CN103013495A

CN103013495A - 一种铜离子荧光探针及其合成方法

Info

Publication number: CN103013495A
Application number: CN201210539628XA
Authority: CN
Inventors: 陈秋云; 李赞
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-12-14
Also published as: CN103013495B

Abstract

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种铜离子荧光探针及其合成方法。本发明公开的铜离子荧光探针，化学名为8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯（简称BODIPY-DPA）。该铜离子荧光探针的合成方法是将2,4-二甲基吡咯与3-氯甲基苯甲酰氯混合后加入CH₂Cl₂，然后加入三氟化硼反应，再依次加入二（2-吡啶甲基）胺和三乙胺反应而成。BODIPY-DPA在溶液中显示浅黄色，在590nm处有较强的荧光发射，能进入HepG-2显示绿色荧光成像，在水溶液中对铜离子的最低检出限达到2.78μM。本发明制备的铜离子荧光探针具有毒性低的特点，100μMHepG-2的抑制率小于10%，因此可用于活体细胞成像及细胞内铜离子的检测，在环境监测以及生物体系统中对检测铜离子具有很好的应用前景。

Description

一种铜离子荧光探针及其合成方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种铜离子荧光探针及其合成方法。

背景技术

近年来，使用人工合成的探针选择性地感应和识别环境中以及生物体系统中重要的离子，特别是重金属离子引起了人们极大的兴趣。铜离子在工业生产上广泛使用，并且它在人体的酶如超氧化物歧化酶、细胞色素C氧化酶以及酪氨酸酶等起辅助催化因子的作用。尽管在有机体中有很重要的作用，但铜离子的过量积聚以及代谢异常都会导致一系列的疾病，例如老年痴呆症、帕金森综合症、心血管疾病等。所以，在环境中以及生物体系统中简便并快速检测铜离子就显得尤为重要。

当前罗丹明系列和荧光黄系列荧光探针被报道用于溶液中铜离子的检测(Tongkate P，Phromyothin D Sumranjit J.Copper(II)ion-sensing mechanism ofoligo-phenylene vinylene derivatives:syntheses and theoretical calculations.Tetrahedron 2012;68:3329-3335.Hou FP，Cheng J,Xi PX,Chen FJ,Huang L,XieGQ,Shi YJ,Liu HY，Bai DC and Zeng ZZ.Recognition of copper and hydrogensulfide in vitro using a fluorescein derivative indicator.Dalton Trans 2012;41:5799-5804)。但这些探针体内稳定性小，荧光受环境的影响较大，且有一定的细胞毒性，难以精确测量细胞中的金属离子。二氟硼基吡咯类化合物在近红外区有较强的吸收，其发射波长为560nm,可望用作生物体内荧光探针。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种高灵敏的荧光探针以检测Cu²⁺，本发明另外一个目的是提供这种荧光探针的合成制备方法。

本发明公开的一种铜离子荧光探针，8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯（简称BODIPY-DPA），其结构式如下：

本发明所公开的铜离子荧光探针，8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯的合成反应步骤如下：

A、将2,4-二甲基吡咯与3-氯甲基苯甲酰氯以摩尔比1:3～3:1比例混合后加入CH₂Cl₂，40℃反应1～8h；

B、接着加入三氟化硼，其中三氟化硼与2,3-二甲基吡咯摩尔比为1:1～1:4，40℃反应2～10h；

C、向混合体系中依次加入二（2-吡啶甲基）胺和三乙胺，氮气保护，80℃油浴回流4～16h，其中，二（2-吡啶甲基）胺与2,4-二甲基吡咯摩尔比1:2～2:1，三乙胺与二（2-吡啶甲基）胺的摩尔比为3:1～1:3；

D、反应结束后用饱和氯化钠溶液萃取洗涤，水相使用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸出溶剂，得褐色油状物；

E、将褐色油状物经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯洗脱，得到暗红色粘稠固体，即为8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯（简写为DOBIPY-DPA）。

本发明的一个较优公开例中，所述的DOBIPY-DPA合成反应步骤A中，2,4-二甲基吡咯与3-氯甲基苯甲酰氯以摩尔比2:1比例混合后加入CH₂Cl₂，40℃反应4h。

