CN108003225A - 一种破伤风类毒素的精制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种破伤风类毒素的精制方法,其包括准备待纯化的破伤风类毒素原液;将破伤风类毒素原液加样于EMD DEAE(M)凝胶层析柱;采用平衡液对加样后的层析柱进行平衡,平衡后,采用洗脱液I洗脱所需的破伤风类毒素单体,收集含破伤风类毒素单体的洗脱液。本发明精制方法显著提高破伤风类毒素单体纯度,且其收率达40%以上,该方法获得的破伤风类毒素单体作为结合疫苗的载体蛋白能显著提高疫苗的免疫原性,为多糖‑蛋白质结合疫苗及其他以TT为联合疫苗组分的疫苗提供了更加安全有效的蛋白质。
Description
技术领域
本发明属于破伤风类毒素制备领域,涉及一种破伤风类毒素的精制方法。
背景技术
破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT或TTd)作为单价或吸附百白破疫苗的主要成分已广泛应用于婴幼儿及适宜人群的预防接种,随着目前国内外细菌性结合疫苗的迅速发展,b型流感嗜血杆菌结合疫苗、脑膜炎球菌结合疫苗、肺炎球菌结合疫苗已有TT作为载体蛋白质的疫苗成功上市(Tontini M,Berti F,Romano MR,et al.Comparison of CRM197,diphtheria toxoid and tetanus toxoid as protein carriers for meningococcalglycoconjugate vaccines[J].Vaccine,2013,31(42):4827-4833.WHO.Recommendationsto assure the quality,safety and efficacy of pneumococcal conjugate vaccines[S].Geneva,19to 23October 2009.),其安全性已得到长期临床试验证实(Centers forDisease Control and Prevention(CDC).Updated recommendations for use oftetanus toxoid,reduced diphtheria toxoid and acellular pertussis(Tdap)vaccinefrom the Advisory Committee on Immunization Practices,2010[J].MMWR MortalWkly Rep,2011,60(1):13-15.Vesikari T,Wysocki J,Chevallier B,etal.Immunogenicity of the 10-valent pneumococcal non-typeable Haemophilusinfluenza protein D conjugate vaccine(PHiD-CV)compared to the licensed 7vCRMvaccine[J].Pediatric Infect Dis J,2009,28(4Suppl):S66-S76.)。由于TT作为疫苗抗原使用途径不同,其质量控制指标也有所差异,如作为破伤风的TT抗原应使用大分子TT,而作为结合疫苗的载体蛋白质应以相对分子质量相对较小的TT单体含量高的纯化蛋白为首选(Vesikari T,Wysocki J,Chevallier B,et al.Immunogenicity of the 10-valentpneumococcal non-typeable Haemophilus influenza protein D conjugate vaccine(PHiD-CV)compared to the licensed 7vCRM vaccine[J].Pediatric Infect Dis J,2009,28(4Suppl):S66-S76.
