CN103884695A - 一种具有快速检测细菌功能的纳米纤维膜传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测细菌的聚烯烃纳米纤维膜传感器及其制备方法。本发明采用聚烯烃共聚物为基体材料，经表面化学改性、生物活性分子的固相合成工艺，制备出化学改性的聚烯烃纳米纤维膜的生物传感器。采用本发明制备出来的纳米纤维膜生物传感器，在性能方面克服了传统检测细菌存在的细菌培养，数菌落等耗时耗力和准确性差的缺点，利用三磷酸腺苷、荧光素酶、荧光素之间发光原理，快速检测细菌释放出来的ATP，实现了对生物有害物质快速响应的纳米纤维膜传感器。并且由于采用了固相合成，使生物活性酶很好的固定在纳米纤维膜表面，可以起到反复循环地检测细菌。可以广泛地应用在生物技术、医疗卫生、食品药品检测、水处理等领域。

Description

一种具有快速检测细菌功能的纳米纤维膜传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有快速检测细菌功能的纳米纤维膜传感器及其制备方法。

背景技术

生物有害病菌一直是人类健康的重大危害，无论是发展中国家还是发达国家都受此问题的困扰。生物有害病菌问题越来越多的世界各国的广泛的关注。因此，对此方面的研究也是方兴未艾，其中能快速检测细菌的生物传感器的研究更成为了其中的热点。

目前，快速检测细菌的方法可分为生物电化学方法和非生物电化学方法，前者包含阻抗/电导法，电势测定法、染料电池技术、循环/伏安法、电流分析法等检测有微生物活动引起的电极间的电荷转移信号的一类方法。后者包含干重、细菌计数和浊度等传统的统计方法，以及检测核酸、蛋白质、脂类衍生物、新陈代谢等细胞成本分析的方法。其中发展最快的为生物荧光检测法，生物荧光法基于荧光虫发光原理，通过检测三磷酸腺苷(ATP)与荧光素、荧光素酶、镁离子反应的荧光强度来检测细菌。

中国专利申请号201010132186.8，公开日为2011年9月28日，发明了一种荧光法细菌快速检测仪，通过荧光检测探头与光电转换器和光电倍增管相连接，中央处理器上连接有输入、输出设备，通过该设备检测细菌，减少了人工分析数据，降低了劳动强度、成本。荧光法细菌快速检测仪是通过安装在循环水旁路上的荧光检测探头，测量水中细菌所发出的荧光，经光电转换器转换成电信号，传输给放大器放大和单片机处理后，由检测仪输出开关信号控制杀菌剂添加泵的运行，以控制水中的菌藻的总数，从而达到杀菌灭藻的功能。

美国加州大学戴维斯分校的王栋、孙刚等人，利用熔融挤出相分离方法，将热塑性聚烯烃/CAB(醋酸丁酸纤维素)共混体系熔融挤出制备了聚烯烃共聚物纳米纤维，并用高压气流成型技术，制备了不同基体材料为载体的纳米纤维膜。其制备的聚烯烃共聚物包括PVA-co-PE、PE-co-MAA、PE-co-GMA纳米纤维膜。由于该制备出来的纳米纤维膜表面有大量的活性基团，有较大的长径比和尺寸效应，该纳米纤维膜极易被改性，而制备出各种具有特殊功能的纳米纤维膜。将荧光素酶固定在纳米纤维表面，不仅可以达到荧光素酶反复使用的目的，而且由于纳米纤维巨大的比表面积，可以很好的保持荧光素酶的活性。

从上面可以看出，生物荧光法检测细菌是最有望实现即时检测细菌的快速方法。生物荧光法基于荧光虫发光原理，通过检测三磷酸腺苷(ATP)与荧光素、荧光素酶反应的荧光光强来实现ATP的检测，而与所有细菌体内含有ATP的含量大致相同。目前，对于生物荧光法制备的细菌传感器存在着荧光素酶缺乏在适当载体固定、或荧光素酶与载体的相互作用弱，易造成生物荧光素酶的流失和一次性使用，使用成本增加。

发明内容

针对上述存在问题，本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供了一种具有快速检测细菌功能的纳米纤维传感器及其制备方法。为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：

