CN115710259A

CN115710259A - 靶向脂滴检测h2s的开启型荧光探针及制备方法和应用

Info

Publication number: CN115710259A
Application number: CN202211313252.0A
Authority: CN
Inventors: 张彩红; 李佳乐; 张文凯; 张国梅; 董川; 双少敏
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2022-10-25
Filing date: 2022-10-25
Publication date: 2023-02-24

Abstract

本发明属于有机荧光探针领域，具体涉及一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针及制备方法和应用，大多数检测H₂S的探针主要针对于体外以及细胞质中的H₂S的检测，很难实现细胞器水平上的内源性H₂S的检测，尤其是脂滴靶向的H₂S的检测。本发明设计了一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针，通过将TBAF‑OH，NBD‑Cl和三乙胺溶解在二氯甲烷和乙醇的混合溶液中，室温搅拌，反应结束后，反应混合物减压浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化分离纯化得到，该探针实现了对细胞和生物体内源性和外源性H₂S的检测，应用该探针还实现了监测在炎症状态下细胞内H₂S含量的波动。

Description

靶向脂滴检测H2S的开启型荧光探针及制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机荧光探针领域，具体涉及一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针及制备方法和应用。

背景技术

硫化氢是一种气体信号分子，由于其在生理和病理过程中的多重作用，近年来成为生物领域的研究热点。据报道，在人体血液中内源性的硫化氢含量是10-100μM，内源性的硫化氢可以参与很多方面的生理过程，例如舒缓血管平滑肌，调节神经传递，抑制胰岛素信号，调节体内炎症以及氧气释放等。因此，选择性识别和高灵敏检测生物体内的H₂S具有十分重要的生物医学意义。然而大多数检测H₂S的探针主要针对于体外以及细胞质中的H₂S的检测，很难实现细胞器水平上的内源性H₂S的检测，尤其是脂滴靶向的H₂S的检测。本专利设计了一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针，实现了对细胞和生物体内源性和外源性H₂S的检测，应用该探针还实现了监测在炎症状态下细胞内H₂S含量的波动。

发明内容

针对上述问题本发明提供了一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针及制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针，其分子式为：C₃₃H₂₀N₄O₆，结构式为：

进一步，所述荧光探针的荧光信号在低极性环境中被点亮。

进一步，所述荧光探针和H₂S作用之后进行共定位实验实现脂滴的靶向。

一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

将TBAF-OH，NBD-Cl和三乙胺溶解在二氯甲烷和乙醇的混合溶液中，室温搅拌，反应结束后，反应混合物减压浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化分离纯化得到所述荧光探针(TBAF-NBD)。

进一步，所述TBAF-OH和NBD-Cl的摩尔比为1:1，所述二氯甲烷和乙醇的体积比为1:1～3。

进一步，所述室温搅拌的转速为600rpm，所述室温搅拌的时间为10～12h。

进一步，所述硅胶柱层析纯化的展开剂为二氯甲烷:乙酸乙酯＝50:1(V:V)。

一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针的应用，应用在制备监测炎症细胞内H₂S含量波动的试剂。

一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针的应用，应用在制备检测细胞内内源性H₂S以及斑马鱼中外源性H₂S的试剂。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

1、本发明荧光探针分子合成过程简单，且后续处理简单。

2、本发明荧光探针分子是一种新型染料。探针与H₂S反应，在低极性环境下，荧光被点亮。

3、本发明荧光探针分子具有高的选择性并且不受其它干扰物质的影响，线性范围为0.5～18.0μM。

4、本发明荧光探针分子和H₂S作用之后和脂滴染色物质进行，共定位系数为0.84。

5、本发明荧光探针分子可以实现对细胞层面内源性H₂S和斑马鱼外源性H₂S进行检测。

6、本发明荧光探针分子可以监测炎症细胞中H₂S水平的变化。

附图说明

图1为探针的紫外吸收、荧光发射、时间、pH光谱图。其中，(a)和(b)为加入H₂S前后探针的吸收光谱和荧光发射光谱；(c)为1,4-二氧六环与PBS缓冲液1：1混合体系中探针对H₂S的荧光强度随时间变化；(d)为在不同pH值下，探针、探针与H₂S反应后荧光强度的变化。

