CN111217799A - 一种吲哚盐-香豆素衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种吲哚盐‑香豆素衍生物及其合成方法和应用，所述衍生物的中文名称为(E)‑1‑(2‑羧乙基)‑2‑(2‑(7‑(二乙氨基)‑2‑氧代‑2H‑铬‑3‑基)乙烯基)‑3,3‑二甲基‑3H‑吲哚‑1–阳离子，英文名称为(E)‑1‑(2‑carboxyethyl)‑2‑(2‑(7‑(diethylamino)‑2‑oxo‑2H‑chromen‑3‑yl)vinyl)‑3,3‑dimethyl‑3H‑indol‑1‑ium，命名为Mito‑CI，该试剂可以高效可逆检测二氧化硫。检测方法是在pH为7.4的纯PBS的缓冲溶液中，通过荧光分光光度计检测二氧化硫。该检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

Description

一种吲哚盐-香豆素衍生物及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及香豆素衍生物，具体属于一种吲哚盐-香豆素衍生物及其合成方法，以及该衍生物在比率可逆检测二氧化硫中的应用。
背景技术
在自然界中存在着多种活性含硫化合物，诸如首要的空气污染物SO2及半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和还原型谷胱甘肽(GSH)等小分子。其中，在pH＝7.4生理条件下，SO2可以水解成亚硫酸根离子和亚硫酸氢根离子(3:1,M/M)，它们在生命活动过程中发挥着至关重要的作用。内源性的二氧化硫已被证实与许多生理和病理过程相关，如抗菌、抗高血压、抗氧化以及对心肌缺血再灌注损伤的保护作用等，还可以增强细胞抗氧化作用，并且在信号传导过程中起重要作用。但是病理学研究表明过量的亚硫酸盐/亚硫酸氢盐会对细胞和一些组织造成毒性反应，不仅造成如肺癌、哮喘等呼吸系统疾病；还会导致中风、过敏、偏头痛、缺血性心脏病、脑肿瘤、心血管疾病及神经系统紊乱等疾病。最近研究发现，GSH是生产内源性SO2的主要原料之一，并且高浓度的SO2可能通过上调NO/cGMP信号通路导致血管舒张。而甲醛恰恰可以通过介导蛋白质S的亚硝基化解除NO信号通路的调控，并且蛋白质S的亚硝化过程中甲醛的吸收和增强可能导致极低的局部GSH浓度。这些结论表明SO2与HCHO有密切的关系。由于目前SO2和HCHO在生物系统中的潜在相互作用仍然未知所以在复杂的细胞生理环境中对SO2的特异性识别将有助于阐明二者在生理、病理等生命活动过程中的联系。虽然目前许多实验室都在研究二氧化硫的荧光检测，但是目前没有具有线粒体靶向同时用HCHO可逆性检测SO2的荧光探针，因此开发线粒体靶向、高效可逆检测SO2的荧光探针对于生物系统的整体健康是非常重要的。
针对以上存在的问题，设计选择性好、灵敏度高、线粒体靶向、具有低细胞毒性并且可逆的荧光探针用于检测活细胞和组织内SO2水平变化，已成为当前生物医学发展中具有挑战性的前沿课题之一。
在本发明中，合成了一种基于吲哚盐-香豆素的化合物，通过探针与SO2在反应前后双通道荧光变化与HCHO的加入而荧光恢复，实现了对SO2的可逆性检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种吲哚盐-香豆素衍生物及其合成方法，以及该衍生物在比率可逆检测SO2中的应用，且检测方法简单，操作方便，选择性好，灵敏度高。
本发明提供的一种吲哚盐-香豆素衍生物，中文名称为(E)-1-(2-羧乙基)-2-(2-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-铬-3-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1–阳离子，英文名称为(E)-1-(2-carboxyethyl)-2-(2-(7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromen-3-yl)vinyl)-3,3-dimethyl-3H-indol-1-ium，命名为Mito-CI，结构式为：
Figure BDA0002394217260000021
本发明提供的一种吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI的合成方法，步骤为：
(1)将4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和丙二酸二乙酯在无水乙醇中混合，往混合物中缓缓加入1当量的哌啶，将混合物在85℃加热反应12小时后，减压除去溶剂，加入35当量浓乙酸和同体积的HCl的混合物，将反应物在120℃下回流13小时；冷却至25℃后，将反应混合物倒入冰水中，其中无水乙醇、浓乙酸和浓盐酸的总体积与冰水的体积比为1:1-1.5；加入NaOH溶液(40％)将pH提高至5，立即形成棕色沉淀。将混合物过滤并用水洗涤四次，在真空中干燥，得到黄棕色固体，即7-二乙氨基香豆素，其中4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和丙二酸二乙酯的摩尔比为1：1.5-2.5；
(2)在0℃下，按体积比为1：1将三氯氧磷缓慢滴加到DMF中，搅拌30分钟，得到红色液体。将7-二乙氨基香豆素与DMF的混合溶液倒入混合物中，得到猩红色悬浮液，将反应混合物在65℃加热13小时。将反应混合物加入冰水中，其中溶剂与冰水对的体积比为1:6-6.5；加入NaOH(40％)溶液以将pH提高至5，出现沉淀；过滤混合物，用水洗涤，干燥并在无水乙醇中重结晶，得即7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛，其中7-二乙氨基香豆素和三氯氧磷的摩尔比为1:3-3.5；