本发明的一个较优公开例中，所述的DOBIPY-DPA合成反应步骤B中，所述的三氟化硼与2,3-二甲基吡咯摩尔比为1:2，40℃反应6h。

本发明的一个较优公开例中，所述的DOBIPY-DPA合成反应步骤C中，所述的二（2-吡啶甲基）胺与2,4-二甲基吡咯摩尔比1:1.2，所述的三乙胺与二（2-吡啶甲基）胺的摩尔比为1:1，氮气保护，80℃油浴回流8h。

本发明制得的DOBIPY-DPA，其分子式为C₃₂H₃₂BF₂N₅，元素分析实测值C,71.81;H,6.03;N,13.06,理论值C,71.78;H,6.02;N,13.08%;¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ_H 8.54(2H,d),7.68(2H,t),7.54(3H,d),7.45(2H,d),7.24-7.11(3H,m),5.96(2H,s),3.82(4H,s),3.75(2H,s),2.58(6H,s),1.30(6H,s).¹³CNMR δ_C(100MHz,CDCl₃)159.30,155.42,149.00,143.07,136.63,131.45,129.74,129.17,128.25,126.87,122.68,122.13,121.16,59.84,58.34,14.46。

BODIPY-DPA在溶液中显示浅黄色，在590nm处有较强的荧光发射，能进入HepG-2显示绿色荧光成像。该化合物在溶液中能与铜离子形成1:1的络合物(DOBIPY)-DPA-Cu，可用于活体细胞中在其它金属离子存在的情况下检测Cu²⁺。活体细胞成像实验证明了BODIPY-DPA系统能够在HepG-2细胞中检测Cu^2+-，因此,探针DOBIPY-DPA可以在环境保护以及生物体中用于Cu²⁺的检测。

基于化合物DOBIPY-DPA可用于溶液中铜离子的定量检测可见附图1。实验结果显示随着氯化铜的加入，DOBIPY-DPA乙醇-水（体积比1:1）溶液位于509nm的荧光逐渐减弱，当DOBIPY-DPA与铜离子的浓度为1:1时，荧光几乎淬灭，溶液中铜离子的检测限度达到0.1μM，同时伴随着509nm荧光淬灭。动物体外荧光实验也进一步证实探针DOBIPY-DPA可以在环境保护以及生物体中用于Cu²⁺检测。

细胞毒性实验，以实施例1得到的化合物为受试化合物：

将HepG-2细胞在含10%热灭活的胎牛血清（FCS）的RPMI1640培养液中，于CO₂培养箱（37℃，5%CO₂、饱和湿度）内连续培养。取对数生长期细胞，消化、计数，以2×10⁴/ml的密度接种于96孔培养板中，每孔100μl。培养24h后，用浓度为10μM,50μM,100μM,的化合物DOBIPY-DPA作用HepG-2细胞24h；用TS100 Nikon倒置相差显微镜观察细胞的生长情况。从细胞形态学观察，可以看出即使使用100μM的化合物DOBIPY-DPA没有观察到显著肿瘤细胞的死亡，100μM化合物对肿瘤细胞的抑制率小于9%，说明化合物具有较低的毒性。

本发明所用的溶剂皆为分析纯，用

分子筛进行除水处理，所用试剂未加特殊说明直接应用而未经任何特殊处理。乙醇（分析纯，上海中试化工总公司）；二氯甲烷（分析纯，上海中试化工总公司）；乙酸乙酯（分析纯，上海中试化工总公司）；三乙胺、氢氧化钠（分析纯，上海化学试剂有限公司）；2,4-二甲基吡咯、3-氯甲基苯甲酰氯、二（2-吡啶甲基）购自Sigma公司。美国Nicolet 20DXBFR-IR型傅立叶红外光谱仪，KBr压片，400~4000cm^-1；日本岛津UV-2450型紫外可见分光光度仪，800-190nm；DHG-9140A型电热恒温鼓风干箱（上海-恒科技有限公司）；DZF-6051型真空干燥箱（上海-恒科技有限公司）；Ti-E2000活细胞工作站显微镜（日本Nikon公司）。

