CN112794847B

CN112794847B - 一种顺序检测水合肼和亚硫酸氢根的新型荧光探针及其合成及应用

Info

Publication number: CN112794847B
Application number: CN201911104264.0A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Hunan Chaoji Testing Technology Co ltd
Current assignee: Hunan Chaoji Testing Technology Co ltd
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2039-11-13
Also published as: CN112794847A

Abstract

本发明涉及一种顺序检测水合肼和亚硫酸氢根的新型荧光探针及其合成及应用，属于分析化学技术领域。该探针的化学结构如式（I）所示，可基于ESIPT和ICT机理顺序检测水合肼和亚硫酸氢根。由于ESIPT和ICT被抑制，该探针在水溶液中无荧光；当加入了水合肼溶液后，ESIPT和ICT作用恢复，使之在615 nm处荧光显著增强；而在“探针+水合肼”体系中继续加入亚硫酸氢根溶液时，ICT作用被抑制，使得最大发射波长蓝移至508 nm处。通过明显的荧光变化，从而实现对这两种物质的顺序检测。本发明所述的荧光探针不仅操作简便、选择性好、灵敏度高、光学性能稳定，且为多功能荧光探针的发展提供了重要思路。

Description

一种顺序检测水合肼和亚硫酸氢根的新型荧光探针及其合成及应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种顺序检测水合肼和亚硫酸氢根的新型荧光探针及其合成及应用。

背景技术

水合肼（N₂H₄•H₂O）是一种无色透明的碱性油状液体，具有强还原性，在农药领域、医药领域和精细化工领域等许多合成领域中有着重要作用；同时，它还具有易燃易爆性，也可在火箭推进系统中作为高能燃料和炸药原料使用。然而，水合肼所具有的剧毒和不稳定性，也使得其在生产、运输、使用等过程当中容易造成环境污染。同时水合肼具有良好的水溶性，易被人体吸收且不易排出体外，当它通过呼吸、饮食或皮肤接触等途径进入人体后，会通过诱导体内生产过量的缺陷蛋白质来破坏DNA，并代谢成有毒的自由基。因此，长期接触会对肝，肾，肺和中枢神经系统产生严重危害。美国环境保护局（EPA）已将其列为潜在的人类致癌物，并限定其最高允许值为10 ppb。

亚硫酸氢根（HSO₃）具有良好的抗氧化能力，可在食品工业中作为保鲜剂和防腐剂以防止微生物生长并抑制褐变。此外它还在染料、制革、造纸和有机合成等作为还原剂而应用。但是，亚硫酸氢根具有毒性，并且高浓度的亚硫酸氢盐会诱发过敏性疾病、胃肠道疾病和哮喘等疾病。因此，食品和药品中的亚硫酸氢根的含量必须严格控制在安全范围内。美国食品药品监督管理局要求对含有亚硫酸氢根超过10 μg/mL的产品进行标识。因此，建立一种方便快捷、高灵敏度、高选择性的检测水合肼和亚硫酸氢根含量的方法，具有非常重要的意义。

近年来，荧光探针因具有操作简便、成本低廉、灵敏度高、选择性好、实时监测和非侵入性等优点，已作为有力的手段被广泛用于离子、小分子等物质的检测。已有大量可用于水合肼、亚硫酸氢根检测的探针被报道，然而可同时检测水合肼、亚硫酸氢根的探针鲜有报道，可顺序检测水合肼、亚硫酸氢根的探针更是未有报道。CN 108440476 A报道了一个利用氰基乙烯基取代的氨基香豆素衍生物，通过氰基乙烯基作为识别基团与水合肼、亚硫酸氢根产生反应,形成具有不同结构的氨基荧光素衍生物，并将信号传导至氨基香豆素荧光基团，促使其荧光发射波长发生改变，从而可用于水合肼和亚硫酸氢根的同时检测。然而该探针存在水溶性较差、发射波长较短等问题（识别水合肼时，最大发射波长为510 nm；识别亚硫酸氢根时，最大发射波长为475 nm），限制了其进一步使用。因此，设计红光发射的水溶性荧光探针，以高灵敏度和高选择性地顺序检测水合肼和亚硫酸氢根，具有非常重要的意义。

