CN108844931B - Lzq荧光探针在同时检测so2衍生物和hsa中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用，LZQ荧光探针的结构式如下所示
Figure RE-DDA0001704185360000011
。制备方法是以3‑醛基‑7‑二乙胺基‑香豆素和腈基苯并噻唑为原料制备。该类型探针能够在蓝色通道检测二氧化硫衍生物亚硫酸盐和亚硫酸氢盐，在红色通道高效的检测HSA，并且HSA可以催化探针与亚硫酸盐和亚硫酸氢盐的反应。本发明设计的荧光探针可用于检测细胞中的HSO3 ‑和HSA的含量。

Description

LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用
技术领域
本发明涉及荧光探针制备领域，具体涉及一种LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用。
背景技术
SO2是一种空气污染物，其毒性主要来源于其衍生物亚硫酸盐（SO3 2-）和亚硫酸氢盐（HSO3 -），长期的暴露SO2可能导致多种疾病的产生，如哮喘、中风、偏头痛，肺癌和脑癌。最近的研究表明，在活细胞的细胞质和线粒体中硫化氢或一些含硫氨基酸可通过活性氧被内源性氧化生成SO2或HSO3 -，从而产生一系列的生物效应，如使ATP酶的活性增加，导致ATP消耗，使膜蛋白的磷酰化受阻，因此对一些蛋白和生物小分子的跨膜运输产生影响。
人血清白蛋白（HSA）是人体中含量最丰富的转运蛋白，可以与多种阴离子、阳离子和生物小分子结合，在许多生理过程中起着非常重要的作用，如调节血液和组织之间的水平衡和作为生理载体运输如胆红素、脂肪酸和药物等分子。SO2与HSA之间存在着密切关联。近几年中有许多文献报道利用荧光探针检测SO2衍生物或HSA。目前关于SO2检测的荧光探针主要基于以下作用机理：1、乙酰丙酸基选择性脱保护；2、与醛的加成；3、与双键的亲核加成等。而对HSA的检测主要基于1、解聚诱导发光；2、聚集诱导发光；3、抑制扭曲的分子内电荷转移等。由于目前存在的荧光探针对SO2和HSA检测机理的不同和SO2作为小分子而HSA作为大分子两者物质本身的差异实现两者的双通道同时检测传感非常困难，且目前国内外尚未报道能够用来双通道识别传感SO2和HSA的荧光探针，因此发明一种可以高效检测液体和生物样品中的HSO3 -和HSA荧光探针尤其重要。
发明内容
本发明提出了一种可以同时识别SO2衍生物和HSA荧光探针及其制备与应用，其结构式如LZQ所示，该探针不仅能够快速、灵敏的识别HSO3 -和HSA，而且HSA能够催化探针与HSO3 - 的反应。
实现本发明的技术方案是：一种LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用，LZQ荧光探针的结构如下：
Figure 878288DEST_PATH_IMAGE001
，所述LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用。
所述LZQ荧光探针在检测溶液和活细胞中二氧化硫衍生物的应用。
所述LZQ荧光探针检测溶液和活细胞中HSA的应用。
所述LZQ荧光探针在HSA催化下检测溶液和活细胞中二氧化硫衍生物的应用。
所述的LZQ荧光探针的制备方法，将2-乙腈基苯并噻唑溶于乙醇中，冷却至0-10℃，依次加入7-（二乙胺基）水杨醛和哌啶，混合物在回流温度下搅拌，反应5-8 h，冷却后将反应体系倒入冰水中，产生沉淀，沉淀过滤得到荧光探针。
所述2-乙腈基苯并噻唑、7-（二乙胺基）水杨醛和哌啶的物质的量之比为1:1：（0.5-2）。
所述7-（二乙胺基）水杨醛的制备步骤如下：
（1）在N2保护下，将DMF超干溶剂缓慢滴加到POCl3中，在20-50 ℃下搅拌30 min，得到红色溶液；
（2）将7-二乙基氨基香豆素溶解到DMF超干溶剂中，然后加入步骤（1）的红色溶液，将得到的混合物在60 ℃下搅拌24 h，反应结束后倒入冰水中，加入NaOH溶液调节pH至5.0，产生沉淀，沉淀过滤，得到7-（二乙胺基）水杨醛。
所述步骤（2）中7-二乙基氨基香豆素的制备步骤如下：将4-（二乙氨基）水杨醛、丙二酸二乙酯和乙醇混合，混合后加入哌啶并在回流条件下搅拌6-12 h，用旋转蒸发仪除去乙醇，然后加入浓HCl和冰醋酸，在回流温度下搅拌6-12 h，反应结束后，将溶液冷却至室温，并倒入冰水中，滴加NaOH溶液调节pH至5，形成沉淀，搅拌1小时后，过滤混合物，用水洗涤，干燥，得到7-二乙基氨基香豆素。
所述4-（二乙氨基）水杨醛、丙二酸二乙酯和哌啶的物质的量之比为1:1：（1-2）。
化学反应式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
