CN112795377B

CN112795377B - 一种具有ict-pet效应的可用于甲醛检测的新型荧光探针制备和应用技术领域

Info

Publication number: CN112795377B
Application number: CN201911103836.3A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Hunan Chaoji Testing Technology Co ltd
Current assignee: Hunan Chaoji Testing Technology Co ltd
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2039-11-13
Also published as: CN112795377A

Abstract

本发明涉及一种具有ICT‑PET效应的可用于甲醛检测的新型荧光探针制备和应用，属于分析化学技术领域，其化学结构如式（I）所示。本发明还公开了所述该荧光探针的制备方法和其在检测环境和生物样本中的应用。本发明的探针随甲醛含量的增加荧光强度显著升高，可用于环境和活细胞等不同体系中的甲醛的检测和荧光成像，具有良好的应用前景。

Description

一种具有ICT-PET效应的可用于甲醛检测的新型荧光探针制备和应用技术领域

本发明涉及荧光探针，特别涉及一种具有ICT-PET效应的可用于甲醛检测的新型荧光探针的制备方法，特别还涉及该荧光分子探针在环境和生物体内的甲醛检测方面的应用，属于化学分析、生物分析检测技术领域。

背景技术

甲醛（Formaldehyde，FA）是一种无色、有强烈刺激性气味的气体。它对人体有致敏、致畸和致癌等毒性，是一种公认的致癌和致畸物质。同时，研究表明，生物体所产生的内源性FA是生命有机体中的重要化学物质，为动物和人类的生理化学反应提供了重要的碳单位。然而，在病理和外部不利因素的影响下，体内产生过量的FA可能会损坏细胞和组织，从而导致阿兹海默等神经退行性疾病。因此、迫切需要开发一种简便、高选择性、高灵敏度的检测方法，对FA的生理功能和疾病诊断具有重要的指导意义。

目前，已有分光光度法、电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法、传感器法等用于FA的检测，然而这些技术存在灵敏度较低，且需要对生物组织的侵入性破坏等问题，限制了进一步的使用。相比之下，荧光成像法则具有灵敏度高、选择性好、设备简单、成本低廉及损伤小等优势，不仅可用于离子、小分子和生物大分子的定性定量检测，也可用于细胞和组织的成像研究，将为FA在生物体内的活性研究提供巨大的价值。已有多种策略用于FA的探针设计中，包括甲胺或肼的形成，氨基的形成，Aza-Cope的重排反应等。然而这些探针都是通过与FA的特异性反应来设计和开发的，通常消耗待测液甚至是细胞中的FA，可能会影响或破坏动态平衡。因此，本发明专利提供了一种截然不同的检测方法，即探针在与FA发生特异性反应并产生荧光信号的同时，释放出FA分子，从而不改变待测环境中FA的含量。

发明内容

针对现有检测的FA荧光探针存在的不足，本发明的第一个目的是在于提供一种操作简单、原料易得的制备FA荧光分子探针的方法。

本发明的第二个目的在于提供上述荧光分子探针在水溶液和生物体内FA的检测应用。

为了实现以上技术目的，本发明提供了一种荧光探针，该荧光探针的结构如式I所示：

式I

所述荧光探针的制备方法优选为：

将2-氨基苯硫酚和3-氨基水杨酸溶于多聚磷酸（PPA）中。185℃下反应完全，抽滤、收集并洗涤滤饼后，硅胶柱层析纯化，得到黄色固体粉末。将纯化后的产物溶于冰醋酸中，加入马来酸酐，加热回流至反应完全，待反应体系冷却后，倒入冷水中，抽滤、收集并洗涤滤饼后，硅胶柱层析纯化，得到黄色固体粉末。将纯化后的产物溶于THF溶液中，加入4-硝基苄胺，室温下反应完全，将体系减压蒸干，硅胶柱层析纯化，旋蒸除去溶剂后得到目标分子探针。

