CN105233809B - 一种双模板分子印迹固相萃取柱及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及固相萃取技术领域，特指一种苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱和使用方法，并和毛细管电泳方法结合用于选择性分离、富集和检测动物食品中阿莫西林、头孢氨苄、苯唑西林、青霉素G、头孢唑林钠和头孢哌酮钠的残留。

Description

一种双模板分子印迹固相萃取柱及使用方法

技术领域

本发明涉及固相萃取技术领域，特指一种苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱和使用方法，并和毛细管电泳方法结合用于选择性分离、富集和检测动物食品中阿莫西林、头孢氨苄、苯唑西林、青霉素G、头孢唑林钠和头孢哌酮钠的残留。

背景技术

β-内酰胺类抗生素是在世界范围内被广泛使用的一类抗生素，在奶牛养殖业中由于其治疗牛乳房炎有显著疗效而被经常使用；由于使用方法不当或不遵守休药期规定都可导致其在牛奶中的残留，经常饮用此类牛奶可能引起过敏体质者的过敏反应，还可能破坏人体正常菌群的平衡，导致耐药菌的产生；在β-内酰胺类抗生素残留检测时，低残留量往往需要在检测前进行适当富集；另外，在进行多残留色谱检测中，样品中大量共存基质特别容易污染色谱柱，还需要通过净化使基质得以去除，即使采用了没有柱污染问题的毛细管电泳方法，样品由于基质复杂，其基质信号与分析物信号有可能发生重叠，影响到定量结果的准确性，同样需要对样品进行净化，因此，对于动物性食品中该类抗生素残留的检测来说，富集和净化是十分必要的。

固相萃取已被广泛用于兽药残留检测的样品前处理中，成为富集和净化的最常用方法之一，然而，固相萃取柱中使用的填料通常都是一些非特异选择性的吸附材料，在实际应用时，往往将干扰物质同时提取到样品中，影响检测结果；而且商用固相萃取柱多为一次性使用，增加了检测成本；分子印迹聚合物是为模板分子量身定做的高分子聚合物，对模板分子和其结构类似物具有高识别性，而且可重复使用多次，这些都是普通固相萃取填料所不能比拟的；目前报道的分子印迹固相萃取填料多采用单一模板分子合成，在用于同类兽药多残留，例如β-内酰胺类多残留的样品前处理时，该类兽药中的某些药物不能被这种单一模板的分子印迹固相萃取填料高效识别，致使在一次样品前处理过程中能够提取到的该类兽药的品种数受到制约，使该类兽药多残留的富集和净化处理效率降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱的制备和使用方法，与毛细管电泳多残留检测方法相结合，可实现对牛奶中阿莫西林、头孢氨苄、苯唑西林、青霉素G、头孢唑林钠和头孢哌酮钠残留的同时检测。

具体步骤如下：

1、一种苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述的固相萃取柱采用如下方法进行制备：

（1）将苯唑西林、头孢氨苄和丙烯酰胺按照0.95~1.05:1.05~0.95:8的摩尔比混合溶解于甲醇中，超声振荡至混合均匀后于室温下放置过夜，其中甲醇的体积（mL）与丙烯酰胺量（mmol）的比值为125:1，按照苯唑西林、头孢氨苄与乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为0.95~1.05:1.05~0.95:40的比例以及与偶氮二异丁腈摩尔比为0.95~1.05:1.05~0.95:0.91的比例将二者加入到上述溶液中超声振荡至混合均匀后，向装有溶液的容器通入氮气以去除氧气，保证聚合反应能够顺利进行，然后将密封的容器置于58~62^°C恒温水浴锅中反应20~24h，制得聚合物微球，将聚合物微球置于索式提取器中，用甲醇-乙酸混合溶剂洗去模板分子后放入真空干燥器中干燥至恒重，得到苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹聚合物微球。

（2）称取苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹聚合物微球，填充至底部装有筛板的空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实，制得苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱。

所述甲醇-乙酸混合溶剂指甲醇和乙酸按照体积比9:1混合得到的溶剂。

所述苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹聚合物微球填充至底部装有筛板的空固相萃取柱中的填充的高度不低于12mm。

2、苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，按照下述步骤进行：

（1）将上述分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用乙腈、甲醇和水在负压状态下淋洗活化，并抽干淋洗溶剂，其中三种溶剂的体积比为1:1:1。