上述应用具体包括：
测试探针储存液加入HSO3 -前后荧光光谱的变化，荧光的激发波长为400 nm；观察荧光探针孵育的细胞及其加入HSO3 -前后荧光成像图的变化。
荧光光谱的变化为：以400 nm光激发时，在486 nm处的荧光迅速增强，约15 min达到最高值。
荧光成像图的变化为：用探针母液孵育细胞，并用共聚焦显微镜，以激发波长为405 nm光源激发，进行细胞成像无明显变化。用外源性的HSO3 -孵育细胞，并用共聚焦显微镜成像荧光增强。
测试探针储存液加入HSA前后荧光光谱的变化，荧光的激发波长为545 nm；观察荧光探针孵育的细胞及其加入HSA前后荧光成像图的变化。
荧光光谱的变化为：以545 nm光激发时，在583 nm处的荧光迅速增强，约3 min达到最高值。
荧光成像图的变化为：用探针母液孵育细胞，并用共聚焦显微镜，以激发波长为552 nm光源激发，进行细胞成像, 可观察到荧光。用外源性的HSA孵育细胞，并用共聚焦显微镜成像可观察到荧光明显增强。
测试探针储存液加入不同浓度的HSA之后，加入同等浓度的HSO3 -其荧光光谱的变化，荧光的激发波长为400 nm。
荧光光谱的变化为：以400 nm为激发波长，加入不同浓度的HSA之后，加入同等浓度的HSO3 -，其460 nm处的荧光强度随HSA浓度的增加而逐渐增强，其到达平衡的时间随HSA浓度的增加而逐渐缩短。
本发明的有益效果是：（1）该探针能够实现HSO3 -和HSA的双通道同时检测。（2）HSA能够催化探针与HSO3 - 的反应。（3）该探针具有合成简单，选择性好，灵敏度高等优点。这为研究SO2和HSA的生理病理作用提供了有效的工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1探针L1的1H NMR图谱。
图2是实施例1探针L1的13C NMR图谱。
图3是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，激发波长为400 nm，2 µM探针LZQ与200 µM HSO3 -反应时，荧光光谱随时间的变化图。
图4是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，激发波长为400 nm，2 µM探针LZQ与浓度范围在0-200 µM的HSO3 -反应时，荧光光谱随HSO3 -浓度的变化图。
图5是在486 nm处的荧光强度与HSO3 -浓度的线性关系图。
图6是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4，）体系中，激发波长为400 nm，2 µM探针LZQ及向2 µM探针LZQ中分别加入不同的阴离子和小分子反应15 min后的荧光光谱图。
图7是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，激发波长为545 nm，2 µM探针LZQ与0.02 mg/mL的HSA反应时，荧光光谱随时间的变化图。
图8是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，激发波长为545 nm，2 µM探针LZQ与浓度范围在0-0.5mg/mL的HSA反应时，荧光光谱随HSA 浓度的变化图。
图9是在583 nm处的荧光强度与HSA浓度的线性关系图。
图10是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4，）体系中，激发波长为545 nm，2 µM探针LZQ及向2 µM探针LZQ中分别加入不同蛋白质、酶、硫醇类化合物反应3 min后的荧光光谱图。
图11是探针LZQ与HSA在HeLa细胞中的荧光图像。A1、A2是HeLa细胞用探针LZQ（2 µM）孵育10 min后的荧光成像。B1、B2是HeLa细胞用探针LZQ（2 µM）孵育后加入HSA（0.1 mg/mL）培养30 min成像图。A1、B1是HeLa细胞成像的暗场图像，A2、B2是HeLa细胞成像的明场图像。选用552 nm的激发波长，收集560-650 nm的发射波长。
图12是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，激发波长为400 nm，2 µM探针LZQ加入不同浓度的HSA（0，0.001，0.002，0.004，0.006，0.008，0.012 mg/mL），然后加入同等浓度的HSO3 -在460 nm处的荧光强度随时间的变化图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用，LZQ荧光探针的结构如下：
