CN106565694B - 一种nbd-有机胺类荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NBD‑有机胺类荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针的结构如式(1)所示，其中，m为0或1‑5的整数，n为0或1‑5的整数，且m、n不同时为0；R1为CH2或本发明提供的荧光探针是一种荧光/比色双通道探针，可以肉眼直接观察到显色变化，可以实现利用纸基检测装置进行监测观察。其可以作为内生硫化氢探针的应用，用于检测生物硫化氢的存在。

Description

一种NBD-有机胺类荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物硫化氢检测领域，更具体地，涉及一种NBD-有机胺类荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
硫化氢是具有多种生物功能的重要内源信号分子。在不同的器官和组织中，硫化氢是胱硫醚-β-合成酶(CBS)，胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-MPST)/半胱氨酸氨基转移酶(CAT)的三种不同路径的酶促反应的体内酶促产物。在中枢神经系统中，硫化氢的生物浓度为50-160μM。在等离子血浆中的硫化物水平为10-100μM。研究表明，体内硫化氢的水平和许多疾病具有相关性，例如阿兹海默症，唐氏综合征，糖尿病和肝硬化。尽管硫化氢一直被认为与许多生理学和病理进程相关联，但是，它在体内的许多潜在的分子活动仍然存在很多的未知，需要进一步的研究。因此，开发有效的化学或更高级的方法用于有选择性地、灵敏性地检测生物硫化氢具有重大的研究价值。
一些硫化氢引发的化学反应，包括亲核加成、叠氮或硝基至有机胺的还原反应、铜沉淀反应、二硝基苯基乙醚的硫解反应等已被成功地利用以开发荧光和/或比色探针，用于生物硫化氢检测。
但是目前的荧光和/或比色探针的颜色变化不能在短时间内达到肉眼可见，多需要借助于设备检测才能监测到，无法开发为纸基检测装置。因此，有必要开发一种荧光/比色双通道探针，可以在短时间内肉眼直接观察到显色变化。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光/比色双通道探针，可以在短时间内肉眼直接观察到显色变化。
为了实现上述目的，本发明提供了一种NBD-有机胺类荧光探针，该荧光探针的结构如式(1)所示：
Figure GDA0001197456930000021
其中，m为0或1-5的整数，n为0或1-5的整数，且m、n不同时为0；R1为CH2或
Figure GDA0001197456930000022
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种NBD-有机胺类荧光探针的制备方法，该方法包括：
(1)在第一有机溶剂和碱性缩合剂存在下，将式(15)所示化合物与NBD-Cl接触反应；得到第一中间产物；
Figure GDA0001197456930000023
(2)在第二有机溶剂存在下，将三氟乙酸与第一中间产物接触，得到式(16)所示化合物；
Figure GDA0001197456930000024
(3)在第三有机溶剂存在下，将式(16)所示化合物与乙酸酐接触反应，得到所述NBD-有机胺类荧光探针。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种NBD-有机胺类荧光探针的制备方法，该方法包括：
在第四有机溶剂和碱性缩合剂存在下，将哌啶与NBD-Cl接触，得到所述NBD-有机胺类荧光探针。
根据本发明的再一方面，所述的NBD-有机胺类荧光探针作为内生硫化氢探针的应用。
通过上述技术方案，本发明提供了一种荧光/比色双通道探针，可以在短时间内肉眼直接观察到显色变化，能够实现纸基检测。该探针可以作为内生硫化氢探针，用于检测体内的生物硫化氢。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1a、图1b、图1c、图1d、图1e、图1f和图1g分别示出了根据本发明的实施例和对比例的不同NBD类化合物与H2S反应的荧光光谱图。
图2a、图2b及图2c分别示出了根据本发明的实施例和对比例的不同NBD类化合物与不同浓度的H2S反应的速率时间曲线图。
图3a、图3b、图3c、图3d及图3e分别示出了根据本发明的实施例和对比例的不同NBD类化合物与H2S反应的紫外-可见光吸收光谱图。