有益效果

发明人设计的荧光探针DOBIPY-DPA在水溶液中对铜离子的最低检出限达到了2.78μM，远低于正常人体血液中的铜离子浓度（11.8~23.6μM）以及美国环境保护局设定的饮用水中的最低浓度（20μM）。本发明制备的荧光染料具有毒性低的特点，100μM HepG-2的抑制率小于10%，因此可用于活体细胞成像及细胞内铜离子的检测，在环境监测以及生物体系统中对检测铜离子具有很好的应用前景。

附图说明

图1DOBIPY-DPA(2μM)的Tris-DMSO((9:1,v/v)溶液随着氯化铜加入荧光变化（(λex=460nm)图谱，

其中CuCl₂浓度为(a-i:0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,2.4,2.8,4.0μM)。

图2DOBIPY-DPA-Cu(2μM)在Tris-DMSO(pH 7.4,9:1,v/v)溶液在各种阴离子(6μM)存在下荧光变化图谱，

其中阴离子分别为F^-,Cl^-,I^-,SO₄ ^2-,NO₃ ^-,CO₃ ^2-,HPO₄ ^2-,HSO₃ ^-,PO₄ ³-,S₂O₃ ^2-,CH₃COO-，λ_ex=460nm。

图3DOBIPY-DPA的化学结构式。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明，以使本领域技术人员更好地理解本发明，但本发明并不局限于以下实施例。

实施例1

2,4-二甲基吡咯（354.4mg,0.38mmol）与3-氯甲基苯甲酰氯（350.2mg，0.19mmol)以摩尔比为2:1混合后加入CH₂Cl₂ 100ml，40℃反应4h；接着加入三氟化硼（BF₃）0.58ml（0.46mmol）,40℃反应6h；然后加入二（2-吡啶甲基）胺（83mg，0.45mmol），三乙胺（378mg，0.45mmol），氮气保护，80℃油浴回流8h；反应结束后，使用3×30ml饱和氯化钠溶液萃取洗涤，水相使用3×30ml二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸出溶剂，得褐色油状物；硅胶柱层析分离，使用乙酸乙酯洗脱，得到暗红色粘稠固体8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯（BODIPY-DPA）75mg,产率73％。分子式C₃₂H₃₂BF₂N₅元素分析实测值C,71.81;H,6.03;N,13.06,理论值C,71.78;H,6.02;N,13.08%;¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ_H 8.54(2H,d),7.68(2H,t),7.54(3H,d),7.45(2H,d),7.24-7.11(3H,m),5.96(2H,s),3.82(4H,s),3.75(2H,s),2.58(6H,s),1.30(6H,s).¹³CNMR δ_C(100MHz,CDCl₃)159.30,155.42,149.00,143.07,136.63,131.45,129.74,129.17,128.25,126.87,122.68,122.13,121.16,59.84,58.34,14.46.。

实施例2

2,4-二甲基吡咯（354.4mg,0.38mmol）与3-氯甲基苯甲酰氯（240mg，0.126mmol)以摩尔比为3:1混合后加入CH₂Cl₂ 200ml，40℃反应8h；接着加入三氟化硼（BF₃）0.58ml（0.46mmol）,40℃反应6h；然后加入二（2-吡啶甲基）胺（83mg，0.45mmol），三乙胺（378mg，0.45mmol），氮气保护，80℃油浴回流8h；反应结束后，使用3×30ml饱和氯化钠溶萃取洗涤，水相使用3×30ml二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸出溶剂，得褐色油状物；硅胶柱层析分离，使用乙酸乙酯洗脱，得到暗红色粘稠固体8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯（BODIPY-DPA）21mg,产率22％。

实施例3

2,4-二甲基吡咯（354.4mg,0.38mmol）与3-氯甲基苯甲酰氯（2.1012g，1.14mmol)以摩尔比为1:3混合后加入CH₂Cl₂ 100ml，40℃反应4h；接着加入三氟化硼（BF₃）0.58ml（0.46mmol）,40℃反应6h；然后加入二（2-吡啶甲基）胺（83mg，0.45mmol），三乙胺（378mg，0.45mmol），氮气保护，80℃油浴回流8h；反应结束后，使用3×30ml饱和氯化钠溶萃取洗涤，水相使用3×30ml二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸出溶剂，得褐色油状物；硅胶柱层析分离，使用乙酸乙酯洗脱，得到暗红色粘稠固体8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基4-硼-3a,4a-二吡咯（BODIPY-DPA）34mg,产率33％。

