CN105223258A

CN105223258A - 阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱及使用方法

Info

Publication number: CN105223258A
Application number: CN201510604178.1A
Authority: CN
Inventors: 田一方; 陈冠华; 郭利辉; 梅晓芸; 洪月琴
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2015-09-22
Filing date: 2015-09-22
Publication date: 2016-01-06
Anticipated expiration: 2035-09-22
Also published as: CN105223258B

Abstract

本发明涉及固相萃取技术领域，特指一种阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱和使用方法，并和毛细管电泳方法结合用于选择性分离、富集和检测动物食品中链霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素和奈替米星的残留。

Description

阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱及使用方法

技术领域

背景技术

氨基糖苷类抗生素是在世界范围内被广泛使用的一类抗生素，除作为兽药用于治疗动物疾病外，它们还会作为饲料添加剂用于促进动物生长。其不合理使用可导致动物性食品中的残留，长期食用此类食品可能引起过敏、耳毒性、肾毒性、神经肌肉阻断以及皮疹、发热、血管神经性水肿及剥脱性皮炎等变态反应，严重者还可能引起过敏性休克等比较严重的毒副作用。由于氨基糖苷类抗生素的分子结构中没有强发色团，其在食品中的残留量利用最常见的紫外可见吸收方法无法获得足够的检测信号，往往需要在检测前进行适当富集，另外，在进行多残留色谱检测中，样品中大量共存基质特别容易污染色谱柱，还需要通过净化使基质得以去除，即使采用了没有柱污染问题的毛细管电泳方法，有些种类的样品由于基质复杂，其基质信号与分析物信号有可能发生重叠，影响到定量结果的准确性，同样需要对样品进行净化，因此，对于动物性食品中该类抗生素残留的检测来说，富集和净化是十分必要的。

固相萃取已被广泛用于兽药残留检测的样品前处理中，成为富集和净化的最常用方法之一。然而，固相萃取柱中使用的填料通常都是一些非特异选择性的吸附材料，在实际应用时，往往将干扰物质同时提取到样品中，影响检测结果；而且商用固相萃取柱多为一次性使用，增加了检测成本。分子印迹聚合物是为模板分子量身定做的高分子聚合物，对模板分子和其结构类似物具有高识别性，而且可重复使用多次，这些都是普通固相萃取填料所不能比拟的。目前报道的分子印迹固相萃取填料多采用单一模板分子合成，在用于同类兽药多残留，例如氨基糖苷类多残留的样品前处理时，该类兽药中的某些药物不能被这种单一模板的分子印迹固相萃取填料高效识别，致使在一次样品前处理过程中能够提取到的该类兽药的品种数受到制约，使该类兽药多残留的富集和净化处理效率降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱的制备和使用方法，与毛细管电泳多残留检测方法相结合，可实现对动物食品中链霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素和奈替米星残留的同时检测。

具体步骤如下：

1、阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述的固相萃取柱采用如下方法进行制备：

（1）将阿米卡星、链霉素和甲基丙烯酸按照0.95~1.05:1.05~0.95:8的摩尔比混合溶解于水和乙腈混合溶剂中，超声振荡至混合均匀后于室温下放置过夜，其中水、乙腈的体积（mL）与甲基丙烯酸量（mmol）的比值为5:35:1，按照阿米卡星、链霉素与乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为0.95~1.05:1.05~0.95:40的比例以及与偶氮二异丁腈摩尔比为0.95~1.05:1.05~0.95:3.65的比例将二者加入到上述溶液中超声振荡至混合均匀后，向装有溶液的容器通入氮气以去除氧气，保证聚合反应能够顺利进行，然后将容器置于58^°C-62^°C恒温水浴振荡器中在旋转条件下反应，制得聚合物微球，将聚合物微球置于索式提取器中，用乙酸-甲醇混合溶剂洗去模板分子，然后用甲醇清洗去除聚合物微球中残留的乙酸，最后放入真空干燥器中干燥至恒重，得到阿米卡星和链霉素双模板分子印迹聚合物微球。

（2）称取阿米卡星和链霉素双模板分子印迹聚合物微球，填充至底部装有筛板的空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实，制得阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱。

所述的在旋转条件下反应指在120-180rpm转速下反应20-24h，在20h聚合反应完毕，可以继续增加至24h，但对实验结果无影响，超过24h这个时间聚合物的吸附能力会有所下降。

