CN103497350B

CN103497350B - 一种氯唑西林分子印迹聚合膜的制备方法

Info

Publication number: CN103497350B
Application number: CN201310416024.0A
Authority: CN
Inventors: 傅强; 孙敏; 杜玮; 杜康丽; 蔡刚; 常春
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2033-09-12
Also published as: CN103497350A

Abstract

本发明公开了一种氯唑西林分子印迹聚合膜的制备方法，包括：（1）氯唑西林聚合液的制备；（2）氯唑西林分子印迹聚合膜的制备：将氯唑西林聚合溶液通氮气除氧，浸入聚偏氟乙烯膜，再通氮气除氧后，静置浸泡；取出完全浸透的聚偏氟乙烯膜置入已被除氧的器皿中，在紫外交联仪下反应；将反应完全后得到的膜取出，用甲醇和冰醋酸的混合液洗脱至洗脱液检测不出模板分子为止，然后再用乙腈水溶液洗至中性，即得氯唑西林分子印迹聚合膜。本发明对氯唑西林在动物源性食品中的残留检测具有重要意义。同时本发明建立的氯唑西林分子印迹聚合物膜具有操作简便、耗能少、反应时间短、干净无污染等特点。

Description

一种氯唑西林分子印迹聚合膜的制备方法

技术领域

本发明属于药物测试技术领域，涉及一种用于测试氯唑西林的聚合膜，尤其是一种氯唑西林分子印迹聚合膜。

背景技术

氯唑西林（cloxacillin,CLOX），又名邻氯青霉素，为广谱半合成青霉素，具有耐酸、耐青霉素酶的特点，抗菌机制是抑制细胞壁合成，对革兰阳性球菌和奈瑟菌有抗菌活性。在临床上主要用于治疗产青霉素酶的葡萄球菌引起的各种严重感染，如败血症、骨髓炎、呼吸道感染、心内膜炎及化脓性关节炎等。

但近年来，随着抗生素的广泛应用，氯唑西林因价格低廉、使用方便、抗菌作用强，在水产养殖上被广泛用于治疗鱼、虾和海参等水产品中细菌引起的疾病，所以氯唑西林的不合理使用已成为水产品的食用安全隐患，对渔业生产和生态环境都具有严重的危害。如水产品中氯唑西林药物的残留，可以破坏人体胃肠道菌群平衡和增强细菌耐药性，给人类身体健康带来危害。其中欧洲医药评价署（EMEA）、食品法典委员会（CAC）和我国农业部均已制定了氯唑西林的最大残留限量（MRL），残留标志物是氯唑西林，残留检测的对象是所有食品动物及其产品，MRL分别为300μg/kg（肝脏、肾脏、肌肉、脂肪），30μg/kg（奶）。而目前对氯唑西林生物样品前处理方法主要是柱前衍生化法，将样品制备成易于分析的形式，再进一步采用色谱技术、免疫技术或生物传感技术进行定性和定量分析，但这种方法回收率低，选择性差，内源性物质干扰大，有时甚至出现“假阴性”的情况。因此，建立一种测试费用低、操作简便、灵敏度高的测定方法，对氯唑西林在动物源性食品中的残留具有重要意义。

分子印迹技术(molecularly imprinted technique,MIT)是二十世纪八十年代迅速发展起来的一种化学分析技术,通常被人们描述为创造与识别“分子钥匙”的人工“锁”技术。它可以在聚合物中形成对模板分子具有特异性的结合位点。从应用角度来看，分子印迹聚合物又可分为不同的类型，其中分子印迹聚合物膜（MIM）与通常制备的棒状或球状的分子印迹聚合物（MIP）相比，具有操作简便、耗能少、反应时间短、干净无污染等特点；同生物膜相比，又具有耐恶劣环境、稳定性高、易于处理和应用的优点。同时MIM可克服传统膜选择性差的缺点实现从复杂体系中对目标化合物进行特异性吸附的作用。

目前，氯唑西林分子印迹膜的制备尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种氯唑西林分子印迹聚合膜的制备方法。该方法测试费用低、操作简便、灵敏度高。