发明内容

为了克服现有荧光探针的性能存在的不足，本发明的第一个目的是在于提供一种可用于顺序检测水合肼和亚硫酸氢根的荧光分子探针及其合成方法和应用，本发明荧光分子探针具有灵敏度高、选择性好、水溶性好的优点。

为了实现上述目的，本发明提供了一种荧光探针，该荧光探针的结构如式I所示：

式I

所述荧光探针的制备方法优选为：

室温下将2,4-二羟基苯甲醛和乙酰乙酸乙酯溶解于甲醇中，90 ^oC下加热回流，反应完全后，旋转蒸发浓缩，再将剩下的液体逐滴滴入水中，抽滤、洗涤滤饼并干燥，可得黄色固体产物。将其溶解于三氟乙酸中，并加入六甲基次胺，于90 ^oC 下加热回流，反应完全后，逐滴滴入冰水中并用NaOH溶液将pH调至近中性，抽滤、洗涤滤饼，烘干后硅胶柱层析分离纯化。将纯化后产物溶解于无水乙醇中，加入2-氨基苯硫酚、37 % HCl以及30 % H₂O₂溶液，常温下搅拌，反应完全后，将体系倒入水中，抽滤收集并洗涤滤饼，真空干燥后硅胶柱层析分离纯化可得黄色产物。将纯化后的产物溶于乙醇中，加入2-甲基吡啶盐和1滴哌啶，40 ^oC下水浴加热回流，待反应完成后，真空浓缩，并用硅胶柱层析分离纯化。将纯化后的产物溶解于二氯甲烷中，在0^oC下缓慢加入含有乙酰氯的二氯甲烷溶液，可见体系溶液颜色由黄色变成无色，待反应完全后，分别用水、饱和NaHCO₃溶液及饱和食盐水萃取，合并有机层，再用无水硫酸镁进行干燥，浓缩，最后烘干得到红色固体产物，即目标分子探针。

本发明的合成如下所示：

本发明提供了一种所述荧光探针的应用，可应用于水合肼和亚硫酸氢根的顺序检测。该探针的检测原理为：利用激发态分子内质子转移效应（excited-stateintramolecular proton transfer，ESIPT）和分子内电荷转移(photo-induced electrontransfer，ICT)机理，利用酯基阻碍探针的ESIPT和ICT作用，使得探针几乎没有荧光发射。当加入水合肼后，恢复了探针的ESIPT和ICT作用，使探针在617 nm处荧光显著增强；而在“探针+水合肼”体系中继续加入亚硫酸氢根溶液时，破坏了体系的共轭结构，从而使ICT过程受到抑制，使得最大发射波长蓝移至508 nm处，通过明显的荧光变化，从而实现对这两种物质的顺序检测。

检测机理如图所示：

本发明提供了一种所述荧光探针测定溶液中水合肼和亚硫酸氢根的方法。具体测定方法是：在室温条件下，所述荧光探针溶解于PBS缓冲溶液（10 mM，pH=7.4）中，将其配置成浓度为5 μM-20 μM。向体系中加入不同浓度的水合肼水溶液，分别测定荧光强度，通过荧光强度与溶液中水合肼浓度的线性关系实现对水合肼的定量检测。之后，该体系不经过分离纯化，可直接用于亚硫酸氢根的检测，即加入不同浓度的亚硫酸氢根水溶液，分别测定荧光强度，通过荧光强度与溶液中亚硫酸氢根浓度的线性关系实现对亚硫酸氢根的定量检测。