所述的乙酸-甲醇混合溶剂指乙酸和甲醇按照体积比1:9混合得到的溶剂。

所述的阿米卡星和链霉素双模板分子印迹聚合物微球填充至底部装有筛板的空固相萃取柱中的填充的高度不低于12mm。

2、阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，按照下述步骤进行：

（1）将上述分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用乙腈、甲醇和水在负压状态下淋洗活化，并抽干淋洗溶剂，其中三种溶剂的体积比为1:1:1。

（2）使制备的以乙腈为溶剂的样品溶液在负压状态下连续通过固相萃取柱，抽干溶剂。

（3）以乙腈和甲醇的混合溶剂为淋洗剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态。

（4）以甲醇和水的混合溶剂作为洗脱剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂。

（5）将洗脱液用氮气吹干溶剂，用水溶解干渣并定容后供毛细管电泳检测。

3、毛细管电泳检测按照下述电泳条件进行。

运行缓冲液组成为180mmol/L三羟甲基氨基甲烷和300mmol/L1-戊烷磺酸钠，pH为9.1，使用前超声10min；分离电压12kV；进样量为6.9kPa×10s；检测波长200nm。

所述负压状态指-20kPa~-100kPa。

所述样品溶液采用如下步骤制备：

（1）称取20.0g经匀浆后的带有氨基糖苷类抗生素残留的鸭肉或牛奶，均匀分置于4个50mL聚乙烯离心管中或称取20.0g经匀浆后的没有氨基糖苷类抗生素残留的空白鸭肉或牛奶，加入5种氨基糖苷类抗生素混合标准溶液，使每种氨基糖苷类抗生素的加标量为0.05mg/kg，均匀分置于4个50mL聚乙烯离心管中。

（2）每管加入三氯乙酸15mL，涡旋混匀后置于恒温水浴振荡器中振摇30min，4000r/min下离心5min，取上清液，每管残渣再加入三氯乙酸15mL，重复上述操作，合并两次上清液于试管中，置于60^°C恒温水浴锅中蒸发至干，用乙腈溶解干渣并定容至1mL，经0.45μm滤膜过滤，共获得4mL鸭肉或牛奶样品溶液。

所述乙腈和甲醇的混合溶剂指乙腈和甲醇按照体积比3:1混合得到的溶剂，乙腈和甲醇混合溶剂的加入量应采用不使被测物质从柱中淋洗出来的最大用量，目的是使样品中共存的干扰物被最大程度地洗掉，而被测物没有在这一步产生损失，本发明中选择4~8mL。

所述甲醇和水的混合溶剂指甲醇和水按照体积比4:1混合得到的溶剂，甲醇和水混合溶剂的加入量应采用使被测物质从柱中完全洗脱出来的最小用量，目的是使样品中的被测物在这一步用最小的溶剂消耗即可被完全洗脱，本发明中选择10~12mL。

现有的氨基糖苷类分子印迹固相萃取柱材料均采用单一模板分子制备而成，对同为氨基糖苷类抗生素的某些非模板分子的药物特异吸附选择性不强，造成其在氨基糖苷类抗生素多残留检测样品前处理中可在一次处理过程中同时富集和净化的药物数受到限制，最终使整个分子印迹固相萃取前处理效率受到影响。为了解决单一模板分子印迹聚合物所存在的上述缺陷，本发明采用了一种双模板分子的沉淀聚合方法，制备出能对动物性食品中含有的链霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素和奈替米星残留同时进行高效富集和净化的印迹聚合物微球，微球粒径约为1.3μm，直接用该聚合物微球进行填充后所得的固相萃取柱重复使用10次后效能基本无下降；对氨基糖苷类抗生素中的多种药物都实现了高特异选择性识别，对同样浓度氨基糖苷类抗生素混合标准溶液吸附回收率的比较显示：链霉素由阿米卡星单模板印迹聚合物微球中的53.9%大幅提升至96.3%，卡那霉素和奈替米星由阿米卡星单模板印迹聚合物微球中的78.2%和71.9%大幅提升至93.7%和91.3%，有效提高了该类抗生素多残留富集和净化的效率；需要特别指出的是，虽然链霉素回收率的大幅提升是将链霉素作为第二模板引入聚合物微球后可以预期的一个效果，但卡那霉素和奈替米星回收率的大幅提升则是将链霉素作为第二模板引入聚合物微球后所取得的意想不到的好效果。

