CN108148014B

CN108148014B - 一种甲醛荧光探针及其制备方法和应用

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Publication number: CN108148014B
Application number: CN201810003977.7A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 何隆薇; 杨雪玲; 徐凯欣
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2018-01-03
Filing date: 2018-01-03
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2038-01-03
Also published as: CN108148014A

Abstract

本发明公开了一种甲醛荧光探针及其制备方法和应用。该探针的分子式为：C₁₄H₁₈N₄O，结构式如下：

该探针在水溶液中自身荧光较弱，与甲醛响应后，在563nm处荧光强度显著增强(200倍)。探针PBD‑FA还可以通过共聚焦荧光显微镜检测活细胞中的甲醛，并进行荧光成像。本发明探针合成简单，并且产率较高；且实现了水溶液中甲醛的特异性和快速检测，具有较大的潜在实用价值。

Description

一种甲醛荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种甲醛荧光探针其制备方法和应用，属于甲醛探针的制备技术领域。

背景技术

甲醛是具有刺激性气味的无色气体，甲醛的主要危害表现为对皮肤黏膜的刺激作用，甲醛是原浆毒物质，能与蛋白质结合，高浓度吸入时出现呼吸道严重的刺激和水肿、眼刺激、头痛。环境中甲醛的主要污染来源是有机合成、化工、合成纤维、染料、木材加工及制漆等行业排放的废水、废气等。某些有机化合物在环境中降解也产生甲醛，如氯乙烯的降解产物也包含甲醛。长期接触低剂量甲醛可能引起慢性中毒，慢性中毒对呼吸系统的危害也是巨大的，长期接触甲醛可引发呼吸功能障碍和肝中毒性病变，引起鼻咽癌、结肠癌、脑瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连及抑制DNA损伤的修复、妊娠综合症、引起新生儿染色体异常、白血病。因此，发明一种能快速、方便检测生理环境中甲醛的方法具有重要的现实意义。

目前甲醛的测定方法有酚试剂比色法、乙酰丙酮比色法、变色酸比色法等化学方法；仪器法有高效液相色谱法、气相色谱法和电化学法。近年来，小分子有机荧光探针受到科学界的广泛关注，它与特定目标分析物发生作用后，荧光信号会发生变化，以达到检测目的。利用荧光探针的荧光分析法具有特异选择性、高灵敏度、响应时间快等优点，可以对细胞内目标分子进行非侵入性成像检测，可以实时在线，形象具体地观察到信号变化。所以，发明能快速检测、易观查信号变化的甲醛荧光探针是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能快速检测甲醛的增强型荧光探针，简称探针PBD-FA；并进一步提供了探针PBD-FA的制备方法和应用。

本发明采用以下技术方案：

一种甲醛荧光探针，该探针分子式为：C₁₄H₁₈N₄O，具有如下所示结构：

本发明的甲醛荧光探针，对甲醛的响应时间为60min左右。所述响应时间为：本发明的甲醛荧光探针作用于含有甲醛的水溶液，采用荧光光谱仪观察荧光光谱峰值达到最大所需时间。

本发明的甲醛荧光探针，能抗氯离子、叠氮阴离子、硝酸根、过氧化二叔丁基、过氧化叔丁醇、精氨酸、谷胱甘肽、丝氨酸、组氨酸、异亮氨酸、硫化氢、甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、丁醛、异戊醛、二乙基丙烯醛、乙醛酸、丙酮、乙酰丙酮、钙离子、铜离子、钾离子、铝离子的干扰，特异性好。

一种甲醛荧光探针的制备方法，它包括以下步骤：

1)将2.0mmol 4-氯-2,1,3-苯并恶二唑溶于DMF中，加入6.0mmol四氢吡咯、1.0mmol硫酸铜，氮气保护回流反应10h以上，反应结束后加水并用二氯甲烷萃取，收集有机相，除去有机相中的水和二氯甲烷，最后用硅胶层析柱进行纯化得到化合物1，其中化合物1的结构式如下：

2)将1.0mmol步骤1)所得化合物1用DMF溶解后，冰浴下滴入DMF与POCl₃的混合溶剂中，移至常温反应1小时，然后分离提纯即得到化合物2，其中化合物2的结构式如下所示：

3)将0.5mmol化合物2用甲醇溶解，冰浴下加入0.5ml氨水，搅拌0.5小时后，移至常温加入0.6mmol烯丙基硼酸频哪醇酯，常温下搅拌8小时以上，除去反应液中的甲醇并进一步分离提纯即得目标探针化合物。