Gross S,Janssen SW,de Vries B,et al.Collaborative study for thevalidation of alternative in vitro potency assays for human tetanusimmunoglobulins[J].Biologicals,2010,38(4):501-510.Montecucco C,SchiavoG.Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins[J].Q RevBiophys,1995,28(4):423-472.)。目前TT原液的单体含量仅为55%~70%,由于各厂家生产工艺不同,致使符合《中国药典》三部(2015年版)(Chinese Pharmacopoeia Commission(ChPC).Pharmacopoeia of People’s Republic of China(VolⅢ)[S].Beijing:ChinaMed Sci Press,2015.(in Chinese)国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015.)要求的制品单体含量有所不同。目前,部分企业以合格的TT原液作为载体蛋白质制备结合疫苗,虽然其符合《中国药典》三部(2015年版)的相关要求,但TT原液的单体含量仅为70%左右,其余30%的蛋白质以二聚体或多聚体形式存在,聚合TT的存在会影响制备工艺和结合疫苗的质量及安全性。
通常采用盐析、超滤或柱层析纯化用于结合疫苗制备所需的载体TT,纯化的TT单体纯度仅能提高到80%~85%,目前部分厂家采用Superdex 200和Sephacryl S-300HR柱层析纯化TT单体,并未得到单体含量较高的TT。
现有技术存在采用硫酸铵盐析和凝胶过滤法二步精制纯化TT原液的方法,其具体步骤为TT原液中加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为25%,2~8℃静置盐析8h;2830×g离心30min,收集沉淀,用0.1%碳酸氢钠溶液复溶后,选择截留相对分子质量为10000的透析袋,用0.85%氯化钠溶液透析至去除硫酸铵,透析后样品采用Superdex200或SephacrylS-300凝胶过滤层析。根据凝胶过滤的分子筛效应,先洗脱下来的峰以TT多聚体和TT二聚体为主,而较后的洗脱组分为TT单体,从而达到分离的目的。Superdex 200和Sephacryl S-300层析介质分离的单体中二聚体含量偏高,不能在柱层析纯化时达到基线分离。此外,Superdex 200层析介质仅能耐压0.3MPa,不利于实际应用。
现有技术存在采用疏水层析和离子交换层析两步法纯化破伤风类毒素的方法,疏水作用层析法是利用样品中各组份与填料之间具有不同的疏水性来进行分离的一种方法,它适用于疏水性的固定相,以含盐的溶液为流动相,使蛋白质能以活性状态进行分离。洗脱液经脱盐后再上离子交换柱进一步纯化目的蛋白。具体方法可为:在室温条件下,将破伤风毒素滤液与2mol/L硫酸铵-磷酸盐溶液等量混合。通过Phenyl Sepharose疏水层析,分别用1mol/L硫酸铵-磷酸盐溶液、0.5mol/L硫酸铵-磷酸盐溶液、50μmol/L磷酸盐缓冲液洗脱,使毒素第一步层析纯化。然后将洗脱液通过G-25Fine凝胶过滤脱盐。最后通过DEAE Sephadex离子交换层析,用氯化钠-磷酸盐缓冲液洗脱,使毒素第二步层析纯化。采用该方法纯化得到的产物是TT单体、二聚体和多聚体的混合物,同样不能有效分离TT单体。
为满足破伤风类毒素的应用需要,提高其质量及安全性,本领域亟需寻找一种新的破伤风类毒素的精制方法,以获得TT单体含量高的破伤风类毒素。
发明内容
有鉴于现实需要,本发明的主要的目的在于提供一种新的破伤风类毒素的精制方法,通过该方法能有效提高破伤风类毒素中TT单体纯度,使其能作为结合疫苗的载体蛋白质。
为实现上述目的,本发明提供一种破伤风类毒素的精制方法,其包括如下步骤:
(1)准备待纯化的破伤风类毒素原液,并调节其pH为6.0~8.0,电导不大于10ms/cm;
(2)将步骤(1)的破伤风类毒素原液(TT原液)加样于以EMD DEAE(M)为填料的凝胶层析柱;
(3)采用平衡液对加样后的层析柱进行平衡,平衡后,采用洗脱液I洗脱所需的破伤风类毒素单体,收集破伤风类毒素单体的洗脱峰。
