CN109293595B - 一种检测硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和应用，该探针结构式如下：

其制备方法如下：1)以异氟尔酮和丙二腈为原料在乙醇中反应，纯化得化合物1；2)冰水浴条件下，POCl₃和3‑N,N‑二乙氨基苯酚在DMF中加热搅拌回流，反应结束后调节pH至中性，纯化得化合物2；3)将化合物1和化合物2溶解在乙醇反应，结束后纯化得HZ‑1；4)将HZ‑1和NBD‑Cl反应，得HZ‑NBD。该荧光探针应用于四氢呋喃‑磷酸盐缓冲液中H₂S的检测或者应用在HepG2细胞内、斑马鱼内对H₂S的检测。该荧光探针对H₂S的识别有着良好的选择性，检测灵敏度高，可达到裸眼识别的效果。

Description

一种检测硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种检测硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和应用，属于生物分析检测技术领域。

背景技术

硫化氢(H₂S)是一种具有特殊气味的气味，对环境的毒性污染已经得到深入的研究。除此之外，H₂S 在体内的含量与不同的生理过程相关，例如H₂S可参与血红蛋白改变，能够调节体内多种酶，对神经细胞进行调节，舒张血管平滑肌，保护胃黏膜，减小压力的作用。但是，生物体内H₂S失调则会导致机体严重损伤，比如老年痴呆症、唐氏综合征、糖尿病、肝硬化等。

目前，存在的检测方法有比色法、电化学分析、色谱分析和金属硫化物沉淀等。遗憾的是，这些方法存在有一定的弊端：灵敏度低，响应时间长，对生物的损害较大。而荧光探针则以其灵敏度高、选择性好、操作简单、对生物损害小和可实时原位检测等优点，在H₂S检测中得到了广泛的应用。近年来，已有很多用来检测H₂S的荧光探针陆续被报道，取得了较大的发展。在此基础上，本发明提出了一种近红外荧光探针HZ-NBD，其对H₂S的识别有着良好的选择性，检测灵敏度高，可达到裸眼识别的效果；除此之外，还可以应用于HepG2细胞和斑马鱼体内成像。这对实现生物体内H₂S的检测具有十分重要的生物学意义。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种检测硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针具有良好的选择性，能够实现裸眼识别并可以用紫外荧光光谱定量分析，具有较好的应用前景。

技术方案：本发明提供了一种检测硫化氢的近红外荧光探针，所述的探针为HZ-NBD，其结构式如下：

本发明还提供了一种检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，该近红外荧光探针的制备反应式如下：

具体步骤如下：

1)以异氟尔酮为原料，在反应溶剂乙醇中与丙二腈反应，氮气保护下回流搅拌6～10h后浓缩、重结晶纯化，得化合物1；

2)在冰水浴条件下，将POCl₃以1～3滴/秒的速度滴加到N，N-二甲基甲酰胺即DMF中，之后边搅拌边将溶解有3-N,N-二乙氨基苯酚的DMF滴加到上述含有POCl₃的DMF中，加热回流搅拌反应，反应结束后将反应液倒入到冰水中调节pH至中性，得到棕色固体，重结晶纯化得化合物2；

3)将化合物1和化合物2溶解在乙醇中，点板跟踪(TLC)反应进程，反应结束后柱层析纯化得化合物HZ-1；

4)将HZ-1和4-氯-7-硝基苯呋咱即NBD-Cl反应，CH₂Cl₂为反应溶剂并加入三乙胺，室温下搅拌8～ 12h，柱层析纯化得到目标化合物HZ-NBD。

步骤1)所述的异氟尔酮、丙二腈和乙醇的摩尔体积配比为1～5mmol：1.2～6mmol：5～15ml。

步骤2)所述的3-N,N-二乙氨基苯酚、POCl₃和反应所用的DMF的摩尔体积配比为10～20mmol：30～ 60mmol：9～20ml。

步骤2)所述的加热回流搅拌反应中加热至70～75℃，回流搅拌反应时长为2～6h；步骤2)所述的反应结束后将反应液倒入到冰水中调节pH至中性过程中，冰水为50～100ml，调节pH所用的调节剂为无水NaCO₃。

