CN101148464A - 利用分子印迹聚合物净化红霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的红霉素分子印迹聚合物的净化红霉素的方法，包括以下步骤：(1)将模板分子红霉素、功能单体甲基丙烯酸和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯混合溶解到致孔剂中，加入引发剂，封口；(2)将合成的聚合物磨碎后，除去微细的颗粒，通过萃取除去模板分子；(3)将除去模板分子的聚合物60℃干燥过夜，获得红霉素的分子印迹聚合物；(4)将红霉素分子印迹聚合物填充到固相萃取柱管中；(5)对固相萃取柱活化，加入溶于40％甲醇中动物组织提取液或水样，经过淋洗固相萃取柱，即洗脱、净化红霉素。本发明具有高选择性、高特异性和耐不良环境的优点，具有广阔的应用潜力。

Description

利用分子印迹聚合物净化红霉素的方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物化学工程技术领域的方法，具体的说，是一种利用分子印迹聚合物净化红霉素的方法。

背景技术

红霉素(Erythromycin，简称ERY)属于大环内酯类抗生素，是一种广泛使用的人畜共用的药物，它可以和细菌的核糖体结合，阻止细菌蛋白的合成，从而起到抑制细菌的作用。如果使用不当会造成残留。对人，畜，环境造成损伤或污染。长期食用红霉素超标的动物性食品，会对人的耳蜗和前庭神经造成损害，甚至会危害到肝肾的功能。

为了保证人民的身体健康，世界各国对红霉素的使用和残留都做了严格的规定并制定了相应的标准，其中欧盟在动物性食品中不同组织规定的限量不同，但最高不能高于400ppm。我国2002年起规定在动物性食品中不得检出红霉素。因此开发灵敏的食品中痕量存在的红霉素的检测方法十分必要。由于动物性食品的基质复杂，而红霉素往往痕量存在，所以有必要对红霉素进行前处理，从而提高检测的灵敏度。目前通用的前处理的方法有液液分配、固相萃取、免疫柱层析技术等，其中固相萃取技术因为操作简单，节约试剂，可同时处理多个样品而得到广泛应用。但是由于目前常用的固相萃取的填料与吸附目标物的作用都是非特异的，固定相的选择性低，易受复杂基质的干扰，限制了该项技术的发展。分子印迹技术是基于分子识别基础上一种功能聚合物制备技术，该聚合物合成时采用目的分子或者类似物作为模板，合成后将模板洗脱后，内部保留和目的分子互补的空间结构和基团，且具有“记忆”功能，可特异的和模板分子发生作用，并通过相应的方式洗脱，从而达到纯化和富集目的分子的作用。由于分子印迹聚合物是采用化学方法合成的，具有抵抗酸碱等恶劣环境的优点，可重复使用，所以应用越来越广泛。

经对现有技术文献的检索发现，Martin等在《THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS》(抗生素杂志)1996，50(1)，89-91上发表的文章“Separation and Detectionof Macrolide Antibiotics by HPLC Using Macrolide-imprinted Syntheticpolymers as stationary phase”(使用分子印迹的方法合成的大环内酯类抗生素的的分子印迹聚合物用于高效液相色谱的固定相)合成的红霉素分子印迹聚合物并尝试将其作为高效液相色谱的填料并进行了评价。这项研究首次证明结构复杂的大环内酯类抗生素可以作为印迹分子合成分子印迹聚合物，且合成的聚合物可以特异性的吸附相应的印迹分子。但是该文章只是理论上的探索性研究，并没有记载合成的材料应用到样品的前处理方面。刘亚等(2006)在其论文《硅胶表面替米考星分子印迹聚合物的制备及性能研究》(北京化工大学，硕士研究生论文)中合成了同为大环内酯类抗生素的替米考星的分子印迹聚合物，并对其物理化学性质进行了分析。但是该文章只是停留在聚合物物理特征的描述和吸附性能的评价阶段。并没有实际应用。到目前为止还没有红霉素分子印迹聚合物固相萃取小柱的实际应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用分子印迹聚合物净化红霉素的方法，从而弥补现有环境中，动物性食品中红霉素残留检测前处理的弊端，简单、快速、特异、高效的纯化和富集痕量红霉素，提高现有检测的灵敏度。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明包括如下步骤如下：

(1)将模板分子即红霉素、功能单体甲基丙烯酸和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，按模板分子∶功能单体∶交联剂摩尔比＝1∶2～8∶20，混合溶解到致孔剂中，致孔剂的成分为甲醇和乙腈的混合溶液，比例为2∶3。当模板分子为0.5mol时，致孔剂的体积为2.5～5ml。加入引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)；体系在氮气氛下封口，60～70℃热引发聚合24～48小时；