附图说明

图1为分别利用阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱(a)和商品ENVI^TM-18固相萃取柱(b)对加标鸭肉样品中5种氨基糖苷类抗生素进行富集和净化后的效果比较电泳图。

1.链霉素2.卡那霉素3.阿米卡星4.新霉素5.奈替米星。

具体实施方式

实施例1

一、阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱制备

A将阿米卡星(14.6mg)和链霉素(14.5mg)与甲基丙烯酸按照摩尔比为1:1:8的比例混合溶解于由1mL水和7mL乙腈组成的混合溶剂中，超声振荡5min，于室温下放置过夜，按照阿米卡星和链霉素与乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为1:1:40的比例以及与偶氮二异丁腈摩尔比为1:1:3.65的比例将二者加入到上述溶液中超声振荡5min，向装有溶液的容器通入氮气5min，然后将其置于60^°C恒温水浴振荡器中在150rpm转速下反应24h，制得聚合物微球，将聚合物微球置于索式提取器中，用体积比为1:9的乙酸-甲醇混合溶剂洗去模板分子，然后用甲醇清洗去除聚合物微球中残留的乙酸，最后放入真空干燥器中干燥至恒重。

B称取200mg上述阿米卡星和链霉素双模板分子印迹聚合物微球，填充至6mL底部装有筛板的空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实。

二、阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱用于加标鸭肉样品的富集和净化

A称取20.0g经匀浆后的空白鸭肉，均匀分置于4个50mL聚乙烯离心管中，加入5种氨基糖苷类抗生素混合标准溶液，使加标量为0.05mg/kg，每管加入三氯乙酸15mL，涡旋混匀20s，置于恒温水浴振荡器中振摇30min，4000rpm下离心5min，取上清液，每管残渣再加入三氯乙酸15mL，重复上述操作，合并两次上清液于试管中，置于60^°C恒温水浴锅中蒸发至干，用乙腈溶解干渣并定容至1mL，经0.45μm滤膜过滤，共获得4mL鸭肉样品溶液。

B将阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用5mL乙腈、5mL甲醇和5mL水在负压状态下淋洗活化，并抽干淋洗溶剂。

C使制备的样品溶液在负压状态下连续通过固相萃取柱，抽干溶剂。

D以5mL体积比为3:1的乙腈和甲醇的混合溶剂为淋洗剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态10min。

E以10mL体积比为4:1的甲醇和水的混合溶剂作为洗脱剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂。

F将洗脱液用氮气吹干溶剂，用水溶解干渣并定容至1mL后供毛细管电泳检测。

三、加标样品的毛细管电泳检测

A电泳条件：运行缓冲液组成为180mmol/L三羟甲基氨基甲烷和300mmol/L1-戊烷磺酸钠，pH为9.1，使用前超声10min；分离电压12kV；进样量为6.9kPa×10s；检测波长200nm。

B上述加标鸭肉样品氨基糖苷类抗生素的回收率分别为：链霉素89.6%，卡那霉素87.2%，阿米卡星90.6%，新霉素85.2%，奈替米星88.4%。

C上述加标鸭肉样品分别经阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱和商品ENVI^TM-18固相萃取柱富集和净化后的效果比较电泳图如附图1所示。

从附图1中可看出，用阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱对鸭肉样品的净化效果要明显优于商品ENVI^TM-18固相萃取柱，采用后者时存在于6min之前很宽的杂质峰以及奈替米星之后与之未基线分离的的杂质峰在采用前者时已全部消失。

实施例2

一、阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱制备

二、阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱用于加标牛奶样品的富集和净化

A称取20.0g空白牛奶，均匀分置于4个50mL聚乙烯离心管中，加入5种氨基糖苷类抗生素混合标准溶液，使加标量为0.05mg/kg，每管加入三氯乙酸15mL，涡旋混匀20s，置于恒温水浴振荡器中振摇30min，4000rpm下离心5min，取上清液，每管残渣再加入三氯乙酸15mL，重复上述操作，合并两次上清液于试管中，置于60^°C恒温水浴锅中蒸发至干，用乙腈溶解干渣并定容至1mL，经0.45μm滤膜过滤，共获得4mL牛奶样品溶液。

