CN113943316B - 一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针、制备方法及其应用，制备方法为：将8‑羟基喹啉‑5‑醛BODIPY和1‑(6‑(氯甲基)吡啶‑2‑基)‑N,N‑二(吡啶‑2‑亚甲基)甲胺溶解于乙腈中，搅拌至溶解后加入碳酸钾，混合物加热至回流反应7～9小时，TLC监测反应进程，判断反应终止；反应结束后，反应液经过过滤、除溶剂，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，即得。本发明提高了检测的专一性和稳定性，灵敏度高，抗干扰性强，适用的pH范围广，荧光探针同Cu²⁺作用前后溶液变化明显，裸眼识别效果好。

Description

一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于化学分析检测及生物分析检测技术领域，涉及一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针、制备方法及其应用。

背景技术

铜离子(Cu²⁺)往往参与生命体的多种生理过程，其含量的或多或少对生命体的健康都起着至关重要的作用。因此，对于铜离子的识别检测也早已经引起了广泛的关注。目前，可实现铜离子检测的方法主要包括原子荧光光谱法(AFS)和吸收光谱法(AAS)，电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)和质谱法(ICP-MS)等，但这些检测方法往往需要精密的仪器设备，会导致在实际检测时出现操作繁琐、高成本以及样品损耗等缺点，而荧光探针检测技术因具有灵敏度高、检测限低、操作简便和样品保真等优点广泛用于铜离子的识别检测。

目前，检测铜离子的荧光探针种类繁多，但绝大多数都会受到一定pH范围的影响，那么在极端pH条件下使用时就会受到限制，诸如工业废水、胃酸，大肠杆菌和溶酶体等体系，同时pH也成为了实际测试中的干扰因素之一。pH范围会限制荧光探针分子的检测主要是由于破坏了荧光探针的分子结构，失去了与铜离子的配位，大多数荧光探针都是由于荧光基团的结构在强酸或强碱条件下不稳定，容易发生开环或水解等反应，打破传感机理。

申请号201910403377.4的中国专利，公开了一种苯并咪唑基取代的喹啉酮类荧光探针及其制备方法和应用，该技术中的荧光探针同Cu²⁺配位后的荧光发射波长为468nm，在实际应用中容易受到背景荧光的干扰，尤其是在细胞内部进行识别检测时，从而干扰检测结果，使检测结果失真；此外，荧光探针同Cu²⁺作用前后，溶液的颜色变化并不是十分明显，裸眼识别效果差。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针，提高了检测的专一性和稳定性，灵敏度高，抗干扰性强，适用的pH范围广，荧光探针同Cu²⁺作用前后溶液变化明显，裸眼识别效果好，解决了现有技术中存在的问题。

本发明的另一目的是，提供一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，操作简便。

本发明的另一目的是，提供一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的应用。

本发明所采用的技术方案是，一方面，提供一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针，所述荧光探针的结构式为：

另一方面，提供一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，具体步骤为：

将8-羟基喹啉-5-醛BODIPY和1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺溶解于乙腈中，8-羟基喹啉-5-醛BODIPY和1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺的物质的量之比为1:1～1:1.5，搅拌至溶解后加入碳酸钾，碳酸钾与8-羟基喹啉-5-醛BODIPY的物质的量比是1:3～1:4；混合物加热至回流反应7～9小时，TLC监测反应进程，判断反应终止；反应结束后，反应液经过过滤、除溶剂，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，即得。

