CN108467726B - 一种用于比率定量检测内源性过氧化氢的近红外荧光探针及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种用于比率定量检测内源性过氧化氢的近红外荧光探针及其制备方法、应用。该近红外荧光探针的结构式为：
。本发明用于比率检测过氧化氢，在过氧化氢存在下对应的荧光波长发生明显位移，可用于外源性以及内源性过氧化氢的检测和定量，并可大大降低外部检测条件的干扰，提高检测精度。此发明比率检测过氧化氢荧光探针的这类化合物，在过氧化氢存在时，紫外吸收亦发生明显变化，可同时用紫外分光光度计及肉眼进行检测。这类化合物作为荧光探针可用于细胞内外过氧化氢水平的检测，这对深入研究过氧化氢在细胞有丝分裂过程中尤其是在研究过氧化氢充当信使分子的功能具有十分重要的指导意义。
Description
技术领域
本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种用于比率定量检测内源性过氧化氢的近红外荧光探针及其制备方法、应用。
背景技术
过氧化氢是一种生物体内小分子，细胞中过氧化氢水平的增加可导致氧化应激并引起细胞损伤。实际上，这种损伤与许多疾病的引发和进展有关，包括神经变性疾病，糖尿病，动脉粥样硬化和癌症。然而，在高等真核生物的研究揭示了过氧化氢也用作调节许多不同的细胞过程的信号分子。
现有技术中，过氧化氢信号传导的研究集中在识别调节过氧化氢产生的机制，随着大规模研究鉴定出越来越多的对硫醇氧化敏感的蛋白质，确定哪些蛋白质在生理条件下被氧化，定量检测细胞内源性过氧化氢等方面研究较少，而且目前存在的用于检测过氧化氢的探针选择性不高，在生物体内受背景荧光的干扰较大，不能很好的揭示过氧化氢在细胞过程以及生物生长发育过程中的作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于比率定量检测内源性过氧化氢的近红外荧光探针。
本发明还提供了一种用于比率定量检测内源性过氧化氢的近红外荧光探针的制备方法。
本发明还提供了上述用于比率定量检测内源性过氧化氢的近红外荧光探针的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
本发明提供了一种用于比率定量检测内源性过氧化氢的近红外荧光探针，该荧光探针的结构式如式Ⅰ所示
本发明还提供了一种上述近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）无水乙腈溶解苯并吲哚和碘乙烷，然后回流反应，得紫色产物a；
（2）量取无水DMF和无水二氯甲烷，混合均匀后得混合溶剂，-10摄氏度冷处理下搅拌20min，逐滴加入POCl3和无水二氯甲烷混合溶液，然后加入10g环己酮，停止冷却2-3h后，升温至45℃后保温加热，将反应得到的黄色液体边倒入冰里边搅拌，过夜，抽滤真空干燥得到黄色固体b；
（3）利用甲苯和正丁醇的混合溶液溶解步骤（2）制备的b和步骤（1）制备的a，，然后加热回流反应，用二氯甲烷比甲醇6:1的硅胶色谱纯化，得到绿色产物c；
（4）取绿色产物c和乙酸钠溶于无水DMF中，氩气保护下反应，用饱和KI洗三次，用二氯甲烷比乙酸乙酯10:1硅胶色谱纯化，得到红色产物d；
（5）将五氟磺酰氯和红色产物d以及三乙胺加入无水二氯甲烷，室温下反应5h，最后用二氯甲烷比甲醇（15:1-5:1）梯度洗脱得到绿色产物e，即探针Cy-Pfs。
进一步的，步骤（1）中，所述每50mL无水乙腈溶解24g苯并吲哚和18g碘乙烷；所述回流为在80℃下回流12h。
进一步的，步骤（2）具体的步骤为：利用40mL无水DMF和40mL无水二氯甲烷混合溶剂溶解步骤（1）制备的产物a，-10℃冷处理下搅拌20min，搅拌过程中逐滴加入37mLPOCl3和35mL无水二氯甲烷混合溶液，然后加入10g环己酮，停止冷却2-3h后，升温至45℃后保温加热3h，将反应得到的黄色液体边倒入冰里边搅拌，过夜，抽滤真空干燥得到黄色固体b。
