CN112961673A - 一种靶向脂滴荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白检测荧光探针技术领域，提供一种靶向脂滴荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针为含有S,N,O杂原子的有机小分子荧光探针，其分子式为C22H16N2OS2，有较好的水溶性，另一方面探针分子靶向脂滴特异性生物成像，能区分正常细胞和癌细胞。荧光探针分子结构中具有三苯胺基团，能靶向脂滴；在PBS缓冲溶液中，探针和HSA作用，发射波长蓝移且荧光增强。其应用包括两方面：探针靶向脂滴特异性生物成像，能区分正常细胞和癌细胞；能在HeLa细胞中用于HSA的成像，能灵敏检测尿液中HSA的浓度。本发明荧光探针合成简单，水溶性好，能准确靶向脂滴，对HSA检测线性范围窄，灵敏度高。

Description

一种靶向脂滴荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于蛋白检测荧光探针技术领域，具体涉及一种靶向脂滴荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
人血清蛋白（HSA），是循环系统中最丰富的运输蛋白，在调节渗透压，参与免疫调节和运输营养物质、代谢物质、药物分子等方面起着至关重要的作用。血浆中的HSA浓度通常为35-50 mg / mL，在尿液中的浓度不超过30 mg / L。 HSA作为临床诊断的重要参数，其浓度的异常与冠心病，多发性骨髓瘤，糖尿病，肝硬化等多种疾病相关。到目前为止，HSA的检测方法主要包括蛋白质组学技术，放射免疫分析，电化学和荧光探针技术。荧光探针由于响应时间快，灵敏度高，操作简单，价格便宜等优点受到了广泛关注。因此，发展准确，快速，高效的荧光探针方法检测 HSA 的含量对特定疾病的诊断具有重要意义。
脂滴（LDs）是多功能细胞器，由磷脂单分子层及中性脂组成的疏水核心构成，并且表面分布着很多蛋白，其功能障碍与许多代谢疾病如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病有关。最近的研究表明，癌细胞由于脂质代谢异常，与正常细胞相比，存在大量极性较低的脂滴。因此，利用癌细胞中存在大量脂滴，可以设计靶向脂滴型荧光探针达到特异性识别癌细胞的目的。
发明内容
本发明旨在提供一种靶向脂滴荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针为含有S, N, O杂原子的有机小分子荧光探针，有较好的水溶性，在PBS（pH=7.4 ，20 mM）缓冲溶液中对HSA的响应具有高选择性、高灵敏度，在HeLa细胞中用于HSA的成像，能灵敏检测尿液中HSA的浓度。另一方面探针分子靶向脂滴特异性生物成像，能区分正常细胞和癌细胞。
本发明由如下技术方案实现的：一种靶向脂滴荧光探针，该荧光探针为含有S, N,O杂原子的有机小分子荧光探针，其分子式为C22H16N2OS2，结构式如下：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002
。
制备所述靶向脂滴荧光探针的方法，具体步骤为：向对二苯氨基苯甲醛的无水乙醇溶液中加入罗丹宁和尿素，将混合物加热回流10-14h；通过TLC确认完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到产物；其中：每1 mmol对二苯氨基苯甲醛使用溶剂无水乙醇12mL；对二苯氨基苯甲醛：罗丹宁：尿素的摩尔比为1：1-1.2：1.3-1.7。
一种靶向脂滴荧光探针的应用，所述荧光探针用于尿液中HSA浓度的检测。
具体检测方法为：在2 mL、pH为7.4的PBS缓冲溶液中加入10 µM探针分子，随后加入0.1 mg/mL 的HSA，检测体系荧光变化，在PBS缓冲溶液中，探针分子的最大吸收峰位置在468 nm，荧光发射波长在610 nm；加入HSA后，最大吸收峰的位置蓝移至448 nm，荧光发射强度增强且发射波长蓝移至575 nm；在PBS缓冲溶液中：检测HSA的线性范围为0.01-0.09 mg/mL，检出限为0.98 µg/mL；
将待测样本尿液稀释100倍，将浓度为0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.08 mg/mL的HSA标准溶液加入到实际样中，记录探针的荧光强度并根据标准线性方程得出待测样本尿液中HSA的含量，计算得到的待测样本中HSA的浓度与加入HSA的浓度有良好的一致性，相对标准偏差小于5%。，回收率在91.38%-103.5%之间。
所述荧光探针在对HAS的细胞成像中的应用。
所述细胞为Hela细胞，具体成像方法为：细胞与探针孵育时，探针没有荧光，加入HSA共同孵育后，发射红色荧光。
所述荧光探针在正常细胞和癌细胞的区分中的用途。
具体区分方法为：使用商业脂滴染料尼罗红进行共定位成像，探针分子的绿色荧光与尼罗红的红色荧光重叠为黄色荧光，Pearson’s共定位系数R达到0.89，显示出探针分子对脂滴的靶向能力；在绿色发射通道中，当癌细胞用探针染色时，显示出数个孤立的强荧光强度的圆点，表明了脂滴的特征结构；在相同实验设置下，用探针染色正常细胞，显示出弱的荧光信号。
