CN102924645A - 一种青霉素类抗生素及其中间体的分子印迹型聚合物的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种青霉素类抗生素及其中间体的分子印迹型聚合物的制备方法，该方法以6-氨基青霉烷酸（6-APA）为模版分子，甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，以乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，通过溶解、聚合、洗脱等步骤得到以6-APA为虚拟模板的印迹聚合物。该印迹聚合物用于固相萃取柱的填料，所制得的固相萃取柱对青霉素类抗生素青霉G钾（PEN）、氨苄青霉素（AMP）、阿莫西林（AMO）及其中间体6-APA均有良好的识别性，可用于动物源性食品中青霉素类抗生素残留检测的样品前处理。

Description

一种青霉素类抗生素及其中间体的分子印迹型聚合物的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及分子印迹聚合物的制备方法；具体说是动物源性食品中一种青霉素类抗生素及其中间体的分子印迹聚合物的制备方法。 

背景技术

青霉素类抗生素是含有6-氨基青霉烷酸(6-APA)母核结构的一类广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较强的抗菌作用，因而广泛用于兽医临床。在动物饲养中如不正确使用青霉素类抗生素将导致其动物源性食品安全问题。 

分子印迹技术 (Molecular Imprinting Techniqe，MIT)是近年来出现的制备具有识别功能的聚合物材料的新技术，可获得在空间结构和结合位点上与某一分子完全匹配的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)。这一技术已经应用于单一目标化合物的固相萃取柱制备，但是同时用于多种化合物及其中间体分离的分子印迹型固相萃取柱制备方法未见报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种青霉素类抗生素及其中间体的分子印迹聚合物的制备方法，该分子印迹聚合物制得的固相萃取柱对具有6-APA母核的青霉素类抗生素PEN、AMP、AMO及其中间产物6-APA均有良好的识别性能。 

本发明技术方案如下： 

一种青霉素类抗生素及其中间体的分子印迹型聚合物的制备方法，该制备方法按如下步骤进行： 

（1）称取质量不大于0.22g模板分子6-氨基青霉烷酸（6-APA）溶解于10 mL甲酸溶液中，加入功能单体甲基丙烯酸（MAA） 0.265-0.795mL，于室温下在超声振荡30 min ，使模板分子与功能单体充分结合；然后向加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA） 2.57-6.43 mL ，偶氮二异丁腈（AIBN） 0.05 g，混合均匀，超声振荡15 min，在N2保护下置60 ℃水浴中加热24 h，得到白色固体聚合物； 

（2）将步骤（1）将所得的白色固体聚合物粉碎，研磨过220目（粒径0.065 mm）筛，用体积比8:2或7:3或6:3的乙腈-水或体积比6:4的甲醇/乙酸溶液洗脱聚合物中的模板分子（6-APA），再用去离子水洗脱溶剂，收集产物于烘箱中60 ℃干燥，得到以6-APA为虚拟模板的印迹聚合物。 

作为优选，本发明方法中所述模板分子：功能单体：交联剂的摩尔比为1:5:30。 

一种固相萃取柱填料，所述填料由权利要求1所述的6-APA为虚拟模板的印迹聚合物和硅藻土组成，所述印迹聚合物与硅藻土的质量比为2:1。 

与已有技术相比，本发明有益效果体现在： 

本发明以6-氨基青霉烷酸(6-APA)母核为分子印迹聚合物的模板，制得分子印迹聚合物，经粉碎后与不同比例膨松剂（硅藻土）混合装柱，所制得的固相萃取柱对具有6-APA母核的青霉素类抗生素PEN、AMP、AMO及其中间体6-APA均有良好的识别性能。 

附图说明

图1为NMIPs的红外光谱图 

图2为MIPs的红外光谱图 

图3为NMIPs的扫描电镜 

图4为MIPs的扫描电镜SEM图。 

图5a为实施例3牛奶样品色谱图。 

图5b为实施例3加标牛奶样品的色谱图。 

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明技术方案做进一步说明。实施例中的试验步骤和试验所用产品及试验器材，若无特别说明均为本领域常规技术手段、市购常规产品及公知仪器。 

实施例1 

（1）通过分别加入5 mL的甲醇、甲酸、乙醇、二氯甲烷、N,N-二甲基酰胺、甲醇/水（7/3）、乙腈、乙腈/水（7/3）、乙腈/水（8/2）做为溶剂，考察不同溶剂的对6-APA和MAA的溶解效果，见表1。因模板分子6-APA不完全溶于有机溶剂，且微溶于水，遇碱分解，对酸较稳定，综合考虑选择甲酸作为致孔剂。 