进一步的，步骤（3）中，所述b和a的质量比为1：6；所述b和混合溶液的料液比为1g：300mL；所述甲苯和正丁醇的体积比为7：3；所述回流反应为80℃下加热回流3h。
进一步的，步骤（4）中，每10mLDMF中加入0.33mmol绿色产物c和0.54g的乙酸钠。
进一步的，步骤（4）中，所述氩气保护下反应的温度为50℃，反应时间为12h。
进一步的，步骤（5）中，所述五氟磺酰氯、三乙胺及无水二氯甲烷的体积比为3：5：2；所述每30μL五氟磺酰氯中加入0.5g红色产物d。
上述制备方法，步骤（5）中，所述室温下反应的时间为5h。
本发明还提供了一种上述近红外荧光探针在定性的检测细胞或生物体内、外的过氧化氢以及定量检测细胞内源性过氧化氢中的应用。
本发明提供的荧光探针在过氧化氢存在下对应的荧光波长发生明显位移，用于过氧化氢的检测过程：
式Ⅰ化合物与待测定生物体内外中的过氧化氢反应，得到结构式 II的化合物。从而导致式Ⅰ化合物的荧光，紫外吸收均发生改变，进而可以用比率荧光的方法进行过氧化氢的定量检测。
本发明用于比率检测过氧化氢，在过氧化氢存在下对应的荧光波长发生明显位移，可用于外源性以及内源性过氧化氢的检测和定量，并可大大降低外部检测条件的干扰，提高检测精度。此发明比率检测过氧化氢荧光探针的这类化合物，在过氧化氢存在时，紫外吸收亦发生明显变化，可同时用紫外分光光度计及肉眼进行检测。这类化合物作为荧光探针可用于细胞内外过氧化氢水平的检测，这对深入研究过氧化氢在细胞有丝分裂过程中尤其是在研究过氧化氢充当信使分子的功能具有十分重要的指导意义。
本发明的有益效果为：
（1）本发明提供的荧光探针在比率检测细胞内过氧化氢时，反应前后具有大的斯托克斯位移，高选择性，高灵敏度。
（2）本发明提供的制备方法，通过控制原料的加入量、加入时间以及反应温度、时间等参数，制备的产物得率高、纯度高。
（3）本发明化合物用于作为比率检测细胞或生物体内的过氧化氢的荧光探针化合物，探针与过氧化氢反应有明显的荧光变化，紫外吸收亦发生明显的变化，进而可以用于生物体内的内源性过氧化氢的检测。
（4）本发明化合物用作荧光探针，可用于细胞内源性过氧化氢进行检测，还可对胎鼠海马区脑部进行原位成像，这对深入研究过氧化氢在生物体内具有的信使分子功能有重要意义。
附图说明
图1为实施例1制备的产物d的核磁谱图。
图2为实施例1制备的探针Cy-Pfs的核磁谱图。
图3为本发明实施例提供的采用的荧光探针对过氧化氢检测前荧光变化图。
图4为本发明实施例提供的采用的荧光探针对过氧化氢检测后荧光变化图。
图5为本发明实施例提供的采用的荧光探针对过氧化氢检测前后紫外吸收变化图。
图6为本发明实施例提供的所采用的荧光探针对过氧化氢的选择性示意图；其中，横坐标从左至右依次为：H202，t-BuO,Glu，TBHP,O2-,NO,.OH,OCl-，Cys，His，GSH
图7为本发明实施例提供的采用荧光探针用于检测细胞内过氧化氢的共聚焦显微镜成像，其中a 代表荧光探针在λem= 750 – 850 nm ( λex = 700 nm) 的成像；b代表荧光探针在λem= 600 – 700nm ( λex = 545 nm)的成像；c代表商业化探针染料在细胞中检测过氧化氢的成像图；d代表商业化细胞核染料在细胞中的成像图。
图8为实施例1制备的荧光探针Cy-Pfs对胎鼠海马区脑部原位成像图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1
基于花菁的式Ⅰ有机化合物的制备：
（1）苯丙吲哚上乙基：50mL无水乙腈溶解苯并吲哚（24g）和碘乙烷（18g）80℃，回流12h，得紫色产物a；