本发明所制备的探针的荧光特性：
在PBS缓冲溶液中，将荧光探针与HSA进行反应，溶液颜色由粉红色变为淡黄色，在365 nm的紫外灯下观察到荧光颜色由较弱的浅粉色变为较强的橙色。用荧光强度变化来检测HSA的浓度：在未加入HSA前，探针的荧光信号弱，发射波长在610 nm，加入HSA后，探针荧光信号增强，发射波长蓝移至575 nm。在PBS缓冲溶液中：检测HSA的线性范围为0.01-0.09mg/mL，检出限为0.98 µg/mL。
本发明利用HSA疏水性的空腔，抑制了探针分子的TICT过程，使探针的红色荧光开启。探针结构中三苯胺基团有较强的疏水性，通过强疏水作用使其嵌入脂滴的疏水核心，与疏水域相互作用，抑制TICT过程，产生强的绿色荧光发射。因此，利用不同的发射通道，探针既可以特异性、高灵敏度检测HSA 浓度，又可以对脂滴特异性成像，识别癌细胞。
与现有技术相比：本发明探针合成简便，且后续处理过程便捷；对HSA表现出较高的选择性、灵敏度，实现了对HSA的细胞成像研究；能灵敏检测尿液中HSA的浓度；可准确靶向脂滴，通过脂滴特异性生物成像能有效区分正常细胞和癌细胞，达到识别癌细胞的目的。
附图说明
图1为实施例四中探针分子与HSA反应前后紫外吸收光谱的研究；
图2为实施例五中探针分子与HSA作用前后的荧光光谱研究；
图3为实施例七中探针分子与HSA反应荧光强度随时间变化示意图；
图4为实施例六中探针分子的荧光光谱随HSA浓度变化示意图；图中：4（a）为荧光滴定谱图，4（b）为探针的荧光强度与HSA浓度的线性关系图；
图5为实施例八中探针分子与不同干扰分析物反应前后的荧光强度变化示意图；
图6为实施例九中Hela细胞与10（μM）探针孵育20分钟，然后加入尼罗红（0.3 μM）继续孵育10分钟的共定位图像；图中：（a）探针的绿色荧光，（b）尼罗红的红色荧光，（c）（a）和（b）叠加图，（d）细胞明场图，（e）探针与商业染料尼罗红在Hela细胞的重叠程度；
图7中：(a)-(c)为实施例九中Hela细胞与10 μM 探针孵育30分钟后，在癌细胞（HeLa）中特异性染色图像；图中：（a）绿色通道图，（b）明场图，（c）复合场图；
(d)-(f)为实施例九中与10 μM TPA-RDN孵育30分钟后，在正常细胞（睾丸间质细胞）中特异性染色；图中：（d）绿色通道图，（e）明场图，（f）复合场图。
图8为实施例十中探针分子对HSA在Hela细胞中的成像研究；(a)-(c)为HeLa细胞与探针（10μM）孵育15分钟：（a）红色通道图，（b）明场图，（c）复合场图；
(d)-(f)为将HeLa细胞与HSA（20μM）进一步孵育20分钟：（d）红色通道图，（e）明场图，（f）复合场图。
图9为本发明所述探针合成路线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：探针分子的合成
合成路线如图9所示，向对二苯氨基苯甲醛（136.67 mg，0.5 mmol）的无水乙醇（6mL）中的溶液中加入罗丹宁 （67 mg，0.5 mmol）和尿素（45 mg，0.75 mmol）。 将混合物加热至回流12小时。
通过TLC确认完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到探针分子（73.04mg，37.6%）。探针分子经检测：1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.53 (s, 1H), 7.47 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.8 Hz, 4H), 7.20 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.16 (d, J= 7.9 Hz, 4H), 6.92 (d, J = 8.7 Hz, 2H). 13C NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 195.69,169.92, 150.05, 145.78, 132.90, 132.22, 130.45, 126.44, 125.59, 125.40,119.84. MS (ESI) calcd for C22H16N2OS2 [M-H]- 387.0626, found 387.0625。
实施例2：探针分子的合成
向对二苯氨基苯甲醛（136.67 mg，0.5 mmol）的无水乙醇（6 mL）中的溶液中加入罗丹宁（67 mg，0.5 mmol）和尿素（30 mg，0.65 mmol）。 将混合物加热至回流10小时。
