CN112876426B - 检测人血清白蛋白的苯并噻唑类荧光探针及制备和试剂盒 - Google Patents

Abstract

基于人血清白蛋白的假酯酶活性，我们发明了一种检测人血清白蛋白的荧光探针及其试剂盒。该探针是包含酯键的苯并噻唑类荧光染料，其自身荧光最大发射波长是580nm。经人血清白蛋白水解后，该探针水解产物在碱性环境中的最大发射峰是522nm。据此，本发明中的探针实现了对人血清白蛋白的高选择性高灵敏检测。本发明中所涉及的人血清白蛋白荧光探针和试剂盒制备方法简单，检测条件温和，具有很好的应用前景。

Description

检测人血清白蛋白的苯并噻唑类荧光探针及制备和试剂盒

技术领域

本发明属于荧光分析技术和精细化工交叉领域，具体而言，涉及制备一种基于苯丙噻唑的探针并用于检测人血清白蛋白及相关应用。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是在肝细胞中开始合成，成熟后因肝细胞对其存储能力较弱而被迅速释放到细胞外，最终主要分布在血浆中。HSA 在生理活动中发挥着重要功能。它不但能够维持血液渗透压、维持血液酸碱平衡，承载输运大部分内源性分子和外源性药物，而且能够发生糖基化、假酯酶催化等反应。依赖于这些功能，HSA的含量是评估人体健康状的重要指标，例如，血清中HSA含量低于正常值可能存在肝硬化或慢性肝炎等疾病，而尿液中HSA含量过高可能存在肾病和心血管疾病。由此可见，发展检测HSA含量的方法对展开生物化学分析以及临床诊断治疗至关重要。

作为血常规评估的一个重要依据，临床上检测白蛋白的溴甲酚绿方法等是利用HSA与探针分子结合后紫外可见吸光度相应改变的原理而设计的。这种方法有两个明显的缺点，一是探针与HSA结合在一定程度上受到其他能与HSA结合的物质的干扰；二是吸光光度法的灵敏度比较低。荧光分析法具有灵敏、快速、简便等优势，因此近年来很多学者致力于为白蛋白开发荧光探针。然而，目前所报道的检测白蛋白的荧光探针都是基于HSA与荧光探针分子的结合特性，虽然改进了灵敏度的问题，但是像极性、黏度等干扰因素以及干扰物的问题仍有待解决。

研究发现HSA有假酯酶活性，能够与一些酯类药物如阿司匹林发生反应。HSA在发挥酯酶活性后会产生两个效果，一是酯类底物被水解为羟基产物，二是HSA中的氨基酸会被酰基化。这一特性独立于极性、黏度等干扰因素。因此，开发依赖于白蛋白假酯酶活性的荧光探针能够更加准确地反应HSA含量及活性。

发明内容

本发明提供一种新的基于白蛋白假酯酶活性的苯并噻唑类荧光探针。人血清白蛋白可催化该探针水解，所得水解产物的吸收峰和荧光峰与探针底物有显著区别。根据水解产物的荧光信息可以推算待测样品中的HSA含量以及活性。本发明旨在解决现有非酶促反应型荧光探针对 HSA检测时易受环境极性、黏度等的干扰问题。

本发明的技术方案如下：

一种基于苯并噻唑的检测人血清白蛋白的荧光探针，命名为HBPA，其结构式如下结构式所示。

本发明提供了如上述所述的荧光探针HBPA的制备方法，其中，合成路线为：

其中，中间体Ⅱ的合成方案为：将化合物Ⅰ和乌洛托品溶于三氟乙酸中，回流反应8-12小时，随后冷却至室温并加入稀的NaOH水溶液中和反应液，再用二氯甲烷萃取中和液，旋干、柱色谱分离。

其中，中间体Ⅲ的合成方案为：将上述所得中间体Ⅱ加入到水合肼的甲醇溶液中，回流反应30-60分钟，旋干反应液。再将所得固体残渣溶于少许甲醇，超声5分钟，再加入冰水搅拌反应10分钟，抽滤得到固体产物。

其中，荧光探针HBPA的合成方案为：将中间体Ⅲ与乙酸-(2-醛基)苯酯溶于甲醇中，室温反应10-30分钟，待反应完全，抽滤即得目标产物。

本发明提供了一种用于人血清白蛋白检测的荧光试剂盒。其中，包含荧光探针和溶剂，所述荧光探针为如上所述的化合物HBPA。

所述的用于人血清白蛋白检测的荧光试剂盒，其中，荧光探针 HBPA的质量浓度为1mM。

所述的用于人血清白蛋白检测的荧光试剂盒，其中，所述溶剂是体积比为1:99 的二甲基亚砜和PBS的混合物。

本发明同时提供了上述荧光试剂盒在溶液体系中对人血清白蛋白的响应效果。具体技术方案如下：

准备几份相同的HBPA(10μM)的弱碱性缓冲溶液(PBS，pH＝7.4 或8.0)，加入不同浓度的HSA的水溶液，在25-50℃下反应30min～60min 后终止反应。测荧光光谱，记录最大发射波长处的荧光值。并分别与HBPA 及其水解产物标准品的荧光光谱对比。