Figure 543493DEST_PATH_IMAGE001
，所述LZQ荧光探针能够同时检测SO2衍生物和HSA。
所述的LZQ荧光探针的制备方法，步骤如下：
将2-乙腈基苯并噻唑（209 mg，1.2 mmol）溶于乙醇（10 mL）中，并冷却至5 ℃，向其中加入7-（二乙胺基）水杨醛（1-b），然后加入哌啶（0.05 mL）。混合物在回流温度下搅拌，通过TLC检测，该反应在5小时内完成。冷却后将反应体系倒入冰水（25 mL）中，产生大量沉淀，将粗产物过滤，用冷乙醇洗涤，并在真空条件下干燥。使用硅胶（100-200目）和石油醚中含有10％乙酸乙酯的溶液经过柱层析法纯化粗产品，以获得紫色固体（301 mg，62.6％），得出探针LZQ。图1是其1H NMR图谱；图2是其13C NMR谱图。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz, ppm): 8.90 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.08 (d, J =8.12 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 7.92 Hz, 1H), 7.51 (t, J = 7.24 Hz, 1H), 7.40-7.50(m, J = 9.04 Hz, 2H), 6.64-6.67 (q, J = 2.32 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 2.2 Hz,1H), 3.46-3.50 (q, J = 7.08 Hz, 4H), 1.25-1.28 (t, J = 7.08 Hz, 6H)。
13C NMR (CDCl3, 100 MHz, ppm): 163.49, 161.26, 157.46, 153.74, 153.00,142.73, 140.41, 134.73, 131.64, 126.74, 125.88, 123.70, 121.50, 116.84,112.12, 110.20, 108.80, 103.43, 97.21, 45.29, 12.52。
实施例2
一种LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用，LZQ荧光探针的结构如下：
Figure 482630DEST_PATH_IMAGE001
，所述LZQ荧光探针能够同时检测SO2衍生物和HSA。
所述的LZQ荧光探针的制备方法，步骤如下：
（1）将4-（二乙氨基）水杨醛（289.86 mg，1.5 mmol）、丙二酸二乙酯（240.2 mg，1.5mmol）和乙醇混合，混合后加入11.7 mL哌啶（1 mmol）并在回流条件下搅拌6 h，用旋转蒸发仪除去乙醇，然后加入浓HCl和冰醋酸，在回流温度下搅拌6 h，反应结束后，将溶液冷却至室温，并倒入冰水中，滴加NaOH溶液调节pH至5，形成沉淀，搅拌1小时后，过滤混合物，用水洗涤，干燥，得到7-二乙基氨基香豆素；
（2）在N2保护下，将DMF超干溶剂缓慢滴加到POCl3中，在20 ℃下搅拌30 min，得到红色溶液；将7-二乙基氨基香豆素溶解到DMF超干溶剂中，然后加入步骤（1）的红色溶液，将得到的混合物在60 ℃下搅拌24 h，反应结束后倒入冰水中，加入NaOH溶液调节pH至5.0，产生沉淀，沉淀过滤，得到7-（二乙胺基）水杨醛；
（3）将2-乙腈基苯并噻唑（174 mg，1 mmol）溶于乙醇中，冷却至0-10 ℃，依次加入7-（二乙胺基）水杨醛（177 mg，1 mmol）和11.7 mL哌啶，混合物在回流温度下搅拌，反应5h，冷却后将反应体系倒入冰水中，产生沉淀，沉淀过滤得到荧光探针。
实施例3
一种LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用，LZQ荧光探针的结构如下：
Figure 415951DEST_PATH_IMAGE001
，所述LZQ荧光探针能够同时检测SO2衍生物和HSA。
所述的LZQ荧光探针的制备方法，步骤如下：
（1）将4-（二乙氨基）水杨醛（289.86 mg，1.5 mmol）、丙二酸二乙酯（240.2 mg，1.5mmol）和乙醇混合，混合后加入17.5 mL哌啶并在回流条件下搅拌10 h，用旋转蒸发仪除去乙醇，然后加入浓HCl和冰醋酸，在回流温度下搅拌10 h，反应结束后，将溶液冷却至室温，并倒入冰水中，滴加NaOH溶液调节pH至5，形成沉淀，搅拌1小时后，过滤混合物，用水洗涤，干燥，得到7-二乙基氨基香豆素；