(3)将2,3,3-三甲基-3H-吲哚和3-溴丙酸在无水乙腈中混合，将混合物在85℃加热反应12小时后，减压除去溶剂，所得残渣用乙醚洗涤三次除去未反应原料，残余物用体积比1:5的二氯甲烷与丙酮重结晶得到浅紫色粉末状产物，即1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物，其中2,3,3-三甲基-3H-吲哚和3-溴丙酸的摩尔比为1：1.5-2.5；
(4)将1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物和7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-亚甲基-3-甲醛溶解在无水乙醇中，混合物在85℃搅拌回流12小时，然后冷却至室温，过滤收集滤液减压旋干，以体积比25:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，纯化得即(E)-1-(2-羧乙基)-2-(2-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-铬-3-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1–阳离子，其中1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物和7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-亚甲基-3-甲醛的摩尔比为1：1-1.5。
作为优选：
所述的步骤(1)中4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和丙二酸二乙酯的摩尔比为1：2。
所述的步骤(2)中7-二乙氨基香豆素和三氯氧磷的摩尔比为1：3.2。
所述的步骤(3)中2,3,3-三甲基-3H-吲哚和3-溴丙酸的摩尔比为1：2。
所述的步骤(4)中1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物和7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛的摩尔比为1：1。
本发明合成的Mito-CI可用于比率可逆检测SO2。
本发明提供的一种比率可逆检测二氧化硫的方法，步骤为：
(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用亚硫酸钠配制2mM的二氧化硫水溶液，将吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI溶于DMSO配制成2mM的溶液；
(2)、取2mL的纯PBS缓冲溶液、10μL Mito-CI的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样二氧化硫的加入，481nm处的荧光强度逐渐增强，655nm处的荧光强度逐渐降低；
(3)、取2mL的纯PBS缓冲溶液、10μL Mito-CI的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，加入100μL二氧化硫溶液，随着甲醛的水溶液的加入，481nm处的荧光强度逐渐降低，655nm处的荧光强度逐渐增强；
(4)、用蒸馏水配制2mM的亚硫酸钠溶液，将纯PBS缓冲溶液加到2mL荧光比色皿中，逐渐加入二氧化硫溶液的体积为0、20、40、60、80μL，同时在荧光光谱仪上测定，以二氧化硫浓度为横坐标，以I481/I655为纵坐标绘制图，得到二氧化硫浓度的工作曲线；线性回归方程为：I481/I655＝0.10c+9.63，c的单位为10-6mol/L。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
1、本发明吲哚盐-香豆素衍生物合成简单，成本低廉；
2、本发明吲哚盐-香豆素衍生物能实现线粒体靶向、比率可逆检测二氧化硫，检测结果灵敏度高，选择性好；
3、本发明检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现；
4、本发明采用双通道检测，检测信号明显且专一性强。
附图说明
图1实施例1制备的吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI的核磁氢谱图
图2实施例1制备的吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI的核磁碳谱图
图3实施例1制备的吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI的质谱图
图4吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI与二氧化硫作用的荧光发射图
图5吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI-SO3 2－与甲醛溶液作用的荧光发射图
图6吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI与各种分析物的荧光柱状图
图7吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI测定二氧化硫的工作曲线
图8吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI可逆测定二氧化硫细胞成像图
图9共定位细胞成像图
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
Mito-CI的制备和表征