图4a、图4b、图4c及图4d分别示出了根据本发明的实施例和对比例的不同NBD类化合物与H2S反应的显色图。
图5示出不同时间、不同浓度H2S与化合物(2)反应的显色结果。
图6示出不同浓度H2S与化合物(2)的纸基检测结果。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然附图中显示了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
本发明提供了一种NBD-有机胺类荧光探针，该荧光探针的结构如式(1)所示：
Figure GDA0001197456930000041
其中，m为0或1-5的整数，n为0或1-5的整数，且m、n不同时为0；R1为CH2或
Figure GDA0001197456930000042
优选地，所述荧光探针选自具有如下结构式的化合物：
Figure GDA0001197456930000043
Figure GDA0001197456930000051
本发明的另一方面提供了一种NBD-有机胺类荧光探针的制备方法，该方法包括：
(1)在第一有机溶剂和碱性缩合剂存在下，将式(15)所示化合物与NBD-Cl接触反应；得到第一中间产物；
Figure GDA0001197456930000052
(2)在第二有机溶剂存在下，将三氟乙酸与第一中间产物接触，得到式(16)所示化合物；
Figure GDA0001197456930000053
(3)在第三有机溶剂存在下，将式(16)所示化合物与乙酸酐接触反应，得到所述NBD-有机胺类荧光探针。
优选地，所述式(15)所示化合物和NBD-Cl的摩尔比为1.0-1.5：1；所述式(16)所示化合物和乙酸酐的摩尔比为1：1.5-2。
根据本发明，所述碱性缩合剂可以为本领域常规的各种选择。优选地，所述碱性缩合剂为N,N-二异丙基乙胺。
根据本发明，所述第一有机溶剂、第二有机溶剂和第三有机溶剂可根据需要确定为本领域各种常规的有机溶剂。优选地，所述第一有机溶剂、第二有机溶剂和第三有机溶剂均为二氯甲烷。
本发明还提供了另一种NBD-有机胺类荧光探针的制备方法，该方法包括：
在第四有机溶剂和碱性缩合剂存在下，将哌啶与NBD-Cl接触，得到所述NBD-有机胺类荧光探针。
优选地，所述碱性缩合剂为N,N-二异丙基乙胺，所述第四有机溶剂为四氢呋喃。
优选地，所述哌啶与NBD-Cl的摩尔比为1：1.2-1.8。
本发明所述的NBD-有机胺类荧光探针可应用作为内生硫化氢探针。
通过以下实施例对本发明进行进一步说明。实施例中所有化学试剂均通过商购获得。
所有光学测试例均在PBS缓冲溶液(50mM，PH＝7.4，含20％DMSO)中进行。
测试例中各化合物溶剂于DMSO中制备成储存液。用PBS缓冲溶液(50mM，PH＝7.4，含20％DMSO)稀释得到不同浓度的化合物。
实施例1
(1)将1.2mmol单-tBOC哌嗪和1.0mmol NBD-Cl溶解于20.0mL二氯甲烷溶剂中，然后加入0.25mL(1.5mmol)N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)；室温下搅拌4h后，减压蒸馏，利用快速柱层析法对减压蒸馏残余物进行纯化，洗脱剂为体积比1.5:100的甲醇与二氯甲烷，得到中间产物
(2)在10mL的二氯甲烷中，将10mL三氟乙酸与步骤(1)获得的中间产物接触，室温下搅拌3h，减压蒸馏得到红色固体物质
Figure GDA0001197456930000062
(3)在20mL二氯甲烷中，将1.0mmol的
Figure GDA0001197456930000071
与1.8mmol乙酸酐接触反应，室温下搅拌3h，减压蒸馏，利用快速柱层析法对减压蒸馏残余物进行纯化，洗脱剂为体积比0.8:100的甲醇与二氯甲烷，得到所述NBD-有机胺类荧光探针化合物式(2)。
化合物式(2)为红色固体，TLC:Rf＝0.2(甲醇:二氯甲烷＝2:100).1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:8.52(d,J＝8.8Hz,1H),6.62(d,J＝8.8Hz,1H),4.27-4.10(m,4H),3.80-3.70(m,4H),2.06(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:168.67,145.36,144.70,144.67,136.18,121.09,103.07,48.84,44.20,21.09.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd.forC12H14N5O4:292.1046,found:292.1047。
