，滤液即为破伤风类毒素原液。
进一步地，步骤S1、S6中所述洗涤浓缩液的方法为：用15～25mmol/LPB缓冲液反复清洗浓缩液，直至透过液在280nm下的吸光度达到恒定，收集洗涤后浓缩液。
进一步地，步骤S4中采用氢氧化钠溶液调pH为7.0～7.4。
进一步地，所述脱毒过程中每5～7天取样测定pH值，并使用氢氧化钠溶液调整脱毒液的pH值为7.0～7.4。
进一步地，步骤S4、S7中所述滤膜的孔径为0.2μm。
本发明具有以下优点：本发明即是吸收了蛋白层析纯化技术的诸多优点，采用破伤风毒素离子交换层析和疏水层析纯化方法，结合经典的切向流超滤技术，工艺中能很好地将浓缩毒素中非特异性蛋白等杂质分离出去。
离子交换层析的原理是：破伤风毒素蛋白质在在一定pH条件下，被阴离子交换基质结合从而留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来，其中，结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来；
疏水层析的原理是：基于的是毒素蛋白质的疏水差异，在高盐溶液中，毒素蛋白与疏水配基相结合，而其它的杂蛋白则没有此种性质，利用此种性质，可以将杂蛋白进一步分离，从而提高蛋白纯度。
同时，本发明采用先纯化后脱毒工艺，利用先进的层析技术在脱毒前去除了毒素中的色素蛋白、培养基残留成分和其它非特异性的蛋白质等，不仅工艺先进、制备毒素纯度高，而且避免了脱毒过程中形成更为复杂的致敏性强的大分子多聚蛋白，毒素纯化后脱毒过程中大大减少了杂蛋白、小分子等物质在脱毒过程中与毒素分子结合的机会，使得脱毒后类毒素成分更加单一、纯度更高，从而获得更好的免疫原性，降低接种副反应的发生。此工艺可大大降低脱毒体积，更加便于操作，节省设备的同时，提高了生产效率。按照本工艺的毒素层析纯化法生产破伤风类毒素原液方法制备的破伤风类毒素原液的质量指标可达到行业标准。
附图说明
图1为本发明方法不同阶段所得破伤风类毒素进行聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，它包括以下步骤：
S1.前处理：将破伤风杆菌培养液过滤，滤液经30KD的超滤滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20，用15mmol/LPB缓冲液反复清洗浓缩液，直至透过液在280nm下的吸光度达到恒定，收集洗涤后浓缩液；
S2.离子交换层析：将上述浓缩液上样于平衡好的Q-Sepharose Fast Flow层析柱，用15mmol/L PB、0.16mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱峰即为IEX毒素目标蛋白；
S3.疏水层析：向步骤S2中收集的洗脱液中加入等量15mmol/LPB、1.5mmol/L硫酸铵，并上样于平衡好的Phenyl FF层析柱，使用PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰即为HIC毒素目标蛋白；
S4.一次膜过滤：用PBS缓冲液稀释HIC毒素目标蛋白至600Lf/ml，加入终浓度为20mmol/L的L-赖氨酸盐酸盐，采用氢氧化钠溶液调pH为7.0，再加入终浓度为0.25％的甲醛溶液，孔径为0.2μm滤膜过滤除菌；
S5.脱毒：将一次除菌过滤后的毒素分别在2℃的温度下放置1d、室温下2d、35℃的温度下21天进行脱毒，即为脱毒液，脱毒过程中每5天取样测定pH值，并使用氢氧化钠溶液调整脱毒液的pH值为7.0；
S6.超滤：脱毒液经30KD的超滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20，用15mmol/LPB缓冲液反复清洗浓缩液，直至透过液在280nm下的吸光度达到恒定，收集洗涤后浓缩液；
S7.二次膜过滤：将步骤S6的超滤液经孔径为0.2μm滤膜过滤除菌，滤液即为破伤风类毒素原液。
实施例2：一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，它包括以下步骤：
S1.前处理：将破伤风杆菌培养液过滤，滤液经30KD的超滤滤膜包超滤浓缩至原体积的1/10，用25mmol/L PB缓冲液反复清洗浓缩液，直至透过液在280nm下的吸光度达到恒定，收集洗涤后浓缩液；
S2.离子交换层析：将上述浓缩液上样于平衡好的Q-Sepharose Fast Flow层析柱，用25mmol/L PB、0.16mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱峰即为IEX毒素目标蛋白；