进一步的，所述8-羟基喹啉-5-醛BODIPY的制备方法：

惰性气体保护下，加入173.2～346.4mg的8-羟基喹啉-5-醛、185.5～389.6mg的2,4-二甲基吡咯、100～150mL的无水CH₂Cl₂以及125～250μL的三氟乙酸，8-羟基喹啉-5-醛和2,4-二甲基吡咯于无水CH₂Cl₂中进行溶解，混合液在室温下搅拌10～12h；然后分批加入227～454mg二氯二氰苯醌的二氯甲烷溶液；反应液立即由淡黄色变成深紫色，继续搅拌2～4h后，再依次加入2～4mL的三乙胺和2～4mL的BF₃·OEt₂，此时，反应液在紫外灯下产生明显的绿色荧光，继续搅拌10～12，TLC监测反应进程；将反应液依次用水、饱和食盐水洗，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压旋蒸除去溶剂后，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为CHCl₃，得到红色固体产物8-羟基喹啉-5-醛BODIPY。

进一步的，所述二氯二氰苯醌的加入方式为：分20～25批，每批的量是20～25mg，每次加入之后搅拌2～3分钟之后再加入下一次的量。

进一步的，所述二氯二氰苯醌的加料速度6～8mg/min。

进一步的，所述1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺的制备方法：

加入352.1～528.1mg的2,6-二氯甲基吡啶、168～252mg的NaHCO₃以及10～30mL的乙腈，搅拌下缓慢滴加199.25～398.5mg二(吡啶-2-亚甲基)胺的乙腈溶液，滴加完毕后，将反应液加热至40～60℃反应3～5h，然后在室温下反应过夜，TLC监测反应进程；反应结束后，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为体积比20:1～10:1的CH₂Cl₂/CH₃OH，得到白色固体产物1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺。

进一步的，所述二(吡啶-2-亚甲基)胺的滴加速度为每秒钟1～2滴。

第三方面，提供一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针在检测胃酸、溶酶体、废水或土壤中铜离子的应用。

进一步的，检测的pH值为3～13。

本发明的有益效果是：

1.荧光探针分子中荧光基团的选择和修饰是非常关键的，选择难度大，试验过程复杂、工作量大；本发明经过大量研究，以8-羟基喹啉-5-醛为切入点，利用醛基引入BODIPY结构，既引入了喹啉环，同时利用荧光基团结构中的羟基引入了DPA结构，荧光探针分子中N原子和O原子同时参与配位，调整同Cu²⁺的配位空间，提高了与Cu²⁺的配位能力，实现了对Cu^{2 +}的高灵敏度、高专一性的识别检测，不受其它常见金属阳离子的干扰。

2.本发明所制备的荧光探针在Cu²⁺的浓度范围为0.5～5.5μmol/L时，具有线性相关性，能够定量检测该浓度范围内Cu²⁺的含量，极大程度上提高了检测灵敏度。

3.本发明所制备的荧光探针进行识别检测时，适用的pH值范围为3～13，可适用于强酸、强碱等极端pH条件下对Cu²⁺的识别检测，具有非常高的商业应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例荧光探针于不同pH条件下对Cu²⁺的响应情况。

图2为本发明实施例荧光探针与1倍金属阳离子作用后的荧光响应。

图3为本发明实施例荧光探针在有无其它金属阳离子存在时对Cu²⁺的荧光响应情况。

图4为本发明实施例荧光探针随着Cu²⁺浓度变化的荧光滴定谱图。

图5为本发明实施例荧光探针同Cu²⁺间的Benesi–Hildebrand曲线。

图6为本发明实施例荧光探针的荧光强度随着Cu²⁺浓度变化的曲线。

图7为本发明实施例荧光探针随着Cu²⁺加入的核磁滴定谱图。

图8为本发明实施例荧光探针对Cu²⁺可能的作用机理。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，

一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的结构式为：

实施例2，

一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，具体为：

将8-羟基喹啉-5-醛BODIPY和1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺溶解于乙腈中，8-羟基喹啉-5-醛BODIPY和1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺的物质的量之比为1:1，乙腈为无水级，搅拌至溶解后加入碳酸钾，碳酸钾与8-羟基喹啉-5-醛BODIPY的物质的量比是1:4；混合物加热至回流反应7小时，TLC监测反应进程，判断反应终止；反应结束后，反应液经过过滤、除溶剂，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，得到目标产物铜离子荧光探针。目标分子的产率为63.9％。