（2）将用乙腈-甲醇样品溶剂制备的样品溶液在负压状态下连续通过固相萃取柱，抽干溶剂。

（3）用乙腈-甲醇淋洗剂在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态。

（4）用甲醇-乙酸洗脱剂在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂。

（5）将洗脱液旋转蒸发至干，用水溶解干渣并定容后供毛细管电泳检测。

3、毛细管电泳检测按照下述电泳条件进行：

运行缓冲液组成为20mmol/L磷酸盐和22mmol/L十二烷基硫酸钠，pH为6.7，使用前超声10 min；分离电压20 kV；进样量为1.47kPa×10s；检测波长200nm。

所述负压状态指-20kPa~-100kPa。

所述样品溶液采用如下步骤制备：

（1）称取20.0g带有β-内酰胺类抗生素残留的牛奶，均匀分置于4个50mL聚乙烯离心管中或称取20.0g空白牛奶（没有β-内酰胺类抗生素残留），加入6种β-内酰胺类抗生素混合标准溶液；使每一种β-内酰胺类抗生素加标量都为0.05mg/kg，均匀分置于4个50mL聚乙烯离心管中。

（2）每管加入乙腈20mL，置于恒温水浴振荡器中振摇20min，4000rpm下离心10min，取上清液，每管残渣再加入乙腈10mL，重复上述操作，合并两次上清液于分液漏斗中；加入5mL乙腈饱和的正己烷，振摇2min，弃去上清液，重复3次后将下层溶液旋转蒸发至干，用乙腈-甲醇上样溶剂溶解干渣并定容至5mL，共获得20mL牛奶样品溶液。

所述乙腈-甲醇样品溶剂指乙腈和甲醇按照体积比4:1混合得到的溶剂。

所述乙腈-甲醇淋洗剂指乙腈和甲醇按照体积比1:1混合得到的溶剂，淋洗剂的加入量应采用不使被测物质从柱中淋洗出来的最大用量，目的是使样品中共存的干扰物被最大程度地洗掉，而被测物没有在这一步产生损失，本发明中选择4~8mL。

所述甲醇-乙酸洗脱剂指甲醇和乙酸按照体积比9:1混合得到的溶剂，洗脱剂的加入量应采用使被测物质从柱中完全洗脱出来的最小用量，目的是使样品中的被测物在这一步用最小的溶剂消耗即可被完全洗脱，本发明中选择5~8mL。

现有的β-内酰胺类分子印迹固相萃取柱材料均采用单一模板分子制备而成，对同为β-内酰胺类抗生素的某些非模板分子的药物特异吸附选择性不强，造成其在β-内酰胺类抗生素多残留检测样品前处理中可在一次处理过程中同时富集和净化的药物数受到限制，最终使整个分子印迹固相萃取前处理效率受到影响；为了解决单一模板分子印迹聚合物所存在的上述缺陷，本发明采用了一种双模板分子的沉淀聚合方法，制备出能对牛奶中含有的阿莫西林、头孢氨苄、苯唑西林、青霉素G、头孢唑林钠和头孢哌酮钠残留同时进行高效富集和净化的印迹聚合物微球，直接用该聚合物微球进行填充后所得的固相萃取柱重复使用10次后效能基本无下降；对β-内酰胺类抗生素中的多种药物都实现了高特异选择性识别，对同样浓度β-内酰胺类抗生素混合标准溶液吸附回收率的比较显示：头孢氨苄由苯唑西林单模板印迹聚合物微球中的48.5%大幅提升至98.1%，头孢哌酮钠由苯唑西林单模板印迹聚合物微球中的58.0%大幅提升至95.2%，有效提高了该类抗生素多残留富集和净化的效率；需要特别指出的是，虽然头孢氨苄回收率的大幅提升是将头孢氨苄作为第二模板引入聚合物微球后可以预期的一个效果，但头孢哌酮钠回收率的大幅提升则是将头孢氨苄作为第二模板引入聚合物微球后所取得的意想不到的好效果。

附图说明

图1为分别利用苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱(A)和商品HLB固相萃取柱(B)对加标牛奶样品中6种β-内酰胺类抗生素进行富集和净化后的效果比较电泳图。

1.阿莫西林 2.头孢氨苄 3.苯唑西林 4.青霉素G 5.头孢唑林钠 6.头孢哌酮钠。

具体实施方式

实施例1

一 苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱制备

A 将苯唑西林(41.9mg)和头孢氨苄(34.7mg)与丙烯酰胺按照摩尔比为1:1:8的比例混合溶解于100 mL甲醇中，超声振荡10min，于室温下放置过夜，按照苯唑西林和头孢氨苄与乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为1:1:40的比例以及与偶氮二异丁腈摩尔比为1:1:0.91的比例将二者加入到上述溶液中超声振荡10min，向装有溶液的容器通入氮气5min后密封容器，然后将其置于60^°C恒温水浴锅中反应24h，制得聚合物微球，将聚合物微球置于索式提取器中，用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶剂洗去模板分子后放入真空干燥器中干燥至恒重。