本发明的合成如下所示：

本发明提供了一种所述荧光探针的应用，可应用于FA的检测。该探针的检测原理为：由于分子内电荷转移作用（intramolecular charge transfer，ICT)被抑制，以及存在光致电子转移作用（photo-induced electron transfer，PET）探针本身无荧光，与FA反应后，ICT作用得以恢复，PET作用被抑制，探针在463 nm处呈现荧光发射，可通过加入FA前后的的荧光强度变化实现FA的检测。检测机理如下所示：

本发明提供了一种所述荧光探针测定FA方法。测定方法是：在室温条件下，所述荧光探针溶解于PBS缓冲溶液，乙腈、二氯甲烷或二甲基亚砜与PBS缓冲溶液按照一定比例配置的溶液中，将其浓度配置成10 μM-40 μM。将不同浓度的FA水溶液加入到探针体系中，测定溶液的荧光强度，通过荧光强度与FA浓度的线性关系是实现对FA的定量检测。

上述检测方法，优选的，溶剂体系为PBS:CH₃CN= 3:7 (v/v)。

上述检测方法，优选的，pH为7.4。

上述检测方法，优选的，荧光探针浓度为10 μM。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

（1）本发明的荧光探针捕获FA发生结构变化，从而产生荧光信号，并且反应后中释放FA，不会影响生理环境的稳定，有利于FA的生物成像，在生命科学领域具有较强的实际应用价值。

（2）本发明的荧光探针制备方法简单、成本低廉、无需复杂仪器，有利于规模化生产，使得其适合推广运用。

附图说明

【图1】本发明实施中荧光探针的荧光强度随FA浓度变化的发射光谱图；

【图2】本发明实施中荧光探针在HeLa细胞内荧光共聚焦成像图。

具体实施方式

以下实施方式旨在进一步阐释说明本发明而不是对本发明的限定。

实施例1

化合物1的合成

将2-氨基苯硫酚（375.57 mg，3.0 mmol）和3-氨基水杨酸（459.39 g，3.0 mmol）的混合物溶于10 ml多聚磷酸（PPA）中。185℃下搅拌至反应完全，然后将反应体系倒入冷水中，有黄色沉淀产生。抽滤、收集滤饼，并用10 %Na₂CO₃溶液洗涤滤饼，可得到绿色固体622.63 mg，产率为85.7 %。

化合物2的合成

将化合物1（484.58 mg，2 mmol）和马来酸酐（245.13 mg，2.5 mmol）溶解于40 ml冰醋酸中，加热回流至反应完全，待反应体系冷却后，倒入冷水中，得到黄色沉淀。抽滤、收集滤饼，并用10 %Na₂CO₃溶液洗涤滤饼，硅胶柱层析纯化，旋蒸除去溶剂后得到黄色固体产物538.38 mg，产率为83.6 %。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.18 (d, 1H, J=7.5 Hz),8.01 (d, 1H, J= 7.5 Hz), 7.53-7.55 (t, 2H, J=8.1 Hz,), 7.36 (d, 1H, J=8.7 Hz ),7.23 (t, 1H, J=8.2 Hz), 7.20 (d, 1H, J=8.7 Hz ), 6.94-6.96 (d, 2H, J=7.8 Hz).

目标分子探针的合成

将化合物2（322 mg，1 mmol）和4-硝基苄胺（188 mg，1 mmol）溶于2 ml THF溶液中，室温下搅拌至反应完全。将体系减压蒸干，硅胶柱层析纯化，减压蒸干溶剂后可得目标分子探针422.8 mg，产率为89.2 %。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.18 (d, 1H, J=7.4Hz), 8.11 (d, 2H, J= 8.0 Hz), 8.02 (d, 1H, J= 7.4 Hz), 7.95(d, 2H, J= 8.0Hz), 7.52-7.56 (t, 2H, J=8.0 Hz,), 7.37 (d, 1H, J=8.6 Hz ), 7.24 (t, 1H, J=8.2 Hz), 7.21 (d, 1H, J=8.6 Hz ), 3.90 (t, 1H, J=5.4 Hz), 3.82(s, 2H), 2.91(d, 2H, J=2.9 Hz). HRMS-ESI, calculated [M+H]⁺: 475.2372, found [M+H]⁺:475.2385.