发明人通过大量研究意外发现采用EMD DEAE(M)凝胶层析柱能对破伤风类毒素原液中的单体、二体及多聚体进行有效分离,相对于现有技术,处理同样量的破伤风类毒素原液,能够获得高收率的纯度符合要求(达90%以上)的破伤风类毒素单体。经高效液相色谱分析显示,本发明可将破伤风类毒素单体纯度提高至95%以上,且其收率达40%左右,能为多糖-蛋白质结合疫苗及其他以TT为联合疫苗组分的疫苗提供更加安全有效的蛋白质。此外,本发明采用一步层析方法即可有效纯化破伤风类毒素原液,相较于现有技术繁琐的步骤,其工艺简单,流程短,具有良好的应用前景。
本发明需控制上样液的pH和电导,如果不调节pH和电导,样品不容易吸附到凝胶上,易流穿下来。
本发明EMD DEAE(M)凝胶为现有产品,其可商购获得。所述的凝胶层析柱既可以是自行填充得到也可直接购买预装柱。优选地,所述凝胶层析柱为EMDDEAE(M)凝胶预装柱形式,其可购自Merck公司。该预装柱的填料为EMD DEAE(M)凝胶。所述预装柱的内径例如为不小于5mm,高度为不小于50mm,柱体积为不小于1ml;例如8mm ID×100mm H,V=5.0ml的预装柱。
上述精制方法中,优选地,所述洗脱液I为含磷酸盐(例如磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钠等)浓度为10~35mmol/L,氯化钠浓度为60~130mmol/L且pH为6.0~8.0的缓冲水溶液。该洗脱液I可采用本领域常规的方式配制得到,例如称取磷酸盐10~35mmol,称取氯化钠60~130mmol,溶于1L纯化水中混匀,调节pH至6.0~8.0即得。
本发明所述待纯化的破伤风类毒素原液是指破伤风梭状芽孢杆菌菌种在适宜的培养基中培养产生破伤风毒素,破伤风毒素中加入适量甲醛溶液,置适宜温度进行脱毒后产生破伤风类毒素,破伤风类毒素经超滤、硫酸铵沉淀后得到精制破伤风类毒素,将精制破伤风类毒素调节到适宜pH后除菌过滤得到实验用破伤风类毒素原液,优选地,在该原液中,其单体含量为70~85%。更优选地,在该原液中,二聚体含量为13~25%,多聚体含量为2.6~3.2%,余量为其他杂质。本发明所述含量是指进行高效液相色谱后,按面积归一化法在检测波长为280nm下计算得到的含量。
上述精制方法中,优选地,步骤(1)中采用平衡液对待纯化的破伤风类毒素原液进行稀释调节,步骤(2)是将稀释调节后的破伤风类毒素原液加样于所述层析柱。例如采用体积与待纯化的破伤风类毒素原液体积相同的平衡液进行稀释,使其pH为6.0~8.0,电导不大于10ms/cm。
上述精制方法中,步骤(2)中控制待纯化的破伤风类毒素原液的载量不大于该凝胶层析柱的最大载样量。本发明EMD DEAE(M)凝胶层析柱的载量可通过动态结合载量测算,该方法为本领域的常规的方法,其可获得在一定流速下,一定缓冲液条件下EMD DEAE(M)凝胶的动态结合载量。
上述精制方法中,步骤(3)中洗脱液Ⅰ的流速为30~75cm/h。
上述精制方法中,步骤(3)中可采用纯化仪进行洗脱。纯化仪为本领域常用纯化设备,其可商购获得,例如采用AKTA purifier 100纯化仪,其可购自通用电气公司,该纯化仪为紫外监测器。通常而言,在进行层析时需要设置监测波长,本发明可设置该纯化仪的监测波长为206~300nm。
上述精制方法中,所述平衡液为含磷酸盐(例如磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钠等)浓度为10~35mmol/L且pH为6.0~8.0的缓冲水溶液。该平衡液的配制方法可为称取磷酸盐10~35mmol至1L纯化水中,调节pH至6.0~8.0得到。
在上述精制方法中,待收集完破伤风类毒素单体的洗脱峰后,可采用洗脱液II洗脱其余杂蛋白(可回收二聚体及多聚体等)。优选地,所述洗脱液II为含磷酸盐(例如磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钠等)浓度为10~35mmol/L,氯化钠浓度为500~1000mmol/L且pH为6.0~8.0的缓冲水溶液。
本发明上述特征可相互组合以获得更好的效果,优选地,上述精制方法包括如下步骤:
(a)准备待纯化的破伤风类毒素原液,该破伤风类毒素原液中单体含量为70~85%,二聚体含量为13~25%,多聚体含量为2.6~3.2%,余量为其他杂质;
(b)采用如下步骤(d)使用的平衡液对步骤(a)中的破伤风类毒素原液进行稀释调节,使得稀释调节后破伤风类毒素原液的pH为6.0~8.0,电导率不大于10ms/cm;
