CN114836200B - 基于人血清蛋白的复合荧光探针及其制备方法和在检测赭曲霉毒素a中的应用 - Google Patents

基于人血清蛋白的复合荧光探针及其制备方法和在检测赭曲霉毒素a中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于毒素检测领域，涉及赭曲霉毒素A的快速检测，特别是指基于人血清蛋白（HSA）的复合荧光探针及其制备方法和在检测赭曲霉毒素A中的应用。所述复合荧光探针为
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE001
和人血清蛋白复合得到。该探针制备简单、价格低廉，可以特异性识别OTA，与OTA反应灵敏，8 min即可达到反应平衡，操作简单，有望在食品中OTA快检领域推广应用。

Description

基于人血清蛋白的复合荧光探针及其制备方法和在检测赭曲霉毒素A中的应用
技术领域
本发明属于毒素检测领域，涉及赭曲霉毒素A的快速检测，特别是指基于人血清蛋白（HSA）的复合荧光探针及其制备方法和在检测赭曲霉毒素A中的应用。
背景技术
OTA是一种由青霉菌属和曲霉菌属的菌种产生的次级代谢产物，广泛存在于谷物、豆类、葡萄酒、咖啡等食品中。OTA可对神经系统、免疫系统、生殖系统、肝脏、肾脏等造成不可逆损伤，国际癌症研究机构（IARC）将其列为2B类致癌物质，严重威胁着人类及动物的身体健康。准确快速的检测食品中OTA的含量对控制食品品质具有重要意义。目前，常用的OTA的检测方法有高效液相-质谱法、薄层色谱法、气相色谱法、电化学法、酶联免疫法、固相微萃取法等，这些方法都可以实现OTA的检测，但一般需要大型专用仪器、专业的操作人员、繁琐的检测步骤，并且检测成本较高，很难实现OTA的快速检测。荧光检测法因其选择性好、灵敏度高、简便快速等优点备受研究者的关注。目前报道的通过荧光法检测OTA的方法一般需要借助酶联反应，但酶联反应法存在抗原、抗体价格高，易失活等问题，因此开发低成本，性质稳定，易于操作的新型荧光快检方法尤为重要。
发明内容
本发明提出一种基于人血清蛋白的复合荧光探针及其制备方法和在检测赭曲霉毒素A中的应用，该探针制备简单、价格低廉，可以特异性识别OTA，与OTA反应灵敏，8 min即可达到反应平衡，操作简单，有望在食品中OTA快检领域推广应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
基于人血清蛋白的复合荧光探针，所述复合荧光探针为和人血清蛋白复合得到。
上述的复合荧光探针的制备方法，步骤为：
（1）取原料和HSA；将溶于DMSO溶液中得到2 mM的储备液，将HSA溶于高纯水中得到1 mM的储备液；
（2）将的储备液和HSA的储备液加入磷酸盐缓冲液中，混合后浓度为5 μM，HAS浓度为5μM，室温下反应10 min，得到复合荧光探针。
磷酸盐缓冲液中反应物和人血清蛋白的物质的量比为1:1。
上述的复合荧光探针在检测赭曲霉毒素A中的应用。
步骤为：
（1）分别向复合荧光探针溶液中加入不同浓度的赭曲霉毒素A的标准溶液，反应8min，以454 nm的光源激发，测定不同浓度的标准溶液对应的荧光发射强度，制作标准曲线；
（2）再向复合荧光探针溶液中加入待测溶液，反应完全后在454 nm的光源激发下，测定其对应的荧光发射强度；
（3）将步骤（2）的荧光发射强度代入步骤（1）的标准曲线中，即得待测溶液中赭曲霉毒素A的定量浓度。
进一步，所述步骤（1）中复合荧光探针溶液为5 μM的溶液与5μM的人血清蛋白溶液等物质的量比混合得到；不同浓度的标准溶液对应的荧光发射强度为在589 nm处测得的荧光发射强度。
进一步，所述步骤（1）中标准曲线为y = 165.76x + 894.59，其中R2=0.9888。
进一步，所述步骤（2）中反应时间为8 min。
上述的应用检测对象为食品。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明所采用的原料和HSA廉价易得，成本低；合成的复合荧光探针在检测OTA过程中，随着反应溶液中OTA浓度的增加，溶液在589 nm处的荧光发射强度逐渐上升。在2-14 μM范围内，溶液的荧光发射强度与OTA的浓度存在良好的线性关系，y = 165.76x +894.59，其中R2=0.9888，可知本申请的荧光探针最低检出限为20 nM。
（2）本发明的复合荧光探针制备简单、选择性好对于不同的干扰物，发明中的复合荧光探针只在OTA存在的条件下，589 nm处的荧光发射强度有显著增强，由PBS溶液中复合荧光探针对OTA响应的荧光发射强度随时间的变化图中，可知复合荧光探针与OTA反应速率较快，在8 min内即可完全反应，大大缩短了现有的检测OTA的时间，且操作简单有望在食品检测领域推广使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为5 μM复合荧光探针与0-34 μM OTA在PBS溶液中的荧光发射光谱图，激发波长为545 nm。
图2为5 μM复合荧光探针与2-14 μM OTA在PBS溶液中荧光发射强度与OTA浓度的线性关系图，激发波长为545 nm，发射波长为589 nm。
图3为5 μM复合荧光探针在PBS中检测OTA及其干扰物的荧光发射强度柱状图, 激发波长为545 nm，发射波长为589 nm，其中干扰物为：黄曲霉毒素B1（AFB1），展青霉素（PAT），呕吐毒素（DON）。