B称取200mg上述苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹聚合物微球，填充至6mL底部装有筛板的空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实。

二 苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱用于加标牛奶样品的富集和净化

A称取20.0g空白牛奶，均匀分置于4个50mL聚乙烯离心管中，加入6种β-内酰胺类抗生素混合标准溶液，使加标量为0.05mg/kg，每管加入乙腈20mL，置于恒温水浴振荡器中振摇20min，4000rpm下离心10min，取上清液，每管残渣再加入乙腈10mL，重复上述操作，合并两次上清液于分液漏斗中；加入5mL乙腈饱和的正己烷，振摇2min，弃去上清液，重复3次后将下层溶液旋转蒸发至干，用乙腈-甲醇样品溶剂溶解干渣并定容至5mL，共获得20mL牛奶样品溶液。

B将苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用10mL乙腈、10mL甲醇和10mL水在负压状态下淋洗活化，并抽干淋洗溶剂。

C使制备的样品溶液在负压状态下连续通过固相萃取柱，抽干溶剂。

D以5mL体积比为1:1的乙腈和甲醇的混合溶剂为淋洗剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态10min。

E以5mL体积比为9:1的甲醇和乙酸的混合溶剂作为洗脱剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂。

F将洗脱液旋转蒸发至干，用水溶解干渣并定容至1mL后供毛细管电泳检测。

三 加标样品的毛细管电泳检测

A电泳条件：运行缓冲液组成为20mmol/L磷酸盐和22mmol/L十二烷基硫酸钠，pH为6.7，使用前超声10 min；分离电压20 kV；进样量为1.47kPa×10s；检测波长200nm。

B上述加标牛奶样品β-内酰胺类抗生素的回收率分别为：阿莫西林85.9%，头孢氨苄96.7%，苯唑西林95.1%，青霉素G 90.2%，头孢唑林钠89.5%，头孢哌酮钠88.1%。

C上述加标牛奶样品分别经苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱和商品HLB固相萃取柱富集和净化后的效果比较电泳图如附图1所示。

从附图1中可看出，用苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱对牛奶样品的净化效果优于商品HLB固相萃取柱，采用后者时存在于基线之上的杂峰所致基线波动以及头孢氨苄和苯唑西林峰处与之未基线分离的的杂质峰在采用前者时已全部消失。

实施例2

一 苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱制备

A 将苯唑西林(40.7mg)和头孢氨苄(35.8mg)与丙烯酰胺按照摩尔比为0.97:1.03:8的比例混合溶解于100 mL甲醇中，超声振荡10min，于室温下放置过夜，按照苯唑西林和头孢氨苄与乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为0.97:1.03:40的比例以及与偶氮二异丁腈摩尔比为0.97:1.03:0.91的比例将二者加入到上述溶液中超声振荡10min，向装有溶液的容器通入氮气5min后密封容器，然后将其置于60^°C恒温水浴锅中反应24h，制得聚合物微球，将聚合物微球置于索式提取器中，用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶剂洗去模板分子后放入真空干燥器中干燥至恒重。

B称取200mg上述苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹聚合物微球，填充至6mL底部装有筛板的空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实。

二 苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱用于加标牛奶样品的富集和净化

A称取20.0g空白牛奶，均匀分置于4个50mL聚乙烯离心管中，加入6种β-内酰胺类抗生素混合标准溶液，使加标量为0.05mg/kg，每管加入乙腈20mL，置于恒温水浴振荡器中振摇20min，4000rpm下离心10min，取上清液，每管残渣再加入乙腈10mL，重复上述操作，合并两次上清液于分液漏斗中；加入5mL乙腈饱和的正己烷，振摇2min，弃去上清液，重复3次后将下层溶液旋转蒸发至干，用乙腈-甲醇样品溶剂溶解干渣并定容至5mL，共获得20mL牛奶样品溶液。

B将苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用10mL乙腈、10mL甲醇和10mL水在负压状态下淋洗活化，并抽干淋洗溶剂。

C使制备的样品溶液在负压状态下连续通过固相萃取柱，抽干溶剂。

D以5mL体积比为1:1的乙腈和甲醇的混合溶剂为淋洗剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态10min。

E以5mL体积比为9:1的甲醇和乙酸的混合溶剂作为洗脱剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂。

F将洗脱液旋转蒸发至干，用水溶解干渣并定容至1mL后供毛细管电泳检测。

三 加标样品的毛细管电泳检测

A电泳条件：运行缓冲液组成为20mmol/L磷酸盐和22mmol/L十二烷基硫酸钠，pH为6.7，使用前超声10 min；分离电压20 kV；进样量为1.47kPa×10s；检测波长200nm。