(c)将步骤(b)稀释调节后的破伤风类毒素原液加样于EMD DEAE(M)凝胶层析柱,例如该预装柱为Merck公司生产的预装柱,其内径例如为不小于5mm,高度为不小于50mm,柱体积为不小于1ml(稀释后的破伤风类毒素原液的加样量不大于该预装柱的最大载样量);
(d)采用纯化仪进行层析,设置该纯化仪的监测波长为206~300nm(优选280nm),首先使用平衡液对所述预装柱进行平衡,该平衡液为含磷酸盐浓度为10~35mmol/L且pH为6.0~8.0的缓冲水溶液;平衡后,采用洗脱液I洗脱所需的破伤风类毒素单体,收集破伤风类毒素单体的洗脱峰,其中,该洗脱液I为含磷酸盐浓度为10~35mmol/L,氯化钠浓度为60~130mmol/L且pH为6.0~8.0的缓冲水溶液,洗脱液的流速为30~75cm/h;待收集完破伤风类毒素单体的洗脱峰后,采用洗脱液II洗脱其余杂蛋白(以进行回收二聚体及多聚体等),所述洗脱液II为含磷酸盐浓度为10~35mmol/L,氯化钠浓度为500~1000mmol/L且pH为6.0~8.0的缓冲水溶液。
另一方面,本发明提供由前述精制方法制备得到的破伤风类毒素。优选地,该破伤风类毒素中单体含量为90~100%。更优选地,其二聚体含量为10~0%,多聚体含量为0%,余量为其余杂质。
综上可知,本发明提供了一种破伤风类毒素的精制方法,该精制方法主要以EMD DEAE(M)纯化TT原液,显著提高了破伤风类毒素单体纯度,且其收率达40%以上,由以上方法获得的破伤风类毒素单体作为结合疫苗的载体蛋白能显著提高疫苗的免疫原性(TT单体的纯度直接影响了结合疫苗的免疫原性),为多糖-蛋白质结合疫苗及其他以TT为联合疫苗组分的疫苗提供了更加安全有效的蛋白质。
附图说明
图1为本发明实施例1纯化前破伤风类毒素原液经HPLC层析图谱。
图2为本发明实施例1纯化后破伤风类毒素原液经HPLC层析图谱。
图3为本发明实施例2的层析图。
图4为本发明实施例3的层析图。
图5为本发明实施例4的层析图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解,现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明,应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中,各原始试剂材料均可商购获得,未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件,或按照仪器制造商所建议的条件。
以下实施例中所采用的EMD DEAE(M)凝胶层析柱为EMDDEAE(M)凝胶预装柱,该预装柱为8mm ID×100mm H,V=5.0ml的预装柱,其购自Merck公司。
以下实施例中采用AKTA purifier 100纯化仪进行层析,其购自通用电气公司,该纯化仪的监测器为紫外监测器,实验过程中设置监测波长为280nm。
以下实施例中的收率是按如下公式计算得到的:
收率=(目的蛋白收集液体积×收集液蛋白含量)/(上样样品体积×样品蛋白含量×TT单体所占百分比)×100%。
实施例1
本实施例提供破伤风类毒素的精制方法,其包括如下步骤:
(a)准备待纯化的破伤风类毒素原液:
本实施例采用按如下方法制备得到的破伤风类毒素原液作为纯化前的破伤风类毒素,破伤风梭状芽孢杆菌菌种,在适宜的培养基中培养产生破伤风毒素,破伤风毒素中加入适量甲醛溶液,置适宜温度进行脱毒后产生破伤风类毒素,破伤风类毒素经超滤、硫酸铵沉淀后得到精制破伤风类毒素,将精制破伤风类毒素调节到适宜pH后除菌过滤得到实验用破伤风类毒素原液。
对所得破伤风类毒素原液进行高效液相色谱分析,其中,高效液相层析系统为Agilent 1100Series,色谱柱为TSK gel G3000SW,安捷伦公司生产。高效液相色谱流动相:0.2M磷酸盐缓冲液+1%异丙醇,pH7.0,该破伤风类毒素原液的高效液相色谱图如图1所示,与图1对应的保留时间、面积等信息如下表1所示:
表1纯化前TT原液经HPLC检测纯度情况
图1及表1中保留时间为28.629min的峰为破伤风类毒素单体峰,其面积归一法含量仅为75.3189%,二聚体保留时间为24.606min,含量为18.39%,多聚体保留时间为18.491min,含量为3.00%;