实施例3，

一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，具体为：

将8-羟基喹啉-5-醛BODIPY和1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺溶解于乙腈中，8-羟基喹啉-5-醛BODIPY和1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺的物质的量之比为1:1.2，搅拌至溶解后加入碳酸钾，碳酸钾与8-羟基喹啉-5-醛BODIPY的物质的量比是1:3；混合物加热至回流反应8小时，TLC监测反应进程，判断反应终止；反应结束后，反应液经过过滤、除溶剂，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，得到目标产物铜离子荧光探针。目标分子的产率达到71.1％。

实施例4，

一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，具体为：

将8-羟基喹啉-5-醛BODIPY和1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺溶解于乙腈中，8-羟基喹啉-5-醛BODIPY和1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺的物质的量之比为1:1.5，搅拌至溶解后加入碳酸钾，碳酸钾与8-羟基喹啉-5-醛BODIPY的物质的量比是1:4；混合物加热至回流反应9小时，TLC监测反应进程，判断反应终止；反应结束后，反应液经过过滤、除溶剂，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，得到目标产物铜离子荧光探针。目标分子的产率为70.2％。

8-羟基喹啉-5-醛BODIPY和1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺的物质的量之比是1:1～1:1.5，从经济角度考虑，该反应中8-羟基喹啉-5-醛BODIPY作为主原料，目的是使其完全参与反应，让DPA过量，使反应正向进行，提高反应产率。当8-羟基喹啉-5-醛BODIPY和1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺的物质的量比为1:1.2时，目标分子的产率最高，达到71.1％，而物质的量比为1:1时，目标分子的产率为63.9％；当高于1:1时，也就是8-羟基喹啉-5-醛BODIPY过量，目标分子的产率影响不大，但是8-羟基喹啉-5-醛BODIPY在制备过程中，原料比较贵，且后处理时比较复杂，产率也不高，因此，从经济的角度考虑，8-羟基喹啉-5-醛BODIPY过量是不合适的。当低于1:1.5时，也就是1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺过量过多时，对产量提高不会太明显，反而对原料造成浪费。

实施例5，

一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，具体按照以下步骤进行：

步骤1，8-羟基喹啉-5-醛BODIPY的合成；

氩气保护下，在500mL的三口瓶中，加入346.3mg的8-羟基喹啉-5-醛(2mmol)、185.5mg的2,4-二甲基吡咯、150mL的无水CH₂Cl₂以及250μL的三氟乙酸，8-羟基喹啉-5-醛和2,4-二甲基吡咯于无水二氯甲烷中进行溶解，混合液在室温下搅拌12h。然后分批加入454mg(2mmol)DDQ(二氯二氰苯醌)，反应液立即由淡黄色变成深紫色，继续搅拌4h后，再依次加入4mL的三乙胺和4mL的BF₃·OEt₂(三氟化硼乙醚)，此时反应液在紫外灯下产生明显的绿色荧光，继续搅拌12(过夜)小时，时间过短，反应不完全，产率低，且副产物过多，后处理会比较麻烦，TLC监测反应进程。将反应液依次用水(100mL×3)、饱和食盐水(100mL×2)洗，无水Na₂SO₄干燥，过滤、滤液减压旋蒸除去溶剂后，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为CHCl₃，得到红色固体产物8-羟基喹啉-5-醛BODIPY，产率53％。

DDQ的具体加入方式为分20～25批，每批的量是20～25mg，每次加入之后搅拌2～3分钟之后再加入下一次的量。DDQ是一种氧化剂，在该反应溶剂无水二氯甲烷中溶解性一般，当加入量过多时容易结块或成颗粒状，影响反应速率和产率。因此，通过少量加入使其因发生反应而提高其溶解性。