实施例2
将0.5mmol哌啶和0.75mmol NBD-Cl溶解于10.0mL四氢呋喃中；然后加入0.25mL(1.5mmol)N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌1h，减压蒸馏，利用快速柱层析法对减压蒸馏残余物进行纯化，洗脱剂为体积比1:2的石油醚与二氯甲烷，得到所述NBD-有机胺类荧光探针化合物式(9)。
化合物(9)为红色固体，TLC:Rf＝0.3(石油醚:二氯甲烷＝1:2).1H NMR(400MHz,CDCl3),δ:8.41(d,J＝8.8Hz,1H)，6.27(d,J＝8.8Hz,1H),4.14-4.07(m,4H),1.86-1.80(m,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:145.08,144.92,144.65,136.29,119.95,103.05,50.95,25.80,23.40.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd.for C11H13N4O3:249.0988,found:249.0979。
对比例1
将0.75mmol乙胺和0.5mmol NBD-Cl溶解于10.0mL四氢呋喃中；然后加入0.25mL(1.5mmol)N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌1h，减压蒸馏，利用快速柱层析法对减压蒸馏残余物进行纯化，洗脱剂为体积比1:1的石油醚与二氯甲烷，得到化合物式(17)。
Figure GDA0001197456930000081
TLC:Rf＝0.6(石油醚:二氯甲烷＝1:2).1H NMR(400MHz,CDCl3),δ:8.50(d,J＝8.4Hz,1H),6.17(d,J＝8.4Hz,1H),3.59-3.53(m,2H),1.47(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:144.73,144.16,143.95,137.66,120.41,98.75,64.87,13.10.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd.for C8H9N4O3:209.0669,found:209.0647。
对比例2
将1.0mmol 2-乙醇胺和1.5mmol NBD-Cl溶解于10.0mL四氢呋喃中；然后加入0.5mL(3.0mmol)N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌1h，减压蒸馏，利用快速柱层析法对减压蒸馏残余物进行纯化，洗脱剂为体积比为1:1的石油醚与乙酸乙酯，得到化合物式(18)。
Figure GDA0001197456930000082
TLC:Rf＝0.3(石油醚:乙酸乙酯＝1:1).1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:9.41(brs,1H),8.51(d,J＝8.8Hz,1H),6.46(d,J＝8.8Hz,1H),4.94(brs,1H),3.71-3.67(dd,J＝5.6Hz,11.2Hz,2H),3.62-3.48(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:145.51,144.31,143.95,137.77,120.43,99.26,58.80,46.04.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd.for C8H9N4O4:225.0624,found:225.0620。
对比例3
将0.5mmol的二乙醇胺和0.75mmol的NBD-Cl溶解于10.0mL的二甲基甲酰胺中；然后加入0.25mL(即1.5mmol)的N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌1h，减压蒸馏，利用快速柱层析法对减压蒸馏残余物进行纯化，洗脱剂为乙酸乙酯，得到化合物式(19)。
Figure GDA0001197456930000091
