CN106799216A - 一种高选择性喹诺酮类抗生素分子印迹聚合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高选择性喹诺酮类抗生素分子印迹聚合物的制备方法。本发明以诺氟沙星作为模板分子，采用沉淀聚合法制备分子印迹聚合物，并对包括功能单体、交联剂在内的制备条件进行优化，获得了对模板分子及其结构类似物具有特异性吸附能力的分子印迹聚合物。本发明制备方法所制备出的高选择性分子印迹聚合物具有极高的印因迹子，具有更优的特异性吸附能力。可以用于有效地、准确地检测出食物中抗生素痕量残留。

Description

一种高选择性喹诺酮类抗生素分子印迹聚合物的制备方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种高选择性喹诺酮类抗生素分子印迹聚合物的制备方法。

背景技术

氟喹诺酮类抗生素(Fluoroquinolones，FQs)是一类具有1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸结构的合成化合物。近年来，其主要用于食用性动物疾病的预防和治疗，导致食品样品中出现了氟喹诺酮类抗生素残留的现象，对人类健康造成了危害，例如可引起成人恶心、呕吐、过敏反应和抗生素耐受，以及青少年关节肿胀和疼痛甚至中枢神经系统损伤。所以美国、欧盟、日本等发达国家对该类药物残留提出了严格的限量规定：FDA于1997年明确规定在进口动物源性食品中禁止使用FQs(氟乙酰苯醌)；欧盟委员会EU2377/90号关于建立共同的动物源性食品兽药最大残留检测程序法规中所规定：恩诺沙星和环丙沙星在动物肌肉、肝脏和肾脏中最大药物残留限量(MRL)为30μg/kg，沙拉沙星和双氟沙星在动物组织中MRL分别为l0～100μg/kg和1900μg/kg；日本肯定列表对该类药物残留规定的MRL为50μg/kg。

许多分析方法已被用于食品中氟喹诺酮类抗生素的检测，如荧光光谱法、酶联免疫吸附法、毛细管电泳法和液相色谱法等。由于样品基质复杂且待测物含量低，大部分方法都需要对实际样品进行前处理以净化和浓缩待测物，主要有液-液萃取(LLE)、透析、超临界流体萃取(SFE)、加压液相萃取(PLE)和固相萃取(SPE)。固相萃取由于其具有操作简单、使用灵活、回收率高、处理的样品体积小、易于自动化等优点成为常用的样品前处理方法。然而，其常用的吸附剂由于缺乏选择性，对复杂的环境、生物体系中的样品很难进行分离，所以它的应用在一定程度上受到限制。本课题以氧氟沙星为模板制备了分子印迹聚合物，并将其制备成分子印迹固相萃取柱，建立了恩诺沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、双氟沙星、环丙沙星、氟甲喹和萘啶酸多残留分析的在线LC-MS/MS方法。

分子印迹聚合物由于可特异性吸附模板分子而广泛应用于样品前处理。分子印迹聚合物的制备方法有多种，包括：本体聚合法[1]、悬浮聚合法[2]、多步溶胀聚合法[3,4]、沉淀聚合法[5,6]、表面印迹[7]等方法。其中沉淀聚合法将包括模板分子、功能单体、交联剂等在内的聚合物体系溶解于大体积的致孔剂中，最终可形成纳米级的聚合物微球。与传统的本体聚合法相比，沉淀聚合法具有无需碾磨等后续操作、产率高、制得的聚合物微粒较规则等优点，成为制备分子印迹聚合物最重要的方法之一。

虽然有文献报道利用喹诺酮类抗生素作为分子印迹聚合物的模板分子，但是，人们一直未能找到一种能够快速、有效地检测喹诺酮类抗生素并且具有良好抗干扰性能的分子印迹聚合物。

发明内容

本发明提供了一种高选择性喹诺酮类抗生素分子印迹聚合物及相应制备方法，该高选择性分子印迹聚合物具有很高的印因迹子，具有更优的特异性吸附能力。

一种高选择性喹诺酮类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

步骤1)、在容器中加入第一预定量的致孔剂；

步骤2)、将第二预定量的模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶于所述致孔剂中，获得相应混合溶液；

步骤3)、对所获得的混合溶液进行超声脱气，持续第一预定时间；

步骤4)、对脱气后的混合物进行通氮处理，持续第二预定时间；

步骤5)、对所述容器进行密封；

步骤6)、将所述容器置于第一预定温度环境中；

步骤7)、对容器内的混合物进行持续搅拌；

步骤8)、过滤并收集容器中生成的聚合物微粒。

在一种优选实现方式中，所述方法还包括：

步骤9)、利用有机溶剂对所述聚合物微粒进行索氏提取；

步骤10)、对所得产物进行甲醇式提取。

在另一种优选实现方式中，所述方法还包括：

步骤11)、在恒温条件下对所得产物进行恒温干燥处理。

在另一种优选实现方式中，所述致孔剂为甲醇或甲醇与乙腈的混合溶液。

在另一种优选实现方式中，所述功能单体包括：甲基丙烯酸(Methacrylic acid，MAA)或4-乙烯吡啶(4-Vinylpyridine，4-VP)。

在另一种优选实现方式中，所述第一预定温度为50-70℃。

一种快速检测食品中痕量喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1)、填充分子印迹在线萃取钢柱；