优选的，步骤1)中硅胶柱层析洗脱剂为二氯甲烷与石油醚的体积比为3:1。

优选的，步骤2)中化合物2的分离提纯方法为：待反应完毕后将反应液缓慢滴入水中，用饱和碳酸钠溶液调pH至中性，用二氯甲烷萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥后，通过旋转蒸发仪除去萃取剂二氯甲烷，最后以体积比为100:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，用硅胶层析柱进行纯化。

优选的，步骤3)中分离提纯目标探针化合物的方法为硅胶柱层析，且洗脱剂配比为二氯甲烷与甲醇体积比为50：1。

上述的甲醛荧光探针的合成路线如下：

化合物PBD-FA即为探针。

上述的甲醛荧光探针的用途：该荧光探针可用于检测水环境中的甲醛和生物样品中的甲醛。

该荧光探针可以利用荧光光谱仪检测水环境中的甲醛；该荧光探针可以利用共聚焦荧光显微镜检测活细胞环境中的甲醛，并进行荧光成像。

具体的包括：

观察加入甲醛荧光探针前后待测水环境的荧光光谱的变化；荧光激发波长为470nm；

或者，在365nm光源照射下，用肉眼观察加入甲醛荧光探针前后待测水环境的荧光变化；

或者，观察加入甲醛荧光探针前后待测生物环境的荧光成像图的变化。

所述生物环境，可以是活细胞。

所述荧光光谱的变化是指：荧光光谱中，563nm处的荧光峰值的变化；如果峰值变大，则说明含有甲醛。优选的，采用荧光光谱仪观察荧光光谱。

所述荧光变化是指：在365nm光源照射下，荧光明显增强。

所述荧光成像图的变化是指：从观察不到荧光到观察到黄色荧光。优选的，采用共聚焦显微镜。

首先，水溶液中的甲醛可以引起荧光探针的荧光光谱变化，因此，可以通过观察荧光光谱仪中光谱的变化程度判断溶液中的甲醛含量，从而定量检测；其检测下限为4.97×10^-8mol/L。其次，随着甲醛荧光探针的加入，水溶液中的甲醛与甲醛荧光探针反应，从而使得含有甲醛的水溶液的颜色发生变化；因此，能通过365nm光源的照射观察溶液的颜色变化而判断溶液中是否含有甲醛及甲醛的大体浓度。再次，通过共聚焦显微镜对孵育了荧光探针PBD-FA和甲醛的活细胞进行荧光成像，观察绿色通道荧光信号的变化以达到检测生物环境中的甲醛的目的。另外，利用本发明的探针，采用荧光光谱仪测试水溶液的甲醛时，在180min左右荧光光谱的峰值达到最大；具备反应时间短的优势，实现了快速检测。

本发明的优点：(1)探针合成简单，并且产率较高；(2)本发明实现了水溶液中甲醛的特异性和快速检测；(3)本发明实现了活细胞水平中甲醛的检测。

附图说明

图1是实施例1中化合物1的¹H NMR图谱；

图2是实施例1中化合物1的¹³C NMR图谱；

图3是实施例1中化合物2的¹H NMR图谱；

图4是实施例1中化合物2的¹³C NMR图谱；

图5是实施例1中探针PBD-FA的¹H NMR图谱；

图6是实施例1中探针PBD-FA的¹³C NMR图谱；

图7是实施例2中探针PBD-FA随不同量甲醛的加入荧光谱图的变化情况；图中，从下至上，甲醛浓度依次为0、10、30、50、70、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000μmol/L的荧光光谱；

图8是探针PBD-FA(10μM)在PBS缓冲溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4，含20％CH₃CN)与80当量甲醛在365nm紫外灯照射下的荧光变化图；

图9是实施例3中探针PBD-FA与1000μmol/L甲醛随时间变化的563nm处荧光强度值变化图；

图10是实施例4中探针PBD-FA对不同干扰分析物的在563nm处荧光强度的柱状数据图；图中1，空白；2，氯离子；3，叠氮阴离子；4，硝酸根；5，过氧化二叔丁基；6，过氧化叔丁醇；7，精氨酸；8，谷胱甘肽；9，丝氨酸；10，组氨酸；11，异亮氨酸；12，硫化氢；13，甲醛；14，乙醛；15，丙醛；16，丁醛；17，丁醛；18，异戊醛；19，二乙基丙烯醛；20，乙醛酸；21，丙酮；22，乙酰丙酮；23，钙离子；24，铜离子；25，钾离子；26，铝离子。

