CN108645826B - 一种快速检测抗坏血酸的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测抗坏血酸的新方法，其特征在于：将二氧化锰纳米材料，邻苯二胺和AA同时混合，通过检测两个荧光强度的变化实现对AA浓度的检测。本发明提供的方法非常简单、特异性强、稳定性好、检测速度快，可进一步研制相应的试剂盒和试纸条，能够满足现场快速、准确的检测要求，可应用于食品安全检测、疾病检测、生物分析、环境分析等领域。

Description

一种快速检测抗坏血酸的新方法
技术领域
本发明涉及化学分析领域，具体涉及一种快速检测抗坏血酸(AA)的新方法，本发明属于检测技术领域。
背景技术
抗坏血酸(AA)，也被称为维生素C，是常见的水溶性维生素，水果与蔬菜中含量非常丰富。AA也是一种抗氧化剂，人为地添加到食品行业的食物中。此外，AA在人类日常生活的许多过程中起着重要的作用，对人的生命至关重要，因此AA被添加到食品和食品防腐剂中，保证食品的质量。同时，AA也被广泛应用于许多其他领域，动物饲料，饮料，化妆品，药物制剂等。在人体中缺乏AA可以引起各种疾病，包括普通感冒，坏血病，精神疾病，不孕症和癌症等。不幸的是，作为一个外源性化学物质，AA不能由人体自身合成只能从食物中摄取维持。因此，AA浓度的确定无疑对疾病诊断具有重要意义。
迄今为止，已经发展了许多用于检测AA的方法，包括用氧化剂、电化学、分光光度法、色谱和化学发光和毛细管电泳进行滴定。但是，这些方法耗时长，且费用高操作比较复杂，对检测人员要求比较高，已经无法满足现场快速检测的需要。因此，迫切需要更简单、有效和灵敏快速的测定AA的方法。目前对于抗坏血酸的检测方法的文献报道较多，但是多是基于抗坏血酸的还原性(Journal of Agricultural&Food Chemistry,2016,64(1):371.Talanta 165(2017)346–350.Nanoscale,2017,9(29):10167-10172.SpectrochimicaActa Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy 180(2017)204–210.Sensors&Actuators B Chemical,2015,212:214-219.Journal ofLuminescence 192(2017)47–55.Biosensors andBioelectronics68(2015)210–217.Talanta 162(2017)135–142.)，食品饮料中还原性物质较多，所以这些方法对检测结果的准确度和特异性影响很大。而在生物环境下，与抗坏血酸共存的谷胱甘肽、多巴胺也会对检测结果产生影响。之前利用二氧化锰纳米材料进行抗坏血酸检测的方法多数不能对以上几种物质实现选择性检测。而比率型生物传感器基于两种信号的变化实现对待测物的检测，降低了外界环境的影响，极大地提高了检测准确性。基于此，我们致力于发展一种简单、快速、高效无酶免标、高特异性检测抗坏血酸的新方法。而谷胱甘肽及多巴胺不能引起所发展传感体系信号的变化。
发明内容
对目标物实现高灵敏、高精准、简单的快速检测方法是分析化学的一个重要发展方向。针对以上存在的问题，我们开发了一种无酶、免标、成本低的快速检测抗坏血酸的新方法。其操作过程简单，成本低，检测结果具有良好的重现性，确保了检测结果的准确度。为达到上述目的，本发明创造的技术方案如下：
本发明提供了一种快速检测抗坏血酸(AA)的新方法。本方法首先将抗坏血酸(AA)、二氧化锰纳米材料(MnO2)二者混合，然后再加入邻苯二胺(o-Phenylenediamine)在室温孵育30min，产生两个荧光，构建了一个比率型荧光强度传感器，其荧光强度的增减与AA浓度呈线性相关，通过检测两个荧光强度的比值即可实现对AA的快速准确检测。
本发明具体包括以下步骤：
(1)制备0.2mM MnO2纳米材料溶液，然后加入0-6μM不同浓度的AA，再加入邻苯二胺(OPDA)室温下孵育30min，然后用荧光分光光度仪检测两个荧光强度，激发波长为360nm，发射波长分别为425nm和568nm。邻苯二胺，二氧化锰纳米材料(MnO2)与AA三者浓度是三者在反应体系中的最终浓度，反应的体系包括邻苯二胺，二氧化锰材料和不同浓度的AA。
(2)以两个荧光响应的比值为纵坐标，以AA浓度为横坐标对检测数据进行处理，然后进行线性拟合，得到线性回归方程，y＝0.07278x+0.03157(R2＝0.99937)；
(3)依据步骤(1)对饮料样品中的抗坏血酸进行检测，根据步骤(2)得到的线性回归方程计算待测溶液中抗坏血酸的浓度。
进一步，本发明所述二氧化锰纳米材料制备方法为：将1mM KMnO4加入0.01M MES缓冲液中，用10mL蒸馏水溶解。然后，将混合物超声处理约30分钟。二氧化锰材料获得后以10000rpm离心10分钟。用蒸馏水反复清洗五次后，最终产物用10mL蒸馏水分散，并在4℃储存。
本发明所述的方法是一种快速检测抗坏血酸的新方法。相对于现有技术，本发明创造所述的AA的检测方法具有以下优势：本发明利用AA，MnO2和邻苯二胺的共同作用构建比率型荧光生物传感器，降低了外界环境对检测结果的影响。所发展的检测方法是在无酶免标的条件下进行操作，具有方法简单、灵敏度高和特异性强且成本低的优势。
附图说明
构成本发明创造的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：
图1为本发明创造实施例所述的抗坏血酸与MnO2纳米材料紫外光谱图。
图2为本发明创造实施例所述的AA，MnO2，邻苯二胺产生两个荧光信号，检测AA的原理验证相关实验数据。
图3为本发明创造实施例所述的优化MnO2所用检测浓度的荧光响应数据。