(2)将合成的聚合物磨碎后，分筛得到粒径在30～60μm之间的颗粒，除去微细的颗粒，最后通过索氏萃取24～72小时进一步除去模板分子；萃取剂的组成为甲醇、醋酸混合液，二者的比例为9∶1。

(3)将除去模板分子的聚合物60℃干燥过夜，获得红霉素的分子印迹聚合物；

(4)将红霉素分子印迹聚合物填充到固相萃取柱管中；

所述的填充到固相萃取柱管，是指：用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和筛板，称量红霉素分子印迹聚合物，用甲醇匀浆后，填充于商品化的1ml～6ml聚丙烯固相萃取小柱内。

所述的称量红霉素分子印迹聚合物，其质量为20mg～200mg。

所述的填充到固相萃取柱管，在抽真空状态下，将匀浆液装入聚丙烯固相萃取小柱，填料的顶端和底端分别装上聚乙烯筛板。

所述的筛板，筛板的孔径为20μm。

(5)先后用5～10ml甲醇(10％醋酸)，5～10ml甲醇，5～10ml 40％甲醇或水对固相萃取柱活化，加入样品，经过淋洗固相萃取柱，即能洗脱、净化和收集红霉素。

所述的对固相萃取柱活化，是指用5～10ml甲醇(10％醋酸)，5～10ml甲醇，5～10ml 40％甲醇或水对固相萃取柱活化。

所述的加入样品，为1ml动物组织提取物或水溶液经抽提后溶于40％甲醇或水中的样品。

所述的淋洗，用2.5ml 80％甲醇淋洗淋洗固相萃取柱。

所述的洗脱，用3ml比例为甲醇和PBS缓冲液的混合液，二者的比例为8∶2，其pH值为7.4。

本发明中，合成的红霉素分子印迹聚合物是一种多孔的结构，内部具有和模板分子相互补的集团，具有“记忆“功能，所以对模板分子具有很高的特异性和选择性。本发明采用制备的红霉素分子印迹聚合物作为固相萃取小柱的填料可以用于动物源性食品和水溶液中实际样品的前处理实践，从而实现对干扰检测的动物基质的去除，富集痕量残留的红霉素，提高检测的灵敏度。本发明所述的方法比较普通C18固相萃取小柱具有特异性好，容量高的特点。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

一.红霉素分子印迹聚合物的制备：

将红霉素(模板)0.5mol，单体甲基丙烯酸(MAA)，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇脂(EGDMA)，按照1∶2∶20的摩尔比例混匀，溶解到2.5ml致孔剂(乙腈∶甲醇＝3∶2)中，置入安培瓶中，再加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)0.02g，超声5分钟，然后冲入氮气5分钟，真空封口，60℃水浴24小时，得红霉素分子印迹聚合物。取出块状聚合物，用研钵磨碎，筛分至平均30～60μm粒径大小，用丙酮悬浮弃去过细微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10％醋酸)索氏抽提72小时去除模板，中间每隔8小时换液一次。取洗脱液20ul，HPLC测定洗脱完全后，60℃烘干24小时备用。

二.红霉素分子印迹聚合物固相萃取小柱的制备：

首先用甲醇冲洗固相萃取小柱和筛板，将合成的分子印迹聚合物100mg用甲醇匀浆，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱体积为3ml，在抽真空状态下压紧填料，最后加上聚乙烯筛板。

三.应用红霉素分子印迹固相萃取小柱纯化、富集猪肉中的红霉素残留先后用10ml甲醇(10％醋酸)，10ml甲醇，10ml 40％甲醇活化固相萃取柱，注意不能使之抽干。加入1ml提取后的样品，用2.5ml甲醇(80％)淋洗小柱，抽干，然后用3×1ml甲醇(20％PBS，pH 7.4)洗脱红霉素。将样品用0.22um的滤器过滤后，取20ul上样，用HPLC分离样品并通过紫外检测器检测样品中红霉素的浓度。

本发明合成的分子印迹聚合物可以特异的识别红霉素，采用本发明所述的方法可以用于动物源性食品中红霉素的分离，净化和富集。对猪肉中添加红霉素200μg/g标准样品的回收率为90.23％，对其它类药物无特异性吸附。

实施例2：

一.红霉素分子印迹聚合物的制备：

将红霉素(模板)0.5mol，单体甲基丙烯酸(MAA)，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇脂(EGDMA)，按照1∶4∶20的摩尔比例混匀，溶解到5ml致孔剂(乙腈∶甲醇＝3∶2)中，置入安培瓶中，再加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)0.02g，超声5分钟，然后冲入氮气5分钟，真空封口，60℃水浴36小时，得红霉素分子印迹聚合物。取出块状聚合物，用研钵磨碎，筛分至30～60μm粒径大小，用丙酮悬浮弃去过细微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10％醋酸)索氏抽提48小时去除模板每隔8小时换次液。HPLC测定洗脱完全后，60℃烘干24小时备用。