（2）量取40mL无水DMF和40mL无水二氯甲烷混合均匀得混合溶剂，将混合溶剂在-10℃冷处理下搅拌20min，搅拌过程中逐滴加入37mLPOCl3和35mL无水二氯甲烷混合溶液，然后加入10g环己酮，停止冷却2-3h后，升温至45℃后保温加热3h，将反应得到的黄色液体边倒入冰里边搅拌，过夜，抽滤真空干燥得到黄色固体b ；
（3）称取1克b和6克a，利用210mL甲苯和90mL正丁醇的混合溶液溶解b和a，80℃加热回流，用二氯甲烷比甲醇6:1的硅胶色谱纯化。得到绿色产物c；
（4）0.33mmol的c和0.54g的乙酸钠溶在10ml无水DMF中，氩气保护下50℃反应12h，用饱和KI洗三次，用二氯甲烷比乙酸乙酯10:1硅胶色谱纯化。得到红色产物d；产物d的核磁谱图如图1所示；
（5）30μl五氟磺酰氯和0.5g的产物d以及50μl三乙胺在20ml无水二氯甲烷室温反应5h。最后用二氯甲烷比甲醇（15:1-5:1）梯度洗脱得到绿色产物e，即探针Cy-Pfs；产物e的核磁谱图如图2所示；
实施例2
将制备所得式Ⅰ化合物作为探针应用于细胞、组织和器官进行对过氧化氢的检测，模拟生理条件，以下各项实验均在pH = 7.4条件下进行（HEPES缓冲溶液，浓度为40 mM），探针的浓度采用10μM。
上述制备所得式Ⅰ化合物对MAO的紫外响应：
pH采用HEPES缓冲溶液控制。于10 mL比色管中加入10μM化合物式一，再加入40 mMHEPES，然后加入过氧化氢，超纯水稀释并定容到0-200μM，摇匀溶液，平衡10 min后，将上述工作液加入比色皿中测定紫外吸收光谱。紫外吸收光谱在检测过氧化氢前后的变化如图3和4所示，荧光探针对过氧化氢检测前后紫外吸收变化图如图5所示。本化合物可用于实现生物体内的过氧化氢检测。同时，本发明实施例所提供的探针与过氧化氢反应后产物结构如下：
实施例3 式Ⅰ化合物对过氧化氢的选择性
pH采用HEPES缓冲溶液控制。取多个10 ml比色管，并在每个10 ml比色管中加入10μM化合物式一，再加入40 mM pH 为7.4的 HEPES缓冲液，然后分别加入如图6所示，待测物依次为：H202，t-BuO,Glu，TBHP,O2-,NO,.OH,OCl-，Cys，His，GSH。最后用超纯水定容到10 ml。摇匀溶液， 25℃下平衡10 min后，将各个比色管中工作液分别倒入到荧光皿中测定荧光光谱。式一化合物对过氧化氢-的选择性如图6所示。并由图6可知式一化合物对过氧化氢具有很好的选择性，专一性识别过氧化氢。本发明制备的探针较现有技术中过氢化氢探针，选择性更好，且灵敏度高，在生物体内不受背景荧光的干扰，能够很好的揭示过氧化氢在细胞过程以及生物生长发育过程中的作用。
实施例4 式Ⅰ化合物用于细胞内源性过氧化氢的检测
人体表面皮肤癌细胞A431细胞按照American type Tissue Culture Collection规定进行培养。10.0 uM 化合物式一孵育A431细胞 10 分钟，用培养基洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照，结果如图7所示,其中7a 使用的激发波波长为700nm，收集波长范围为750-850 nm,7b使用的激发波波长为545 nm，收集波长范围为600-700 nm ；7c是（商业过氧化氢探针染料）孵育A431细胞10分钟，用培养基洗涤三次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照，使用的激发波长488nm，收集波长500-600nm。然后加入1 uM Hoechest（商品化细胞核染色染料）孵育A431细胞 10 分钟，用培养基洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照，结果如图7d所示。