B上述加标牛奶样品β-内酰胺类抗生素的回收率分别为：阿莫西林86.7%，头孢氨苄97.2%，苯唑西林95.2%，青霉素G 91.9%，头孢唑林钠90.2%，头孢哌酮钠87.9%。

Claims (10)

1.一种双模板分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述萃取柱为苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱，采用如下方法进行制备：

(1)将苯唑西林、头孢氨苄和丙烯酰胺按照0.95～1.05:1.05～0.95:8的摩尔比混合溶解于甲醇中，超声振荡至混合均匀后于室温下放置过夜，其中甲醇的体积与丙烯酰胺量的比值为125mL:1mmol，按照苯唑西林、头孢氨苄与乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为0.95～1.05:1.05～0.95:40的比例以及与偶氮二异丁腈摩尔比为0.95～1.05:1.05～0.95:0.91的比例将二者加入到上述溶液中超声振荡至混合均匀后，向装有溶液的容器通入氮气以去除氧气，保证聚合反应能够顺利进行，然后将密封的容器置于58～62℃恒温水浴锅中反应20～24h，制得聚合物微球，将聚合物微球置于索式提取器中，用甲醇-乙酸混合溶剂洗去模板分子后放入真空干燥器中干燥至恒重，得到苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹聚合物微球；

(2)称取苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹聚合物微球，填充至底部装有筛板的空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实，制得苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹固相萃取柱。

2.如权利要求1所述的一种双模板分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述甲醇-乙酸混合溶剂指甲醇和乙酸按照体积比9:1混合得到的溶剂。

3.如权利要求1所述的一种双模板分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述苯唑西林和头孢氨苄双模板分子印迹聚合物微球填充至底部装有筛板的空固相萃取柱中的填充的高度不低于12mm。

4.如权利要求1所述的一种双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于按照下述步骤进行：

(1)将上述分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用乙腈、甲醇和水在负压状态下淋洗活化，并抽干淋洗溶剂，其中三种溶剂的体积比为1:1:1；

(2)将用乙腈-甲醇样品溶剂制备的样品溶液在负压状态下连续通过固相萃取柱，抽干溶剂；

(3)用乙腈-甲醇淋洗剂在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态；

(4)用甲醇-乙酸洗脱剂在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂；

(5)将洗脱液旋转蒸发至干，用水溶解干渣并定容后供毛细管电泳检测。

5.如权利要求4所述的一种双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于所述毛细管电泳检测按照下述电泳条件进行：运行缓冲液组成为20mmol/L磷酸盐和22mmol/L十二烷基硫酸钠，pH为6.7，使用前超声10min；分离电压20kV；进样量为1.47kPa×10s；检测波长200nm。

6.如权利要求4所述的一种双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于：所述负压状态指-20kPa～-100kPa。

7.如权利要求4所述的一种双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于所述样品溶液采用如下步骤制备：

(1)称取20.0g带有β-内酰胺类抗生素残留的牛奶，均匀分置于4个50mL聚乙烯离心管中或称取没有β-内酰胺类抗生素残留的20.0g空白牛奶，加入6种β-内酰胺类抗生素混合标准溶液；使每一种β-内酰胺类抗生素加标量都为0.05mg/kg，均匀分置于4个50mL聚乙烯离心管中；

(2)每管加入乙腈20mL，置于恒温水浴振荡器中振摇20min，4000rpm下离心10min，取上清液，每管残渣再加入乙腈10mL，重复上述操作，合并两次上清液于分液漏斗中；加入5mL乙腈饱和的正己烷，振摇2min，弃去上清液，重复3次后将下层溶液旋转蒸发至干，用乙腈-甲醇上样溶剂溶解干渣并定容至5mL，共获得20mL牛奶样品溶液。

8.如权利要求4所述的一种双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于所述乙腈-甲醇样品溶剂指乙腈和甲醇按照体积比4:1混合得到的溶剂。

9.如权利要求4所述的一种双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于所述乙腈-甲醇淋洗剂指乙腈和甲醇按照体积比1:1混合得到的溶剂，淋洗剂的加入量应采用不使被测物质从柱中淋洗出来的最大用量，目的是使样品中共存的干扰物被最大程度地洗掉，而被测物没有在这一步产生损失，选择4～8mL。

10.如权利要求4所述的一种双模板分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于所述甲醇-乙酸洗脱剂指甲醇和乙酸按照体积比9:1混合得到的溶剂，洗脱剂的加入量应采用使被测物质从柱中完全洗脱出来的最小用量，目的是使样品中的被测物在这一步用最小的溶剂消耗即可被完全洗脱，选择5～8mL。