CN107290312A - 一种比率型荧光检测h2s的试剂及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种比率型检测H2S荧光试剂及其合成方法和应用，所述的试剂是：7‑(diethylamino)‑2‑oxo‑2H‑chromen‑4‑yl 2‑(pyridin‑2‑yldisulfanyl)benzoate，中文名称是7‑(二乙基氨基)‑2‑氧代‑2H‑色烯‑4‑基2‑(吡啶‑2‑基二硫烷基)苯甲酸酯(HS‑1)。检测方法是在pH为7.4的PBS缓冲溶液中，通过荧光分光光度计定量检测H2S的含量。该检测过程为比率型荧光检测，灵敏度高、选择性好、检测过程简便、检测结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及硫化氢检测技术，具体涉及一种比率型荧光检测H2S的试剂及其合成方法和应用。
背景技术
硫化氢是一种无色有臭鸡蛋气味的气体，长久被认为是有毒的、对环境有害的。但近十几年来，大量的研究发现硫化氢在哺乳动物体内广泛存在，而且发挥着极其重要的生理作用。此外，研究表明硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三种气体信号分子，具有多种生理功能。在植物体内，硫化氢发挥调节种子发芽，根系生长，叶子气孔打开与闭合，以及细胞渗透压，盐压等功能，在动物体内，硫化氢的作用包括调制血压，缓解缺血性再灌注损伤，发挥抗炎作用，调节细胞内氧化应激压力，降低代谢率等。硫化氢水平的改变与多种疾病相关，如唐氏综合征和阿尔茨海默氏病和心血管疾病等。硫化氢能够发挥降低血压，调节心率的作用。最新的研究发现，硫化氢具有降低癌症发病率的作用。到目前为止，已经有很多方法用来检测体内及体外硫化氢及硫氢根浓度，如：亚甲基蓝法、气相色谱及小分子荧光探针。其中，小分子荧光探针检测由于其具有高灵敏度、高选择性、非侵入性、操作简便及实时成像的特征，已被视为是最有前景的检测技术。
在本发明中，合成了7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(HS-1)，通过H2S反应前后荧光强度比值的变化，实现H2S的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种比率型荧光检测H2S的试剂及其合成方法和应用。
本发明提供的一种比率型荧光检测H2S的试剂，是7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(HS-1)，英文名:7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl 2-(pyridin-2-yl disulfanyl)benzoate，结构式为：
7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(HS-1)的合成方法，步骤为：
(1)在N2保护下，0℃时向丙二酸(1eq.)和苯酚(2eq.)的混合物中缓慢滴加过量的POCl3，混合物加热到115℃反应直到大量HCl气体被释放(大约1.5h)；上层清液被倾倒在水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，在旋转蒸发仪上旋干后得棕色油状化合物丙二酸二苯酯；
(2)将化合物丙二酸二苯酯(1eq.)和间羟基-N,N-二乙基苯胺(1eq.)溶解在甲苯中，反应液回流7h；反应完成后冷却至室温，有固体析出，过滤，滤饼用正己烷洗涤，干燥，得黄色固体7-二乙胺基-4-羟基香豆素；
(3)将二巯基吡啶(1eq.)溶于氯仿中，加入2-巯基水杨酸(1eq.)，滴加15mmol氯化亚砜，搅拌1h，生成淡黄色固体，抽滤，干燥得到化合物2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸；
(4)将化合物2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸(1eq.)，7-二乙胺基-4-羟基-香豆素(1eq.)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(1eq.)，和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.1eq.)，加入二氯甲烷中，室温搅拌12h；旋转蒸发除去溶剂并将剩余物过硅胶柱，得到黄色固体7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯。
一种比率型荧光检测H2S的方法，步骤为：
(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM的HS-1的DMSO溶液；
(2)、将2000μL pH 7.4的PBS缓冲溶液、5μL HS-1的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，403nm的荧光强度逐渐增强，519nm的荧光逐渐减弱；