(b)采用如下步骤使用的平衡液对步骤(a)中的破伤风类毒素原液进行稀释,具体步骤为取上述破伤风类毒素原液7mL,加7mL含磷酸盐浓度为25mmol/L且pH为6.96的缓冲水溶液(平衡液),测得稀释后的TT原液的pH为6.96,电导为9.27ms/cm;
(c)将步骤(b)稀释后的破伤风类毒素原液加样于EMD DEAE(M)凝胶预装柱;稀释后的破伤风类毒素原液的加样量不大于该预装柱的最大载样量;
(d)使用平衡液对加样后的预装柱进行平衡,该平衡液为含磷酸盐浓度为25mmol/L且pH为6.96的缓冲水溶液;平衡后,采用洗脱液I洗脱所需的破伤风类毒素单体,收集第6~14min破伤风类毒素单体的洗脱峰,其中,该洗脱液I为含磷酸盐浓度为25mmol/L,氯化钠浓度为120mmol/L且pH为7.0的缓冲水溶液,洗脱液的流速为75cm/h;待收集完破伤风类毒素单体的洗脱峰后,采用洗脱液II洗脱其余杂蛋白,以进行回收二聚体及多聚体等杂蛋白,所述洗脱液II为含磷酸盐浓度为25mmol/L,氯化钠浓度为520mmol/L且pH为7.0的缓冲水溶液。
将收集的含TT单体的洗脱液合并,然后取样进行高效液相色谱分析,其采用的仪器设备、试剂、方法等均与上述分析TT原液相同,所得高效液相色谱如图2所示,与图2对应的保留时间、面积等信息如下表2所示:
表2纯化后TT原液经HPLC检测纯度情况
图2及表2中保留时间为29.013min的峰为破伤风类毒素单体峰,其纯度达96.07%。对比TT原液可知,本实施例显著提到了破伤风类毒素单体纯度,收率为47.64%。
实施例2
本实施例采用与实施例1基本相同的方法纯化TT原液,按与实施例1相同的方法测试,该原液中破伤风类毒素单体含量仅为71.61%,二聚体含量为25.77%,多聚体含量为2.62%,经与实施例1相同的方法进行层析,将第6~14min TT单体的洗脱液合并,取样按实施例1相同的方法测试纯化后TT单体纯度,其HPLC如图3所示,纯度达96.04%,其收率为48.62%。二聚体含量为3.96%。多聚体含量为0。
实施例3
本实施例采用与实施例1基本相同的方法纯化TT原液,按与实施例1相同的方法测试,该原液中破伤风类毒素单体含量仅为77.43%,二聚体含量为19.37,多聚体含量为3.20,经与实施例1相同的方法进行层析,将第7~15min收集的含TT单体的洗脱液合并,取样按实施例1相同的方法测试纯化后TT单体含量,其HPLC如图4所示,纯度达97.36%,其收率为41.69%。二聚体含量为2.64%。多聚体含量为0。
实施例5
本实施例采用与实施例1基本相同的方法纯化TT原液,按与实施例1相同的方法测试,该原液中破伤风类毒素单体含量仅为83.59%,二聚体含量为13.72,多聚体含量为2.70,经与实施例1相同的方法进行层析,将第7~15min收集的含TT单体的洗脱液合并,取样按实施例1相同的方法测试纯化后TT单体含量,其HPLC如图5所示,纯度达95.03%,其收率为46.00%。二聚体含量为4.97%。多聚体含量为0。
通过上述实施例结果显示:经过纯化后,TT单体纯度均能达到95%以上,收率在40%以上,具有很好的重复性。
实验例
在摸索纯化工艺的过程中,分别尝试了几种不同的凝胶介质,均没有达到理想效果,现将结果汇总如下。
备注:纯化所用的凝胶均为Merck公司产品,高效液相色谱柱为G5000,安捷伦公司生产。
高效液相色谱流动相:0.2M磷酸盐缓冲液+1%异丙醇,pH7.0,配制方法如下:
本发明尝试了CPX阳离子交换树脂。用CPX胶装入GE公司XK16/20柱,柱体积10ml。用起始缓冲液25mmolNaAc+150mmolNaCl,pH5.5平衡柱子。将TT未纯化样品用25mmol NaAc,pH5.0缓冲液稀释至电导9.21,测得pH为5.583。上样13ml,结果由于起始缓冲液电导为17ms/cm,与样品电导相差较大,导致样品穿透没有吸附上。用25mmolNaAc+1M NaCl,pH5.5洗脱液只洗脱下一个小峰,高效液相色谱分析显示为TT多聚体和一些小分子物质。
第二次实验中将起始缓冲液用纯化水稀释至电导10.52ms/cm后重新上样,尝试用0-45%浓度的洗脱液进行梯度洗脱。高效液相色谱结果显示流穿液里有大量TT单体,没有完全吸附上。在收集的洗脱液中,在0-45%梯度中洗脱下来的均是TT多聚体、TT二聚体和TT单体的混合物,TT单体没有分离开,纯度只有50%左右。25mmolNaAc+1MNaCl,pH5.5洗脱液洗下的是TT多聚体。