步骤3)所述的化合物1、化合物2和乙醇的摩尔体积配比为2～5mmol：2～5mmol：5～15ml。

步骤4)所述的HZ-1、NBD-Cl和CH₂Cl₂的摩尔体积配比为3～10mmol：3～10mmol：5～15ml。

步骤4)所述的三乙胺的加入量为0.03～0.08当量。

本发明还提供了一种检测硫化氢的近红外荧光探针的应用，该荧光探针应用于四氢呋喃-磷酸盐缓冲液(即THF/PBS)中H₂S的检测或者应用在HepG2细胞内、斑马鱼内对H₂S的检测。

其中：

所述的四氢呋喃-磷酸盐缓冲液中四氢呋喃与磷酸盐缓冲液的体积用量比为1:1～9:1。

本发明提供的检测硫化氢的近红外荧光探针对H₂S选择性高、灵敏度高，在THF/PBS缓冲溶液加入HS^-后，该探针分子中的NBD基团发生硫解，出现红色荧光，溶液颜色由粉红色变为暗红色，可实现裸眼识别 H₂S，其对H₂S的检测限为13.2nM，7min内即能响应完全，pH的适用范围为6～10。

本发明提供的检测硫化氢的近红外荧光探针保持了固有近红外荧光探针的优点，且克服了现有技术存在的对H₂S选择性差、灵敏度低的缺点，且该荧光探针生物兼容性较好，细胞毒性低，能够实现对细胞和斑马鱼H₂S的高灵敏度检测。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

(1)该近红外荧光探针实现了对HS^-的快速检测，并且灵敏度高、选择性好、现象明显，365nm紫外灯下可观察到由开始的微弱荧光到极强的红色荧光；

(2)该红外荧光探针生物兼容性较好、细胞毒性低，并成功应用于HepG2细胞和斑马鱼成像，为探针在细胞及活体中检测H₂S提供了可能。

附图说明

图1是本发明实施例1中探针HZ-NBD(1*10^-5M)与10当量各分析物在THF/PBS(v/v,1:1)缓冲溶液中的荧光发射图；

图2是本发明实施例1中探针HZ-NBD与不同NaSH浓度溶液在THF/PBS(v/v,1:1)缓冲溶液中的紫外吸收图；

图3是本发明实施例1中探针HZ-NBD与不同NaSH浓度溶液在THF/PBS(v/v,1:1)缓冲溶液中的荧光发射图；

图4是本发明实施例1中pH对探针HZ-NBD识别H₂S的影响图谱。

图5是加入探针HZ-NBD和HS^-后，荧光增强，在生理pH环境中保持稳定的图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，但实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1:

一种检测硫化氢的近红外荧光探针HZ-NBD，其结构式如下：

其制备反应式如下：

具体步骤如下：

1)称取0.691g(5mmol)异氟尔酮和丙二腈0.396g(6mmol)溶于10ml无水乙醇中，氮气保护下回流搅拌6h，旋蒸除去多余溶剂，得到黄色固体，后无水乙醇重结晶，即得淡黄色晶体目标产物1，产率94％；

2)冰浴搅拌条件下将2.75mlPOCl₃(30mmol)缓慢滴加到3ml DMF中，后逐渐加入溶解了1.66g 3-N,N- 二乙氨基苯酚(10mmol)的6ml DMF,加热至75℃回流搅拌2h，反应结束后冷却至室温并倒入60ml冰水中，用Na₂CO₃调节pH至中性，有大量棕灰色固体生成，抽滤，无水乙醇重结晶，即得棕灰色晶体目标产物2，产率95％；