（2）在N2保护下，将DMF超干溶剂缓慢滴加到POCl3中，在30 ℃下搅拌30 min，得到红色溶液；将7-二乙基氨基香豆素溶解到DMF超干溶剂中，然后加入步骤（1）的红色溶液，将得到的混合物在60 ℃下搅拌24 h，反应结束后倒入冰水中，加入NaOH溶液调节pH至5.0，产生沉淀，沉淀过滤，得到7-（二乙胺基）水杨醛；
（3）将2-乙腈基苯并噻唑（174 mg，1 mmol）溶于乙醇中，冷却至0-10 ℃，依次加入7-（二乙胺基）水杨醛（177 mg，1 mmol）和17.5 mL哌啶，混合物在回流温度下搅拌，反应6h，冷却后将反应体系倒入冰水中，产生沉淀，沉淀过滤得到荧光探针。
实施例4
一种LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用，LZQ荧光探针的结构如下：
Figure 553672DEST_PATH_IMAGE001
，所述LZQ荧光探针能够同时检测SO2衍生物和HSA。
所述的LZQ荧光探针的制备方法，步骤如下：
（1）将（289.86 mg，1.5 mmol）、丙二酸二乙酯（240.2 mg，1.5 mmol）和乙醇混合，混合后加入23.4 mL哌啶并在回流条件下搅拌12 h，用旋转蒸发仪除去乙醇，然后加入浓HCl和冰醋酸，在回流温度下搅拌12 h，反应结束后，将溶液冷却至室温，并倒入冰水中，滴加NaOH溶液调节pH至5，形成沉淀，搅拌1小时后，过滤混合物，用水洗涤，干燥，得到7-二乙基氨基香豆素；
（2）在N2保护下，将DMF超干溶剂缓慢滴加到POCl3中，在50 ℃下搅拌30 min，得到红色溶液；将7-二乙基氨基香豆素溶解到DMF超干溶剂中，然后加入步骤（1）的红色溶液，将得到的混合物在60 ℃下搅拌24 h，反应结束后倒入冰水中，加入NaOH溶液调节pH至5.0，产生沉淀，沉淀过滤，得到7-（二乙胺基）水杨醛；
（3）将2-乙腈基苯并噻唑（174 mg，1 mmol）溶于乙醇中，冷却至0-10 ℃，依次加入7-（二乙胺基）水杨醛（177 mg，1 mmol）和23.4 mL哌啶，混合物在回流温度下搅拌，反应8h，冷却后将反应体系倒入冰水中，产生沉淀，沉淀过滤得到荧光探针。
探针LZQ对HSO3 -检测的光谱性能研究
（1）探针LZQ与HSO3 -随时间变化的荧光发射光谱
向2 mL的PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，加入2 μL浓度为2 mM的探针LZQ储备液，再加入20 μL浓度为20 mM的HSO3 -，用400 nm的激发波长，测试其荧光发射光谱随时间的变化。如图3所示，HSO3 -的加入阻断了探针分子的TICT作用，从而使得探针的荧光得以释放，并在486 nm处荧光逐渐增强，约15 min左右达到平衡，表明探针LZQ对HSO3 -的响应速度较快，可以用于实时检测HSO3 -。
（2）探针LZQ与不同当量的HSO3 -反应的荧光光谱的变化
向2 mL的PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，加入2 μL浓度为2 mM的探针LZQ储备液，再加入不同浓度的（0-200 μM）的HSO3 -，反应15 min后，用荧光光谱仪在激发波长为400nm下测试探针与不同浓度的HSO3 -反应液的荧光光谱变化，如图4所示，随着加入HSO3 -的浓度的增加，反应液的荧光强度不断增强。如图5所示，486 nm处的荧光强度与HSO3 -（0-200 μM）的浓度呈现了良好的线性关系。
（3）探针LZQ对不同干扰分析物的选择性研究
配制20 mM的不同种类的阴离子和小分子储备液。向2 mL的PBS缓冲（10 mM，pH =7.4）体系中，加入2 μL浓度为2 mM的探针LZQ储备液，再加入200 μM的分析物：HSO3 -、F-、Cl-、Br-、SO4 2-、NO3 -、NO2 -、HCO3 -、CO3 2-、H2PO4 -、HPO4 2-、ACO-、SCN-、S2O3 2-、HS-、ClO-、Cys、Hcy、GSH(1 mM)、H2O2，反应15 min后监测测试溶液的荧光光谱变化，激发波长为400 nm。由图6可知，上述离子和小分子不干扰探针对HSO3 -的识别。
（4）探针LZQ与细胞中HSO3 -的荧光成像研究
在37 ℃、95%空气、5%二氧化碳的细胞培养箱中，将HeLa细胞接种到共聚焦培养皿中进行贴壁培养。将实验分为三组，A组：空白HeLa细胞孵育30 min。B组：从实施例2的探针母液中取出1 μL加入到孵育有HeLa细胞的培养皿（含有1 mL PBS培养基）中，探针浓度为2μM，培养30 min。C组：向孵育好的含有2 μM探针的细胞中加入600 μM的HSO3 -孵育30 min。之后用预热的PBS（pH = 7.4）缓冲溶液对A、B、C组细胞分别洗涤三次，随后分别用共聚焦显微镜对三组细胞进行荧光成像。用波长为405 nm的激光器照射，收集430-520 nm处荧光。A组结果表明HeLa细胞本身没有荧光，B组HeLa细胞内可观察到微弱的蓝色荧光，说明探针很好的进入了细胞。C组可以观察到细胞内的蓝色荧光明显的增强，说明HSO3 -进入细胞中并与细胞内的探针发生反应。以上实验结果说明探针LZQ可用于活细胞内HSO3 -的检测，具有较好的实用价值。