图4为5 μM复合荧光探针与20 μM OTA在PBS溶液中荧光发射强度随时间的变化图，激发波长为545 nm，发射波长为589 nm。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：复合荧光探针的制备
将溶于DMSO中得到2 mM的储备液，HSA溶于超纯水中得到1 mM的水溶液，在2 mL PBS溶液（10 mM，pH=7.4）中加入5 μL的储备液，再加入10μL HSA的储备液，混合均匀后反应10 min得到复合荧光探针溶液。
应用例1：复合荧光探针对OTA的检测
向PBS溶液中加入5 μL的储备液，再加入10 μL HSA的储备液，混合均匀后反应10 min，再加入一定体积不同浓度的OTA溶液，混合均匀后反应8 min测定体系的荧光发射强度。
具体浓度：溶液终体积为2 mL，OTA的浓度为0-34μM；所有检测溶液均在室温下置于10.0 mm的石英荧光比色皿中测量荧光发射光谱。
从图1荧光发射光谱图中可以看出，随着反应溶液中OTA浓度的增加，溶液在589nm处的荧光发射强度逐渐上升。
从图2可以看出2-14 μM范围内，溶液的荧光发射强度与OTA的浓度存在良好的线性关系：y = 165.76x + 894.59，其中R2=0.9888，计算得到在溶液中OTA的检测限为20 nM。该实验结果表明本发明设计的复合荧光探针对OTA有很高的灵敏度，并且可以使实现OTA的定量检测。
应用例2：复合荧光探针的选择性实验
复合荧光探针的选择性实验：配置OTA和其他分析物：黄曲霉毒素B1（AFB1），展青霉素（PAT），呕吐毒素（DON）的乙腈溶液，浓度均为2 mM。向复合荧光探针的PBS溶液中加入20μL干扰物的乙腈溶液，干扰物的最终浓度为20 μM。
如图3所示，对于不同的干扰物，发明中的复合荧光探针只在OTA存在的条件下，589 nm处的荧光发射强度有显著增强。该选择性实验的结果表明，本发明的复合荧光探针对OTA检测具有高选择性，可满足特异性检测OTA的要求。
应用例3：复合荧光探针对OTA的响应时间实验
复合荧光探针在PBS溶液中对OTA的响应速率实验，其中最终测试溶液的总体积为2 mL，OTA的最终浓度为20 μM。
图4是在589 nm处，在PBS溶液中复合荧光探针对OTA响应的荧光发射强度随时间的变化图，可知复合荧光探针与OTA反应速率较快，在8 min内即可完全反应。
应用例4：复合荧光探针在检测食品中OTA的应用
以绿豆为研究对象，研究复合荧光探针对实际样品中OTA的检测能力。将绿豆研磨成粉得到绿豆粉，取1g绿豆粉，加入4 mL甲醇/水（V:V=7:3）的混合液，振荡提取15 min，离心后取上清液得到待测液。向复合荧光探针的PBS溶液加入5 μL待测液，分别加入2、5、10 μL OTA储备液，混合均匀后反应8 min测定体系的荧光发射强度。
具体浓度：溶液终体积为2 mL，OTA的浓度分别为2、5、10 μM；所有检测溶液均在室温下置于10.0 mm的石英荧光比色皿中测量荧光发射光谱。
由表1可知，低、中、高三个浓度的加标回收率均在90-105 %之间，三次平行实验的RSD均小于10%，说明基于复合荧光探针建立的荧光传感体系可以用于食品中OTA的定量检测。
表1 复合荧光探针在检测绿豆中OTA的应用
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于人血清蛋白的复合荧光探针，其特征在于：所述复合荧光探针为和人血清蛋白复合得到。
2.权利要求1所述的复合荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤为：将储备液和人血清蛋白储备液加至磷酸盐缓冲液中，室温下反应10 min，得到基于人血清蛋白的复合荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述储备液为2 mM的DMSO溶液；人血清蛋白储备液为1 mM的水溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：磷酸盐缓冲液中反应物和人血清蛋白的物质的量比为1:1。
5.权利要求1所述的复合荧光探针在制备检测赭曲霉毒素A的探针中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤为：
（1）分别向复合荧光探针溶液中加入不同浓度的赭曲霉毒素A的标准溶液，反应8 min，以454 nm的光源激发，测定不同浓度的标准溶液对应的荧光发射强度，制作标准曲线；
（2）再向复合荧光探针溶液中加入待测溶液，反应完全后在454 nm的光源激发下，测定其对应的荧光发射强度；
（3）将步骤（2）的荧光发射强度代入步骤（1）的标准曲线中，即得待测溶液中赭曲霉毒素A的定量浓度。
7.根据权利要求6的应用，其特征在于：所述步骤（1）中复合荧光探针溶液为5 μM的溶液与5μM的人血清蛋白溶液等物质的量比混合得到；不同浓度的标准溶液对应的荧光发射强度为在589 nm处测得的荧光发射强度。
8.根据权利要求6的应用，其特征在于：所述步骤（1）中标准曲线为y = 165.76x +894.59，其中R2=0.9888。
9.根据权利要求6的应用，其特征在于：所述步骤（2）中反应时间为8min。
10.根据权利要求5-9任一项所述的应用，其特征在于：所述应用的检测对象为食品。
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