一种快速检测细菌的纳米纤维传感器，所述纳米纤维膜传感器为一种PVA-co-PE的纳米纤维膜表面有共价键键接荧光素酶的聚烯烃共聚物的纳米纤维膜。

所述制备方法包括以下步骤；

A活性PVA-co-PE纳米纤维膜的制备

将PVA-co-PE纳米纤维膜膜浸渍在2～5mol/L的氢氧化钠中，

浸渍温度为15～50℃，

浸渍时间为10～60min，

取出后，浸渍在质量分数为5～20％的三聚氯氰的1，4-二氧六环溶液中；

浸渍温度为15～50℃，

浸渍时间为10～60min，

取出清洗、干燥，得到活性PVA-co-PE纳米纤维膜；

B荧光素酶在活性PVA-co-PE纳米纤维膜表面的固定

将经A步骤得到活性PVA-co-PE纳米纤维膜浸渍在浓度分别为：

荧光素酶            0.1g/L～100g/L

二硫苏糖醇          1～10mmol/L；

EDTA                1～10mmol/L；

Tris-HCl缓冲溶液    1～500mmol/L

的混合溶液中并均匀搅动；

浸渍温度为4℃，

浸渍时间为24小时，

取出后，用1～500mmol/Lris-HCl缓冲溶液清洗三次、取出干燥，即得表面有共价键键接荧光素酶的聚烯烃共聚物的纳米纤维膜。

所述的荧光素为萤火虫荧光素酶或细菌荧光素酶中的一种。

由于采用了上述的技术方案，本发明具有以下特点：

该纳米纤维膜传感器的基材采用PVA-co-PE纳米纤维膜，由于PVA-co-PE纳米纤维膜表面有大量的活性羟基，易于被表面改性。本发明将PVA-co-PE纳米纤维膜，高浓氢氧化钠溶液中将膜表面羟基活化，然后与活性单体三聚氯氰发生亲核加成反应，将生物活性分子荧光素酶固相合成到纳米纤维膜表面，使荧光素酶很好的固定在载体上，扩大了荧光素酶的使用范围。该纳米纤维膜传感器采用荧光素酶为检测部分，活性极高，可以检测浓度10^-15mol/L以下的ATP浓度；该纳米纤维膜传感器表面固定有生物活性的荧光素酶分子，防止普通荧光法检测细菌时造成酶的大量流失，实现了反复循环对灭活细菌的检测，节约了成本。本发明设计思路简单、明确、合理，通过固相合成的方法，将荧光素酶固定在亲水性的聚烯烃纳米纤维膜表面，再进行对荧光素和ATP之间的催化反应。

具体实施方式

一种快速检测细菌的纳米纤维传感器及其制备方法，所述纳米纤维膜传感器为一种PVA-co-PE的纳米纤维膜表面有共价键键接荧光素酶的聚烯烃共聚物的纳米纤维膜。

所述制备方法包括以下步骤；

一种快速检测细菌的生物传感器的制备：

A聚烯烃共聚物纳米纤维膜的制备，所述制备采用中国专利公开号为CN 101553607A的制备方法，即将PVA-co-PE、醋酸丁酸纤维素酯(CAB)按照质量比为1∶4混合均匀，干燥。经双螺杆挤出机熔融共混挤出，收集后，经60℃丙酮回流72小时萃取CAB，得到纤维直径≤500nm的纳米纤维。

将用丙酮萃取好的PVA-co-PE的纳米纤维以质量分数为1％～5％分散到一定的溶剂中，制备成纳米纤维悬浮液。然后利用高压气流成型技术，将纳米纤维悬浮液成型与各种纤维织物上。

B活性PVA-co-PE纳米纤维膜的制备

将PVA-co-PE纳米纤维膜放置在容器中，并加入浓度为2～5mol/L的氢氧化钠溶液至纳米纤维膜完全浸润，置入恒温水浴摇床中，

摇床恒温为15～50℃，

时间为10～60min，

取出后，放置于质量分数为5～20％的三聚氯氰的1，4-二氧六环溶液的容器中，直到纳米纤维膜完全浸润，置入恒温水浴摇床中；

摇床恒温为15～50℃，

时间为10～60min，

取出清洗、干燥，得到活性PVA-co-PE纳米纤维膜；

C荧光素酶在活性PVA-co-PE纳米纤维膜表面的固定

将经B步骤得到活性PVA-co-PE纳米纤维膜放入容器中并浸渍在浓度分别为：

荧光素酶            0.1g/L～100g/L

二硫苏糖醇          1～10mmol/L；

EDTA                1～10mmol/L；

Tris-HCl缓冲溶液    1～500mmol/L

的混合溶液中，并置入恒温水浴摇床中；

摇床恒温为4℃，

时间为24小时，

取出后，用1～500mmol/Lris-HCl缓冲溶液清洗三次、取出干燥，即得表面有共价键键接荧光素酶的聚烯烃共聚物的纳米纤维膜。

所述的荧光素酶为萤火虫荧光素酶或细菌荧光素酶中的一种。

实施例1

按上述方法，制备的PVA-co-PE纳米纤维膜置于容器中，与浓度为在2mol/L氢氧化钠溶液中混合至完全浸润，然后将容器放入恒温水浴摇床中，恒温15℃，时间为30分钟，取出清洗、干燥。然后将NaOH处理好的纳米纤维膜与质量分数为5％三聚氯氰的1，4-二氧六环溶液中在容器中混合均匀至完全浸润，放置于恒温水浴摇床中，恒温15℃，时间为60分钟，取出、清洗、干燥，制备成表面具有活性三嗪的纳米纤维膜。