步骤2，1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺的合成；

在100mL三口瓶中，加入528.1mg的2,6-二氯甲基吡啶(3mmol)、168mg的NaHCO₃以及30mL的乙腈，搅拌下缓慢滴加398.5mg二(吡啶-2-亚甲基)胺(2mmol)的乙腈溶液，滴加完毕后，将反应液加热至60℃反应5h，然后在室温下反应12小时(过夜)，TLC监测反应进程。反应结束后，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为CH₂Cl₂/CH₃OH(20:1,v/v)，得到白色固体产物1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺(简称DPA)，产率64％。将2,6-二溴甲基吡啶替换为2,6-二氯甲基吡啶，降低亲核取代的活性。

步骤3，荧光探针分子的制备；

将步骤1得到的8-羟基喹啉-5-醛BODIPY和步骤2得到的DPA溶解于10mL乙腈中，搅拌至溶解后加入碳酸钾，碳酸钾与原料8-羟基喹啉-5-醛BODIPY的物质的量比1:3，混合物加热至回流反应7～9小时，TLC监测反应进程，判断反应终止。反应结束后，反应液经过过滤、除溶剂，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，得到目标产物铜离子荧光探针分子(探针1)，红色固体，177.3mg，产率63.9％。¹H NMR(CDCl₃,600MHz,TMS)δ(ppm):1.05(s,6H),2.58(s,6H),3.92(s,4H),3.93(s,2H),5.57(s,2H),5.93(s,2H),7.14～7.18(m,3H),7.27(s,1H),7.41(dd,J₁＝8.40Hz,J₂＝3.6Hz,1H),7.52(d,J＝7.80Hz,1H),7.54(d,J＝7.80Hz,1H),7.59(s,1H),7.60(s,1H),7.64～7.69(m,3H),8.09(d,J＝8.40Hz,1H),8.54(d,J＝4.20Hz,2H),9.02(d,J＝4.20Hz,1H).¹³C NMR(CDCl₃,150MHz,TMS)δ(ppm):159.3,159.2,156.0,155.8,154.9,150.2,149.2,142.8,140.3,138.2,137.4,136.5,133.4,132.3,128.1,126.8,124.5,122.9,122.7,122.1,121.4,119.8,109.8,71.8,60.2,60.1,31.6,22.7,14.7,14.2,14.1.HR-MS(ESI):m/z calcd for C₄₁H₃₉BF₂N₇O[(M+H)⁺]:694.3272,found 694.3266。探针1对Cu²⁺可能的作用机理，如图8所示。

实施例6，

一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，具体按照以下步骤进行：

步骤1，8-羟基喹啉-5-醛BODIPY的合成；

氩气保护下，在500mL的三口瓶中，加入259.8mg的8-羟基喹啉-5-醛、287.55mg的2,4-二甲基吡咯、120mL的无水CH₂Cl₂以及200μL的三氟乙酸，8-羟基喹啉-5-醛和2,4-二甲基吡咯于无水二氯甲烷中进行溶解，混合液在室温下搅拌11h。然后分批加入340.5mgDDQ(二氯二氰苯醌)，反应液立即由淡黄色变成深紫色，继续搅拌3h后，再依次加入3mL的三乙胺和3mL的BF₃·OEt₂(三氟化硼乙醚)，此时反应液在紫外灯下产生明显的绿色荧光，继续搅拌11小时(过夜)，时间过短，反应不完全，产率低，且副产物过多，后处理会比较麻烦，TLC监测反应进程。将反应液依次用水(100mL×3)、饱和食盐水(100mL×2)洗，无水Na₂SO₄干燥，过滤、滤液减压旋蒸除去溶剂后，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为CHCl₃，得到红色固体产物8-羟基喹啉-5-醛BODIPY。