表1 不同溶剂的对6-APA和MAA的溶解效果 

（2）功能单体MAA与模板分子6-APA用量之比的影响：实验固定模板分子用量，改变功能单体的量，考察功能单体与模板分子的摩尔比为3:1、5:1、7:1、9:1时功能单体和模 板分子间的相互作用情况，在甲酸溶液中使模板分子与功能单体充分结合后，用岛津2500型紫外可见分光光度计于198nm处测定甲酸溶液中剩余模板分子6-APA的吸光度值分别为0.947,0.558,0.537,0.531。当随着功能单体量的增多，吸光度不断下降，说明模板分子与功能单体相互作用形成主客体复合物。当功能单体与模板分子的摩尔比由5:1再增多时，吸光度变化不再明显，说明此时模板分子与功能单体已经作用充分，多余的功能单体会发生自身缔合，形成非特异性的结合位点，使得吸附传质阻力增加，不利于制备印迹聚合物，所以功能单体与模板分子的摩尔比5：1为最佳选择。 

交联剂用量的影响： 

实验合成乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）与6-APA摩尔比为10:1、20:1、30:1、40:1、50：1的聚合物，分别称取上述5个不同比例的分子印迹聚合物粉末各20mg,加入1.0 mmol/L的6-APA标准溶液2mL，振荡吸附2h后，测溶液中剩余6-APA的含量，然后计算分子印迹聚合物粉末的吸附量，结果如表2所示。 

表2不同比例的分子印迹聚合物粉末与6-氨基青霉烷酸（6-APA）的结合量 

由上表可见，随着交联剂用量的增加，分子印迹聚合物MIPs的平衡吸附量也随之增加，当 n(EDMA):n(6-APA)=30达到最大值，随后吸附量减少。因此，实验选择 n(EDMA):n(6-APA)=30:1为最佳比例。 

经在不同配比下测定分子印迹聚合物对模板分子的吸附性能，最终确立了以模板分子：功能单体：交联剂=1:5:30为最佳配比。 

（3）对比甲醇/乙酸（8/2，指体积比，下同）、乙腈/水（8/2）、乙腈/水（7/3）、乙腈/水（6/4）四种溶液对模板的去除效果。结果表明，乙腈/水（6/4）不能完全除去模板分子；甲醇/乙酸（8/2）、乙腈/水（8/2）完全除去模板分子均需要80h以上，乙腈/水（7/3）既能完全除去模板分子且所需时间较短，所以实验选择乙腈/水（7/3）作为除去模板的溶液。 

（4）称取3.000 g印迹聚合物放入索氏提取器中，于圆底烧瓶中加入50mL的乙腈/水（V:V=7:3）溶液，95 ℃水浴使之回流洗脱，每3小时取索氏提取器中液体以及圆底烧瓶中溶液，过0.22 μm滤膜，用HPCE检测，直至索氏提取器中6-APA分子全部转移到圆底烧瓶 中为止，结果表明72 h后索氏提取器中的模板分子已完全转移到圆底烧瓶中。 

（5）含非分子印迹聚合物NMIPs与分子印迹聚合物MIPs结果比较 

用红外分光光度计测NMIPs和MIPs的红外光谱，以纯的KBr为底样测试，在波数范围 4000 ~ 400 cm^-1测定。由红外谱图1、2可知，MIPs较NMIPs在3420 cm ^-1附近出现的较宽的峰为羧酸基团中的-OH伸缩振动峰；1730 cm^-1附近出现的较强峰为-C=O的伸缩振动峰，这2个峰的出现说明 MIPs 可以形成以羧基为氢键的作用点，此处的含非分子印迹聚合物NMIPs即模板分子含量为0时采用本发明方法制备获得的聚合物。 

采用S-4800扫描电子显微镜观察NMIPs和 MIPs的形貌粒径，见图3、4.。结果表明，NMIPs 微球表面光滑，平均粒径约为 1. 5 ~ 2 μm，分布较为均匀；而 MIPs 微球表面粗糙， 粒径分布较宽， 粗糙的微球表面具有大量的孔穴， 因此具有较大的比表面积和孔体积， 有利于结合位点和底物的接触，从而有较高的负载量和对底物的较高识别性。 

采用Scatchard分析法测定了MIPs和NMIPs 对底物分子的结合量，结果表明，MIPs对底物分子的结合量明显地大于NMIPs 对底物分子的结合量。说明印迹过程中模板分子在 MIPs中留下的结合位点决定了 MIPs对模板分子高的亲和性和特异识别性。 

实施例2 

比较质量比1：1、2：3、2：1、3：1的MIPs和硅藻土的装填效果。比较样品溶液通过分子印迹固相萃取柱（MISPE）的速率以及对模板分子的吸附效果，结果见表3， 

表3分子印迹聚合物固相萃取柱制备条件的选择 

聚合物：硅藻土	1：1	3：2	2：1	3：1
					滤过速度（mL/min）	2	1.6	1	0.3
吸附量（umol/g）	15.6	19.2	24.5	25.0

由表3可以看出：当MIPs与硅藻土比例为3:1时，MISPE的吸附效果较佳，但是上样速率过慢，当配比为1:1和3:2时虽然样品通过速率较快但是吸附效果较差。因此选择最佳配比为2:1。 