图2为探针的选择性、干扰性、线性光谱图及在不同极性中荧光发射强度变化。其中，(a)为探针的选择性荧光发射光谱图；(b)为在含/不含H₂S的情况下，探针与其它氨基酸和阴离子(SO₄ ^2-；CO₃ ^2-；SCN^-；HCO₃ ^-；C₂O₄ ^2-；AcO^-；Cl^-；Br^-；HPO₄ ^-；CN^-(200μΜ)；GSH；Cys；Hcy；S₂O₃ ^2-；SO₃ ^2-；HSO₃ ^-(100μΜ))反应的光谱图；(c)为随着H₂S浓度(0、0.5、1.3、2.4、3.4、5、8、10、13、15、18、20μΜ)的增加，插图探针的荧光强度与H₂S浓度呈线性关系图；(d)为在不同极性中探针与H₂S反应荧光强度变化图。

图3为共定位图。其中，(A)为BODIPY493/503的绿色荧光通道；(B)为探针红色荧光通道；(C)为探针和H₂S反应后与BODIPY493/503叠合场图像；(D)为明场；(E)为探针和H₂S反应后与BODIPY493/503沿胞内某条线的强度分布；(F)为强度散点图。

图4为内源性H₂S成像图。其中，(A)为空白细胞；(B)为探针孵育15分钟；(C)为200μM Cys孵育60分钟，然后用探针孵育15分钟；(D)为1mM PAG孵育60分钟，200μM Cys孵育60分钟，然后用probe2孵育15分钟；图A1-图D1为明场图像；图A2-D2为叠合场图像。

图5为LPS诱导的炎症细胞中H₂S的成像。其中，(A)与探针孵育15分钟；(B)为用1.0μg/mL LPS预处理细胞3h，然后与探针孵育；(C)为用LPS(1.0μg/mL)孵育细胞4h，然后用探针孵育；图A1-图C1为明场图像；图A2-C2为叠合场图像。

图6为外源性H₂S成像图。其中图(A)为空白；(B)探针孵育20分钟；(C)探针孵育20分钟，然后用10μM H₂S处理；(D)探针孵育20分钟，然后用20μMH₂S处理；(A1-D1)明场图像；(A2-D2)叠合场图像。

具体实施方式

实施例1

一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针，其结构式为：

将TBAF-OH(0.0648g，0.16mmol)，NBD-Cl(0.0287g,0.16mmol)和TEA(50μL)溶解在2mL二氯甲烷和4mL乙醇的混合溶液中，室温下以600rpm的转速搅拌10h，用TCL板监测反应过程，待反应结束，反应混合物减压浓缩，粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷:乙酸乙酯＝50:1(V:V))纯化分离纯化得到目标探针，紫红色粉末即为所述靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针。

MS(ESI)calcd for C₃₃H₂₀N₄O₆[M+H]⁺,569.1416；found,569.1457.

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆,δ/ppm)δ8.60(d,J＝8.2Hz,1H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.94-7.83(m,4H),7.56(t,J＝7.3Hz,1H),7.37(t,J＝7.2Hz,4H),7.27(d,J＝8.2Hz,1H),7.20-7.12(m,6H),6.88(d,J＝8.0,2H).

¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)170.37,156.54,154.98,151.09,150.54,145.55,144.75,144.31,135.02,134.57,133.70,130.74,129.85,129.68,125.99,125.54,125.08,125.01,123.11,119.82,118.78,118.52,109.93,39.90,39.76,39.63,39.49,39.35,39.21,39.07.

实施例2

将TBAF-OH(0.0648g，0.16mmol)，NBD-Cl(0.0287g,0.16mmol)和TEA(50μL)溶解在2mL二氯甲烷和2mL乙醇的混合溶液中，室温下以600rpm的转速搅拌过夜。用TCL板监测反应过程，待反应结束，反应混合物减压浓缩，粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷:乙酸乙酯＝50:1(V:V))纯化分离纯化得到目标探针，紫红色粉末即为所述靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针。

实施例3

将TBAF-OH(0.0648g，0.16mmol)，NBD-Cl(0.0287g,0.16mmol)和TEA(50μL)溶解在2mL二氯甲烷和6mL乙醇的混合溶液中，室温下以600rpm的转速搅拌11h。用TCL板监测反应过程，待反应结束，反应混合物减压浓缩，粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷:乙酸乙酯＝50:1(V:V))纯化分离纯化得到目标探针，紫红色粉末即为所述靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针。