图11是实施例5中探针PBD-FA与HeLa细胞中甲醛响应的荧光成像图；图中，(A)是加入5μM探针PBD-FA孵育30分钟后的荧光成像，(B-E)是随后分别加入100、200、400、800μmol/L甲醛继续培育90分钟后的荧光成像；第一行：明场成像；第二行：绿色通道荧光成像；第三行：明场与绿色通道荧光成像图的叠加图；激发波长为488nm，标尺为25微米。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

化合物1的合成：

将308mg 4-氯-2,1,3-苯并恶二唑(2.0mmol)置于烧瓶中，加入248mg五水合硫酸铜(1.0mmol)，用10mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，再加入426mg(6mmol)四氢吡咯，在氮气保护下加热至回流反应过夜(10h以上)，反应完毕。待反应完毕后，加入50ml水，用二氯甲烷(50ml×6)萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥后，通过旋转蒸发仪除去萃取剂二氯甲烷。最后以体积比为3:1的二氯甲烷与石油醚为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化，得到280mg黄色固体(产率为74％)，所得黄色固体即为化合物1。¹H NMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):2.06-2.09(m,4H),3.69-3.72(t,J＝6.8Hz,4H),5.09-5.18(m,2H),5.95-5.97(d,J＝7.6Hz,1H),6.86-6.89(d,J＝8.8Hz,1H),7.24-7.28(t,J＝8.0Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ(ppm):26.50,51.11,99.96,103.38,135.43,138.35,146.99,152.12。

化合物2的合成：

取1mLPOCl₃至于烧瓶中，冰浴下缓慢加入1mLDMF，继续在冰浴下搅拌5min，移至室温继续搅拌0.5小时，取189mg(1mmol)化合物1用DMF溶解，在冰浴下缓慢滴入DMF与POCl₃的混合溶液中，然后移至室温继续搅拌1小时，反应完毕。待反应完毕后将反应液缓慢滴入水中，用饱和碳酸钠溶液调pH至中性，用二氯甲烷(50ml×6)萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥后，通过旋转蒸发仪除去萃取剂二氯甲烷。最后以体积比为100:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化，得到167mg黄色固体(产率为77％)，所得黄色固体即为化合物2。¹H NMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):2.16-2.20(m,4H),3.56(2H),4.21(2H),6.00-6.02(d,J＝8.0Hz,1H),7.81-7.83(d,J＝8.0,1H),9.94(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ(ppm):25.40,29.70,42.93,50.03,52.15,101.78,102.33,110.44,142.56,145.16,147.48,185.84。

探针PBD-FA的合成：

取108mg(0.5mmol)化合物2用5mL甲醇溶解，冰浴下加入0.5mL氨水，搅拌0.5h，撤去冰浴，再加入101mg(0.6mmol)烯丙基硼酸频哪醇酯，在室温下继续搅拌8小时以上，反应完毕。反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂(甲醇)除去得到粗产品。以体积比为50：1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化，得到98mg黄色固体(产率为76％)，所得黄色固体即为探针PBD-FA。¹H NMR(400MHz,CDOD),δ(ppm):2.05-2.08(m,4H),2.55-2.74(m,2H),3.68-3.71(t,J＝6.4Hz,4H),4.18-4.21(t,J＝5.8Hz,1H),4.98-5.04(1H),7.81-7.83(d,J＝8.0,1H),5.68-5.78(m,1H),5.93-5.95(d,J＝7.6Hz,1H),7.17-7.19(d,J＝7.6Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDOD):δ(ppm):26.47,42.52,51.10,53.83,103.24,117.17,118.01,131.95,136.26,137.46,147.30,150.47。

实施例2

探针PBD-FA与不同当量甲醛反应的荧光光谱变化

取实施例1制备的探针PBD-FA溶于CH₃CN中，制成浓度为1mmol/L探针母液(探针PBD-FA的浓度为1mmol/L)；将质量分数为37％的甲醛溶液加入蒸馏水，配制成甲醛浓度为100mmol/L的甲醛母液。从探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，加入不同当量(0-100eq)的甲醛母液(所述当量是指甲醛母液中甲醛的摩尔数相对于探针母液中探针的摩尔数的倍数)，用570μLCH₃CN和不同体积的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配置成探针浓度为10μmol/L，含20％CH₃CN的测试溶液。用荧光光谱仪测试探针与不同当量甲醛反应液的荧光光谱变化(激发波长为470nm)，荧光光谱变化情况如图7所示。由图7可见，随着甲醛加入当量的逐渐增加，探针PBD-FA溶液在563nm处的荧光峰值逐渐增强。当荧光强度达到最大值时，比探针PBD-FA空白液的荧光强度增强265.5倍。如图8可见，探针PBD-FA水溶液在加入甲醛后在365nm紫外灯照射下发出强黄色荧光。