实施例2

荧光探针母液的制备

将上述分离得到的纯度在99 %以上的产物，准确称量4.74 mg并小心转移于50 mL的容量瓶中，室温下加入CH₃CN溶液并使之完全溶解，定容至刻度线，得浓度为1 mM的探针母液。在测试过程中，每次用微量进样器量取20 μL的上述溶液，将其溶于测试体系中，使得每次测试总体积为2 mL，此时荧光探针的浓度为10 μM。

实施例3

FA母液的制备

FA用PBS缓冲溶液配制成5 mL不同的浓度梯度（0.1 mM、0.2 mM、0.4 mM、0.7 mM、1.0 mM、1.5 mM、2.0 mM、3.0 mM）的母液。其余测试需要使用的待测物则分别用PBS缓冲溶液配制成浓度为3 mM的母液。

实施例4

荧光探针荧光强度与FA浓度的关系

量取4.900 mL PBS缓冲溶液，将50 μL浓度为1 mM的探针母液溶解其中，再移取50μL不同浓度的FA母液中，使得最终整个检测体系探针的浓度为10 μM，而FA的浓度则分别为1 μM、2 μM、4 μM、7 μM、10 μM、15 μM、20 μM、30 μM。室温孵育20 min后，分别在10 mm的比色皿中测试不同体系的荧光光谱（附图1）。结果表明，随着FA浓度逐渐增加，体系在463 nm处的荧光发射强度逐渐增强。

实施例5

荧光探针对细胞中FA的响应

在HeLa培养基中加入10 μM的荧光探针溶液，置于 37 ^oC，5 %的CO₂下在培养箱中孵育30分钟后，用0.1 M的PBS 缓冲液（10 mM，pH=7.4）洗涤三次，除去未进入细胞的探针分子，然后更换培养基，再由FA缓冲溶液（50 μM）培养30分钟，用0.1 M的PBS 缓冲液（10 mM，pH=7.4）洗涤三次，置于荧光显微镜下观察其荧光变化，结果如附图2所示。实验表明进入细胞体内的探针分子和FA反应，发出强烈的蓝色荧光，因此该荧光探针对细胞中的FA有良好的成像作用，可用于检测生物体内的FA。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明范围的限制，本领域的相关技术人员能从发明公开的内容不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种具有ICT-PET效应的可用于甲醛检测的荧光探针，其特征在于，具有式（I）结构：

式（I）。

2.根据权利要求1所述的可用于甲醛检测的荧光探针制备方法，其特征在于：将2-氨基苯硫酚和3-氨基水杨酸溶于多聚磷酸（PPA）中，185℃下反应完全，抽滤、收集并洗涤滤饼后，硅胶柱层析纯化，得到黄色固体粉末，将纯化后的产物溶于冰醋酸中，加入马来酸酐，加热回流至反应完全，待反应体系冷却后，倒入冷水中，抽滤、收集并洗涤滤饼后，硅胶柱层析纯化，得到黄色固体粉末，将纯化后的产物溶于THF溶液中，加入4-硝基苄胺，室温下反应完全，将体系减压蒸干，硅胶柱层析纯化，旋蒸除去溶剂后得到目标分子探针。

3.根据权利要求1所述荧光探针的用途，其特征在于，用于非疾病的诊断和治疗的环境和生物样本中的甲醛的检测和荧光定量分析。

4.根据权利要求3所述荧光探针的用途，其特征在于，甲醛的检测条件为：激发波长为380 nm，在400-700 nm范围内进行荧光发射光谱的检测，检测体系的pH为6.0-8.6，检测体系的溶剂为PBS:CH₃CN= 3:7。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，将待测样品加入到荧光探针的检测溶液中，若溶液的荧光呈现蓝色，则表明待测样品中含有甲醛，若无明显蓝色荧光，则表明待测样品中未含有甲醛，测定溶液的荧光强度还可作为甲醛浓度的评价指标。