本发明的目的是通过以下技术方案来解决的：

这种氯唑西林分子印迹聚合膜的制备方法，包括以下步骤：

（1）氯唑西林聚合液的制备

称取氯唑西林并使之溶于致孔剂中，超声，待氯唑西林完全溶解得20-100㎎/ml的氯唑西林有机溶液；

在上述氯唑西林有机溶液中，加入功能单体，其中模板分子与功能单体物质的量比为1:2—1:12；之后涡旋5—20min，使氯唑西林与功能单体充分预聚合；再加入交联剂和引发剂，其中引发剂与功能单体的物质的量比为1:10—1:20；待混合均匀，即得所需氯唑西林聚合液。

（2）氯唑西林分子印迹聚合膜的制备

将上述氯唑西林聚合溶液通氮气5-20min除氧，浸入聚偏氟乙烯膜，再通氮气5-20min除氧后，静置浸泡5—20min；取出完全浸透的聚偏氟乙烯膜置入已被除氧的器皿中，在紫外交联仪下反应3—12h；将反应完全后得到的膜取出，用甲醇和冰醋酸的混合液洗脱至洗脱液检测不出模板分子为止，然后再用50—80%的乙腈水溶液洗至中性，即得氯唑西林分子印迹聚合膜；

进一步，上述步骤（1）中所述致孔剂为二甲基乙酰胺DMAC、N-甲基吡咯烷酮NMP、二甲基甲酰胺DMF、甲醇和二甲基亚砜DMSO的一种或两种以上组合。

进一步，上述步骤（1）中，所述功能单体为α-甲基丙烯酸MAA或4-乙烯基吡啶4-VPY；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯EDMA和三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯TRIM的一种或两种的组合；所述引发剂为苯基双（2，4，6-三甲基苯甲酰基）氧化膦TPO和偶氮二异丁腈AIBN的一种或两种的组合。

进一步，将步骤（2）所得的氯唑西林分子印迹膜放在乙腈中保存，使用前在室温条件下自然干燥1—2h即可。

进一步，步骤2）中，所述甲醇和冰醋酸的混合液中，甲醇和冰醋酸的体积比为1：（1-9）。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明简化了抗生素样品的前处理手段，克服了抗生素样品复杂、干扰物多、浓度波动范围大的缺点；

（2）本发明突破了以往检测技术的灵敏度和选择性限制，分子印迹膜具有专一选择性、高度稳定性和使用寿命长等。

（3）本发明较以往的检测方法更易于操作，在氯唑西林的富集、分离和检测方面具有良好的应用前景，并对其他抗生素的分析检测提供了借鉴。

综上所述，本发明是一种测试费用低、操作简便、灵敏度高的测定方法，对氯唑西林在动物源性食品中的残留检测具有重要意义。同时本发明建立的氯唑西林分子印迹聚合物膜（MIM）与通常制备的棒状或球状的分子印迹聚合物（MIP）相比，具有操作简便、耗能少、反应时间短、干净无污染等特点；同生物膜相比，又具有耐恶劣环境、稳定性高、易于处理和应用的优点。

附图说明

图1为实施例1所得的氯唑西林分子印迹膜对模板分子吸附的等温吸附曲线。

图2为实施例1所得的氯唑西林分子印迹膜对模板分子吸附的Scatchard模型。

图3为实施例1所得的氯唑西林分子印迹膜与非分子印迹聚合膜、常规PVDF膜的水通量比较。

具体实施方式

本发明的氯唑西林分子印迹聚合膜的制备方法，包括以下步骤：

（1）氯唑西林聚合液的制备

在上述氯唑西林有机溶液中，加入功能单体，其中模板分子（即氯唑西林）与功能单体物质的量比为1:2—1:12；之后涡旋5—20min，使氯唑西林与功能单体充分预聚合；再加入交联剂（交联度为60—90%）和引发剂（引发剂与功能单体的物质的量比为1:10—1:20）于溶液中待混合均匀，即得所需氯唑西林聚合液；所述致孔剂为二甲基乙酰胺DMAC、N-甲基吡咯烷酮NMP、二甲基甲酰胺DMF、甲醇和二甲基亚砜DMSO的一种或两种以上组合。所述功能单体为α-甲基丙烯酸MAA或4-乙烯基吡啶4-VPY。所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯EDMA和三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯TRIM的一种或两种的组合。所述引发剂为苯基双（2，4，6-三甲基苯甲酰基）氧化膦TPO和偶氮二异丁腈AIBN的一种或两种的组合。