步骤2，1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺的合成；

在100mL三口瓶中，加入440.1mg的2,6-二氯甲基吡啶、210mg的NaHCO₃以及20mL的乙腈，搅拌下缓慢滴加298.88mg二(吡啶-2-亚甲基)胺的乙腈溶液，滴加完毕后，将反应液加热至50℃反应4h，然后在室温下反应11小时(过夜)，TLC监测反应进程。反应结束后，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为CH₂Cl₂/CH₃OH(15:1,v/v)，得到白色固体产物1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺(简称DPA)。

步骤3与实施例5相同。

实施例7，

一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，具体按照以下步骤进行：

步骤1，8-羟基喹啉-5-醛BODIPY的合成；

氩气保护下，在500mL的三口瓶中，加入173.2mg的8-羟基喹啉-5-醛、389.6mg的2,4-二甲基吡咯(4.2mmol)、100mL的无水CH₂Cl₂以及125μL的三氟乙酸，8-羟基喹啉-5-醛和2,4-二甲基吡咯于无水二氯甲烷中进行溶解，混合液在室温下搅拌10h。然后分批加入227mgDDQ(二氯二氰苯醌)，反应液立即由淡黄色变成深紫色，继续搅拌2h后，再依次加入2mL的三乙胺和2mL的BF₃·OEt₂(三氟化硼乙醚)，此时反应液在紫外灯下产生明显的绿色荧光，继续搅拌10小时(过夜)，时间过短，反应不完全，产率低，且副产物过多，后处理会比较麻烦，TLC监测反应进程。将反应液依次用水(100mL×3)、饱和食盐水(100mL×2)洗，无水Na₂SO₄干燥，过滤、滤液减压旋蒸除去溶剂后，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为CHCl₃，得到红色固体产物8-羟基喹啉-5-醛BODIPY。

步骤2，1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺的合成；

在100mL三口瓶中，加入352.1mg的2,6-二氯甲基吡啶、252mg的NaHCO₃(3mmol)以及10mL的乙腈，搅拌下缓慢滴加199.25mg二(吡啶-2-亚甲基)胺的乙腈溶液，滴加完毕后，将反应液加热至40℃反应3h，然后在室温下反应10小时(过夜)，TLC监测反应进程。反应结束后，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为CH₂Cl₂/CH₃OH(10:1,v/v)，得到白色固体产物1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺(简称DPA)。

步骤3与实施例5相同。

实施例8，

一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，

步骤S1中在8-羟基喹啉-5-醛BODIPY的合成中通过控制DDQ的加料速度6～8mg/min，其余步骤与实施例5相同；8-羟基喹啉-5-醛BODIPY产率为57.3％，提高了反应产率。

实施例9，

一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，

步骤S2中制备的1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺控制二(吡啶-2-亚甲基)胺的滴加速度为每秒钟1～2滴，其余步骤与实施例5相同。

滴加速度过快容易增加双边产物的用量，降低单边产物的产率，控制双边产物的产率，得到单边产物。滴加速度过快时，DPA的产率降低至57％～61％。

实施例10，

将实施例5所制备的荧光探针于不同pH条件下对Cu²⁺的响应情况，如图1所示，sensor(探针)1以实施例5得到的荧光探针分子制作，1-Cu²⁺表示传感器1检测Cu²⁺，适用的pH值范围为3～13，可实现于胃酸、溶酶体或极端pH下的工业废水中对Cu²⁺的检测。

实施例11，

将实施例5所制备的荧光探针分别与多种1倍金属阳离子作用后的荧光响应，如图2所示，在多种金属阳离子中，荧光探针对Cu²⁺表现出了高度的专一性。

实施例12，

将实施例5所制备的荧光探针在有无其它金属阳离子存在时对Cu²⁺的荧光响应情况，如图3所示，能够看出该荧光探针对Cu²⁺表现出高度的专一性，而且在其它多种金属阳离子存在时，专一性并未受到干扰。另外，实施例5所制备的荧光探针同Cu²⁺作用前后，测试溶液颜色由黄绿色变成了橘红色，具有很好的裸眼识别效果。在实际应用时，如果裸眼识别效果差，判断Cu²⁺是否存在需经过紫外/荧光分光光度法进行测试才能得出，缺乏检测结果的直观性，而裸眼识别效果好的荧光探针能够首先更直接的判断出体系中是否有Cu²⁺，简化了操作过程，提高检测的时效性。