上述检测方法，优选的，溶剂体系为PBS缓冲溶液。

上述检测方法，优选的，pH为7.4。

上述检测方法，优选的，荧光探针浓度为10 μM。

本发明的顺序检测水合肼和亚硫酸氢根的新型荧光探针，具有以下优势：

（1）本发明的荧光分子探针具有特异性高的优点，能够避免其他脂肪胺、芳香胺和无机盐的干扰，有利于溶液中水合肼和亚硫酸氢根的检测，具有较强的实际应用价值。

（2）本发明的荧光分子探针具有良好的水溶性，并且操作简单高效，成本低，较传统的只检测水合肼或只检测亚硫酸氢根的方法省时省力，适合大规模推广运用。

附图说明

【图1】本发明实施中荧光探针的荧光强度随水合肼浓度变化的荧光发射光谱图

【图2】本发明实施中“荧光探针+水合肼”体系的荧光强度随HSO₃ ^-浓度变化的荧光发射光谱图

【图3】本发明实施中荧光探针对水合肼的选择性图；

【图4】本发明实施中“荧光探针+水合肼”体系对亚硫酸氢根的选择性图；

具体实施方式

以下实施方式旨在进一步阐释说明本发明而不是对本发明的限定。

实施例1

化合物1的合成

室温下将2,4-二羟基苯甲醛（2.76 g，20 mmol）溶解于10 mL 甲醇，加入乙酰乙酸乙酯（5.16 g，40 mmol）和哌啶20 mmol，升温至90 ^oC下加热回流，TLC监测反应直至完全。将反应取下放冷后，旋转蒸发除去甲醇，再将剩下的液体逐滴滴入水中，可见大量黄色固体析出。抽滤并洗涤滤饼，干燥后可得黄色固体产物3.33 g，产率81.7 %。

化合物2的合成及结构表征

室温下将化合物1 (3.06 g, 15 mmol)，溶解于10 mL三氟乙酸中，向体系中加入六甲基次胺(8.40 g, 60 mmol)，90 ^oC 下加热回流，TLC监测直至反应完全。将反应取下并放冷，逐滴滴入500 mL冰水中，用1N的NaOH溶液将pH调至近中性，可见有沉淀析出，抽滤并洗涤滤饼，烘干后硅胶柱层析分离纯化，得黄色产物630 mg，产率18.1 %。¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ=2.43 (s, 3H)，6.97 (dd, J ₁ = 8.8 Hz, J ₂ = 0.4 Hz, 1H)，7.74 (d, J= 8.8 Hz, 1H)，8.54 (s, 1H)，12.49 (s, 1H)。

化合物3的合成及结构表征

室温下将化合物2（580 mg，2.5 mmol）溶解于10 mL无水乙醇中，然后再加入2-氨基苯硫酚(375 mg, 3 mmol)、37 % HCl (1 mmol)以及30 % H₂O₂ (1.2 mmol)，常温下搅拌。TLC监测反应直至完全，将反应体系倒入200 mL水中，抽滤收集并洗涤滤饼，真空干燥后硅胶柱层析分离纯化可得黄色产物700 mg，产率83.1 %。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ=2.48(s, 3H), 7.12 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.51 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.61 (t, J = 8.8Hz, 2H), 7.99-8.05 (m, 2H), 8.55 (s, 1H)。

化合物4的合成及结构表征

称取化合物3（674 mg，2 mmol），2-甲基吡啶盐（573 mg, 2.4 mmol）溶于无水乙醇中，并加入1滴哌啶，40℃水浴反应至完全。将体系减压蒸干，硅胶柱层析纯化，减压蒸干溶剂，得到紫红色固体粉末880 mg，产率77.5 %。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆, TMS): δ =4,40(s, 3H), 7.02(d, J=8.3 Hz, 1H), 7.27(d, J=7.34 Hz, 1H), 7.34(d, J=7.42 Hz,1H), 7.45 (dd, J=11.0, 4.1 Hz, 1H), 7.55 (dd, J=11.1, 4.2 Hz, 1H), 7.62(d, J=8.4 Hz, 1H), 7,65-7.69 (m,2H), 8.03 (d, J=8.1 Hz, 1H), 8.11-8.12 (m,1H), 8.19(d, J=8.0 Hz, 1H), 8.59(s,1H), 8.91(d, J=7.8 Hz, 1H)。