将上述的活性纳米纤维膜与0.1g/L荧光素酶、1mmol/L二硫苏糖醇、1mmol/L EDTA、1mmol/LTris-HCl缓冲溶液混合溶液中并均匀搅动，浸渍温度为0℃，浸渍时间为12小时，然后用1mmol/L tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液清洗三次以上，即制备表面固定有荧光素酶的纳米纤维膜。即制得可快速检测细菌的纳米纤维传感器。

实施例2

按上述方法，制备的PVA-co-PE纳米纤维膜置于容器中，与浓度为在3mol/L氢氧化钠溶液中混合至完全浸润，然后将容器放入恒温水浴摇床中，恒温25℃，时间为20分钟，取出清洗、干燥。然后将NaOH处理好的纳米纤维膜与质量分数为10％三聚氯氰的1，4-二氧六环溶液中在容器中混合均匀至完全浸润，放置于恒温水浴摇床中，恒温20℃，时间为30分钟，取出、清洗、干燥，制备成表面具有活性三嗪的纳米纤维膜。

将上述的活性纳米纤维膜与1g/L荧光素酶、3mmol/L二硫苏糖醇、3mmol/L EDTA、50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液混合溶液中并均匀搅动，浸渍温度为2℃，浸渍时间为18小时，然后用50mmol/L tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液清洗三次以上，即制备表面固定有荧光素酶的纳米纤维膜。即制得可快速检测细菌的纳米纤维传感器。

实施例3

按上述方法，制备的PVA-co-PE纳米纤维膜置于容器中，与浓度为在4mol/L氢氧化钠溶液中混合至完全浸润，然后将容器放入恒温水浴摇床中，恒温30℃，时间为30分钟，取出清洗、干燥。然后将NaOH处理好的纳米纤维膜与质量分数为15％三聚氯氰的1，4-二氧六环溶液中在容器中混合均匀至完全浸润，放置于恒温水浴摇床中，恒温30℃，时间为40分钟，取出、清洗、干燥，制备成表面具有活性三嗪的纳米纤维膜。

将上述的活性纳米纤维膜与10g/L荧光素酶、5mmol/L二硫苏糖醇、5mmol/L EDTA、100mmol/L Tris-HCl缓冲溶液混合溶液中并均匀搅动，浸渍温度为4℃，浸渍时间为24小时，然后用100mmol/L tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液清洗三次以上，即制备表面固定有荧光素酶的纳米纤维膜。即制得可快速检测细菌的纳米纤维传感器。

实施例4

按上述方法，制备的PVA-co-PE纳米纤维膜置于容器中，与浓度为在5mol/L氢氧化钠溶液中混合至完全浸润，然后将容器放入恒温水浴摇床中，恒温40℃，时间为40分钟，取出清洗、干燥。然后将NaOH处理好的纳米纤维膜与质量分数为20％三聚氯氰的1，4-二氧六环溶液中在容器中混合均匀至完全浸润，放置于恒温水浴摇床中，恒温40℃，时间为50分钟，取出、清洗、干燥，制备成表面具有活性三嗪的纳米纤维膜。

将上述的活性纳米纤维膜与30g/L荧光素酶、7mmol/L二硫苏糖醇、7mmol/L EDTA、200mmol/L Tris-HCl缓冲溶液混合溶液中并均匀搅动，浸渍温度为6℃，浸渍时间为30小时，然后用200mmol/L tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液清洗三次以上，即制备表面固定有荧光素酶的纳米纤维膜。即制得可快速检测细菌的纳米纤维传感器。

实施例5

按上述方法，制备的PVA-co-PE纳米纤维膜置于容器中，与浓度为在3mol/L氢氧化钠溶液中混合至完全浸润，然后将容器放入恒温水浴摇床中，恒温50℃，时间为60分钟，取出清洗、干燥。然后将NaOH处理好的纳米纤维膜与质量分数为20％三聚氯氰的1，4-二氧六环溶液中在容器中混合均匀至完全浸润，放置于恒温水浴摇床中，恒温50℃，时间为60分钟，取出、清洗、干燥，制备成表面具有活性三嗪的纳米纤维膜。