3)称取0.38g化合物1(2mmol)和0.38g化合物2(2mmol)溶解在5ml无水乙醇中，溶解即可，点板跟踪反应进程，反应结束后旋蒸除去大部分溶剂，用石油醚：乙酸乙酯(5：1)作为洗脱剂进行柱层析纯化，即得目标产物HZ-1，产率20％；

4)称取0.6g HZ-1(3mmol)和0.6g NBD-Cl(3mmol)溶于5ml重蒸的二氯甲烷中，加入0.03当量的三乙胺，将反应液置于室温下搅拌8h，反应结束后旋蒸除去大部分溶剂，用石油醚：乙酸乙酯(2：1)作为洗脱剂进行柱层析纯化，即得检测硫化氢的近红外荧光探针HZ-NBD，产率25％。

一种检测硫化氢的近红外荧光探针的应用，该应用于四氢呋喃-磷酸盐缓冲溶液中H₂S的检测，其步骤如下：

步骤1、探针母液的配制：称取0.0052g HZ-NBD，用四氢呋喃溶解于10ml容量瓶中，浓度为1*10^-3M；各分析物母液的配制：称取各对应量的分析物(NaSH,NaHSO₃,GSH,Hcy,Cys,His,Asp,Thr,Trp,Tyr, Lys,Arg,Glu,Gly,Ala,Phe,Asn,Pro,NaCl,AcONa)，用蒸馏水溶解，浓度为1*10^-2M；测试时根据需求稀释母液。

步骤2、取探针母液加入相应的四氢呋喃-磷酸盐缓冲溶液，配置成10μM(四氢呋喃:磷酸盐缓冲溶液＝1:1,v/v)的溶液。

(1)然后分别加入100μM的各分析物，测试其荧光发射光谱变化情况；

(2)然后加入不同浓度的HS^-,测试不同HS^-浓度下其紫外吸收光谱和荧光发射光谱变化情况；

步骤3、用浓HCl和NaOH溶液调节磷酸盐缓冲溶液的pH值(3～12)，取探针母液加入到相应的不同 pH值的四氢呋喃-磷酸盐缓冲溶液中，浓度为10μM，然后加入100μM的HS^-，测试不同pH值下其荧光发射光谱变化情况。

结果分析：

单独探针母液在672nm处基本无荧光，当加入10当量HS^-时荧光显著增强，但当加入其它离子和生物小分子时，并没有特别明显的荧光增强变化，由上述结果可知，HZ-NBD在四氢呋喃:磷酸盐缓冲溶液 (1:1,v/v)体系中对HS^-有好的荧光选择性(结果见图1)。

单独探针母液在530nm处有最大紫外吸收，随着加入HS^-浓度的增加，其紫外吸收光谱明显发生变化，探针分子产生一个以560nm为中心的新的吸收峰，相应地溶液的颜色由粉红色变为紫红色，可达到裸眼识别的效果(结果见图2)。

单独探针母液基本无荧光，随着加入HS^-浓度的增加，其荧光发射光谱发生变化，在672nm处出现了强的发射峰，非常有利于生物细胞成像分析；线性方程y＝72013x+247201(R²＝0.9962)被拟合出来，经计算检测限为13.2nM(结果见图3和图4)。

配置pH＝3～12的磷酸盐缓冲溶液，加入探针HZ-NBD后，荧光无变化；而当加入探针HZ-NBD和HS^-后，荧光增强，并能在生理pH环境中保持稳定(结果如图5)。

实施例2

一种检测硫化氢的近红外荧光探针HZ-NBD，其结构式如下：

其制备反应式如下：

具体步骤如下：

1)称取0.138g(1mmol)异氟尔酮和丙二腈0.079g(1.2mmol)溶于5ml无水乙醇中，氮气保护下回流搅拌6h。旋蒸除去多余溶剂，得到黄色固体，后无水乙醇重结晶，即得淡黄色晶体目标产物1，产率94％；