（2）氯唑西林分子印迹聚合膜的制备

将上述氯唑西林聚合溶液通氮气5-20min除氧，浸入聚偏氟乙烯膜（PVDF），再通氮气5-20min除氧后，静置浸泡5—20min；取出完全浸透的聚偏氟乙烯膜置入已被除氧的器皿中，在紫外交联仪下反应3—12h；将反应完全后得到的膜取出，用甲醇和冰醋酸的混合液洗脱至洗脱液检测不出模板分子为止，然后再用50—80%的乙腈水溶液洗至中性，即得氯唑西林分子印迹聚合膜。其中甲醇和冰醋酸的的混合液中，甲醇和冰醋酸的体积比为1：1—1：9。将所得的氯唑西林分子印迹膜放在乙腈中保存，使用前在室温条件下自然干燥1—2h即可。

下面结合实施例对本发明做进一步详细描述：

实施例1

（1）、氯唑西林聚合液的制备：

称取170mg氯唑西林于7ml DMF中，60℃下超声溶解，再加入0.25μl MAA并涡旋20min使氯唑西林与功能单体充分预聚合，之后再加入1.5ml EDMA，66mg TPO并涡旋使之混匀，之后通氮气10min除氧，得氯唑西林聚合液。

（2）、氯唑西林分子印迹聚合膜的制备：

将商品化的PVDF浸入上述聚合液中，在溶液中继续通氮气10min除氧，之后密闭；静置20min后，将浸透的PVDF转移至已除氧的密闭容器中；然后在紫外交联仪下照射反应4h；之后将步骤（2）重复操作三次。

将上述聚合所得的膜用甲醇和冰醋酸的混合液（甲醇/冰醋酸=9/1，v/v）索氏回流洗脱至洗脱液中检测不出模板分子为止（甲醇/冰醋酸能破坏氢键，快速洗脱模板分子），之后再用80%乙腈水溶液将印迹膜洗至中性，得氯唑西林分子印迹聚合膜。

氯唑西林分子印迹聚合膜放在乙腈中保存，使用前取出在室温条件下自然干燥（即室温晾干1-2h）。

实施例2

（1）、氯唑西林预聚合液的制备：

称取170.4mg氯唑西林于7.5ml DMSO中，50℃下超声溶解，再加入0.35ml MAA并涡旋10min，使氯唑西林与功能单体充分预聚合再加入1.8ml TRIM，100mg AIBN并涡旋使之混匀，之后通氮气5min除氧，得氯唑西林聚合液。

（2）、氯唑西林分子印迹聚合膜的制备：

将商品化的PVDF膜浸入上述氯唑西林聚合溶液中，在溶液中继续通氮气5min除氧，之后密闭；静置5min后，将浸透的PVDF转移至已除氧的密闭容器中；然后在紫外交联仪下照射反应12h；之后再将步骤（2）重复操作一次。

将上述聚合所得的膜用甲醇和乙酸的混合液（甲醇/冰醋酸=1/1，v/v）索氏回流洗脱至洗脱液中检测不出模板分子为止（甲醇/冰醋酸能破坏氢键，快速洗脱模板分子），之后再用40%乙腈水溶液将印迹膜洗至中性，得氯唑西林分子印迹聚合膜。

氯唑西林分子印迹聚合膜放在乙腈中保存，使用前取出在室温条件下自然干燥.。

实施例3

（1）、氯唑西林聚合液的制备：

称取200mg氯唑西林于9ml甲醇中，40℃下超声溶解，再加入300μl4-VPY并涡旋5min使氯唑西林与功能单体充分预聚合，再加入2mlEDMA，100mg TPO并涡旋使之混匀，之后通氮气20min除氧，得氯唑西林聚合液。

（2）、氯唑西林分子印迹聚合膜的制备：

将商品化的PVDF膜浸入上述氯唑西林聚合溶液中，并在溶液中继续通氮气20min除氧，之后密闭；静置10min后，将浸透的PVDF转移至已除氧的密闭容器中；然后在紫外交联仪下照射反应3h；之后将步骤（2）重复操作五次。

将上述聚合所得的膜用甲醇和乙酸的混合液（甲醇/冰醋酸=5/1，v/v）索氏回流洗脱至洗脱液中检测不出模板分子为止（甲醇/冰醋酸能破坏氢键，快速洗脱模板分子），之后再用60%乙腈水溶液将印迹膜洗至中性，得氯唑西林分子印迹聚合膜。