将上述的活性纳米纤维膜与70g/L荧光素酶、9mmol/L二硫苏糖醇、9mmol/L EDTA、200mmol/L Tris-HCl缓冲溶液混合溶液中并均匀搅动，浸渍温度为8℃，浸渍时间为32小时，然后用200mmol/L tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液清洗三次以上，即制备表面固定有荧光素酶的纳米纤维膜。即制得可快速检测细菌的纳米纤维传感器。

实施例6

按上述方法，制备的PVA-co-PE纳米纤维膜置于容器中，与浓度为在3mol/L氢氧化钠溶液中混合至完全浸润，然后将容器放入恒温水浴摇床中，恒温30℃，时间为30分钟，取出清洗、干燥。然后将NaOH处理好的纳米纤维膜与质量分数为10％三聚氯氰的1，4-二氧六环溶液中在容器中混合均匀至完全浸润，放置于恒温水浴摇床中，恒温60℃，时间为120分钟，取出、清洗、干燥，制备成表面具有活性三嗪的纳米纤维膜。

将上述的活性纳米纤维膜与100g/L荧光素酶、10mmol/L二硫苏糖醇、10mmol/L EDTA、500mmol/L Tris-HCl缓冲溶液混合溶液中并均匀搅动，浸渍温度为10℃，浸渍时间为36小时，然后用500mmol/L tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液清洗三次以上，即制备表面固定有荧光素酶的纳米纤维膜。即制得可快速检测细菌的纳米纤维传感器。

采用如下方式对聚烯烃纳米纤维膜传感器进行检测方法如下：

配置一定浓度的荧光素、镁离子、EDTA的Tris-HCl(pH＝7.4)的缓冲溶液，然后将上述的固定好荧光素酶的活性纳米纤维膜在4℃的条件下摇晃，然后与一定浓度的细菌溶液进行混合，然后利用荧光分光光度计进行荧光检测。

各实施例的处理方式如下：

A实施例1～2制备好PVA-co-PE纳米纤维膜传感器，即时按照上述测试方法，进行检测灭活的大肠杆菌的稀溶液；

B实施例3～4制备好PVA-co-PE纳米纤维膜传感器，在4℃的条件下陈化30天，按照上述测试方法，进行检测灭活的大肠杆菌的稀溶液；

C实施例5～6制备好PVA-co-PE纳米纤维膜传感器，在4℃的条件下陈化60天，按照上述测试方法，进行检测灭活的大肠杆菌的稀溶液；

测试结果表明，做如上处理A的实施例1～2，检测的荧光强度为同样浓度的荧光素、灭活大肠杆菌浓度的荧光强度的30倍，做如上处理B的实施例3～4，检测的荧光强度为同样浓度的荧光素、灭活大肠杆菌浓度的荧光强度的25倍，做如上处理C的实施例5～6，检测的荧光强度为同样浓度的荧光素、灭活大肠杆菌浓度的荧光强度的20倍。

结果表明此纳米纤维传感器具有速、敏感检测细菌的优点，即使灭活的大肠杆菌释放的ATP的浓度在10^-12mol/L以下也可以检测出较强的荧光信号。并且该几种纳米纤维膜的传感器具有很好的耐久性，陈化时间60天时，传感器也具有很好的灵敏性和耐久性。

Claims (2)

1.一种快速检测细菌的纳米纤维传感器，其特征在于：所述纳米纤维膜传感器为一种PVA-co-PE的纳米纤维膜表面有共价键键接荧光素酶的聚烯烃共聚物的纳米纤维膜。

2.一种快速检测细菌的纳米纤维传感器的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤；

A活性PVA-co-PE纳米纤维膜的制备

将PVA-co-PE纳米纤维膜膜浸渍在2～5mol/L的氢氧化钠中，

浸渍温度为15～50℃，

浸渍时间为10～60min，

取出后，浸渍在质量分数为5～20％的三聚氯氰的1，4-二氧六环溶液中；

浸渍温度为15～50℃，

浸渍时间为60～120min，

取出清洗、干燥，得到活性PVA-co-PE纳米纤维膜；

B荧光素酶在活性PVA-co-PE纳米纤维膜表面的固定

将经A步骤得到活性PVA-co-PE纳米纤维膜浸渍在浓度分别为：

荧光素酶            0.1g/L～100g/L

二硫苏糖醇          1～10mmol/L；

EDTA                1～10mmol/L；

Tris-HCl缓冲溶液    1～500mmol/L

的混合溶液中并均匀搅动；

浸渍温度为0～10℃，

浸渍时间为12～36小时，

取出后，用1～500mmol/L Tris-HCl缓冲溶液清洗三次、取出干燥，即得表面有共价键键接荧光素酶的聚烯烃共聚物的纳米纤维膜。

所述的荧光素为萤火虫荧光素酶或细菌荧光素酶中的一种。