二.红霉素分子印迹聚合物固相萃取小柱的制备：

首先用10ml甲醇冲洗固相萃取小柱和筛板，将合成的分子印迹聚合物20mg用甲醇匀浆，填充到1ml聚丙烯固相萃取小柱中，在抽真空状态下压紧填料，最后加上聚乙烯筛板。

三.应用红霉素分子印迹固相萃取小柱纯化、富集猪肉中的红霉素残留

先后用5ml甲醇(含有10％醋酸)，5ml甲醇，5ml 40％甲醇活化固相萃取柱，注意不能使之抽干。加入1ml组织匀浆提取后的样品，用2.5ml甲醇(80％)淋洗小柱，抽干，然后用4×1ml甲醇(20％PBS，pH 7.4)洗脱红霉素。将样品用0.22um的滤器过滤后，取20ul上样，用HPLC分离样品并通过紫外检测器检测样品中红霉素的浓度。

本发明的效果为，应用本发明所述的材料和方法对猪肉中添加红霉素500μg/g标准样品的回收率为80.77％，对其它类药物无特异性吸附。

实施例3：

一.红霉素分子印迹聚合物的制备：

将红霉素(模板)0.5mol，单体甲基丙烯酸(MAA)，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇脂(EGDMA)，按照1∶3∶20的摩尔比例混匀，溶解到3ml致孔剂(乙腈∶甲醇＝3∶2)中，置入安培瓶中，再加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)0.02g，超声10分钟，然后冲入氮气5分钟，真空封口，65℃水浴24小时，得红霉素分子印迹聚合物。取出块状聚合物，用研钵磨碎，筛分至30～60μm左右粒径大小，用丙酮悬浮弃去过细微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10％醋酸)索氏抽提24小时去除模板。HPLC测定洗脱完全后，60℃烘干24小时备用。

二.红霉素分子印迹聚合物固相萃取小柱的制备

将制得红霉素分子印迹聚合物50mg用甲醇匀浆，填充到聚丙烯固相萃取3ml小柱中，在抽真空状态下压紧填料，最后加上聚乙烯筛板。

三.应用红霉素分子印迹固相萃取小柱纯化、富集鸡肝中的红霉素残留

先后用5ml甲醇(10％醋酸)，5ml甲醇，5ml 40％甲醇活化固相萃取柱，注意不能使之抽干。加入1ml经匀浆后的鸡肝样品，用2.5ml甲醇(80％)淋洗小柱，抽干，然后用3×1ml甲醇(20％PBS，pH 7.4)洗脱红霉素。将样品用0.22um的滤器过滤后，取20ul上样，用HPLC分离样品并通过紫外检测器检测样品中红霉素的浓度。

本发明的效果为，应用本发明所述的材料和方法对鸡肝中添加红霉素500μg/g标准样品的回收率为85.81％，对其它类药物无特异性吸附。

实施例4：

一.红霉素分子印迹聚合物的制备：

将红霉素(模板)0.5mol，单体甲基丙烯酸(MAA)，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇脂(EGDMA)，按照1∶8∶20的摩尔比例混匀，溶解到4ml致孔剂(乙腈∶甲醇＝3∶2)中，置入安培瓶中，再加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)0.02g，超声10分钟，然后冲入氮气5分钟，真空封口，70℃水浴24小时，得红霉素分子印迹聚合物。取出块状聚合物，用研钵磨碎，筛分至30～60μm左右粒径大小，用丙酮悬浮弃去过细微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10％醋酸)索氏抽提24小时去除模板。HPLC测定洗脱完全后，60℃烘干24小时备用。

二.红霉素分子印迹聚合物固相萃取小柱的制备：

首先用10ml甲醇冲洗固相萃取小柱和筛板，将合成的分子印迹聚合物200mg用甲醇匀浆，填充到6ml聚丙烯固相萃取小柱中，在抽真空状态下压紧填料，最后加上聚乙烯筛板。

三.应用红霉素分子印迹固相萃取小柱富集自来水中的红霉素残留

先后用10ml甲醇(10％醋酸)，10ml甲醇，10ml 40％甲醇活化固相萃取柱，注意不能使之抽干。加入1000ml自来水样品后，真空抽气，使柱子处于半干燥状态，用2.5ml甲醇(80％)淋洗小柱，抽干，然后用3×1ml甲醇(20％PBS，pH7.4)洗脱红霉素。将样品用0.22um的滤器过滤后，用HPLC分离样品并通过紫外检测器检测样品中红霉素的浓度。