实施例4

2,4-二甲基吡咯（354.4mg,0.38mmol）与3-氯甲基苯甲酰氯（350.2mg，0.19mmol)以摩尔比为2:1混合后加入CH₂Cl₂ 100ml，40℃反应4h；接着加入三氟化硼（BF₃）0.116ml（0.92mmol）,40℃反应10h；然后加入二（2-吡啶甲基）胺（166mg，0.90mmol），三乙胺（378mg，0.45mmol），氮气保护，80℃油浴回流16h；反应结束后，使用3×30ml饱和氯化钠溶萃取洗涤，水相使用3×30ml二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸出溶剂，得褐色油状物；硅胶柱层析分离，使用乙酸乙酯洗脱，得到暗红色粘稠固体8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯（BODIPY-DPA）56mg,产率54.5％。

实施例5

2,4-二甲基吡咯（354.4mg,0.38mmol）与3-氯甲基苯甲酰氯（350.2mg，0.19mmol)以摩尔比为2:1混合后加入CH₂Cl₂ 50ml，40℃反应4h；接着加入三氟化硼（BF₃）0.116ml（0.92mmol）,40℃反应10h；然后加入二（2-吡啶甲基）胺（41mg，0.25mmol），三乙胺（189mg，0.225mmol），氮气保护，80℃油浴回流4h；反应结束后，使用3×30ml饱和氯化钠溶萃取洗涤，水相使用3×30ml二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸出溶剂，得褐色油状物；硅胶柱层析分离，使用乙酸乙酯洗脱，得到暗红色粘稠固体8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯（BODIPY-DPA）47mg,产率46％。

实施例6

2,4-二甲基吡咯（354.4mg,0.38mmol）与3-氯甲基苯甲酰氯（350.2mg，0.19mmol)以摩尔比为2:1混合后加入CH₂Cl₂ 100ml，40℃反应4h；接着加入三氟化硼（BF₃）0.58ml（0.46mmol）,40℃反应10h；然后加入二（2-吡啶甲基）胺（81mg，0.5mmol），三乙胺（756mg，0.90mmol），氮气保护，80℃油浴回流4h；反应结束后，使用3×30ml饱和氯化钠溶萃取洗涤，水相使用3×30ml二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸出溶剂，得褐色油状物；硅胶柱层析分离，使用乙酸乙酯洗脱，得到暗红色粘稠固体8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基4-硼-3a,4a-二吡咯（BODIPY-DPA）62mg,产率61％。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种铜离子荧光探针，8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯（简称BODIPY-DPA），其特征在于具有如下结构式：

2.一种合成如权利要求1所述的铜离子荧光探针的方法，其特征在于，反应步骤如下：

C、向混合体系中依次加入二（2-吡啶甲基）胺和三乙胺，氮气保护，80℃油浴回流4～16h，其中，二（2-吡啶甲基）胺与2,4-二甲基吡咯摩尔比为1:2～2:1，三乙胺与二（2-吡啶甲基）胺的摩尔比为3:1～1:3；

E、将褐色油状物经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯洗脱，得到暗红色粘稠固体，即为8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的DOBIPY-DPA合成反应步骤A中，2,4-二甲基吡咯与3-氯甲基苯甲酰氯以摩尔比2:1比例混合后加入CH₂Cl₂，40℃反应4h。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的DOBIPY-DPA合成反应步骤B中，所述的三氟化硼与2,3-二甲基吡咯摩尔比为1:2，40℃反应6h。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的DOBIPY-DPA合成反应步骤C中，所述的二（2-吡啶甲基）胺与2,4-二甲基吡咯摩尔比1:1.2，所述的三乙胺与二（2-吡啶甲基）胺的摩尔比为1:1，氮气保护，80℃油浴回流8h。