目标荧光分子探针的合成及结构表征

在25 mL圆底烧瓶中加入化合物4（852 mg, 1.5 mmol）并溶解于10 mL二氯甲烷溶液中得体系A，向10 mL二氯甲烷溶液中加入乙酰氯（135 mg，1.5 mmol）得体系B，0^oC下向体系A中加入1 mmol三乙胺，并缓慢加入体系B。0^oC下搅拌，体系溶液颜色由黄色变成无色，TLC监测反应直至反应完全。分别用水、饱和NaHCO₃溶液及饱和食盐水萃取，合并有机层，用无水硫酸镁干燥后旋转蒸发以除掉溶剂，可得目标荧光探针515 mg，产率56.3 %。¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆, TMS): δ =2.28(s, 3H), 4,39(s, 3H), 7.03(d, J=8.4 Hz, 1H),7.29(d, J=7.34 Hz, 1H), 7.32(d, J=7.42 Hz, 1H), 7.46 (dd, J=11.1, 4.0 Hz,1H), 7.53 (dd, J=11.2, 4.1 Hz, 1H), 7.64(d, J=8.4 Hz, 1H), 7,66-7.68 (m,2H),8.01 (d, J=8.1 Hz, 1H), 8.10-8.12 (m,1H), 8.18 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.57(s,1H),8.93(d, J=7.8 Hz, 1H)。HR-MS (ESI, positive), m/z: calculated [M-I]⁺:483.5146, found [M-I]⁺: 483.5179.

实施例2

荧光探针母液的制备

将上述分离得到的纯度在99 %以上的产物，准确称量6.10 mg并小心转移于50 mL的容量瓶中，室温下加入CH₃CN，充分摇匀使之完全溶解，最后定容至刻度线，得到1 mM的探针母液。在测试过程中，每次用微量进样器量取20 μL的上述溶液，将其溶于测试体系中，并保证每次测试总体积为2 mL，此时测试体系中荧光探针的浓度为10 μM。

实施例3

检测试剂的制备

水合肼用PBS缓冲溶液配制成5 mL不同的浓度梯度（0.1 mM、0.15 mM、0.2 mM、0.3mM、0.5 mM、0.7 mM、1.0 mM、1.5 mM、2.0 mM、3.0 mM）的母液。

亚硫酸氢根用PBS缓冲溶液配制成5 mL不同的浓度梯度（0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.5 mM、1.0 mM、1.5 mM、2.0 mM、3.0 mM、4.0 mM）

其余测试需要使用的小分子和无机盐则分别用PBS缓冲溶液配制成浓度为3 mM的母液。

实施例4

荧光探针荧光强度与水合肼浓度的关系

量取4.900 mL PBS缓冲溶液，将50 μL浓度为1 mM的探针母液溶解其中，再移取50μL不同浓度的水合肼母液中，使得最终整个检测体系探针的浓度为10 μM，而水合肼的浓度则分别为1 μM、1.5 μM、2 μM、3 μM、5 μM、7 μM、10 μM、15 μM、20 μM、30 μM。室温孵育20min后，分别在10 mm的比色皿中测试不同体系的荧光光谱（附图1）。结果表明，随着水合肼浓度逐渐增加，体系在617 nm处的荧光发射强度逐渐增强。

实施例5

“荧光探针+水合肼”体系荧光强度与亚硫酸氢根浓度的关系

量取4.850 mL PBS缓冲溶液，将50 μL浓度为1 mM的探针母液溶解其中，再移取50μL浓度为10 mM的水合肼母液溶解其中，充分响应后，再移取50 μL不同浓度的亚硫酸氢根母液中，使得亚硫酸氢根的浓度则分别为1 μM、2 μM、3 μM、5 μM、10 μM、15 μM、20 μM、30 μM、40 μM。室温孵育20 min后，分别在10 mm的比色皿中测试不同体系的荧光光谱（附图2）。结果表明，随着亚硫酸氢根浓度逐渐增加，体系在508 nm处的荧光发射强度逐渐增强。

