CN101397163B - 利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，步骤为：将模板分子四环素、功能单体甲基丙烯酸、介导印迹的金属离子和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯混合溶解到致孔剂中，加入引发剂，封口，将合成的聚合物搅碎后，除去微细的颗粒，通过萃取除去模板分子，将除去模板分子的聚合物干燥过夜，获得四环素的分子印迹聚合物；将四环素分子印迹聚合物填充到固相萃取柱管中；对固相萃取柱活化和预处理，加入KH₂PO₄处理后的尿样，经过淋洗固相萃取柱，即洗脱、净化四环素。本发明具有高选择性、高特异性、耐不良环境和能够直接在水环境中使用的优点。

Description

利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物化学工程技术领域的方法，具体的说，是一种利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法。

背景技术

四环素(Tetracycline，简称TC)属于四环素类抗生素，是一种广泛使用的人畜共用的药物，常被用于治疗和预防传染性疾病或作为饲料添加剂促进动物生长。如果使用不当会造成残留。对人，畜，环境造成损伤或污染。长期食用四环素超标的动物性食品，对人体会产生直接的毒副作用和引起过敏反应。为了保证人民的身体健康，世界各国，如欧盟、日本、美国和我国农业部，对四环素的使用和残留都做了严格的规定并制定了相应的标准，其中欧盟对动物性食品及不同组织中规定的限量不同，如牛奶中最高不能高于100ppm。同时，由于牛奶、血液、尿液等生物样品及被四环素污染的河水、废水等环境样品中的水含量很高。因此，开发兼容水环境且灵敏的检测方法，对分析痕量存在的四环素十分必要。由于动物性食品和环境样品的基质复杂，所以有必要进行前处理，从而提高检测的灵敏度。

目前通用的前处理方法有液液分配、固相萃取、免疫柱层析技术等，其中固相萃取技术因为操作简单，节约试剂，可同时处理多个样品而得到广泛应用。但是由于目前常用的固相萃取填料与目标物的吸附作用都是非特异的，固定相的选择性低，易受复杂基质的干扰，限制了该项技术的发展。分子印迹技术是基于分子识别基础上的一种功能聚合物制备技术，该聚合物合成时采用目的分子或者类似物作为模板，合成后将模板洗脱，内部保留和目的分子互补的空间结构和基团，且具有“记忆”功能，可特异的和模板分子发生作用，并通过相应的方式洗脱，从而达到纯化和富集目的分子的作用。由于分子印迹聚合物是采用化学方法合成的，具有抵抗酸碱等恶劣环境的优点，可重复使用，所以应用越来越广泛。不过，很多用非共价聚合的方法开发出来的分子印迹聚合物在水环境中的兼容性比较低。如何在含水丰富的样品中使用分子印迹聚合物，以便直接净化提取生物和环境样品中的目标分析物，是分子印迹技术应用研究方面的重要课题。

经对现有技术文献的检索发现，R.Suedee等在《Journal of ChromatographyB》(2004，811，191-200)上发表的文章“Use of molecularly imprinted polymersfrom a mixture of tetracycline and its degradation products to produceaffinity membranes for the removal of tetracycline from water”(将四环素及其降解产物印迹的分子印迹聚合物用于制备亲和性膜)合成了四环素分子印迹聚合物并尝试将其作为亲和膜中的识别材料进行了评价。这项研究首次证明，以四环素类抗生素作为模板分子制备的分子印迹聚合物，可以从水中特异性的分离吸附相应的抗生素。但是该文章的印迹聚合物是在不含水的有机溶剂中制备的，并且只是从理论上探索水溶液中的PH值、离子强度等因素对亲和吸附的影响，并没有记载合成的材料应用到样品的前处理方面。Yan HY等在《Talanta》(2008；75：227-232.)上发表的“Water-compatible molecularly imprintedpolymers for selective extraction of ciprofloxacin from human urine”中，于甲醇和水的混合物中制备了能从人的尿液中选择性提取喹诺酮类抗生素环丙沙星的分子印迹聚合物。但是该文章介绍的方法依赖于模板抗生素的物理化学特性，未见适用于其它抗生素分子印迹聚合物的报道。在含水样品中的抗生素检测和处理方面，到目前为止还没有报道涉及金属离子介导的分子印迹聚合物。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用分子印迹聚合物净化含水样品中四环素的方法，从而弥补在四环素残留的检测过程中，现有的技术在环境及生物样品前处理方面存在的弊端，简单、快速、特异、高效的纯化和富集痕量四环素，提高现有检测的灵敏度。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明首先制备四环素分子印迹聚合物，然后将四环素分子印迹聚合物填充到固相萃取柱管中，得到四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱，在应用四环素分子印迹固相萃取小柱纯化、富集尿液中的四环素残留。