氯唑西林分子印迹聚合膜放在乙腈中保存，使用前取出在室温条件下自然干燥（即，室温晾干1-2h即可）

实施例4

（1）、氯唑西林聚合液的制备：

称取200mg氯唑西林于9ml DMAC中，40℃下超声溶解，再加入300μl MAA并涡旋5min使氯唑西林与功能单体充分预聚合，再加入2mlEDMA，100mg TPO并涡旋使之混匀，之后通氮气10min除氧，得氯唑西林聚合液。

（2）、氯唑西林分子印迹聚合膜的制备：

将商品化的PVDF膜浸入上述氯唑西林聚合溶液中，再在溶液中继续通氮气10min除氧，之后密闭；静置20min后，将浸透的PVDF转移至已除氧的密闭容器中；然后在紫外交联仪下照射反应12h；之后将步骤（2）重复操作二次。

下面结合附图对本发明做进一步阐述：

图1是氯唑西林分子印迹聚合膜(MIM)及非印迹聚合膜(NIM)对不同浓度的氯唑西林的等温吸附曲线。在测定的浓度范围内，MIM和NIM对氯唑西林的吸附量随氯唑西林浓度的增加而增加，且MIM的吸附量明显大于NIM，而两者间的差异说明两者空间结构上存在着差异，这主要是由于MIM中存在着大小和排列顺序与模板分子氯唑西林结构互补的空穴。两者吸附量的差值主要来自于这种空穴的特异性选择吸附能力。

图2是Scatchard模型图，用以评价存在不同结合位点的氯唑西林分子印迹聚合膜(MIM)与模板分子氯唑西林间的结合特性。在Scatchard图中，Q/C²与Q之间呈明显的非线性关系，表明MIM对模板分子氯唑西林的结合位点并非一致。图的两端有两个明显的部分分别呈良好的线性关系，这表明MIM对氯唑西林存在两类结合力不同的结合位点。

图3是普通PVDF膜、氯唑西林分子印迹聚合膜（MIM）和氯唑西林非分子印迹聚合膜（NIM）的水通透量比较，并分别对普通PVDF膜与MIM、NIM与MIM的水通流量结果做样本t检验，两组结果P＜0.05，表明MIM与普通PVDF膜、NIM有明显差异。

Claims

1.一种氯唑西林分子印迹聚合膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)氯唑西林聚合液的制备

在上述氯唑西林有机溶液中，加入功能单体，其中模板分子与功能单体物质的量比为1:2—1:12；之后涡旋5—20min，使氯唑西林与功能单体充分预聚合；再加入交联剂和引发剂，其中引发剂与功能单体的物质的量比为1:10—1:20；待混合均匀，即得所需氯唑西林聚合液；

(2)氯唑西林分子印迹聚合膜的制备

将上述氯唑西林聚合溶液通氮气5-20min除氧，浸入聚偏氟乙烯膜，再通氮气5-20min除氧后，静置浸泡5—20min；取出完全浸透的聚偏氟乙烯膜置入已被除氧的器皿中，在紫外交联仪下反应3—12h；将反应完全后得到的膜取出，用甲醇和冰醋酸的混合液洗脱至洗脱液检测不出模板分子为止，然后再用体积浓度为50—80％的乙腈水溶液洗至中性，即得氯唑西林分子印迹聚合膜；

所述致孔剂为二甲基乙酰胺DMAC、N-甲基吡咯烷酮NMP、二甲基甲酰胺DMF、甲醇和二甲基亚砜DMSO的一种或两种以上组合；

所述功能单体为α-甲基丙烯酸MAA或4-乙烯基吡啶4-VPY；

所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯EDMA和三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯TRIM的一种或两种的组合；

所述引发剂为苯基双(2，4，6-三甲基苯甲酰基)氧化膦TPO和偶氮二异丁腈AIBN的一种或两种的组合。

2.根据权利要求1所述的氯唑西林分子印迹聚合膜的制备方法，其特征在于，将步骤(2)所得的氯唑西林分子印迹膜放在乙腈中保存，使用前在室温条件下自然干燥1—2h即可。

3.根据权利要求1所述的氯唑西林分子印迹聚合膜的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述甲醇和冰醋酸的混合液中，甲醇和冰醋酸的体积比为1：(1-9)。