实施例6

荧光探针对水合肼检测的选择性

将浓度为1 mM探针母液50 μL溶解于4.900 mL PBS缓冲溶液，再移取50 μL浓度为3 mM的甲胺，乙胺、乙二胺，丙胺，环己胺，正己胺、苯胺，萘胺母液分别加入体系中，室温孵育20 min，分别测定其荧光光谱，记录617 nm的荧光强度值（附图3）。如图所示，结果表明只有加入水合肼溶液时，荧光探针的荧光明显加强，而加入其它测试物质时，均没有或只有微弱的荧光变化。表明该荧光探针具有良好的选择性。

实施例7

“荧光探针+水合肼”体系对亚硫酸氢根检测的选择性

量取4.850 mL PBS缓冲溶液，将50 μL浓度为1 mM的探针母液溶解其中，再移取50μL浓度为10 mM的水合肼母液溶解其中，充分响应后，分别加入50 μL浓度为3 mM的硝酸根离子、硫酸氢根离子、碳酸根离子、氟离子、氯离子、溴离子、碘离子、半胱氨酸、谷胱甘肽母液，室温孵育20 min，分别测定其荧光光谱，记录508 nm的荧光强度值（附图4）。如图所示，结果表明只有加入亚硫酸氢根溶液时，其荧光明显加强，而加入其它测试物质时，均没有或只有微弱的荧光变化。表明该荧光探针具有良好的选择性。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明范围的限制，本领域的相关技术人员能从发明公开的内容不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种顺序检测水合肼和亚硫酸氢根的荧光探针，其特征在于，荧光探针具有式（I）所示的结构：

式I。

2.一种如权利要求1所述荧光分子探针的制备方法，其特征在于，包含下列步骤：室温下将2,4-二羟基苯甲醛和乙酰乙酸乙酯溶解于甲醇中，90 ℃下加热回流，反应完全后，旋转蒸发浓缩，再将剩下的液体逐滴滴入水中，抽滤、洗涤滤饼并干燥，可得黄色固体产物；将黄色固体产物溶解于三氟乙酸中，并加入六甲基次胺，于90 ℃下加热回流，反应完全后，逐滴滴入冰水中并用NaOH溶液将pH调至近中性，抽滤、洗涤滤饼，烘干后硅胶柱层析分离纯化。

3.如权利要求2所述荧光分子探针的制备方法，其特征在于，还包含下列步骤：将纯化后产物溶解于无水乙醇中，加入2-氨基苯硫酚、37% HCl以及30% H₂O₂ 溶液，常温下搅拌，反应完全后，将体系倒入水中，抽滤收集并洗涤滤饼，真空干燥后硅胶柱层析分离纯化可得黄色产物。

4.如权利要求3所述荧光分子探针的制备方法，其特征在于，还包含下列步骤：将纯化后的产物溶于乙醇中，加入2-甲基吡啶盐和1滴哌啶，40 ℃下水浴加热回流，待反应完成后，真空浓缩，并用硅胶柱层析分离纯化。

5.如权利要求4所述荧光分子探针的制备方法，其特征在于，还包含下列步骤：将纯化后的产物溶解于二氯甲烷中，在0 ℃下缓慢加入含有乙酰氯的二氯甲烷溶液，可见体系溶液颜色由黄色变成无色，待反应完全后，分别用水、饱和NaHCO₃溶液及饱和食盐水萃取，合并有机层，再用无水硫酸镁进行干燥，浓缩，最后烘干得到红色固体产物，即目标分子探针。

6.一种如权利要求1所述荧光探针在制备用于水合肼和亚硫酸氢根的顺序检测检测试剂中的应用，其特征在于，用于水合肼和亚硫酸氢根的顺序检测：将探针分子溶解在PBS缓冲溶液中，或者将探针分子溶解在甲醇、乙醇、乙腈或二甲亚砜有机溶剂中，或者将探针分子溶解在PBS缓冲溶液和上述有机溶剂任意比例的混合溶剂中，最终配制成浓度为10μM的探针溶液；然后在溶解有探针分子的上述探针溶液中加入不同浓度含有水合肼或亚硫酸氢根的待测溶液，观察其荧光变化。