将丙二酸二乙酯(6.08g，38mmol)，4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛(3.67g，19mmol)和哌啶(2.0mL)与无水乙醇(60mL)混合，然后将混合物回流12小时。反应完成后，在减压下蒸发溶剂。接下来，加入浓乙酸(40mL)和HCl(40mL)的混合物，将反应物在120℃下回流13小时。接下来，冷却至25℃后，将反应混合物倒入200ml 0℃的水中。加入NaOH溶液(40％)将pH提高至5，立即形成棕色沉淀。，将混合物过滤并用水洗涤四次，在真空中干燥，获得黄棕色固体。(3.92g,产率:95％)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.82(d,J＝9.3Hz,1H),7.42(d,J＝8.8Hz,1H),6.68(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.51(d,J＝2.3Hz,1H),5.99(d,J＝9.3Hz,1H),3.42(q,J＝7.0Hz,4H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ156.80,144.96,129.78,109.22,108.62,97.04,44.49,12.77.
在0℃下将三氯氧磷(6mL)缓慢加入到DMF(6mL)中，搅拌30分钟，得到红色液体。将7-二乙氨基香豆素(4.50g，20.7mmol)的DMF(35mL)溶液倒入混合物中，得到猩红色悬浮液，将反应混合物在65℃加热13小时。接下来，将反应混合物加入300mL的0℃水中。加入NaOH(40％)溶液以将pH提高至5，出现沉淀。过滤混合物，用水洗涤，干燥并在乙醇中重结晶，得到7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛。(3.0g,产率:58％)。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.89(s,1H),8.41(s,1H),7.68(d,J＝9.0Hz,1H),6.82(d,J＝9.0Hz,1H),6.60(s,1H),3.51(q,J＝7.0Hz,4H),1.15(t,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ187.60,161.21,158.92,153.89,146.61,133.55,113.58,110.94,108.14,96.83,45.01,12.83.
将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(3.18g,20mmol)和3-溴丙酸(6.08g,40mmol)在30mL无水乙腈中混合，将混合物在85℃加热反应12小时；反应完成后减压除去溶剂，所得残渣用20mL乙醚洗涤三次除去未反应原料，残余物用体积比二氯甲烷(5mL)与丙酮(25mL)重结晶得到浅紫色粉末状产物(3.78g,产率:57.7％)。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.69(s,1H),7.99(d,J＝4.3Hz,1H),7.85(d,J＝4.0Hz,1H),7.65–7.59(m,2H),4.66(t,J＝6.8Hz,2H),2.99(t,J＝6.9Hz,2H),2.86(s,3H),1.53(s,6H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ198.40(s),172.01(s),142.23(s),141.32(s),129.82(s),129.39(s),123.95(s),116.04(s),54.73(s),43.99(s),31.57(s),22.34(s),14.82(s).
将7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛(98.0mg，0.4mmol)和1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物(92.9mg，0.4mmol)在无水乙醇(40mL)中混合，回流12小时。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂。粗产物用体积比25:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，得到所需的Mito-CI(102.87mg,产率:56％)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.82(s,1H),8.21(d,J＝13.4Hz,1H),7.82(d,J＝10.6Hz,2H),7.80(d,J＝8.0Hz,1H),7.61–7.54(m,2H),7.52(d,J＝7.3Hz,1H),6.98–6.87(m,1H),6.71(s,1H),4.60(s,2H),3.56(d,J＝6.6Hz,4H),2.88(s,2H),1.73(s,6H),1.18(t,J＝6.8Hz,6H).(图1)13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ171.76,159.86,158.06,154.38,141.50,132.81,129.33,123.29,112.84,111.75,109.88,97.04,51.85,45.31,32.14,26.51,21.55,12.96.(图2)ESI-MS m/z:[Mito-CI+H]+Calcd.For 459.2278,Found 459.2283(图3).