步骤2)、以适当溶剂提取食品样本中的喹诺酮类抗生素；

步骤3)、提取液过在线分子印迹萃取钢柱；

步骤4)、在线淋洗；

步骤5)、在线洗脱；

步骤6)、液相色谱-质谱分析。

本发明以诺氟沙星作为模板分子，采用沉淀聚合法制备分子印迹聚合物，并对包括功能单体、交联剂在内的制备条件进行优化，获得了对模板分子及其结构类似物具有特异性吸附能力的分子印迹聚合物。本发明制备方法制备的高选择性分子印迹聚合物具有极高的印因迹子，与现有分子印迹聚合物相比，具有更优的特异性吸附能力。可以用于有效地、准确地检测出食物中抗生素痕量残留。

附图说明

图1为分子印迹聚合物MIPs与空白聚合物NIPs的扫描电镜图：其中，(A)为MIPs放大2000倍的结果；(B)和(C)为MIPs与NIPs放大30000倍的结果。

图2示出了模板分子与MAA比例对印迹因子的影响；

图3示出了交联剂用量对印迹因子的影响；

图4示出了利用自动化在线分析系统对抗生素残留进行检测的过程。

具体实施方式

以下结合附图及其实施例对本发明进行详细说明，但并不因此将本发明的保护范围限制在实施例描述的范围之中。

实施例1诺氟沙星分子印迹聚合物的制备

本实施例中，采用沉淀聚合法以诺氟沙星为模板分子制备分子印迹聚合物。在100mL的圆底玻璃瓶中加入60mL致孔剂(甲醇或甲醇与乙腈的混合溶液)，将一定量的模板分子、功能单体Methacrylic acid(MAA)或4-Vinylpyridine(4-VP)、交联剂Ethyleneglycol dimethacrylate,(EGDMA)或Trimethylolpropane trimethylacrylate(TRIM)、引发剂2,2-azobisisobutyronitrile(AIBN)AIBN溶于致孔剂中，超声脱气5min，通氮气除氧5min，封口。置于60℃，100～120转/分搅拌24h。反应结束后，收集所制得的聚合物微粒，用甲醇/乙酸(9/1，V/V)索式提取36h，以除去模板分子，再用甲醇索式提取12h，以除去乙酸，40℃真空干燥至恒重，得到诺氟沙星的分子印迹聚合物(MIPs)。空白聚合物(NIPs)与MIPs制备过程基本相同，只是不加入模板分子。

诺氟沙星分子印迹聚合物色谱评价

将制备所得的MIPs与NIPs聚合物悬浮于甲醇中，分别用真空泵将其填入50mm×4.6mm的不锈钢管柱制成MIP和NIP填充柱。将填充柱联入高效液相色谱仪，分别测定诺氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、双氟沙星的保留时间。需要说明的是，下文中，所获得的分子印迹聚合物分别用MIP1、2、3等标示。

色谱条件：流动相为甲醇，流速0.5mL/min；进样体积为20μL，四种喹诺酮类抗生素进样浓度均为0.50g/L的甲醇溶液；检测波长为280nm。印迹因子定义为I＝k’MIP/k’NIP，k’MIP和k’NIP分别为被分析物在MIP和NIP填充柱上的容量因子，且k’＝(tr-t0)/t0，tr、t0分别为待测物的保留时间和死时间，死时间通过5％丙酮甲醇(V/V)溶液测定。

MIPs的扫描电镜观察结果如图1。如图所示，沉淀聚合法制备的诺氟沙星分子印迹聚合物呈不规则的球形且存在一定的团聚现象(图1A)，从结果看所制备出的聚合物为比较规则的微米级颗粒(图1.B，图1.C)。

由于诺氟沙星等喹诺酮类抗生素在大部分低极性有机溶剂如二氯甲烷、氯仿等中的溶解性较差，故一般采用甲醇与乙腈的混合溶液(30/30，V/V)作为致孔剂，本发明的MIP2即采用该混合溶液，但在此条件下制备的聚合物的填充柱，联入色谱系统，在流速为0.5mL/min的情况下，柱压大于4000psi，这说明聚合物微粒粒径不适合用于色谱分离，为了解决这个问题，申请人对致孔剂进行了优化。