随后本发明尝试了分别用20%和50%浓度的洗脱液洗脱,液相结果显示20%浓度洗脱下的TT单体纯度仅有60%左右。50%浓度洗脱液洗脱下TT多聚体。
综合以上三次实验的结果,本发明放弃使用CPX阳离子交换树脂。
本发明使用Phenyl(s)HIC凝胶,装填XK16/20层析柱,柱体积为10ml。将样品用纯化水稀释至电导为5.05ms/cm后上样。上样缓冲液为25mmolPB+0.5MNaCl,pH7.0。可能由于上样缓冲液中盐浓度稍低,导致样品大量穿透。
将上样缓冲液调整为25mmolPB+1MNaCl,pH7.0后重新上样,流穿液中TT单体纯度为65.67%,用25mmolPB,pH7.0洗脱液洗脱,洗脱液中TT单体纯度仅为34.89%。
综合以上两次实验的结果,Phenyl(s)HIC凝胶并不适用于TT单体的纯化。
本发明又选择阴离子交换树脂进行了实验。选择Fractogel EMD DEAE(M)凝胶。将样品用25mmol PB,pH7.0对倍稀释至电导9.37ms/cm后进行上样。上样缓冲液为25mmol PB+0.5M NaCl,pH7.0。用25mmolPB+0-1M NaCl,pH7.0进行梯度洗脱。收集样品进行高效液相色谱分析。结果显示,样品有一部分被吸附上,一部分被上样缓冲液洗脱下来,这说明上样缓冲液里的盐浓度过高,导致样品被洗脱下来。在用25mmolPB+1MNaCl,pH7.0缓冲液进行梯度洗脱时,盐浓度低时,洗脱下来的主要成分是TT单体,随着盐浓度的增加,TT二聚体及多聚体也被随之洗脱下来。
随后,本发明将上样缓冲液改为25mmolPB,pH7.0,以期能将更多的样品吸附到柱子上,再用25mmolPB+1MNaCl,pH7.0缓冲液进行梯度洗脱。同样盐浓度低时,洗脱下来的主要成分是TT单体,随着盐浓度的增加,TT二聚体及多聚体也被随之洗脱下来。由此本发明得到提示,想要得到纯度较高的TT单体,应选择一个合适的较低浓度的盐溶液,并且用25mmolPB,pH7.0缓冲液进行上样时,目的蛋白都能吸附上。
根据梯度洗脱的结果,本发明分别选择25mmolPB+130mmol NaCl,pH7.0、25mmolPB+120mmol NaCl,pH7.0、25mmol PB+110mmol NaCl,pH7.0缓冲液洗脱TT单体,选择25mmolPB+520mmol NaCl,pH7.0洗脱杂蛋白。高效液相色谱分析TT单体的纯度,用25mmol PB+130mmol NaCl,pH7.0、25mmol PB+120mmol NaCl,pH7.0、25mmol PB+110mmol NaCl,pH7.0缓冲液洗脱时TT单体的纯度分别为90.37%、96.16%、95.93%。由此确定,用FractogelEMD DEAE(M)凝胶纯化TT单体时,样品用25mmol PB,pH7.0稀释至电导为9.0ms/cm左右,上样缓冲液为25mmol PB,pH7.0。采用25mmolPB+120mmolNaCl,pH7.0缓冲液洗脱TT单体,25mmolPB+520mmolNaCl,pH7.0洗脱杂蛋白。计算TT单体的收率为40%左右。
Fractogel EMD DEAE(M)凝胶的粒径是中等大小,随后本发明尝试了小粒径的Fractogel EMD DEAE(S)凝胶,按照以上确定的实验条件进行重复,希望能将收率提高。根据色谱分析的结果,TT单体纯度为87%左右。调整洗脱浓度为10%,所得样品TT单体纯度为87.58%。纯度均不能达到90%以上的要求,放弃使用此胶。
最终确定的优选的方案为使用Fractogel EMD DEAE(M)凝胶纯化TT单体,样品用25mmolPB,pH7.0稀释至电导为9.0ms/cm左右,平衡缓冲液为25mmolPB,pH7.0。采用12%浓度的25mmolPB+1MNaCl,pH7.0缓冲液洗脱TT单体,52%浓度的25mmolPB+1MNaCl,pH7.0洗脱杂蛋白。