本发明同时提供了上述荧光试剂盒在溶液体系中选择性识别人血清白蛋白的应用，具体技术方案如下：

准备几份相同的HBPA(10μM)的弱碱性缓冲溶液(PBS，pH＝7.4 或8.0)，各自分别加入水、HSA、蛋白酶、脂肪酶、羧酸酯酶、淀粉酶、血清凝集素、肌红蛋白等，测HBPA水解产物对应最大发射波长处的荧光值并作对比。其中所述生物分子加入的量相等。

有益效果：本发明的荧光探针HBPA对人血清白蛋白响应的荧光可以与极性、黏度等引起的探针自身荧光区分开，选择性和响应性高，具有很好的应用前景。本发明HBPA探针对应的荧光试剂盒制备条件容易实现，适用于实际扩大规模生产。

附图说明

图1：核磁共振氢谱图；

图2：HBPA所制荧光试剂盒的性能测定图；

图3：探针HBPA的分解产物与HSA浓度的线性关系图；

图4：荧光试剂盒中的HBPA探针对含有不同生物质的荧光响应对比结果图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面将结合本发明中的附图，对本发明一部分实施例中的技术方案进行具体描述。

实施例1.探针HBPA的合成，具体包括以下步骤：

(1)将化合物Ⅰ(10g，44.07mmol)和乌洛托品(618mg，44.07mmol)溶于三氟乙酸中，回流8h，用1N的NaOH中和反应液，用DCM萃三次，并旋干DCM。用柱色谱析柱分离得到180mg黄色固体Ⅱ。

(2)将水合肼(30mg，0.67mmol)溶于甲醇中，加入化合物Ⅱ(60mg， 0.22mmol)室温反应10min。旋干反应液，加入1ml甲醇超声两分钟，再加入5ml冰水零度搅拌五分钟，抽滤得到50mg淡黄色固体Ⅲ。

(3)将中间体Ⅲ(60mg,0.22mmol)和乙酸-(2-醛基)苯酯溶于甲醇中室温反应10min。抽滤反应液，得到50mg淡黄色固体HBPA。其核磁共振氢谱图如图1所示。

实施例2.一种检测人血清白蛋白的荧光试剂盒的制备，将该实施例1制得的荧光探针HBPA以1mM的浓度溶于二甲基亚砜中，再加入缓冲液溶液(PBS，pH＝7.4，100mM)将该荧光探针稀释倍至10μM。

实施例3.用HBPA所制荧光试剂盒的性能测定：

向上述12个相同的荧光试剂盒，分别加入不同量(具体终浓度分别为0,10,20,50,100,150,200,250,300,350,400,500mg/L)的HSA。如图2所示，在420nm的激发光源照射下，空白样品和低浓度人血清白蛋白样品的最大荧光峰在580nm附近，而高浓度的HSA荧光最大峰在 522nm左右。且随着HSA的量增加，522nm处荧光的荧光强度逐渐增强。说明该探针对人血清白蛋白有很显著的响应。

如图3所示，进一步的分析表明探针HBPA的分解产物与HSA浓度的线性关系为Y＝0.119X+0.315。这一结果适用于HSA定量。

向12个相同的荧光试剂盒中分别加入等摩尔量的不同生物质：人血清白蛋白、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰凝乳蛋白酶、羧酸酯酶、淀粉酶、溶菌酶、肌红蛋白、植物血清凝集素作为实验组，加水作为对照组。荧光试剂盒中的HBPA探针对含有不同生物质的荧光响应对比结果如图4所示，该荧光探针对人血清白蛋白的选择性明显优于其他生物分子。

综上所述，本发明通过利用白蛋白的假酯酶活性，设计合成了一个含酯基的苯并噻唑类荧光探针HBPA及其相应的荧光试剂盒。该探针自身的荧光最大发射峰在580nm，经过与人血清白蛋白相互作用被水解后，该探针水解产物的最大发射峰在522nm。据此，HBPA及对应的荧光试剂盒可以实现对人血清白蛋白的检测。本发明所涉及的探针和试剂盒对人血清白蛋白的选择性更高，在生物学和医疗诊断领域具有更大的潜力。

必须指出，本发明所描述的实施例并不是全部实施例，不可将其理解为对本发明的限定。本发明中所提出的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，与本文所公开的原理和新颖特点相一致的实施例都属于本发明所要保护的范围。

Claims (3)

1.一种基于苯并噻唑的检测人血清白蛋白的荧光探针，探针HBPA结构如下结构式所示，

。

2.如权利要求1所述的用于检测人血清白蛋白的荧光探针的制备方法，其特征在于合成路线为：

其中，包含的反应条件为：（i）加乌洛托品在三氟乙酸中回流；（ii）加水合肼在甲醇中回流；（iii）加2-醛基乙酸苯酯在甲醇中室温搅拌。

3.一种用于人血清白蛋白检测的荧光试剂盒，其特征在于，包含荧光探针和溶剂，所述荧光探针为权利要求1所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针HBPA；所含溶剂为弱碱性pH7.4-8.0缓冲盐溶液。

Images