本发明用极性较强的溶剂甲醇作为致孔剂，因其极性较大，所制备的聚合物相对比较疏松，颗粒比较大，在线检测时柱压比较小。

功能单体种类的优化

功能单体在分子印迹聚合物制备过程中的主要作用是提供适当的功能基团与模板分子发生共价或非共价作用，作用的强弱是决定聚合物特异性吸附能力优劣的重要因素。因此，本发明对功能单体的种类进行了优化。

本实验分别采用MAA和4-VP作为功能单体合成了MIP1和MIP3。实验结果表明：四种喹诺酮类抗生素在MIP1上的印迹因子均大于1.50，说明MIP1对模板分子及其结构类似物具有一定的特异性吸附能力；虽然由于NIP3制得的填充柱联入色谱系统后压力过大，导致无法求得MIP3的印迹因子数值，但四种喹诺酮类抗生素在MIP3上的容量因子均小于在MIP1上相应的值，且均在1.7以下，这说明4-VP作为功能单体合成的分子印迹聚合物对模板分子及其结构类似物的吸附能力很弱。以上现象是因为诺氟沙星分子3位上的羧基可与功能单体MAA上的羧基发生氢键作用，而4-VP分子不能与诺氟沙星分子产生较强的非共价作用。因此在以下的实验中以MAA作为功能单体。利用氟沙星分子3位上的羧基可与功能单体MAA上的羧基发生氢键作用来增强吸附能力。

功能单体与模板分子比例的优化

本发明在MAA用量固定为4mmol的情况下，采用不同摩尔量的模板分子合成了一系列分子印迹聚合物，并进行了色谱评价，结果如图2所示。

结果表明，印迹因子随着MAA比例的增大，呈现先增大后降低而后略有上升的趋势，且在模板分子与MAA的摩尔比为1︰4时，印迹因子达到最大值。这是因为MAA与模板分子之间是依靠非共价键作用的，这就决定了MAA比例的增大在一定程度上会增强模板分子与MAA之间的作用力；但同时MAA分子之间也会发生非共价的相互作用，MAA比例的增大会使这种作用增强，从而干扰模板分子与MAA之间的作用。因此只有在MAA与模板分子具有一恰当的比例时，两者的非共价作用才能达到最强，从而获得最优的特异性吸附能力。在本实验中，当MAA与诺氟沙星的摩尔比为4︰1时，所制备的分子印迹聚合物对模板分子及其结构类似物表现出强的特异性吸附能力。因此，在随后的实验中，MAA与模板分子的摩尔比固定为为4︰1，即MAA的用量为4mmol，模板分子的用量为0.32。

交联剂的用量和种类优化

EGDMA是分子印迹聚合物制备过程中最为常用的交联剂，但有文献采用TRIM作为交联剂。本实验通过色谱评价优化了交联剂的用量和种类，结果如图3所示。

结果表明，随着EGDMA的用量的增大，印迹因子先增大后降低，在EGDMA为10mmol时达到最大值。这说明交联剂的用量是分子印迹聚合物特异性吸附能力的重要影响因素，这是因为交联剂的用量可以影响聚合物的交联情况，从而影响三维孔穴的形成。实验还研究了交联剂种类对印迹因子的影响，使用10mmol TRIM和10mmol EGDMA作为交联剂分别制备了MIP11和MIP5，四种喹诺酮类抗生素(诺氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、双氟沙星)在MIP11上的印迹因子分别为1.186、1.255、1.157、1.058，明显小于在MIP5上相应的印迹因子，这表明MIP5的特异性吸附能力优于MIP11。因此，交联剂的优化结果为10mmol EGDMA。

分子印迹聚合物的制备条件如功能单体、交联剂等会影响聚合物对模板分子的特异性吸附能力，因此需要对制备条件进行优化。本实验中通过印迹因子的高低来判断分子印迹聚合物特异性吸附能力的优劣，分子印迹聚合物具有较高印迹因子说明其制备条件有利于获得更优的特异性吸附能力。

表1：模板、单体、引发剂、交联剂和致孔剂的量的优化

表2：不同合成条件下分子印迹聚合物对不同抗生素的印迹因子

从表1和表2可以看出，MIP1、MIP2优化了致孔剂的种类对分子印迹聚合物印迹因子的影响，可以看出在选择纯甲醇为致孔剂时，合成的分子印迹聚合物对不同抗生素的印迹因子较以甲醇乙腈混合溶液为致孔剂时为大；对比MIP1和MIP3，可以看出MAA更适合作为本实验分子印迹聚合物合成的模板；MIP1、MIP4-MIP7研究了模板量对分子印迹聚合物印迹因子的影响，可以看出在模板用量为0.32mmoL时，聚合物的印迹因子最佳；MIP5、MIP8-MIP10研究了交联剂的用量对分子印迹聚合物印迹因子的影响，可以看出在MIP5，即交联剂用量为10mmoL的条件下，合成的分子印迹聚合物对不同抗生素的分离度较大；对比MIP5和MIP10可以看出，交联剂EGDMA与TRIM相比更适合本实验中分子印迹聚合物的合成。因此合成条件选择为60mL纯甲醇体系，0.32mmoL模板分子，4mmoLMAA为单体，10mmoL EGDMA为交联剂，在40mg引发剂AIBN的引发下进行合成。