实施例4

探针的吸收、发射光谱性质及时间、pH进行了研究。研究结果表明：在PBS(ph＝7.4,20mM):1,4-二氧六环(1:1,v/v)的溶液体系中探究了探针和探针与H₂S作用的光谱性能。如图1中(a)所示，在紫外光谱中，TBAF-NBD的溶液颜色为浅黄色，TBAF-NBD的吸收峰位置在394nm处(摩尔吸光系数ε＝3.41×10⁴L M^-1cm^-1)，添加20μM H₂S后，可以观察到在415nm和556nm出现了两个新的吸收峰，溶液颜色由浅黄色变为独有的粉红色。在荧光实验中(图1中(b))，TBAF-NBD的荧光由于强吸电子基团(NBD醚)而被猝灭，当亲核H₂S存在时，H₂S介导的NBD醚裂解TBAF-NBD使转化为TBAF-OH，在566nm处表现出强荧光，在365nm紫外分析仪下溶液颜色由无色变为橙色荧光和溶液颜色的变化说明探针可以从两方面检测H₂S。

H₂S在生物体内的活性高，寿命短，因此探针对H₂S的快速检测至关重要。在415nm的激发波长下，通过观察566nm处荧光发射强度的变化，考察了探针在PBS(ph＝7.4,20mM):1,4-二氧六环(1:1，v/v)的体系下对H₂S的动态荧光响应时间。如图1中(c)所示，当添加20μMH₂S时，荧光强度随时间变化逐步增加，大约在8min左右达到基本稳定状态，说明探针可以实现快响应H₂S。同时也评估了不同的pH条件对探针和H₂S作用前后的影响。从图1中(d)可以看出，探针在pH＝3-10范围内，荧光强度无明显变化，说明酸碱条件对探针的干扰很小。在添加分析物H₂S后，pH＝6-10范围内荧光开启，在pH＝7.4的情况下有很强的荧光信号，这有助于在生理环境中检测H₂S。

实施例5

荧光探针的选择性、干扰性及线性光谱图：

荧光探针必须对目标分析物具有高特异性才能具备一定的实用价值，我们进一步探究了探针在PBS(ph＝7.4，20mM):1,4-二氧六环(1:1，v/v)的溶液体系中对H₂S的特异性选择性。探针与各种分析物包括常见的阴离子和其他活性硫物种(SO₄ ^2-，CO₃ ²，SCN^-，HCO₃ ^-，C₂O₄ ^2-，AcO^-，Cl^-，Br^-，HPO₄ ^-，CN^-，(200μM)GSH，Cys，Hcy，S₂O₃ ^2-，SO₃ ^2-，HSO₃ ^-(100μM))反应10分钟后分别测试了紫外吸收强度和荧光发射强度。荧光谱图如图2中(a)所示，添加常见的阴离子时并没有很明显的荧光增强，添加其他活性硫物种时荧光强度有微弱上升，但上升的程度远小于H₂S，添加H₂S后，荧光发射强度急剧增强。干扰性实验中(图2中(b))，活性硫物种的存在对检测H₂S不足以产生干扰。以上结果表明，探针对H₂S良好选择有望应用于复杂的生理环境中。

为了评估探针对H₂S的检测是否具有较高的灵敏度，利用荧光光谱对不同浓度H₂S与探针作用进行了荧光滴定分析。在PBS(ph＝7.4，20mM):1,4-二氧六环(1:1，v/v)的溶液体系中，如图2中(c)所示，当H₂S的浓度由0μM增加到35μM时，在566nm处的荧光强度也逐步增强。经线性拟合发现566nm处的荧光强度与H₂S在0.5-18μM的浓度范围呈良好的线性。探针对H₂S检出限(LOD＝3σ/K)为0.09539μM。结果表明，探针具有高的敏感性，检出限低，在分析检测痕量H₂S方面有一定的优势。