单独利用喹啉作为荧光基团，其荧光为较弱的淡蓝色，在同金属离子配位时容易受到干扰，因为喹啉环本身的共轭体系不是很大，虽然可作为荧光基团，但发射波长较短，容易在识别检测时受到环境中背景荧光的干扰，且裸眼识别效果较差。本发明实施例5以8-羟基喹啉-5-醛为切入点，利用醛基引入BODIPY结构，既引入了喹啉环，同时也改善了其荧光性能，延长了发射波长，并提高了裸眼识别的效果和对Cu²⁺的专一性。BODIPY结构的引入能够提高荧光分子的稳定性，本发明实施例利用荧光基团结构中的羟基引入了DPA结构，荧光探针分子中N原子和O原子同时参与配位，调整同Cu²⁺的配位空间，提高了与Cu²⁺的配位能力，检测的专一性和稳定性。

实施例13，

实施例5所制备的荧光探针随着Cu²⁺浓度变化的荧光滴定谱图，如图4所示，最大发射波长为516nm；发射波长接近近红外，在实际应用时，对排除背景荧光的干扰具有一定的能力。荧光探针在Cu²⁺浓度范围为0～10μmol/L范围内，荧光强度呈现出了较明显的变化，这说明荧光探针在低浓度的Cu²⁺中仍然具有较高的灵敏度。图4中，从上至下每个曲线对应的Cu²⁺浓度值分别为0、0.5μmol/L、1μmol/L、1.5μmol/L、2μmol/L、2.5μmol/L、3μmol/L、3.5μmol/L、4μmol/L、4.5μmol/L、5μmol/L、5.5μmol/L、6μmol/L、6.5μmol/L、7μmol/L、7.5μmol/L、8μmol/L、9μmol/L、10μmol/L。

实施例5所制备的荧光探针同Cu²⁺间的Benesi–Hildebrand曲线，如图5所示；根据Benesi-Hildebrand方程，以1/Cu²⁺为横坐标，1/[F-F₀]为纵坐标进行线性拟合，可得线性方程：Y＝9.19×10^-10×X+9.98×10^-5，计算出体系的络合常数Ka为1.1×10⁵M^-1(R²＝0.9986)，从数量级上(一般10⁵为中强配位，10⁴以下配位稳定性较差)可判断出探针分子同Cu²⁺的配位是十分稳定的，能够用于偏酸和偏碱性(极端pH)的废水或土壤等体系。

实施例14，

实施例5所制备的荧光探针的荧光强度随着Cu²⁺浓度变化，如图6所示；荧光探针在Cu²⁺的浓度范围为0.5～5.5μmol/L时，具有线性相关性，能够定量检测该浓度范围内Cu²⁺的含量，检测下限为0.5μmol/L，而血液中允许的Cu²⁺浓度范围为15.7～23.6μmol/L，饮用水中为低于30μmol/L，这说明荧光探针可实现于血液和饮用水中对Cu²⁺的高灵敏度检测。申请号为201210539628.X的中国专利，公开了一种铜离子荧光探针及其合成方法，配位点只有DPA结构中的三个N原子，显然稳定性是有待考量的；铜离子浓度的检测下限为2.78μM，检测限较高，灵敏度不足。