通过TLC确认完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到探针分子（58.47mg，30.1%），探针分子经检测：1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.53 (s, 1H), 7.47 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.8 Hz, 4H), 7.20 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.16 (d, J= 7.9 Hz, 4H), 6.92 (d, J = 8.7 Hz, 2H). 13C NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 195.69,169.92, 150.05, 145.78, 132.90, 132.22, 130.45, 126.44, 125.59, 125.40,119.84. MS (ESI) calcd for C22H16N2OS2 [M-H]- 387.0626, found 387.0625。
实施例3：探针分子的合成
向对二苯氨基苯甲醛（136.67 mg，0.5 mmol）的无水乙醇（6 mL）中的溶液中加入罗丹宁（80.4 mg，0.6 mmol）和尿素（45 mg，0.85 mmol）。 将混合物加热至回流14小时。通过TLC确认完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到探针分子（62.94 mg，32.4%）；探针分子经检测：1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.53 (s, 1H), 7.47 (d, J = 8.5 Hz,2H), 7.40 (t, J = 7.8 Hz, 4H), 7.20 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 7.9 Hz,4H), 6.92 (d, J = 8.7 Hz, 2H). 13C NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 195.69, 169.92,150.05, 145.78, 132.90, 132.22, 130.45, 126.44, 125.59, 125.40, 119.84. MS(ESI) calcd for C22H16N2OS2 [M-H]- 387.0626, found 387.0625。
实施例4：探针分子与HSA反应前后紫外吸收光谱的研究
为测试探针分子与HSA作用前后的紫外吸收光谱变化，在2 mL PBS缓冲溶液（pH=7.4）中加入探针分子（10 µM），随后加入HSA（0.1 mg/mL）,记录吸光度变化，结果如图1所示。由图1可知，探针分子的最大吸收峰位置分别在468 nm（ε = 2.26 × 104 M-1 cm-1），加入HSA（1 mg/mL）后，最大吸收峰的位置蓝移至448 nm（ε =2.37 × 104 M-1 cm-1），溶液的颜色由粉色变为淡黄色。
实施例5：探针分子与HSA作用前后的荧光光谱研究
为测试探针分子与HSA作用前后的荧光光谱变化，在2 mL PBS缓冲溶液（pH=7.4）中加入探针分子（10 µM），随后加入HSA（0.1mg/mL），检测体系荧光变化，检测结果如图2所示，结果显示：在未加入HSA前，探针的荧光信号较弱，发射波长在610 nm，加入HSA后，探针荧光信号大约增强了7倍，发射波长蓝移至575 nm。在365 nm的紫外灯下观察到荧光颜色由较弱的浅粉色变为较强的橙色。探针分子可与HSA进行反应，利用荧光强度的变化可检测HSA的浓度。
实施例6：探针分子对HSA的时间响应研究
为测试探针分子对HSA的时间响应研究，对探针分子与HSA反应的荧光强度随时间(0~40分钟)的变化进行了研究，结果如图3所示。荧光强度在4min内迅速增加，并保持稳定。由图4可知，探针分子对HSA响应速度很快。
实施例7：探针分子对不同浓度HSA条件下荧光强度变化的研究
为测试探针分子对不同浓度HSA条件下荧光强度变化，在PBS（pH=7.4, 20 mM）缓冲溶液中，探针分子对不同浓度HSA（0, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07,0.08, 0.09, 0.2, 0.3 mg/mL）的荧光强度进行了研究。如图4a所示，随HSA浓度的增加，荧光强度逐渐增强，当HSA的浓度为0.3 mg/mL时，荧光强度几乎不再改变。由图4b可知，检测HSA的线性范围为0.01-0.09 mg/mL，并根据IUPAC的定义计算出检出限为0.98 µg/mL。说明本发明荧光探针分子对HSA的检测表现出较高的灵敏度。
实施例8：探针分子对HSA的选择性研究
为测试探针分子对HSA的选择性，对探针分子与不同的离子，氨基酸及蛋白（(1)Ag+, (2) Zn2+, (3) Mn2+, (4) Ba2+, (5) Fe3+, (6) Hg2+, (7) ClO4 -, (8) HSO3 -, (9)S2O3 2-, (10) CH3COO-, (11) S2O7 2- , (12) SCN-, (13) 组氨酸, (14) 谷氨酸, (15) 天冬酰胺, (16) 半胱氨酸,（17）同型半胱氨酸, (18) 谷胱甘肽, (19) α-胰凝乳蛋白酶,(20) 抑肽酶, (21) 酪蛋白,(22) γ-球蛋白, (23) 胃蛋白酶, (24) 血红蛋白, (25)溶菌酶, (26) 空白, (27) 牛血清蛋白, (28) 人血清蛋白）反应前后的荧光强度的变化进行了实验研究，HSA，BSA 浓度为5 µM，其他干扰物浓度均为100 µM。结果如图5所示，结果显示探针分子对HSA检测具有高度的选择性。