本发明包括如下步骤：

第一步，制备四环素分子印迹聚合物

①将模板分子四环素、功能单体甲基丙烯酸(MAA)、介导印迹的金属离子和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，按模板分子：金属离子：功能单体：交联剂摩尔比＝1：1～5：2～10：20，混合溶解到致孔剂中，加入引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)，混合溶解后，体系置于安培瓶中，充入氮气，然后在氮气气氛下封口，60～70℃热引发聚合反应24～48小时；

所述金属离子为Mg²⁺，Fe²⁺，Cu²⁺中一种。

所述四环素和致孔剂的用量为：当模板分子为0.1mmol时，致孔剂的体积为4～7ml。

所述致孔剂为甲醇和水的混合溶液，两者体积比为9：1～3。

②将合成的聚合物搅拌分散后，得到粒径在0.1～1.5μm之间的颗粒，除去微细的颗粒；最后通过索氏萃取进一步除去模板分子；

所述索氏萃取，其条件为：萃取剂采用甲醇、醋酸混合液，二者的体积比为9：1～8：2，萃取时间为24～72小时，萃取分三次完成，每次8小时以上；最后用纯甲醇萃取1～2次，除去剩余的醋酸。

③将除去模板分子的聚合物干燥过夜，获得四环素的分子印迹聚合物。

所述干燥，其温度为60℃。

通过以上步骤，获得的分子印迹聚合物为直径在1.0μm左右的球状颗粒。在含水丰富的环境中，实验测得该聚合物能特异性吸附四环素，每克聚合物理论上的最大吸附量为4.1毫克四环素。并且适合用作固相萃取的填料，与已有的检测方法(如ELISA、HPLC等)相结合，能够处理含水丰富的生物样品(如尿样)，并获得较高的回收率。不但有效地净化了基质，而且富集了目标分析物，显著提高四环素残留的检测灵敏度和检测效率。

第二步，将四环素分子印迹聚合物填充到固相萃取柱管中，得到四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱；

所述的填充到固相萃取柱管，是指：用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和筛板，称量四环素分子印迹聚合物50mg～150mg，用乙醇匀浆后，填充于商品化的1ml～6ml聚丙烯固相萃取小柱内。

所述的填充到固相萃取柱管，在抽真空状态下，将匀浆液装入聚丙烯固相萃取小柱，填料的顶端和底端分别装上聚乙烯筛板。

所述的筛板，其孔径为0.5μm。

第三步，先后用乙腈、乙酸、HCl、双蒸水、FeSO₄对四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱活化预处理，加入KH₂PO₄处理后的尿样，经过淋洗固相萃取柱，即能洗脱、净化和收集四环素。

所述的对四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱活化，是指用5～10ml乙腈、乙酸、HCl，5～10ml双蒸水，1～2mlFeSO₄对固相萃取柱预处理，其中乙腈、乙酸、HCl体积比为8:1:1，HCl浓度为1.0mol L^-1，FeSO₄浓度为0.25mmol L^-1。

所述的加入KH₂PO₄处理后的尿样，是指9ml尿液用约1ml的0.2molL^-1 KH₂PO₄处理后，加入其中的1～10ml。

所述的淋洗，是指用1～3ml的体积浓度为80％的甲醇淋洗四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱。

所述的洗脱，是指用2～3ml乙腈、乙酸、HCl的混合液，乙腈、乙酸、HCl体积比为8:1:1，其中HCl浓度为1.0mol L^-1。

本发明中，合成的四环素分子印迹聚合物是一种细小颗粒，内部具有和模板分子相互补的基团，具有“记忆“功能，所以对模板分子具有很高的特异性和选择性。本发明采用制备的四环素分子印迹聚合物作为固相萃取小柱的填料可以用于生物样品和水溶液中实际样品的前处理实践，从而实现对干扰检测的动物基质的去除，富集痕量残留的四环素，提高检测的灵敏度。本发明所述的方法具有特异性好，容量高的特点，回收率大于80％。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