实施例2
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mMMito-CI的DMSO溶液，配制2mM二氧化硫水溶液；取2mL纯PBS缓冲溶液、10μL Mito-CI的DMSO溶液加入到一个荧光比色皿中，取二氧化硫的水溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，加样的同时在荧光分光光度仪上检测，随着二氧化硫的加入，481nm的荧光强度逐渐增强，655nm的荧光强度逐渐降低。荧光发射图见图4。
实施例3
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mMMito-CI的DMSO溶液，配制2mM二氧化硫水溶液，配制2mM的甲醛水溶液，取2mL纯PBS缓冲溶液、10μL Mito-CI的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，加入100μL二氧化硫的水溶液，制成Mito-CI-SO3 2－的DMSO溶液，取甲醛的水溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，加样的同时在荧光分光光度仪上检测，随着甲醛水溶液的加入，481nm的荧光强度逐渐降低，655nm的荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图5。
实施例4
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mMMito-CI的DMSO溶液，配制2mM二氧化硫水溶液；在荧光比色皿中，各加入2mL的纯PBS缓冲溶液和10μL Mito-CI的DMSO溶液，再分别加入10倍当量的其它分析物和二氧化硫：Mito-CI,K+,Mg2+,Na+,NO3 －,I－,SO4 2－,CH3COO－,N3 －,H2PO4 －,NO2 －,H2S,Cys,GSH,SO3 2－的水溶液，在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的481nm与655nm两处的荧光强度比值柱状图(见图6)。二氧化硫使得检测体系在481nm处荧光强度明显增强，655nm处荧光强度明显降低，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。
实施例5
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mMMito-CI的DMSO溶液，配制2mM二氧化硫水溶液；在5个比色皿中各加入2mL的纯PBS缓冲溶液和10μL Mito-CI的DMSO溶液，然后分别加入二氧化硫溶液的体积为0、20、40、60、80μL，同时在荧光光谱仪上测定，以二氧化硫浓度为横坐标，以I481/I655为纵坐标绘制图，得到二氧化硫浓度的工作曲线；线性回归方程为：I481/I655＝0.10c+9.63，c的单位为10-6mol/L，见图7。
实施例6
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mMMito-CI的DMSO溶液，配制2mM二氧化硫水溶液；把10μLMito-CI的DMSO溶液加入到2mL的PBS缓冲溶液中；将探针溶液加入HepG-2细胞培养液中，使得其浓度为10μM，与HepG-2细胞在37℃下，反应20min，体系在荧光成像仪下有微弱蓝色荧光，与明显的红色荧光；然后再加入外源的二氧化硫，使其浓度为40μM，在37℃下，反应20min，体系在荧光成像仪下显示蓝色荧光增强，红色荧光淬灭。最后再加入外源的甲醛溶液，使其浓度为40μM，在37℃下，反应20min，体系在荧光成像仪下显示蓝色荧光淬灭，红色荧光增强，见图8。
实施例7
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mMMito-CI的DMSO溶液，配制2mM二氧化硫水溶液；把10μL Mito-CI的DMSO溶液加入到2mL的PBS缓冲溶液中；将探针溶液加入HepG-2细胞培养液中，使得其浓度为10μM，与HepG-2细胞在37℃下，反应10min；将体系在荧光成像仪下观测；紧接着将0.2μMMito-Tracker Green加入刚刚的体系中，在37℃下，反应10min。将体系在荧光成像仪下观测，同时对得到的荧光图片进行共定位率计算，见图9。

Claims (8)

1.一种吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI，其特征在于，结构式为：
Figure FDA0002394217250000011
2.如权利要求1所述的一种吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI的合成方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和丙二酸二乙酯在无水乙醇中混合，往混合物中缓缓加入1当量的哌啶，将混合物在85℃加热反应12小时后，减压除去溶剂，加入35当量浓乙酸和同体积的HCl的混合物，将反应物在120℃下回流13小时；冷却至25℃后，将反应混合物倒入冰水中，其中无水乙醇、浓乙酸和浓盐酸的总体积与冰水的体积比为1:1-1.5；加入NaOH溶液将pH提高至5，立即形成棕色沉淀；将混合物过滤并用水洗涤四次，在真空中干燥，得到黄棕色固体，即7-二乙氨基香豆素，其中4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和丙二酸二乙酯的摩尔比为1：1.5-2.5；