应用本发明所述的方法可以特异的从自来水中富集红霉素，对添加红霉素0.2μg/g标准样品的自来水的回收率为109.51％。

实施例5：

一.红霉素分子印迹聚合物的制备：

将红霉素(模板)0.5mol，单体甲基丙烯酸(MAA)，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇脂(EGDMA)，按照1∶2∶20的摩尔比例混匀，溶解到5ml致孔剂(乙腈∶甲醇＝3∶2)中，置入安培瓶中，再加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)0.02g，超声10分钟，然后冲入氮气5分钟，真空封口，65℃水浴24小时，得红霉素分子印迹聚合物。取出块状聚合物，用研钵磨碎，筛分至30～60μm左右粒径大小，用丙酮悬浮弃去过细微粒。烘干聚合物后，用甲醇(含10％醋酸)索氏抽提24小时去除模板。HPLC测定洗脱完全后，60℃烘干24小时备用。

二.红霉素分子印迹聚合物固相萃取小柱的制备：

首先用甲醇冲洗固相萃取小柱和筛板，将合成的分子印迹聚合物150mg用甲醇匀浆，填充到6ml聚丙烯固相萃取小柱中，在抽真空状态下压紧填料，最后加上聚乙烯筛板。

三.应用红霉素分子印迹固相萃取小柱富集自来水中的红霉素残留

先后用5ml甲醇(含10％醋酸)，5ml甲醇，10ml 40％甲醇活化固相萃取柱，注意不能使之抽干。加入500ml自来水样品后，真空抽气，使柱子处于半干燥状态，用2.5ml甲醇(80％)淋洗小柱，抽干，然后用3×1ml甲醇(20％PBS，pH7.4)洗脱红霉素。将样品用0.22um的滤器过滤后，用HPLC分离样品并通过紫外检测器检测样品中红霉素的浓度。

采用本发明的富集方法对添加红霉素1μg/g标准样品的自来水的回收率为76.62％。

Claims (10)

1.一种利用分子印迹聚合物净化红霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将模板分子即红霉素、功能单体甲基丙烯酸和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，按摩尔比＝1∶2～8∶20，混合溶解到乙腈和甲醇的混合液，比例为3∶2致孔剂中，加入引发剂偶氮二异丁氰，在氮气氛下封口，60～70℃热引发聚合24～48小时；

(2)将合成的聚合物磨碎后，分筛得到粒径在30～60μm之间的颗粒，除去微细的颗粒，通过萃取除去模板分子；

(3)将除去模板分子的聚合物60℃干燥过夜，获得红霉素的分子印迹聚合物；

(4)将红霉素分子印迹聚合物填充到固相萃取柱管中；

(5)对固相萃取柱活化，加入动物组织提取物或水溶液经抽提后溶于40％甲醇或水中的样品1mL，经过淋洗固相萃取柱，即洗脱、净化红霉素。

2.根据权利要求1所述的红霉素分子印迹聚合物的净化红霉素的方法，其特征是，所述的萃取，其萃取剂的组成为甲醇、醋酸比例为9∶1混合液。

3.根据权利要求1所述的红霉素分子印迹聚合物的提取红霉素的方法，其特征是，所述的填充到固相萃取柱管，是指：用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和筛板，称量红霉素分子印迹聚合物，用甲醇匀浆后，填充于商品化的1ml～6ml聚丙烯固相萃取小柱内。

4.根据权利要求3所述的红霉素分子印迹聚合物的净化红霉素的方法，其特征是，所述的填充到固相萃取柱管，在抽真空状态下，将匀浆液装入聚丙烯固相萃取小柱，填料的顶端和底端分别装上聚乙烯筛板。

5.根据权利要求3所述的红霉素分子印迹聚合物的净化红霉素的方法，其特征是，所述的称量红霉素分子印迹聚合物，其质量为20mg～200mg。

6.根据权利要求4所述的红霉素分子印迹聚合物的净化红霉素的方法，其特征是，所述的筛板，筛板的孔径为20μm。

7.根据权利要求1所述的红霉素分子印迹聚合物的净化红霉素的方法，其特征是，所述的对固相萃取柱活化，是指先后用含10％醋酸5～10ml甲醇，5～10ml甲醇，5～10ml40％甲醇或水活化固相萃取柱。

8.根据权利要求1所述的红霉素分子印迹聚合物的净化红霉素的方法，其特征是，所述的加入样品，为1ml，溶解于40％甲醇或水中。

9.根据权利要求1所述的红霉素分子印迹聚合物的净化红霉素的方法，其特征是，所述的淋洗，用2.5ml80％甲醇淋洗淋洗固相萃取柱，用3ml比例为甲醇∶PBS缓冲液＝8∶2，pH7.4的混合液洗脱、净化、收集红霉素。

10.根据权利要求1所述的红霉素分子印迹聚合物的净化红霉素的方法，其特征是，所述的洗脱，用3ml比例为甲醇∶PBS缓冲液＝8∶2，pH7.4的混合液洗脱红霉素。