一.四环素分子印迹聚合物的制备：

将四环素模板0.1mmol、功能单体甲基丙烯酸(MAA)、介导印迹的FeSO₄和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，按1：1：4：20摩尔比混合，溶解到4.5ml致孔剂(甲醇：水＝9：1)中，置入安培瓶中，加入引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)10mg；超声5分钟，然后冲入氮气5分钟，在氮气保护下封口，60℃水浴24小时，得四环素分子印迹聚合物。取出团状聚合物，加入乙醇用玻璃棒搅碎，洗涤得0.1～1.5μm颗粒，用丙酮悬浮弃去过细微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10％醋酸)索氏抽提72小时去除模板，中间每隔8小时换一次液。脱液经HPLC测定洗脱完全后，60℃烘干24小时备用。

二.四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱的制备：

首先用甲醇冲洗固相萃取小柱和筛板，将合成的分子印迹聚合物100mg用甲醇匀浆，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱体积为3ml，在抽真空状态下压紧填料，最后加上聚乙烯筛板。

三.应用四环素分子印迹固相萃取小柱纯化、富集尿液中的四环素残留

先后用10ml乙腈/乙酸/1.0mol L^-1 HCl(8:1:1，v/v/v)，5ml双蒸水，1ml0.25mmolL^-1 FeSO₄对固相萃取柱活化预处理，注意不要抽干。加入2ml KH₂PO₄处理后的样品，用1.5ml甲醇(80％)淋洗小柱，抽干，然后用3ml乙腈/乙酸/1.0mol L^-1 HCl(8:1:1，v/v/v)的混合液洗脱四环素。洗脱液用0.22um的滤器过滤后，5mol L^-1 NaOH调节pH至2.0以上，以氮气吹干后重新溶解于200μl流动相，取样品20ul上样，用HPLC分离样品并通过紫外检测器检测样品中四环素的浓度。

本发明合成的分子印迹聚合物可以特异的识别四环素，采用本发明所述的方法可以用于含水样品中四环素的分离，净化和富集。对尿液中添加四环素200μg/g标准样品的回收率为90.9％，对其它类药物无特异性吸附。

实施例2：

一.四环素分子印迹聚合物的制备：

将四环素模板0.1mmol、功能单体甲基丙烯酸(MAA)、介导印迹的FeSO₄和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，按1：2：6：20摩尔比混合，溶解到5ml致孔剂(甲醇：水＝9：1)中，置入安培瓶中，加入引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)10mg；超声5分钟，然后冲入氮气5分钟，在氮气保护下封口，60℃水浴24小时，得四环素分子印迹聚合物。取出团状聚合物，加入乙醇用玻璃棒搅碎，洗涤得0.1～1.5μm颗粒，用丙酮悬浮弃去过细微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10％醋酸)索氏抽提64小时去除模板，中间每隔8小时换一次液。脱液经HPLC测定洗脱完全后，60℃烘干24小时备用。

二.四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱的制备：

首先用甲醇冲洗固相萃取小柱和筛板，将合成的分子印迹聚合物150mg用甲醇匀浆，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱体积为6ml，在抽真空状态下压紧填料，最后加上聚乙烯筛板。

三.应用四环素分子印迹固相萃取小柱纯化、富集尿液中的四环素残留

先后用6ml乙腈/乙酸/1.0mol L^-1HCl(8:1:1，v/v/v)，7ml双蒸水，1.5ml0.25mmol L^-1 FeSO₄对固相萃取柱活化预处理，注意不要抽干。加入5ml KH₂PO₄处理后的样品，用2.0ml甲醇(80％)淋洗小柱，抽干，然后用2ml乙腈/乙酸/1.0mol L^-1 HCl(8:1:1，v/v/v)的混合液洗脱四环素。洗脱液用0.22um的滤器过滤后，5mol L^-1 NaOH调节pH至2.0以上，以氮气吹干后重新溶解于200μl流动相，取样品20ul上样，用HPLC分离样品并通过紫外检测器检测样品中四环素的浓度。

本实施例效果为，采用本实施例所述的材料和方法对尿液中添加四环素100μg/g标准样品的回收率为89.1％，对其它类药物无特异性吸附。

实施例3：

一.四环素分子印迹聚合物的制备：

将四环素模板0.1mmol、功能单体甲基丙烯酸(MAA)、介导印迹的FeSO₄和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，按1：2：8：20摩尔比混合，溶解到6ml致孔剂(甲醇：水＝9：1)中，置入安培瓶中，加入引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)10mg；超声5分钟，然后冲入氮气5分钟，在氮气保护下封口，60℃水浴36小时，得四环素分子印迹聚合物。取出团状聚合物，加入乙醇用玻璃棒搅碎，洗涤得0.1～1.5μm颗粒，用丙酮悬浮弃去过细微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10％醋酸)索氏抽提72小时去除模板，中间每隔8小时换一次液。脱液经HPLC测定洗脱完全后，60℃烘干24小时备用。