最后说明的是:以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点,而非限制本发明的技术方案,尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解:依然可以对本发明进行修改或者等同替换,而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换,均应涵盖在本发明的保护范围当中。
Claims (10)
1.一种破伤风类毒素的精制方法,其包括如下步骤:
(1)准备待纯化的破伤风类毒素原液,并调节其pH为6.0~8.0,电导不大于10ms/cm;
(2)将步骤(1)的破伤风类毒素原液加样于以EMD DEAE(M)为填料的凝胶层析柱;
(3)采用平衡液对加样后的层析柱进行平衡,平衡后,采用洗脱液I洗脱所需的破伤风类毒素单体,收集破伤风类毒素单体的洗脱峰;
优选地,步骤(3)中洗脱液I的流速为30~75cm/h;
优选地,步骤(3)中采用纯化仪进行洗脱;更优选地,设置该纯化仪的监测波长为206~300nm。
2.根据权利要求1所述的破伤风类毒素的精制方法,其中,所述凝胶层析柱为EMD DEAE(M)凝胶预装柱形式;优选地,该凝胶预装柱的内径例如为不小于5mm,高度为不小于50mm,柱体积为不小于1ml;例如8mm ID×100mm H,V=5.0ml的凝胶预装柱。
3.根据权利要求1所述的破伤风类毒素的精制方法,其中,所述洗脱液I为含磷酸盐浓度为10~35mmol/L,氯化钠浓度为60~130mmol/L且pH为6.0~8.0的缓冲水溶液。
4.根据权利要求1所述的破伤风类毒素的精制方法,其中,在待纯化的破伤风类毒素原液中,其单体含量为70~85%;更优选地,在该原液中,二聚体含量为13~25%,多聚体含量为2.6~3.2%,余量为其他杂质。
5.根据权利要求1所述的破伤风类毒素的精制方法,其中,步骤(1)中采用平衡液对待纯化的破伤风类毒素原液进行稀释调节,步骤(2)是将稀释调节后的破伤风类毒素原液加样于所述层析柱;例如采用体积与待纯化的破伤风类毒素原液体积相同的平衡液进行稀释,使其pH为6.0~8.0,电导不大于10ms/cm。
6.根据权利要求1所述的破伤风类毒素的精制方法,其中,所述平衡液为含磷酸盐浓度为10~35mmol/L且pH为6.0~8.0的缓冲水溶液。
7.根据权利要求1所述的破伤风类毒素的精制方法,其中,待收集完破伤风类毒素单体的洗脱峰后,采用洗脱液II洗脱其余杂蛋白;优选地,所述洗脱液II为含磷酸盐浓度为10~35mmol/L,氯化钠浓度为500~1000mmol/L且pH为6.0~8.0的缓冲水溶液。
8.根据权利要求1所述的破伤风类毒素的精制方法,其包括如下步骤:
(a)准备待纯化的破伤风类毒素原液,该破伤风类毒素原液中单体含量为70~85%,二聚体含量为13~25%,多聚体含量为2.6~3.2%,余量为其他杂质;
(b)采用如下步骤(d)中使用的平衡液对步骤(a)中的破伤风类毒素原液进行稀释调节,使得稀释后破伤风类毒素原液的pH为6.0~8.0,电导率不大于10ms/cm;
(c)将步骤(b)稀释调节后的破伤风类毒素原液加样于EMD DEAE(M)凝胶层析柱,例如该层析柱为Merck公司生产的预装柱,其内径例如为不小于5mm,高度为不小于50mm,柱体积为不小于1ml;
(d)采用纯化仪进行层析,设置监测波长为206~300nm,首先使用平衡液对所述层析柱进行平衡,该平衡液为含磷酸盐浓度为10~35mmol/L且pH为6.0~8.0的缓冲水溶液;平衡后,采用洗脱液I洗脱所需的破伤风类毒素单体,收集破伤风类毒素单体的洗脱峰,其中,该洗脱液I为含磷酸盐浓度为10~35mmol/L,氯化钠浓度为60~130mmol/L且pH为6.0~8.0的缓冲水溶液,洗脱液I的流速为30~75cm/h;待收集完破伤风类毒素单体的洗脱峰后,采用洗脱液II洗脱其余杂蛋白,所述洗脱液II为含磷酸盐浓度为10~35mmol/L,氯化钠浓度为500~1000mmol/L且pH为6.0~8.0的缓冲水溶液。
9.一种破伤风类毒素,其是由权利要求1~8中任一项所述的精制方法制备得到的。
10.根据权利要求9所述的破伤风类毒素,其中,该破伤风类毒素中单体含量为90~100%;优选地,其二聚体含量为10~0%,多聚体含量为0%,余量为其余杂质。
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