实施例2

喹诺酮类抗生素残留的检测

为了获取快速、有效地检测喹诺酮类抗生素的分子印记聚合物，本申请的发明人利用不同类型的喹诺酮抗生素进行了数千次的实验，在实施例1中方法的基础上变换条件，制备了包括：氧氟沙星、环丙沙星、沙拉氟沙星、双氟沙星为模板的分子印记聚合物，发现只有诺氟沙星为模板的分子印记聚合物对这一类氟喹诺酮类抗生素具有较好的吸附性和分离度。而其他物质作为模板分子时，均不能得到较好的吸附性和分离度。分离度是在线检测评价分子印记聚合物选择性效果的指标，分离度越高说明分子印迹聚合物对不同物质的选择性越好。

检测过程：

本发明利用两台Agilent-l200系列高效液相色谱(PaloAlto,eA,UsA),一个77251进样阀，一个10mL的定量环，一个六通阀，自行搭建一台分子印迹固相萃取一HPLC/MS/MS联用系统(实验装置见图4)。以Restek C18柱(150mm×2.l mm i.d，particle sizes 5μm)作为分析柱。在不锈钢管(4.6mm×10mm)内湿法填充分子印迹聚合物以作为固相萃取柱。其中泵A用于分子印迹固相萃取柱的活化、进样和淋洗；泵B用于分子印迹固相萃取柱的洗脱及其随后的色谱分离。

分别从市场采购若干蜂蜜、鱼肉样品对其进行标注，制成加标样品。

利用自动分析系统进行样品的抗生素残留分析检测，检测结果如下：

表3：不同模板分子印记聚合物对同类物质的分离度

从上面的数据可以看出，本发明的以诺氟沙星为模板分子制备的分子印迹聚合物相比于其他抗生素作为模板分子的分子印迹聚合物具有显著更高的印迹因子。印迹因子是分子印迹聚合物分离能力的体现，反应了同等条件下MIP与NIP对目标物吸附能力的比值，印迹因子越大，MIP与NIP对目标物的吸附能力差别越大，所合成的聚合物对目标物的选择性也就越大，大的印迹因子使得分子印迹聚合物物在后续的实际应用中具有更强的抗干扰能力，能够更好的吸附所要检测的目标物。本发明的分子印迹聚合物可以用于有效地、准确地检测出食物中抗生素痕量残留。而本申请人在利用其他模板分子制备的分子印迹聚合物进行检测时，由于吸附性和分离度不够，检测结果无法使用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的保护范围之内。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

Claims (7)

1.一种高选择性喹诺酮类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

步骤1)、在容器中加入第一预定量的致孔剂；

步骤2)、将第二预定量的模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶于所述致孔剂中，获得相应混合溶液；

步骤3)、对所获得的混合溶液进行超声脱气，持续第一预定时间；

步骤4)、对脱气后的混合物进行通氮处理，持续第二预定时间；

步骤5)、对所述容器进行密封；

步骤6)、将所述容器置于第一预定温度环境中；

步骤7)、对容器内的混合物进行持续搅拌；

步骤8)、过滤并收集容器中生成的聚合物微粒。

2.根据权利要求1所述的高选择性喹诺酮类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：

步骤9)、利用有机溶剂对所述聚合物微粒进行索氏提取；

步骤10)、对所得产物进行甲醇式提取。

3.根据权利要求2所述的高选择性喹诺酮类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：

步骤11)、在恒温条件下对所得产物进行恒温干燥处理。

4.根据权利要求2所述的高选择性喹诺酮类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述致孔剂为甲醇或甲醇与乙腈的混合溶液。

5.根据权利要求2所述的高选择性喹诺酮类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述功能单体包括：甲基丙烯酸(Methacrylic acid，MAA)或4-乙烯吡啶(4-Vinylpyridine，4-VP)。

6.根据权利要求1所述的高选择性喹诺酮类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述第一预定温度为50-70℃。

7.一种快速检测食品中痕量喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1)、填充分子印迹在线萃取钢柱；

步骤2)、以适当溶剂提取食品样本中的喹诺酮类抗生素；

步骤3)、提取液过在线分子印迹萃取钢柱；

步骤4)、在线淋洗；

步骤5)、在线洗脱；

步骤6)、液相色谱-质谱分析。