二.四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱的制备：

首先用甲醇冲洗固相萃取小柱和筛板，将合成的分子印迹聚合物100mg用甲醇匀浆，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱体积为3ml，在抽真空状态下压紧填料，最后加上聚乙烯筛板。

三.应用四环素分子印迹固相萃取小柱纯化、富集尿液中的四环素残留

先后用9ml乙腈/乙酸/1.0mol L^-1 HCl(8:1:1，v/v/v)，5ml双蒸水，1.2ml0.25mmol L^-1 FeSO₄对固相萃取柱活化预处理，注意不要抽干。加入10ml KH₂PO₄处理后的样品，用1.5ml甲醇(80％)淋洗小柱，抽干，然后用3ml乙腈/乙酸/1.0mol L^-1 HCl(8:1:1，v/v/v)的混合液洗脱四环素。洗脱液用0.22um的滤器过滤后，5mol L^-1 NaOH调节pH至2.0以上，以氮气吹干后重新溶解于200μl流动相，取样品20ul上样，用HPLC分离样品并通过紫外检测器检测样品中四环素的浓度。

本实施例效果为，采用本实施例所述的材料和方法对尿液中添加四环素50μg/g标准样品的回收率为86.2％，对其它类药物无特异性吸附。

实施例4：

一.四环素分子印迹聚合物的制备：

将四环素模板0.1mmol、功能单体甲基丙烯酸(MAA)、介导印迹的FeSO₄和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，按1：2：7：20摩尔比混合，溶解到6.5ml致孔剂(甲醇：水＝9：1)中，置入安培瓶中，加入引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)10mg；超声5分钟，然后冲入氮气5分钟，在氮气保护下封口，60℃水浴24小时，得四环素分子印迹聚合物。取出团状聚合物，加入乙醇用玻璃棒搅碎，洗涤得0.1～1.5μm颗粒，用丙酮悬浮弃去过细微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10％醋酸)索氏抽提56小时去除模板，中间每隔8小时换一次液。脱液经HPLC测定洗脱完全后，60℃烘干24小时备用。

二.四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱的制备：

首先用甲醇冲洗固相萃取小柱和筛板，将合成的分子印迹聚合物90mg用甲醇匀浆，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱体积为3ml，在抽真空状态下压紧填料，最后加上聚乙烯筛板。

三.应用四环素分子印迹固相萃取小柱纯化、富集尿液中的四环素残留

先后用7ml乙腈/乙酸/1.0mol L^-1 HCl(8:1:1，v/v/v)，8ml双蒸水，1.0ml0.25mmol L^-1 FeSO₄对固相萃取柱活化预处理，注意不要抽干。加入10ml KH₂PO₄处理后的样品，用1.5ml甲醇(80％)淋洗小柱，抽干，然后用2ml乙腈/乙酸/1.0mol L^-1 HCl(8:1:1，v/v/v)的混合液洗脱四环素。洗脱液用0.22um的滤器过滤后，5mol L^-1 NaOH调节pH至2.0以上，以氮气吹干后重新溶解于200μl流动相，取样品20ul上样，用HPLC分离样品并通过紫外检测器检测样品中四环素的浓度。

本实施例效果为，采用本实施例所述的材料和方法对尿液中添加四环素40μg/g标准样品的回收率为85.3％，对其它类药物无特异性吸附。

实施例5：

一.四环素分子印迹聚合物的制备：

将四环素模板0.1mmol、功能单体甲基丙烯酸(MAA)、介导印迹的FeSO₄和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，按1：1：8：20摩尔比混合，溶解到5ml致孔剂(甲醇：水＝9：1)中，置入安培瓶中，加入引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)10mg；超声5分钟，然后冲入氮气5分钟，在氮气保护下封口，60℃水浴36小时，得四环素分子印迹聚合物。取出团状聚合物，加入乙醇用玻璃棒搅碎，洗涤得0.1～1.5μm颗粒，用丙酮悬浮弃去过细微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10％醋酸)索氏抽提72小时去除模板，中间每隔8小时换一次液。脱液经HPLC测定洗脱完全后，60℃烘干24小时备用。

二.四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱的制备：

首先用甲醇冲洗固相萃取小柱和筛板，将合成的分子印迹聚合物80mg用甲醇匀浆，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱体积为3ml，在抽真空状态下压紧填料，最后加上聚乙烯筛板。