实施例9：探针分子对脂滴特异性生物成像及对癌细胞的识别
使用商业脂滴（LD）染料尼罗红进行了共定位实验，结果如图6、7所示，图6显示，探针分子的绿色荧光能够与尼罗红的红色荧光很好的重叠为黄色荧光，Pearson’s共定位系数R达到0.89，显示出对脂滴良好的靶向能力。由图7可知，当癌细胞（HeLa）用探针分子染色时，发射出较强的绿色荧光信号。在相同的实验设置下，用探针分子染色的正常细胞（睾丸间质细胞），显示出非常弱的绿色荧光信号。因此，探针分子可以识别癌细胞与正常细胞。
实施例10：探针分子对HSA在Hela细胞中的成像研究
为测试探针分子对HSA在Hela细胞中的成像，对探针分子（10 μM）与HSA（5 μM）反应后的变化进行了细胞成像研究。由图8可知，在激光共聚焦下，探针本身几乎没有荧光。加入HSA（5μM）后，继续孵育20分钟，观察到较强的红色荧光，因此，探针分子可以对HSA进行细胞成像。
实施例11：探针分子对HSA在尿液中的检测
为了消除背景干扰，将尿液稀释100倍，将三种已知浓度的HSA(0.02 mg/mL, 0.05mg/mL, 0.08 mg/mL) 标准溶液加入到实际样中，记录探针的荧光强度并根据标准线性方程得出实际尿液中HSA的含量，测试结果见表1。
表1：探针分子对HSA在尿液中的检测
Figure DEST_PATH_IMAGE004
从表中可以看出经计算得到的实际样品中HSA的浓度与加入HSA的浓度有着良好的一致性，相对标准偏差小于5%。，回收率在91.38%-103.5%之间。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种靶向脂滴荧光探针，其特征在于：该荧光探针为含有S, N, O杂原子的有机小分子荧光探针，其分子式为C22H16N2OS2，结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.制备权利要求1所述靶向脂滴荧光探针的方法，其特征在于：具体步骤为：向对二苯氨基苯甲醛的无水乙醇溶液中加入罗丹宁和尿素，将混合物加热回流10-14h；通过TLC确认完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到产物；其中：每1 mmol对二苯氨基苯甲醛使用溶剂无水乙醇12 mL；对二苯氨基苯甲醛：罗丹宁：尿素的摩尔比为1：1-1.2：1.3-1.7。
3.一种权利要求1所述靶向脂滴荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针用于尿液中HSA浓度的检测。
4.根据权利要求3所述的一种靶向脂滴荧光探针的应用，其特征在于：具体检测方法为：在2 mL、pH为7.4的PBS缓冲溶液中加入10 µM探针分子，随后加入0.1mg/mL 的HSA，检测体系荧光变化，在PBS缓冲溶液中，探针分子的最大吸收峰位置在468 nm，荧光发射波长在610 nm；加入HSA后，最大吸收峰的位置蓝移至448 nm，荧光发射强度增强且发射波长蓝移至575 nm；在PBS缓冲溶液中：检测HSA的线性范围为0.01-0.09 mg/mL，检出限为0.98 µg/mL；
将待测样本尿液稀释100倍，将浓度为0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.08 mg/mL的HSA标准溶液加入到实际样中，记录探针的荧光强度并根据标准线性方程得出待测样本尿液中HSA的含量，计算得到的待测样本中HSA的浓度与加入HSA的浓度有良好的一致性，相对标准偏差小于5%，回收率在91.38%-103.5%之间。
5.一种权利要求1所述靶向脂滴荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针在对HAS的细胞成像中的应用。
6.根据权利要求5所述的靶向脂滴荧光探针的应用，其特征在于：所述细胞为Hela细胞，具体成像方法为：细胞与探针孵育时，探针没有荧光，加入HSA共同孵育后，发射红色荧光。
7.一种权利要求1所述靶向脂滴荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针在正常细胞和癌细胞的区分中的用途。
8.根据权利要求7所述的靶向脂滴荧光探针的应用，其特征在于：具体区分方法为：使用商业脂滴染料尼罗红进行共定位成像，探针分子的绿色荧光与尼罗红的红色荧光重叠为黄色荧光，Pearson’s共定位系数R达到0.89，显示出探针分子对脂滴的靶向能力；在绿色发射通道中，当癌细胞用探针染色时，显示出数个孤立的强荧光强度的圆点，表明了脂滴的特征结构；在相同实验设置下，用探针染色正常细胞，显示出弱的荧光信号。
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