S3.疏水层析：向步骤S2中收集的洗脱液中加入等量25mmol/L PB、2.5mmol/L硫酸铵，并上样于平衡好的Phenyl FF层析柱，使用PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰即为HIC毒素目标蛋白；
S4.一次膜过滤：用PBS缓冲液稀释HIC毒素目标蛋白至800Lf/ml，加入终浓度为20mmol/L的L-赖氨酸盐酸盐，采用氢氧化钠溶液调pH为7.4，再加入终浓度为0.25％的甲醛溶液，孔径为0.2μm滤膜过滤除菌；
S5.脱毒：将一次除菌过滤后的毒素分别在8℃的温度下放置1d、室温下2d、40℃的温度下21天进行脱毒，即为脱毒液，脱毒过程中每7天取样测定pH值，并使用氢氧化钠溶液调整脱毒液的pH值为7.4；
S6.超滤：脱毒液经30KD的超滤膜包超滤浓缩至原体积的1/15，用25mmol/LPB缓冲液反复清洗浓缩液，直至透过液在280nm下的吸光度达到恒定，收集洗涤后浓缩液；
S7.二次膜过滤：将步骤S6的超滤液经孔径为0.2μm滤膜过滤除菌，滤液即为破伤风类毒素原液。
实施例3：一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，它包括以下步骤：
S1.前处理：将破伤风杆菌培养液过滤，滤液经30KD的超滤滤膜包超滤浓缩至原体积的1/15，用20mmol/L PB缓冲液反复清洗浓缩液，直至透过液在280nm下的吸光度达到恒定，收集洗涤后浓缩液；
S2.离子交换层析：将上述浓缩液上样于平衡好的Q-Sepharose Fast Flow层析柱，用20mmol/L PB、0.16mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱峰即为IEX毒素目标蛋白；
S3.疏水层析：向步骤S2中收集的洗脱液中加入等量20mmol/L PB、2mmol/L硫酸铵，并上样于平衡好的Phenyl FF层析柱，使用PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰即为HIC毒素目标蛋白；
S4.一次膜过滤：用PBS缓冲液稀释HIC毒素目标蛋白至700Lf/ml，加入终浓度为20mmol/L的L-赖氨酸盐酸盐，采用氢氧化钠溶液调pH为7.2，再加入终浓度为0.25％的甲醛溶液，孔径为0.2μm滤膜过滤除菌；
S5.脱毒：将一次除菌过滤后的毒素分别在6℃的温度下放置1d、室温下2d、37℃的温度下21天进行脱毒，即为脱毒液，脱毒过程中每6天取样测定pH值，并使用氢氧化钠溶液调整脱毒液的pH值为7.2；
S6.超滤：脱毒液经30KD的超滤膜包超滤浓缩至原体积的1/18，用20mmol/L PB缓冲液反复清洗浓缩液，直至透过液在280nm下的吸光度达到恒定，收集洗涤后浓缩液；
S7.二次膜过滤：将步骤S6的超滤液经孔径为0.2μm滤膜过滤除菌，滤液即为破伤风类毒素原液。
以下通过实验说明本发明的有益效果：
实验1.制备破伤风类毒素原液
S1.前处理：
(1)发酵液过滤：发酵罐培养结束后，将静置上清液分别经过一级、二级澄清滤堆滤器和除菌滤器进行过滤，收获破伤风毒素；
(2)毒素超滤浓缩：通过Millipore Pellicon超滤装置，选用30kD膜包，确保进液管路和截留管路均和超滤罐相连通，透析液排入活毒废水管路，缓慢启动超滤系统，维持进液压力不超过0.2MPa，超滤浓缩破伤风毒素至原体积的1/20～1/10后，保持此浓缩液体积液位，连续流加20mmol/LPB缓冲液反复清洗浓缩液，直至透过液中A280下的吸光度达到恒定，降低进液流速，从截留端收集洗涤后浓缩破伤风毒素，待进行层析。
S2.离子交换层析：使用Q Sepharose Fast Flow(QFF)层析凝胶，将破伤风毒素浓缩液样品经过离子交换层析柱进行层析，完整收集IEX毒素目标蛋白。
其中，目标蛋白洗脱：用20mmol/L PB、0.16mol/L NaCl溶液进柱洗脱目标蛋白，当UV检测值达到100mAU时，开始收集目标蛋白，当UV检测值下降到100mAU时，停止收集目标蛋白；杂质洗脱：使用20mmol/L PB、1mol/L NaCl溶液进柱洗脱杂蛋白，冲洗层析柱至少3CV。
S3.疏水层析：向IEX后收获毒素目标蛋白中缓慢加入等量20mmol/LPB+2mol/L硫酸铵溶液进行稀释，使用Phenyl FF(high sub)层析凝胶，将稀释后样品经过疏水层析柱进行层析，完整收集HIC毒素目标蛋白；
其中，杂质洗脱使用PB+0.5mol/L(NH4)2SO4洗脱杂蛋白，冲洗体积2～3CV。
目标蛋白洗脱使用PB溶液冲洗疏水层析柱至少3CV，当UV检测值达到100mAU时，开始收集目标蛋白，当UV检测值下降到100mAU时，停止收集目标蛋白。
S4.一次膜过滤：用磷酸盐缓冲生理氯化钠溶液(PBS)稀释HIC收获目标蛋白至600～800Lf/ml，加入终浓度20mmol/LL-赖氨酸盐酸盐、使用氢氧化钠溶液调整pH值7.0～7.4、缓慢加入终浓度0.25％的甲醛溶液，0.2μm除菌过滤、缓慢摇匀。