TLC:Rf＝0.4(乙酸乙酯).1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:8.45(d,J＝9.2Hz,1H),6.55(d,J＝9.2Hz,1H),5.00(brs,2H),4.40-4.00(m,4H),3.76(t,J＝5.6Hz,4H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:146.01,144.75,143.38,135.99,119.69,102.65,58.18,56.26.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd.for C10H13N4O5:269.0886,found:269.0881。
对比例4
将苯胺(93mg,1.0mmol)与NBD-Cl(300mg,1.5mmol)溶解于10mL干燥THF中，加入DIPEA(0.5mL,3.0mmol)。室温搅拌1h后，减压蒸馏，利用快速柱层析法对减压蒸馏残余物进行纯化，洗脱剂为体积比为6:1的石油醚与乙酸乙酯，得到化合物式(20)。
Figure GDA0001197456930000092
TLC:Rf＝0.4(石油醚:乙酸乙酯＝6:1).1H NMR(400MHz,CDCl3),δ:8.46(d,J＝8.4Hz,1H),7.74(brs,1H),7.55-7.51(m,2H),7.42-7.35(m,3H),6.73(d,J＝8.4Hz,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:144.92,144.11,142.28,137.68,137.59,129.56,126.37,123.82,122.98,101.55.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd.for C12H9N4O3:257.0675,found:257.0602。
对比例5
(1)将单-tBOC哌嗪(115mg,0.62mmol)与NBD(S)-Cl(110mg,0.5mmol)溶解于20mL二氯甲烷中，然后加入DIPEA(0.13mL,0.75mmol)。室温搅拌2h后，减压蒸馏，利用快速柱层析法对减压蒸馏残余物进行纯化，洗脱剂为体积比2:100的甲醇与二氯甲烷，得到中间产物。
(2)将中间产物溶于15mL二氯甲烷中，加入15mL三氟乙酸。室温搅拌2h，减压蒸馏得到化合物式(21)。
Figure GDA0001197456930000101
TLC:Rf＝0.7(甲醇:二氯甲烷＝1:10).1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:8.58(d,J＝8.8Hz,1H),6.93(d,J＝8.8Hz,1H),4.20-4.10(m,4H),3.23-3.16(m,4H),1.23(brs,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:148.74,147.63,146.91,131.85,128.60,106.44,47.77,43.68.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd.forC10H12N5O2S:266.0712,found:266.0703。
测试例1
荧光光谱试验：在PBS缓冲溶液中(50mM，PH＝7.4，含20％DMSO)，将1μM NBD类化合物和100μM H2S进行荧光光谱试验，反应时间为30min。
结果如图1a-图1e所示，化合物式(2)、化合物式(9)、化合物式(17)、化合物式(18)、化合物式(19)、化合物式(20)与化合物式(21)的最大发射波长为560nm，最大激发波长为470nm。
从几种化合物与H2S反应导致的荧光淬灭可以看出，化合物式(2)和化合物式(9)的荧光淬灭非常明显，而化合物式(17)、化合物式(18)、化合物式(19)、化合物式(20)与化合物式(21)的荧光淬灭非常微弱。说明化合物式(2)和化合物式(9)与H2S的反应更显著。
测试例2
动力学研究试验：在PBS缓冲溶液中(PH＝7.4)，测定不同化合物在560nm处的时间依赖荧光信号，经过数据拟合求得硫解反应速率。
结果如图2a-图2c所示，其中，化合物式(2)、化合物式(9)及化合物式(18)的硫解反应速率k2分别为21.77、1.10、0.05M-1S-1。而化合物式(21)、化合物式(17)、化合物式(19)在mM量级H2S存在下的反应速率也仅与化合物式(18)相当，化合物式(20)在mM量级H2S存在下也未能测得反应速率。