实施例15，

实施例5所制备的荧光探针随着Cu²⁺加入的核磁滴定谱图，如图7所示，以氘代氯仿为溶剂，对比分析荧光探针在加入0.5倍铜离子前后¹H NMR数据的变化情况。结果表明，在同Cu²⁺作用后，芳环结构上H的化学位移发生了略微变化，变化最明显的是吡啶环与喹啉环中间的亚甲基结构H_b，化学位移由5.57向5.91移动，而H_a，H_c和H_d则均有不同程度的向低场高化学位移移动的趋势，这说明8-羟基喹啉和吡啶中的O和N原子参与Cu²⁺配位，导致对于H_a，H_b，H_c和H_d的束缚力减弱，因此，向高化学位移低场方向移动，这也进一步支撑了荧光探针同Cu²⁺的配位机理，提高了检测效果。探针在同底物作用之前，于516nm处呈现出较强的黄绿色荧光，当加入一定浓度的Cu²⁺之后，该处的荧光强度发生了明显的猝灭，猝灭率可达到84.2％，这说明该探针对Cu²⁺具有明显的荧光猝灭响应，且发射峰也没有明显的移动。另外，本发明实施例的探针分子本身为非共轭体系，作用机理主要是基于光诱导电子转移机理(PET机理)进行识别检测的。

经试验，实施例2-4、6-9制得的荧光探针均获得了检测专一性和稳定性高，灵敏度高，抗干扰性强，适用的pH范围广，裸眼识别效果好等技术效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为：

2.如权利要求1所述一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

将化合物A和1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺溶解于乙腈中，化合物A和1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺的质量比1:1～1:1.5，搅拌至溶解后加入碳酸钾，碳酸钾的加入质量是原料化合物A加入质量的3～4倍；混合物加热至回流反应7～9小时，TLC监测反应进程，判断反应终止；反应结束后，反应液经过过滤、除溶剂，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，即得；

其中，化合物A的结构式为：

3.根据权利要求2所述一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物A的制备方法：

惰性气体保护下，加入173.2～346.4mg的8-羟基喹啉-5-醛、185.5～389.6mg的2,4-二甲基吡咯、100～150mL的无水CH₂Cl₂以及125～250μL的三氟乙酸，8-羟基喹啉-5-醛和2,4-二甲基吡咯于无水CH₂Cl₂中进行溶解，混合液在室温下搅拌10～12h；然后分批加入227～454mg二氯二氰苯醌的二氯甲烷溶液；反应液立即由淡黄色变成深紫色，继续搅拌2～4h后，再依次加入2～4mL的三乙胺和2～4mL的BF₃·OEt₂，此时，反应液在紫外灯下产生明显的绿色荧光，继续搅拌10～12，TLC监测反应进程；将反应液依次用水、饱和食盐水洗，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压旋蒸除去溶剂后，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为CHCl₃，得到红色固体产物化合物A。

4.根据权利要求3所述一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述二氯二氰苯醌的加入方式为：分20～25批，每批的量是20～25mg，每次加入之后搅拌2～3分钟之后再加入下一次的量。

5.根据权利要求3所述一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述二氯二氰苯醌的加料速度6～8mg/min。

6.根据权利要求2所述一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺的制备方法：

加入352.1～528.1mg的2,6-二氯甲基吡啶、168～252mg的NaHCO₃以及10～30mL的乙腈，搅拌下缓慢滴加199.25～398.5mg二(吡啶-2-亚甲基)胺的乙腈溶液，滴加完毕后，将反应液加热至40～60℃反应3～5h，然后在室温下反应过夜，TLC监测反应进程；反应结束后，减压浓缩，残留物用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为体积比20:1～10:1的CH₂Cl₂/CH₃OH，得到白色固体产物1-(6-(氯甲基)吡啶-2-基)-N,N-二(吡啶-2-亚甲基)甲胺。

7.根据权利要求6所述一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述二(吡啶-2-亚甲基)胺的滴加速度为每秒钟1～2滴。

8.权利要求1所述一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针在非诊断和治疗目的的检测胃酸、溶酶体、废水或土壤中铜离子的应用。

9.根据权利要求8所述一种于极端pH条件下检测铜离子的荧光探针在非诊断和治疗目的的检测胃酸、溶酶体、废水或土壤中铜离子的应用，其特征在于，检测的pH值为3～13。

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