S5.脱毒：将除菌过滤后破伤风毒素放置在2～8℃的温度下1天，室温2天，37℃的温度下21天进行脱毒，每天缓慢摇动1次；脱毒过程中每5～7天取样测定pH值，并使用氢氧化钠溶液调整pH值7.0～7.4；脱毒结束后取样进行絮状单位测定和脱毒试验。
S6.超滤：脱毒试验合格后，通过Millipore Pellicon超滤装置，选用30kD膜包，使用磷酸盐缓冲生理氯化钠溶液(PBS)将脱毒后类毒素超滤至原体积的1/20～1/15，PBS反复清洗浓缩液，直至透过液中A280下的吸光度达到恒定，收集超滤后类毒素；
S7.二次膜过滤：超滤后类毒素经0.2μm除菌过滤后混匀，即为破伤风类毒素原液。
实验2.聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定实验
(1)实验样品：上述实验1中步骤S1毒素超滤浓缩后的浓缩液，标记为a；步骤S2收集到的IEX毒素目标蛋白，标记为b；步骤S3收集到的HIC毒素目标蛋白，标记为c；
(2)实验方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳；
(3)实验结果：如图1所示。图中：M为标准分子蛋白。
由图1可知：分别使用不同纯化阶段样品a、b和c进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果显示经过两步层析纯化后，毒素的主分子带大小均为55kDa和95kDa条带附近，且只有此两条明显主带，分子量大小符合文献150kDa～159.5kDa的报道，毒素纯度较高。
实验3.破伤风类毒素原液质检实验
(1)检测对象：实施例1、实施例2、实施例4生产的破伤风类毒素原液。
(2)检测方法：取样按现行药典方法检测PN、絮状单位、纯度、无菌试验、特异性毒性、毒性逆转试验，于2～8℃保存；
(3)检测结果：见表1。
表1：破伤风类毒素原液质检结果
由表1可知：经过各项检定，得到的三批破伤风类毒素原液结果均符合现行药典要求，可操作性强，有利于大规模生产。

Claims (1)

1.一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1. 前处理：将破伤风杆菌培养液过滤，滤液经30KD的超滤滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20～1/10，洗涤浓缩液并收集；
S2. 离子交换层析：将上述浓缩液上样于平衡好的Q-Sepharose Fast Flow层析柱，用15～25mmol/L PB、0.16mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱峰即为IEX毒素目标蛋白；
S3. 疏水层析：向步骤S2中收集的洗脱液中加入等量15～25mmol/L PB、1.5～2.5mmol/L硫酸铵，并上样于平衡好的Phenyl FF层析柱，使用PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰即为HIC毒素目标蛋白；
S4. 一次膜过滤：用PBS缓冲液稀释HIC毒素目标蛋白至600～800 Lf/ml，加入终浓度为20mmol/L的L-赖氨酸盐酸盐，调pH为7.0～7.4，再加入终浓度为0.25%的甲醛溶液，滤膜过滤除菌；
S5. 脱毒：将一次除菌过滤后的毒素分别在2～8℃的温度下放置1d、室温下2d、35～40℃的温度下21天进行脱毒，即为脱毒液；
S6. 超滤：脱毒液经30KD的超滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20～1/15，洗涤浓缩液并收集；
S7. 二次膜过滤：将步骤S6的超滤液经滤膜过滤除菌，滤液即为破伤风类毒素原液；
其中，步骤S1、S6中所述洗涤浓缩液的方法为：用15～25mmol/L PB缓冲液反复清洗浓缩液，直至透过液在280nm下的吸光度达到恒定，收集洗涤后浓缩液；
步骤S4中采用氢氧化钠溶液调pH为7.0～7.4；
所述脱毒过程中每5～7天取样测定pH值，并使用氢氧化钠溶液调整脱毒液的pH值为7.0～7.4；
步骤S4、S7中所述滤膜的孔径为0.2μm。
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层析法纯化破伤风毒素的试验研究;顾洁等;《微生物学免疫学进展》;20061231;第34卷(第1期);31-34 *
破伤风类毒素的发展历史、现状和新型破伤风疫苗的研究进展;彭祥兵;《微生物学免疫学进展》;19971231;第25卷(第2期);54-56 *

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