6-APA分子印迹固相萃取柱的制备  称取150 mg MIPs及75 mg硅藻土（MIPs：硅藻土=2:1）装入3 mL空的固相萃取（SPE）柱）中，用筛板压紧，继续轻敲小柱，直至筛板与聚合物结合紧密为止。 

实施例3 

（1）精确称取模板分子6-氨基青霉烷酸（6-APA）0.22 g溶解于盛有10 mL甲酸的容器中，加入功能单体甲基丙烯酸（MAA）0.44 mL，于室温下在超声仪中振荡30 min ，使模板分子与功能单体充分结合；然后向容器中加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）3.86mL ，偶氮二异丁腈（AIBN）0.05 g，混合均匀，超声振荡15 min，向容器中充入N₂并密封，置60 ℃水浴中加热24 h，得到白色固体聚合物； 

（2）将步骤（1）将所得的白色固体聚合物粉碎，研磨过220目（粒径0.065 mm）筛，用体积比8:2或7:3或6：3的乙腈-水或体积比6:4的甲醇/乙酸溶液洗脱聚合物中的模板分子6-APA，再用去离子水洗脱溶剂，收集产物于烘箱中60 ℃干燥，得到以6-APA为虚拟模板的印迹聚合物。 

（3）在3mL固相萃取小柱空管中自下而上依次装入玻璃棉和以6-APA为模板制备的分子印迹聚合物，敲实并使表面平齐，上面再加入一层玻璃棉，装填高度约为0.5cm，制成6-APA MISPE柱。6-APA MISPE柱先用2 mL甲醇活化；再加入5 mL正己烷，待正己烷没入柱填料时，取1 mL中溶解液，以5 mL/min的流速过柱；用5 mL正己烷淋洗，弃淋洗液；再用6 mL甲醇/乙酸（体积比为8:2）溶液进行洗脱；收集洗脱液，用氮吹仪吹干，用0.5 mL 浓度为30 mmol/L的氢氧化钠溶液溶解，过0.22 μm微孔滤膜后制得上HPCE检测液。 

（4）准确量取10.00 mL牛奶样品，将牛奶样品中加入不同浓度标样，置于50 mL离心管中，加入10 mL 3.2 g/L溴化四丁基铵乙腈溶液，漩涡震荡1 min，接着超声波提取10 min后，在5000 r/min速度下离心10 min，分离上清液。下层残渣再重复提取两次，合并3次上清提取液。在提取液中加入10 mL正己烷，振荡混匀萃取，静置10 min后，除去正己烷层，收集水相。水相于50 ℃水浴蒸干后，再用5 mL 0.5 mol/L磷酸二氢钾溶液使之充分溶解。 

（5）结果 

在（4）的条件下提取的牛奶样品，经6-APA MISPE柱净化，进行高效液相色谱测定如下图所示，由图5a可知所选市售牛奶未经检出青霉素类抗生素。 

为了验证牛奶中青霉素类抗生素残留前处理方法的准确性进行了加标回收实验，分别向空白牛奶样品中添加0.6、1.2和2.5 mg/L 3个质量浓度水平的青霉素类（PENs）混合标准液，按（4）（3）的方法提取、净化后用高效液相色谱进行检测，每个添加水平重复测定6次。结果见表4。从表4可以看出，4种青霉素类（PENs）药物的平均回收率为83.5 ％～ 87.27％，相对标准偏差（RSD）为1.03 ％～7.35 ％。 

表4不同添加水平下各目标物的添加回收率和相对标准偏差(n=6) 

Claims (3)

1.一种青霉素类抗生素及其中间体的分子印迹型聚合物的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）称取质量不大于0.22g模板分子6-氨基青霉烷酸（6-APA）溶解于10 mL甲酸溶液中，加入功能单体甲基丙烯酸（MAA） 0.265-0.795mL，于室温下在超声振荡30 min ，使模板分子与功能单体充分结合；然后加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA） 2.57-6.43 mL；再加入偶氮二异丁腈（AIBN） 0.05 g，混合均匀，超声振荡15min，在N₂保护下置60 ℃水浴中加热24 h，得到白色固体聚合物；

（2）将步骤（1）将所得的白色固体聚合物粉碎，研磨过220目筛，用体积比8:2或7:3或6:3的乙腈-水或体积比6:4的甲醇/乙酸溶液洗脱聚合物中的模板分子（6-APA），再用去离子水洗脱溶剂，收集产物于烘箱中60 ℃干燥，得到以6-APA为虚拟模板的印迹聚合物。

2.根据权利要求1所述青霉素类抗生素及其中间体的分子印迹型聚合物的制备方法，其特征在于：所述模板分子：功能单体：交联剂的摩尔比为1:5:30。

3.一种固相萃取柱填料，其特征在于，所述填料由权利要求1所述的6-APA为虚拟模板的印迹聚合物和硅藻土组成，所述印迹聚合物与硅藻土的质量比为2:1。

Images