探针LZQ对HSA-检测的光谱性能研究
（1）探针LZQ与HSA随时间变化的荧光发射光谱
向2 mL的PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，加入2 μL浓度为2 mM的探针LZQ储备液，再加入2 μL浓度为20 mg/mL的HSA，用545 nm的激发波长，测试其荧光发射光谱随时间的变化。如图7所示，HSA的加入抑制了TICT的作用，导致探针荧光增强，实现了探针LZQ对HSA的荧光“关-开”的响应，并在3 min内达到响应平衡，实验结果表明探针LZQ可以快速的检测HSA。
（2）探针LZQ与不同当量HSA反应的荧光光谱的变化
向2 mL的PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，加入2 μL浓度为2 mM的探针LZQ储备液，再加入不同浓度的HSA（0~0.5 mg/mL）后，反应3 min后，以545 nm的光激发，监测583 nm处的荧光光谱的变化。如图8所示，随着加入HSA的浓度的增加，探针LZQ的荧光强度不断增强。如图9所示，583 nm处的荧光强度与HSA（0~0.04 mg/mL）的浓度呈现了良好的线性关系。
（3）不同蛋白质、酶、硫醇类化合物对探针LZQ识别HSA的影响
配制20 mg/mL的不同种类的蛋白质、酶；及20 mM的不同种类的硫醇储备液。向2mL的PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，加入2 μL浓度为2 mM的探针LZQ储备液，再加入蛋白质类(0.02 mg/mL)：HSA，白蛋白，乳铁蛋白，组蛋白，球蛋白；酶类(0.02 mg/mL)：胰蛋白酶，葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶，β-NADH；溶菌酶；硫醇类：二硫苏糖醇（DTT, 100 μM），ATP（100 μM），Cys（100 μM），Hcy（100 μM），GSH（1 Mm）；DNA类：dsDNA(500 nm)，ssDNA(500 nm)，反应6 min后监测荧光发射光谱的变化。如图10所示，加入HSA后探针溶液的荧光强度明显增强，加入以上其他物质，荧光强度没有明显变化，由此可见，该探针对HSA的识别具有较高的选择性。
（4）探针LZQ识别HSA的细胞成像研究
探究探针LZQ影像细胞中HSA的能力。实验结果如图11所示，图A1，A2是探针与细胞单独孵育的荧光成像图，图中显示出相对较暗的红色荧光，说明探针能与细胞内的HSA作用，证明探针LZQ具有较好的细胞膜通透性，可以很好的进入细胞，图B1, B2是在相同的培养条件下加入0.1 mg/mL的HSA后的细胞成像图，可以观察到细胞内的红色荧光明显的增强，说明HSA进入细胞中并与细胞内的探针发生反应。
（5）HSA对探针LZQ识别HSO3 -的催化作用研究
在2 mL的PBS缓冲溶液（10 mM，pH = 7.4）中加入2 μL浓度为2 mM的探针LZQ（2 μM），再向溶液中分别加入0.001, 0.002, 0.004, 0.006, 0.008, 0.012 (mg/mL)的HSA，混合3 min后，加入3 μL浓度为20 mM的亚硫酸氢钠储备液，
在400 nm的激发下进行光谱测试，测试结果如图12所示，当加入HSA的浓度越大，探针LZQ与HSO3 -的作用速率越快，且荧光强度增强，说明HSA对探针LZQ和HSO3 -反应起到催化作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用，其特征在于LZQ荧光探针的结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用，其特征在于：所述SO2衍生物是溶液和活细胞中的SO2衍生物。
3.根据权利要求1所述的LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用，其特征在于：所述HSA 是溶液和活细胞中的HSA。
4.根据权利要求1所述的LZQ荧光探针在同时检测SO2衍生物和HSA中的应用，其特征在于：所述HSA 用于催化溶液和活细胞中二氧化硫衍生物。
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