(3)、将2000μL pH 7.4的PBS缓冲溶液、5μL HS-1的DMSO溶液加到另外六个荧光比色皿中，分别再加入体积为0、40、80、120、160、200μL的H2S/HS-溶液，在荧光分光光度仪上测定403/519对应的荧光强度比值R为0.27，1.00，2.54，4.31，5.71，6.64，以H2S浓度为横坐标，以荧光强度比R为纵坐标绘制图，得到H2S浓度的工作曲线；线性回归方程为：R＝0.036c-0.27，c的单位为μM；
(4)、将2000μL pH 7.4的PBS缓冲溶液和5μLHS-1的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取VμL待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入步骤(3)的线性回归方程，得到浓度c，待测样品C待测样＝2000μL×c×10-6/VμL,即可求得H2S的浓度。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：1、本发明的检测方法，对H2S显示了高的选择性；2、对H2S实现了比率型检测；3、可在纯水溶液中进行检测。
附图说明
图1实施例1制备的HS-1的核磁氢谱图
图2实施例1制备的HS-1的核磁碳谱图
图3实施例1制备的HS-1的质谱图
图4HS-1试剂与H2S作用的荧光发射图
图5HS-1试剂与各种分析物的荧光柱状图
图6用HS-1试剂测定H2S的工作曲线
图7用HS-1试剂测定样品的荧光发射图
具体实施方式
实施例1 7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(HS-1)的合成及表征。
(1)在N2保护下，0℃时向丙二酸(11.0g，106mmol)和苯酚(19.95g，212mmol)的混合物中缓慢滴加POCl3(11.5mL，123mmol)，混合物加热到115℃反应直到大量HCl气体被释放(大约1.5h)。上层清液被倾倒在150mL水中，用乙酸乙酯萃取(3×100mL)，合并有机层，在旋转蒸发仪上旋发干后得棕色油状化合物丙二酸二苯酯(20.6g，产率98％)。
(2)将化合物1(12.8g，50mmol)和间羟基-N,N-二乙基苯胺(8.25g，50mmol)溶解在50mL甲苯中，反应液回流7h。反应完成后冷却至室温，有固体析出，过滤，滤饼用正己烷洗涤，干燥，得黄色固体7-二乙胺基-4-羟基香豆素(8.7g，产率74％)。
(3)将二巯基吡啶(3.3g，15mmol)溶于80mL氯仿中，加入2-巯基水杨酸(2.31g，15mmol)，滴加15mmol氯化亚砜，搅拌1h，生成淡黄色固体，抽滤，干燥得到化合物2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸(5.5g，产率97％)。
(4)将化合物2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸(262mg，1mmol)，7-二乙胺基-4-羟基-香豆素(233mg，1mmol)，EDC(192mg，1mmol)，和DMAP(12.2mg，0.1mmol)，加入30mL二氯甲烷中，室温搅拌12h。旋转蒸发除去溶剂并将剩余物过硅胶柱，得到黄色固体7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(HS-1)(80mg，产率17％)。
产物HS-1表征结果见图1-3。
实施例2
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，并用DMSO配制2mM HS-1的溶液；把2mL的PBS(pH 7.4)溶液及5μL HS-1的DMSO溶液加到荧光比色皿中，取H2S的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，加样的同时在荧光分光光度仪上检测，随着HS-的加入，403nm的荧光强度逐渐增强，519nm的荧光逐渐减弱。荧光发射图见图4。
实施例3
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，并用DMSO配制2mM的HS-1溶液；在22个荧光比色皿中，各加入2mL的PBS(pH 7.4)溶液和5μL的试剂的DMSO溶液，再分别加入100μLH2S，以及100μL(2×10-2M)的各种分析物：F-,Cl-,Br-,I-,CN-,NO3 -,NO2 -SO3 2-,SCN-,AcO-,CO3 2-,SO4 2-,ClO2 -,ClO3 -,ClO4 -,HS-,CO3 2-,PO4 3-,HCO3 -Cys,Hcy和GSH在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的403/519相对荧光强度比值R的柱状图，(见图5)。H2S使得试剂的403/519荧光强度比值由0.27增加到8.54，其它的分析物基本没有引起试剂荧光强度比值的变化。