三、加标样品的毛细管电泳检测

B上述加标牛奶样品氨基糖苷类抗生素的回收率分别为：链霉素92.5%，卡那霉素90.8%，阿米卡星93.4%，新霉素88.3%，奈替米星90.1%。

Claims

1.阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述的固相萃取柱采用如下方法进行制备：

（1）将阿米卡星、链霉素和甲基丙烯酸按照0.95~1.05:1.05~0.95:8的摩尔比混合溶解于水和乙腈混合溶剂中，超声振荡至混合均匀后于室温下放置过夜，其中水、乙腈的体积（mL）与甲基丙烯酸量（mmol）的比值为5:35:1，按照阿米卡星、链霉素与乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为0.95~1.05:1.05~0.95:40的比例以及与偶氮二异丁腈摩尔比为0.95~1.05:1.05~0.95:3.65的比例将二者加入到上述溶液中超声振荡至混合均匀后，向装有溶液的容器通入氮气以去除氧气，保证聚合反应能够顺利进行，然后将容器置于58^°C-62^°C恒温水浴振荡器中在旋转条件下反应，制得聚合物微球，将聚合物微球置于索式提取器中，用乙酸-甲醇混合溶剂洗去模板分子，然后用甲醇清洗去除聚合物微球中残留的乙酸，最后放入真空干燥器中干燥至恒重，得到阿米卡星和链霉素双模板分子印迹聚合物微球；

2.如权利要求1所述的阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述的在旋转条件下反应指在120-180rpm转速下反应20-24h，在20h聚合反应完毕，可以继续增加至24h，但对实验结果无影响，超过24h这个时间聚合物的吸附能力会有所下降。

3.如权利要求1所述的阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述的乙酸-甲醇混合溶剂指乙酸和甲醇按照体积比1:9混合得到的溶剂。

4.如权利要求1所述的阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述的阿米卡星和链霉素双模板分子印迹聚合物微球填充至底部装有筛板的空固相萃取柱中的填充的高度不低于12mm。

5.如权利要求1所述的阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）将上述分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用乙腈、甲醇和水在负压状态下淋洗活化，并抽干淋洗溶剂，其中三种溶剂的体积比为1:1:1；

（2）使制备的以乙腈为溶剂的样品溶液在负压状态下连续通过固相萃取柱，抽干溶剂；

（3）以乙腈和甲醇的混合溶剂为淋洗剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态；

（4）以甲醇和水的混合溶剂作为洗脱剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂；

6.如权利要求5所述的阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于所述毛细管电泳检测按照下述电泳条件进行：运行缓冲液组成为180mmol/L三羟甲基氨基甲烷和300mmol/L1-戊烷磺酸钠，pH为9.1，使用前超声10min；分离电压12kV；进样量为6.9kPa×10s；检测波长200nm。

7.如权利要求5所述的阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于：所述负压状态指-20kPa~-100kPa。

8.如权利要求5所述的阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于所述样品溶液采用如下步骤制备：

（1）称取20.0g经匀浆后的带有氨基糖苷类抗生素残留的鸭肉或牛奶，均匀分置于4个50mL聚乙烯离心管中或称取20.0g经匀浆后的没有氨基糖苷类抗生素残留的空白鸭肉或牛奶，加入5种氨基糖苷类抗生素混合标准溶液，使每种氨基糖苷类抗生素的加标量为0.05mg/kg，均匀分置于4个50mL聚乙烯离心管中；

9.如权利要求5所述的阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于：所述乙腈和甲醇的混合溶剂指乙腈和甲醇按照体积比3:1混合得到的溶剂，乙腈和甲醇混合溶剂的加入量应采用不使被测物质从柱中淋洗出来的最大用量，目的是使样品中共存的干扰物被最大程度地洗掉，而被测物没有在这一步产生损失，选择4~8mL。

10.如权利要求5所述的阿米卡星和链霉素双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于：所述甲醇和水的混合溶剂指甲醇和水按照体积比4:1混合得到的溶剂，甲醇和水混合溶剂的加入量应采用使被测物质从柱中完全洗脱出来的最小用量，目的是使样品中的被测物在这一步用最小的溶剂消耗即可被完全洗脱，选择10~12mL。