2)冰浴搅拌条件下将4.12mlPOCl₃(45mmol)缓慢滴加到5.5mlDMF中，后逐渐加入溶解了2.49g 3-N,N- 二乙氨基苯酚(15mmol)的8mlDMF,加热至73℃回流搅拌4h。反应结束后冷却至室温并倒入60ml冰水中，用Na₂CO₃调节pH至中性，有大量棕灰色固体生成，抽滤，无水乙醇重结晶，即得棕灰色晶体目标产物2，产率95％；

3)称取0.75g化合物1(4mmol)和0.75g化合物2(4mmol)溶解在10ml无水乙醇中，溶解即可，哌啶2-3滴，点板跟踪反应进程。反应结束后旋蒸除去大部分溶剂，用石油醚：乙酸乙酯(5：1)作为洗脱剂进行柱层析纯化，即得目标产物HZ-1，产率20％；

4)称取1.2g HZ-1(6mmol)和1g NBD-Cl(5mmol)溶于10ml的二氯甲烷中，加入0.05当量的三乙胺，将反应液置于室温下搅拌10h，反应结束后旋蒸除去大部分溶剂，用石油醚：乙酸乙酯(2：1)作为洗脱剂进行柱层析纯化，即得检测硫化氢的近红外荧光探针HZ-NBD，产率25％。

一种检测硫化氢的近红外荧光探针的应用，该应用于HepG2细胞中H₂S的检测，其步骤如下：将HepG2 细胞分为三组：第一组细胞先用N-乙基马来酰亚胺(500μM)预处理0.5h，随后用HZ-NBD(10μM) 处理0.5h；第二组细胞仅用HZ-NBD(10μM)处理0.5h；第三组先用N-乙基马来酰亚胺(500μM) 预处理0.5h，随后用HZ-NBD(10μM)处理0.5h、NaSH(200μM)处理0.5h。

结果分析：

当把用N-乙基马来酰亚胺预处理后的细胞随之用HZ-NBD处理时，细胞内无荧光；当单独用HZ-NBD处理细胞时，细胞内有微弱荧光；当把用N-乙基马来酰亚胺预处理后的细胞随之用HZ-NBD和NaSH处理时，可以观察到细胞内明显的红色荧光，这说明探针HZ-NBD可以检测细胞内源性和外源性H₂S。

实施例3

一种检测硫化氢的近红外荧光探针HZ-NBD，其结构式如下：

其制备反应式如下：

具体步骤如下：

1)称取0.414g(3mmol)异氟尔酮和丙二腈0.238g(3.6mmol)溶于10ml无水乙醇中，氮气保护下回流搅拌6h。旋蒸除去多余溶剂，得到黄色固体，后无水乙醇重结晶，即得淡黄色晶体目标产物1，产率94％；

2)冰浴搅拌条件下将5.5mlPOCl₃(60mmol)缓慢滴加到5ml DMF中，后逐渐加入溶解了3.32g 3-N,N- 二乙氨基苯酚(20mmol)的10mlDMF,加热至70℃回流搅拌6h。反应结束后冷却至室温并倒入100ml冰水中，用Na₂CO₃调节pH至中性，有大量棕灰色固体生成，抽滤，无水乙醇重结晶，即得棕灰色晶体目标产物2，产率95％；

3)称取0.93g化合物1(5mmol)和0.95g化合物2(5mmol)溶解在15ml无水乙醇中，溶解即可，哌啶2-3滴，点板跟踪反应进程。反应结束后旋蒸除去大部分溶剂，用石油醚：乙酸乙酯(5：1)作为洗脱剂进行柱层析纯化，即得目标产物HZ-1，产率20％；

4)称取2g HZ-1(10mmol)和2g NBD-Cl(10mmol)溶于15ml重蒸的二氯甲烷中，加入0.08当量的三乙胺，将反应液置于室温下搅拌12h，反应结束后旋蒸除去大部分溶剂，用石油醚：乙酸乙酯(2：1)作为洗脱剂进行柱层析纯化，即得检测硫化氢的近红外荧光探针HZ-NBD，产率25％。