(2)在0℃下，按体积比为1：1将三氯氧磷缓慢滴加到DMF中，搅拌30分钟，得到红色液体；将7-二乙氨基香豆素与DMF的混合溶液倒入混合物中，得到猩红色悬浮液，将反应混合物在65℃加热13小时；将反应混合物加入冰水中，其中溶剂与冰水对的体积比为1:6-6.5；加入NaOH溶液将pH提高至5，出现沉淀；过滤混合物，用水洗涤，干燥并在无水乙醇中重结晶，得即7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛，其中7-二乙氨基香豆素和三氯氧磷的摩尔比为1:3-3.5；
(3)将2,3,3-三甲基-3H-吲哚和3-溴丙酸在无水乙腈中混合，将混合物在85℃加热反应12小时后，减压除去溶剂，所得残渣用乙醚洗涤三次除去未反应原料，残余物用体积比1:5的二氯甲烷与丙酮重结晶得到浅紫色粉末状产物，即1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物，其中2,3,3-三甲基-3H-吲哚和3-溴丙酸的摩尔比为1：1.5-2.5；
(4)将1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物和7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-亚甲基-3-甲醛溶解在无水乙醇中，混合物在85℃搅拌回流12小时，然后冷却至室温，过滤收集滤液减压旋干，以体积比25:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，纯化得即(E)-1-(2-羧乙基)-2-(2-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-铬-3-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1–阳离子，其中1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物和7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-亚甲基-3-甲醛的摩尔比为1：1-1.5。
3.如权利要求2所述的Mito-CI的合成方法，其特征在于，所述的步骤(1)中4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和丙二酸二乙酯的摩尔比为1：2。
4.如权利要求2所述的Mito-CI的合成方法，其特征在于，所述的步骤(2)中7-二乙氨基香豆素和三氯氧磷的摩尔比为1：3.2。
5.如权利要求2所述的Mito-CI的合成方法，其特征在于，所述的步骤(3)中2,3,3-三甲基-3H-吲哚和3-溴丙酸的摩尔比为1：2。
6.如权利要求2所述的Mito-CI的合成方法，其特征在于，所述的步骤(4)中1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物和7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛的摩尔比为1：1。
7.如权利要求1所述的吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI在检测二氧化硫中的应用。
8.一种比率可逆检测二氧化硫的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用亚硫酸钠配制2mM的二氧化硫水溶液，将权利要求1所述的吲哚盐-香豆素衍生物Mito-CI溶于DMSO配制成2mM的溶液；
(2)、取2mL的纯PBS缓冲溶液、10μL Mito-CI的DMSO溶液加入到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样二氧化硫的加入，481nm处的荧光强度逐渐增强，655nm处的荧光强度逐渐降低；
(3)、取2mL的纯PBS缓冲溶液、10μL Mito-CI的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，加入100μL二氧化硫溶液，随着甲醛的水溶液的加入，481nm处的荧光强度逐渐降低，655nm处的荧光强度逐渐增强；
(4)、用蒸馏水配制2mM的亚硫酸钠溶液，将纯PBS缓冲溶液加到2mL荧光比色皿中，逐渐加入二氧化硫溶液的体积为0、10、20、30、40μL，同时在荧光光谱仪上测定，以二氧化硫浓度为横坐标，以I481/I655为纵坐标绘制图，得到二氧化硫浓度的工作曲线；线性回归方程为：I481/I655＝0.10c+8.13，c的单位为10-6mol/L。
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