实施例5 对胎鼠海马区脑部原位成像试验
取出生一周的小鼠，向海马区原位注射探针(100μM,50μL)30min，在小动物荧光成像仪上分别从两个通道获取其对应荧光现象，如图8所示。 从图8中两个通道荧光强度的对比可以看出，探针可以对发育时期小鼠脑部海马区中存在的的过氧化氢进行原位比率荧光成像。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于比率定量检测内源性过氧化氢的近红外荧光探针，其特征在于，该荧光探针的结构式如式Ⅰ所示
2.一种如权利要求1所述近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）无水乙腈溶解苯并吲哚和碘乙烷，然后回流反应，得紫色产物a；
（2）量取无水DMF和无水二氯甲烷，混合均匀后得混合溶剂，-10摄氏度冷处理下搅拌20min，逐滴加入POCl3和无水二氯甲烷混合溶液，然后加入10g环己酮，停止冷却2-3h后，升温至45℃后保温加热，将反应得到的黄色液体边倒入冰里边搅拌，过夜，抽滤真空干燥得到黄色固体b；
（3）利用甲苯和正丁醇的混合溶液溶解步骤（2）制备的b和步骤（1）制备的a，，然后加热回流反应，用二氯甲烷比甲醇6:1的硅胶色谱纯化，得到绿色产物c；
（4）取绿色产物c和乙酸钠溶于无水DMF中，氩气保护下反应，用饱和KI洗三次，用二氯甲烷比乙酸乙酯10:1硅胶色谱纯化，得到红色产物d；
（5）将五氟磺酰氯和红色产物d以及三乙胺加入无水二氯甲烷，室温下反应5h，最后用二氯甲烷比甲醇（15:1-5:1）梯度洗脱得到绿色产物e，即探针Cy-Pfs。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述每50mL无水乙腈溶解24g苯并吲哚和18g碘乙烷；所述回流为在80℃下回流12h。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）具体为：利用40mL无水DMF和40mL无水二氯甲烷混合溶剂溶解步骤（1）制备的产物a，-10℃冷处理下搅拌20min，搅拌过程中逐滴加入37mLPOCl3和35mL无水二氯甲烷混合溶液，然后加入10g环己酮，停止冷却2-3h后，升温至45℃后保温加热3h，将反应得到的黄色液体边倒入冰里边搅拌，过夜，抽滤真空干燥得到黄色固体b。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述b和a的质量比为1：6；所述b和混合溶液的料液比为1g：300mL；所述甲苯和正丁醇的体积比为7：3；所述回流反应为80℃下加热回流3h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，每10mLDMF中加入0.33mmol绿色产物c和0.54g的乙酸钠。
7.根据权利要求2或6所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述氩气保护下反应的温度为50℃，反应时间为12h。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述五氟磺酰氯、三乙胺及无水二氯甲烷的体积比为3：5：2；所述每30μL五氟磺酰氯中加入0.5g红色产物d。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述室温下反应的时间为5h。
10.一种如权利要求1所述的近红外荧光探针在定性的检测细胞或生物体内、外的过氧化氢以及定量检测细胞内源性过氧化氢中的应用。
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