一种检测硫化氢的近红外荧光探针的应用，该应用于斑马鱼内H₂S的检测，其步骤如下：将斑马鱼分为三组：第一组细胞先用N-乙基马来酰亚胺(500μM)预处理0.5h，随后用HZ-NBD(10μM)处理0.5 h；第二组细胞仅用HZ-NBD(10μM)处理0.5h；第三组先用N-乙基马来酰亚胺(500μM)预处理0.5 h，随后用HZ-NBD(10μM)处理0.5h，NaSH(200μM)处理0.5h。

结果分析：

当把用NEM预处理后的斑马鱼随之用HZ-NBD处理时，斑马鱼内无荧光；当单独用HZ-NBD处理斑马鱼时，斑马鱼内有微弱荧光；当把用NEM预处理后的斑马鱼随之用HZ-NBD和NaSH处理时，可以观察到斑马鱼内明显的红色荧光，这说明探针HZ-NBD可以检测活体内源性和外源性H₂S。

Claims (10)

1.一种检测硫化氢的近红外荧光探针，其特征在于：所述的探针为HZ-NBD，其结构式如下：

。

2.一种如权利要求1所述的检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于:该近红外荧光探针的制备反应式如下：

具体步骤如下：

1)以异氟尔酮为原料，在反应溶剂乙醇中与丙二腈反应，氮气保护下回流搅拌6～10h后浓缩、重结晶纯化，得化合物1；

2)在冰水浴条件下，将POCl₃滴加到N，N-二甲基甲酰胺即DMF中，之后边搅拌边将溶解有3-N,N-二乙氨基苯酚的DMF滴加到上述含有POCl₃的DMF中，加热回流搅拌反应，反应结束后将反应液倒入到冰水中调节pH至中性，得到棕色固体，重结晶纯化得化合物2；

3)将化合物1和化合物2溶解在乙醇中，反应结束后柱层析纯化得化合物HZ-1；

4)将HZ-1和4-氯-7-硝基苯呋咱即NBD-Cl反应，CH₂Cl₂为反应溶剂并加入三乙胺，室温下搅拌8～12h，柱层析纯化得到目标化合物HZ-NBD。

3.根据权利要求2所述的一种检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤1)所述的异氟尔酮、丙二腈和乙醇的摩尔体积配比为1～5mmol：1.2～6mmol：5～15ml。

4.根据权利要求2所述的一种检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤2)所述的3-N,N-二乙氨基苯酚、POCl₃和反应所用的DMF的摩尔体积配比为10～20mmol： 30～60mmol：9～20ml。

5.根据权利要求2所述的一种检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤2)所述的加热回流搅拌反应中，加热至70℃～75℃，回流搅拌反应时长为2～6h；步骤2)所述的反应结束后将反应液倒入到冰水中调节pH至中性过程中，冰水为50～100ml，调节pH所用的调节剂为无水NaCO₃。

6.根据权利要求2所述的一种检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤3)所述的化合物1、化合物2和乙醇的摩尔体积配比为2～5mmol：2～5mmol：5～15ml。

7.根据权利要求2所述的一种检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤4)所述的HZ-1、NBD-Cl和CH₂Cl₂的配比为摩尔体积配比为3～10mmol：3～10mmol：5～15ml。

8.根据权利要求2所述的一种检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤4)所述的三乙胺的加入量为0.03～0.08当量。

9.一种如权利要求1所述的检测硫化氢的近红外荧光探针的应用，其特征在于：该荧光探针应用于四氢呋喃-磷酸盐缓冲液中H₂S的检测或者应用在HepG2细胞、斑马鱼内对H₂S的检测。

10.如权利要求9所述的一种检测硫化氢的近红外荧光探针的应用，其特征在于：所述的四氢呋喃-磷酸盐缓冲液中四氢呋喃与磷酸盐缓冲液的体积用量比为1:1～9:1。

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