由此可知，NBD探针化合物式(2)、化合物式(9)与H2S的硫解反应反应速率远快于其他化合物，其中化合物式(2)的反应速率更快。
测试例3
紫外-可见光吸收光谱试验：在PBS缓冲溶液中(50mM，PH＝7.4，包含20％的二甲基亚砜)，对10μM化合物式(2)和化合物式(9)分别与100μM H2S的反应进行紫外-可见光吸收光谱试验；在PBS缓冲溶液中(50mM，PH＝7.4，包含20％的二甲基亚砜)，对10μM化合物式(17)、化合物式(18)及化合物式(19)分别与2mM H2S的反应进行紫外-可见光吸收光谱试验。
如图3a-图3e所示，在反应开始时，所有化合物在450-500nm范围内都有明显的吸收峰，这个吸收峰是NBD基团在450-500nm范围内产生的紫外-可见光吸收峰。但是，随着时间的推移，由于化合物与H2S发生了硫解反应，使得吸光度随着反应的进行发生了变化。从图中可见，随着硫解反应的进行，图3a和图3b分别在530-550nm范围内又出现了明显的吸收峰，这个吸收峰是硫解反应产物NBD-SH在该范围内产生的紫外-可见光吸收峰，然而，图3c-图3e中在530-550nm范围内没有出现吸收峰。说明化合物式(2)和化合物式(9)与H2S发生了较明显的硫解反应。
测试例4
显色反应：在PBS缓冲溶液中(50mM，PH＝7.4，包含20％的二甲基亚砜)，15μM化合物式(2)和15μM化合物式(9)分别与100μM H2S进行显色反应；在PBS缓冲溶液中(50mM，PH＝7.4，包含20％的二甲基亚砜)，15μM化合物式(17)、15μM化合物式(18)及15μM化合物式(19)分别与2mM H2S进行显色反应。结果如图4a-4d所示。
如图4a所示，没添加H2S前，化合物式(2)的溶液为淡黄色，加入H2S后，随着硫解反应的进行，溶液变为淡紫色，颜色变化明显，肉眼可见。
如图4b所示，没添加H2S前，化合物式(9)的溶液为淡橘色，加入H2S后，随着硫解反应的进行，溶液变为很浅的淡黄色，颜色变化明显，肉眼可见。
如图4c所示，没添加H2S前，化合物式(18)的溶液为黄色，加入H2S后，随着硫解反应的进行，溶液变为淡黄色，颜色变化不明显，肉眼不易观察。
如图4d所示，没添加H2S前，化合物式(19)的溶液的颜色为淡橘色，加入H2S后，随着硫解反应的进行，溶液变为很浅的淡橘色，颜色变化不明显，肉眼不易观察。
测试例5
测定10μM化合物(2)在不同浓度的H2S存在下，分别反应5min和1h时的颜色变化，结果如图5所示。可以看出，化合物(2)对H2S的肉眼识别在短时间内即可体现，并且，随时时间推移，颜色变化越来越明显。
测试例6
在不同浓度的H2S存在下，对1μM化合物(2)进行纸基检测，时间为30min。结果如图6所示，不存在H2S时显示为浅黄色，随着H2S浓度增加颜色越来越深，存在1mM H2S时显示为红色。说明少量化合物(2)即可在短时间内通过纸基检测显著识别H2S。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (5)

1.NBD-有机胺类荧光探针作为内生硫化氢探针的应用，其特征在于，所述荧光探针选自具有如下结构式的化合物：
Figure FDA0002040550730000011
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述NBD-有机胺类荧光探针由包括以下步骤的方法制得：
(1)在第一有机溶剂和碱性缩合剂存在下，将单-tBOC哌嗪与NBD-Cl接触反应；得到第一中间产物；
(2)在第二有机溶剂存在下，将三氟乙酸与第一中间产物接触，得到
Figure FDA0002040550730000012
(3)在第三有机溶剂存在下，将
Figure FDA0002040550730000013
与乙酸酐接触反应，得到所述NBD-有机胺类荧光探针。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，单-tBOC哌嗪与NBD-Cl的摩尔比为1.0-1.5：1；
Figure FDA0002040550730000014
与乙酸酐的摩尔比为1：1.5-2。
4.根据权利要求2所述的应用，其中，所述碱性缩合剂为N,N-二异丙基乙胺。
5.根据权利要求2所述的应用，其中，所述第一有机溶剂、第二有机溶剂和第三有机溶剂均为二氯甲烷。
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