实施例3

探针PBD-FA与甲醛随时间变化的荧光变化

从实施例2中荧光探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，加入30μL浓度为100mmol/L的甲醛母液，再加入570μL CH₃CN和2.4mL的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配制成探针浓度为10μmol/L，甲醛浓度为1000μmol/L，含20％CH₃CN的测试溶液。用470nm的激发波长，测试其随时间变化的荧光光谱。由图9可见，随着时间增加，563nm处的荧光强度逐渐变大，并且在150min左右达到最大值。

实施例4

探针PBD-FA对不同干扰分析物的选择性研究

从实施例2中荧光探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，分别加入以下不同浓度的分析物(干扰物浓度为1mmol/L；甲醛浓度为0.8mmol/L)：氯离子、叠氮阴离子、硝酸根、过氧化二叔丁基、过氧化叔丁醇、精氨酸、谷胱甘肽、丝氨酸、组氨酸、异亮氨酸、硫化氢、甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、丁醛、异戊醛、二乙基丙烯醛、乙醛酸、丙酮、乙酰丙酮、钙离子、铜离子、钾离子、铝离子，用570μL CH₃CN和不同体积的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配置成探针浓度为10μmol/L，含20％CH₃CN的测试溶液。反应1.5小时后检测测试液的荧光光谱变化。由图10可以发现，相对于空白测试液，加入铜离子、钙离子稍有增强，加入二乙基丙烯醛、硝酸根和各种氨基酸的测试液荧光强度没有明显变化。然而，加入甲醛的测试液的荧光强度发生了显著增强。实验结果说明探针PBD-FA对甲醛具有良好的选择性。

实施例5

探针PBD-FA与细胞中甲醛的荧光成像

从实施例2中荧光探针母液中取出5μL加入到育有HeLa细胞的培养皿(含1mL PBS培养基)中，探针浓度为5μmol/L，孵育30分钟，作为控制组；在其中一组控制组样品中分别加入100、200、400和800μmol/L的甲醛，继续孵育90分钟，作为实验组。随后分别用共聚焦显微镜对控制组和实验组进行荧光成像，使用激发波长为488nm的光源激发，收集绿色通道范围的荧光，结果如图11所示。在控制组的荧光成像中，几乎观察不到荧光；然而，在实验组中，可以观察到明显的荧光，且随着甲醛浓度的增加荧光显著增强。实验结果说明探针PBD-FA可以通过共聚焦显微镜检测细胞环境中的甲醛，具有潜在的实际应用价值。

Claims

1.一种甲醛荧光探针，其特征在于，该探针分子式为：C14H18N4O，具有如下所示结构：

。

2.一种权利要求 1 所述的甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1)将 2.0mmol 4-氯-2,1,3-苯并恶二唑溶于 DMF 中，加入 6.0mmol 四氢吡咯、1.0mmol 硫酸铜，氮气保护回流反应 10h 以上，反应结束后加水并用二氯甲烷萃取，收集有机相，除去有机相中的水和二氯甲烷，最后用硅胶层析柱进行纯化得到化合物 1，其中化合物 1 的结构式如下：

；

2)将 1.0mmol 步骤 1）所得化合物 1 用 DMF 溶解后，冰浴下滴入 DMF 与 POCl3的混合溶剂中，移至常温反应 1 小时，然后分离提纯即得到化合物 2，其中化合物 2 的结构式如下所示：

；

3)将 0.5mmol 化合物 2 用甲醇溶解，冰浴下加入 0.5ml 氨水，搅拌 0.5 小时后，移至常温加入0.6mmol 烯丙基硼酸频哪醇酯，常温下搅拌 8 小时以上，除去反应液中的甲醇并进一步分离提纯即得目标探针化合物。

3.根据权利要求 2 所述的甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤 1）中硅胶柱层析洗脱剂为二氯甲烷与石油醚的体积比为 3:1。

4.根据权利要求 2 所述的甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤 2）中化合物2 的分离提纯方法为：待反应完毕后将反应液缓慢滴入水中，用饱和碳酸钠溶液调 pH 至中性，用二氯甲烷萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥后，通过旋转蒸发仪除去萃取剂二氯甲烷，最后以体积比为 100:1 的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，用硅胶层析柱进行纯化。

5. 根据权利要求 2 所述的甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤 3）中分离提纯目标探针化合物的方法为硅胶柱层析，且洗脱剂配比为二氯甲烷与甲醇体积比为 50：1。