图4为本发明创造实施例所述的优化实验Ph条件的荧光响应数据。
图5为本发明创造实施例所述的两个荧光强度随AA浓度变化的荧光曲线。
图6为本发明创造实施例所述的两个荧光强度随AA浓度变化在425nm和568nm处荧光值比值(F425/F568)的线性拟合曲线及方程。
图7为本发明创造实施例所述的检测抗坏血酸特异性干扰实验数据。
具体实施方式
为了使本发明上述特征和发明创造中优化条件更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。
以下邻苯二胺(OPDA)，二氧化锰纳米材料(MnO2)与AA三者反应的体系是200μL(包括OPDA，二氧化锰材料和不同浓度的AA)，下面给出的三者的浓度都是在200μL体系下的浓度。
实施例1
将1mMKMnO4加入0.01M MES缓冲液中，用10mL蒸馏水溶解。然后，将混合物超声处理约30分钟(颜色变为棕褐色)。二氧化锰材料获得后以10000rpm离心10分钟。用蒸馏水反复清洗五次后，最终产物用10mL蒸馏水分散，并在4℃储存。MnO2纳米材料最后的浓度为0.68mM。配制抗坏血酸终浓度为10μM。紫外可见分光光度计分别测定紫外吸收光谱。
实施例2
1mM OPDA与0.2mM MnO2纳米材料混合后(a)；0.2mM MnO2与20μM AA混合，再与1mMOPDA混合后(b)；1mM OPDA与20μM AA混合后(c)；1mM OPDA(d)；0.2mM MnO2(e)；20μM AA(f)。利用荧光分光光度仪测荧光强度(如图1所示)。激发波长为360nm，发射波长分别为425nm和568nm。
实施例3
1mM OPDA与不同浓度的MnO2(0，0.25，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5mM)测定荧光强度。激发波长360nm，发射波长为568nm。
实施例4
0.2mM MnO2与20μM AA混合，再与1mM OPDA混合与不同Ph值得反应缓冲溶液(5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5)反应30min，测定荧光强度。激发波长360nm，发射波长分别为425nm和568nm。
实施例5
0-50nM的AA与0.2mM MnO2混合，再加入1mM OPDA，反应30min，测定荧光强度。激发波长360nm，发射波长分别为425nm和568nm。
实施例6
0-6μM的AA与0.2mM MnO2混合，再加入1mM OPDA，反应30min，测定荧光强度，做出425nm与568nM荧光比值，通过线性拟合获得线性方程：
y＝0.07278x+0.03157(R2＝0.99937)式(1))
实施例7
选择性验证：a:抗坏血酸，b:甘氨酸c:谷氨酸,d:精氨酸,e:赖氨酸,f:脯氨酸,g:组氨酸,h:半胱氨酸,i:谷胱甘肽,j:葡萄糖,k:多巴胺,l:BSA蛋白,m:钙离子,n:钠离子,o:锌离子,p:铜离子,q:铁离子作为本实验检测的干扰物质，验证该方法的特异性。干扰物质浓度均为20μM,分别与0.2mM MnO2和1mM OPDA混合反应30min后，利用荧光分光光度仪测其荧光强度。如图7所示，只有10μM AA的两个荧光信号比值最大，而其他干扰物质的比值很小，表明该方法对AA检测特异性强、灵敏度高、方法非常简单。
实施例8
以标准加入法对所发展检测新方法进行验证，将四种饮料样品稀释到一定浓度，用该传感器检测出原有AA浓度，在向样品中分别添加AA量为：1,2,4μM；再加入MnO2(0.2mM)与OPDA(1mM)的混合溶液，在相同条件下进行样品检测。根据检测结果确定根据所得线性方程式(1)计算得出AA实际检出浓度，据此计算加标回收率(见表1)，证明此方法可应用于实际样品检测。
表1检测抗坏血酸在实际饮料中的实验数据。
Figure BDA0001648102470000071
实际样品中添加AA后，利用得到的线性方程计算出AA的实际检出量，可以得到回收率在85-120％范围内，说明此方法用于检测AA的浓度是准确。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例，并不用于限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种快速检测饮料中抗坏血酸的新方法，其特征在于：将二氧化锰纳米材料，邻苯二胺和AA同时混合，在单一激发光360nm激发下，通过检测在425nm及568nm两个荧光强度的变化实现对AA浓度的检测；具体操作方法如下：
(1)在1mM邻苯二胺和0.2mM二氧化锰纳米材料的混合溶液中，加入0-6μM不同浓度的抗坏血酸溶液，反应30min后，用荧光分光光度仪器检测两个荧光信号的荧光强度，其激发波长为360nm，发射波长分别为425nm和568nm；
(2)以两个荧光强度比值为纵坐标，以抗坏血酸浓度为横坐标对检测数据进行处理，然后进行线性拟合，得到线性回归方程，y＝0.07278x+0.03157，其中R2＝0.99937；
(3)以多种饮料为实际样品，利用标准加入法对抗坏血酸进行检测；检测过程如上(1)所述，并根据步骤(2)得到的线性回归方程计算待测溶液中抗坏血酸的浓度。
2.权利要求1所述的一种快速检测饮料中抗坏血酸的新方法，其特征在于：所述二氧化锰纳米材料制备方法为：将1mMKMnO 4加入0.01M MES缓冲液中，用10mL蒸馏水溶解，然后，将混合物超声处理30分钟，二氧化锰材料获得后以10000rpm离心10分钟，用蒸馏水反复清洗五次后，最终产物用10mL蒸馏水分散，并在4℃储存。
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