三.应用四环素分子印迹固相萃取小柱纯化、富集尿液中的四环素残留

先后用8ml乙腈/乙酸/1.0mol L^-1 HCl(8:1:1，v/v/v)，8ml双蒸水，1.0ml0.25mmol L^-1 FeSO₄对固相萃取柱活化预处理，注意不要抽干。加入10ml KH₂PO₄处理后的样品，用1.5ml甲醇(80％)淋洗小柱，抽干，然后用3ml乙腈/乙酸/1.0mol L^-1 HCl(8:1:1，v/v/v)的混合液洗脱四环素。洗脱液用0.22um的滤器过滤后，5molL^-1 NaOH调节pH至2.0以上，以氮气吹干后重新溶解于200μl流动相，取样品20ul上样，用HPLC分离样品并通过紫外检测器检测样品中四环素的浓度。

本实施例效果为，采用本实施例所述的材料和方法对尿液中添加四环素20μg/g标准样品的回收率为84.2％，对其它类药物无特异性吸附。

Claims (10)

1.一种利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，制备四环素分子印迹聚合物

①，将模板分子四环素、功能单体甲基丙烯酸、介导印迹的金属离子和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，按模板分子：金属离子：功能单体：交联剂摩尔比＝1∶1～5∶2～10∶20，混合溶解到致孔剂中，加入引发剂偶氮二异丁腈，混合溶解后，体系置于安培瓶中，充入氮气，然后在氮气气氛下封口，60～70℃热引发聚合反应，其中金属离子为Mg²⁺，Fe²⁺，Cu²⁺中一种；

②，将合成的聚合物搅拌分散后，得到粒径在0.1～1.5μm之间的颗粒，除去微细的颗粒，最后通过索氏萃取进一步除去模板分子；

③，将除去模板分子的聚合物干燥过夜，获得四环素的分子印迹聚合物；

第二步，将四环素分子印迹聚合物填充到固相萃取柱管中，得到四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱；

第三步，先后用乙腈、乙酸、HCl三者的混合液、双蒸水、FeSO₄对四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱活化预处理，加入KH₂PO₄处理后的尿样，经过淋洗四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱，即能洗脱、净化和收集四环素。

2.根据权利要求1所述的利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，其特征是，第一步中，所述四环素和致孔剂的用量为：当模板分子为0.1mmol时，致孔剂的体积为4～7ml，其中所述致孔剂为甲醇和水的混合溶液，甲醇和水体积比为9∶1～3。

3.根据权利要求1所述的利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，其特征是，第一步中，所述索氏萃取，其条件为：萃取剂采用甲醇、醋酸混合液，二者的体积比为9∶1～8∶2，萃取时间为24～72小时。

4.根据权利要求1所述的利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，其特征是，第二步中，所述的填充到固相萃取柱管，是指：用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和筛板，称量四环素分子印迹聚合物50mg～150mg，用乙醇匀浆后，填充于商品化的1ml～6ml聚丙烯固相萃取小柱内。

5.根据权利要求1或4所述的利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，其特征是，所述的填充到固相萃取柱管，是在抽真空状态下，将匀浆液装入聚丙烯固相萃取小柱，填料的顶端和底端分别装上聚乙烯筛板。

6.根据权利要求5所述的利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，其特征是，所述的筛板，其孔径为0.5μm。

7.根据权利要求1所述的利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，其特征是，第三步中，所述的对四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱活化，是指用5～10ml乙腈、乙酸、HCl的混合液，5～10ml双蒸水，1～2mlFeSO₄对四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱预处理，其中乙腈、乙酸、HCl体积比为8∶1∶1，HCl浓度为1.0mol·L^-1，FeSO₄浓度为0.25mmol·L^-1。

8.根据权利要求1所述的利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，其特征是，第三步中，所述的加入KH₂PO₄处理后的尿样，是指9ml尿液用1ml的0.2mol·L^-1 KH₂PO₄处理后，加入其中的1～10ml。

9.根据权利要求1所述的利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，其特征是，第三步中，所述的淋洗，是指用1～3ml的体积浓度为80％的甲醇淋洗固相萃取柱。

10.根据权利要求1所述的利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，其特征是，第三步中，所述的洗脱，是指用2～3ml乙腈、乙酸、HCl的混合液，乙腈、乙酸、HCl体积比为8∶1∶1，其中HCl浓度为1.0mol·L^-1。