通过在不同极性溶液中探究了极性与发光强度之间的关系(图2中(d))，随着极性的不断降低，探针的荧光强度逐渐增加，说明该探针在低极性环境下发光性能更好。

实施例6

共定位成像：通过共定位实验验证探针具有靶向脂滴的能力(图3)。用商业脂滴染色剂BODIPY和探针共同孵育细胞，绿色通道(图3中(A))为商业脂滴染色剂的发光通道，红色通道(图3中(B))为探针和H₂S作用之后的发光通道。使用灵敏度更高的显微镜成像显示，商业脂滴染色剂的绿色荧光与探针/H₂S的红色荧光匹配良好，呈现出黄色的荧光(图3中(C))，两通道在线性感兴趣区(ROI)内的荧光强度分布紧密同步，具有较高的共定位系数。图3中(D)为明场；图3中(E)为探针和H₂S反应后与BODIPY 493/503沿胞内某条线的强度分布；图3中(F)为强度散点图。

实施例7

内源性H₂S成像：我们对探针检测生物体内的H₂S的可行性进行了评估。众所周知，胱硫氨酸γ裂解酶(CSE)催化Cys代谢是产生内源性H₂S的重要途径之一，添加Cys可以刺激细胞产生更多内源性H₂S相反，PAG是已知的CSE抑制剂，添加PAG之后，抑制了细胞产生H₂S。首先，对探针是否可以检测Hela细胞中的内源性H₂S进行了评估，不添加探针的空白细胞作为对照组(图4中(A))，可以观察到在添加10μM的探针的细胞中可以看到微弱的荧光(图4中(B))，证明探针可以实现对细胞层面微量H₂S进行检测。其次，我们利用添加Cys刺激细胞产生H₂S(图4中(C))，并用PAG抑制CSE使Cys减少H₂S的产生作为对照(图4中(D))。与我们预期一样，添加Cys后发射信号在细胞内明显增加，先用PAG处理细胞后再添加Cys，荧光信号减弱。

图4中A1-D1为明场图像，图4中A2-D2为叠合场图像。

实施例8

LPS诱导的炎症细胞中H₂S的成像：脂多糖LPS作为一种炎症诱导分子，被用于构建炎症模型。我们也研究了使用探针来监测LPS诱导的活细胞炎症中H₂S的波动。如图5中(A)所示，与探针孵育15分钟，LPS刺激后，细胞形态发生变化，表明LPS引起细胞炎症。此外，如图5中(B)和(C)所示，随着时间的推移(3～4h)，细胞的荧光也有明显的增强，提示炎症细胞中H₂S水平升高，TBAF-NBD可作为一种有效的探针监测这一过程。

图5中A1-C1为明场图像，图5中A2-C2为叠合场图像。

实施例9

外源性H₂S成像：在斑马鱼体内探究了探针对H₂S的外源性成像。如图6中(B)所示，与空白斑马鱼(图6中(A))相比，添加探针导致荧光微弱增强，这可能是由于斑马鱼体内有很少的H₂S存在，如图6中(C)和(D)所示，随着添加H₂S(10μM，20μM)浓度的不断增加，荧光强度也随之增加。荧光信号的增强说明探针可以检测外源性H₂S。

图6中A1-D1为明场图像，图5中A2-D2为叠合场图像

Claims

1.一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针，其特征在于，其分子式为：C₃₃H₂₀N₄O₆，结构式为：

2.根据权利要求1所述的一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的荧光信号在低极性环境中被点亮。

3.根据权利要求1所述的一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针，其特征在于，所述荧光探针和H₂S作用之后进行共定位实验实现脂滴的靶向。

4.一种权利要求1所述靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将TBAF-OH，NBD-Cl和三乙胺溶解在二氯甲烷和乙醇的混合溶液中，室温搅拌，反应结束后，反应混合物减压浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化分离纯化得到所述荧光探针。

5.根据权利要求4所述的一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述TBAF-OH和NBD-Cl的摩尔比为1:1，所述二氯甲烷和乙醇的体积比为1:1～3。

6.根据权利要求4所述的一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述室温搅拌的转速为600rpm，所述室温搅拌的时间为10～12h。

7.根据权利要求4所述的一种靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述硅胶柱层析纯化的展开剂为二氯甲烷:乙酸乙酯＝50:1(V:V)。

8.一种权利要求1所述靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针的应用，其特征在于，应用在制备监测炎症细胞内H₂S含量波动的试剂。

9.一种权利要求1所述靶向脂滴检测H₂S的开启型荧光探针的应用，其特征在于，应用在制备检测细胞内内源性H₂S以及斑马鱼中外源性H₂S的试剂。