经实验证明，其它分析物不干扰体系对H2S的测定。
实施例4
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，并用DMSO配制2mM的HS-1溶液，用蒸馏水配制20mM的NaHS溶液；把2mL PBS(pH 7.4)溶液和5μL的试剂的DMSO溶液加到荧光比色皿中，分别再加入体积为0、40、80、120、160、200μL的HS-溶液，在荧光分光光度仪上测定403/519对应的荧光强度比值R为0.27，1.00，2.54，4.31，5.71，6.64，以H2S浓度为横坐标，以荧光强度比值R为纵坐标绘制图，得到H2S浓度的工作曲线(见图6)；线性回归方程为：R＝0.036c-0.27，c的单位为μM；
实施例5
配制pH＝7.4的PBS(10mM)缓冲溶液，配制20mM的NaHS水溶液，并用DMSO配制2mM的HS-1溶液；把2mL的PBS(pH 7.4)溶液和5μL的HS-1的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，取NaHS的溶液180μL，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定403/519的对应的荧光强度比值为6.16，通过实施例4的线性回归方程，求得c＝178.611×10-5mol/L，偏差为0.99％。见图7。
Claims (4)
1.一种比率型荧光检测H2S的试剂，其特征在于，是7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(HS-1)，结构式为：
2.如权利要求1所述的一种比率型荧光检测H2S试剂的合成方法，其特征在于，步骤为：
(1)在N2保护下，0℃条件下向1摩尔当量丙二酸和2摩尔当量苯酚的混合物中缓慢滴加过量POCl3，混合物加热到115℃反应，直到大量HCl气体被释放，上层清液倾倒在水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，在旋转蒸发仪上蒸发后得棕色油状化合物丙二酸二苯酯；
(2)将1摩尔当量丙二酸二苯酯和1摩尔当量间羟基-N,N-二乙基苯胺溶解在甲苯中，反应液回流7h；反应完成后冷却至室温，有固体析出，过滤，滤饼用正己烷洗涤，干燥，得黄色固体7-二乙胺基-4-羟基香豆素；
(3)将1摩尔当量二巯基吡啶溶于氯仿中，加入1摩尔当量2-巯基水杨酸，滴加1摩尔当量氯化亚砜，搅拌1h，生成淡黄色固体，抽滤，干燥得到化合物2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸；
(4)将化合物1摩尔当量2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸，1摩尔当量7-二乙胺基-4-羟基-香豆素，1摩尔当量1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，和0.1摩尔当量4-二甲基氨基吡啶，加入二氯甲烷中，室温搅拌12h；旋转蒸发除去溶剂并将剩余物过硅胶柱，得到黄色固体7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯。
3.如权利要求1所述的试剂在H2S检测中的应用。
4.一种比率型荧光检测H2S的方法，其特征在于，步骤为：
(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM的HS-1的DMSO溶液；
(2)、将2000μL pH 7.4的PBS缓冲溶液、5μL HS-1的DMSO溶液加到荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，403nm的荧光强度逐渐增强，519nm的荧光逐渐减弱；
(3)、将2000μL pH 7.4的PBS缓冲溶液、5μL HS-1的DMSO溶液加到另外六个荧光比色皿中，分别再加入体积为0、40、80、120、160、200μL的HS-溶液，在荧光分光光度仪上测定403/519对应的强度比值R为0.27，1.00，2.54，4.31，5.71，6.64，以H2S浓度为横坐标，以比值R为纵坐标绘制图，得到H2S浓度的工作曲线；线性回归方程为：R＝0.036c-0.27，c的单位为μM；
(4)、将2000μL pH 7.4的PBS缓冲溶液、5μL HS-1的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取VμL待测样品溶液，加入到此荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的比值代入步骤(3)的线性回归方程，得到浓度c，待测样品C待测样＝2000μL×c×10-6/VμL，即可求得H2S的浓度。
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