CN111077124B - 一种红-黄-蓝三荧光发射传感器及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析化学以及快速检测领域，具体涉及一种红‑黄‑蓝三荧光发射传感器及其制备和在精确可视化检测碱性磷酸酶中的应用。传感器由二氧化锰纳米片、邻苯二胺、红色荧光量子点和缓冲液构成；或，传感器由二氧化锰纳米片、邻苯二胺、红色荧光量子点和含底物的缓冲液构成，其中底物为L‑抗坏血酸‑2‑磷酸。本发明红‑黄‑蓝三荧光发射传感器可在同一波长激发下，其三个不同波长的荧光针对活度逐渐增加的碱性磷酸酶表现出黄色荧光峰降低、红色荧光峰增强和蓝色荧光峰增强，整体荧光颜色变化为“黄色–橙色–红色–紫色”用于可视化检测目标物含量，也可通过测量三个不同发射波长处的荧光强度，以其强度变化为信号参量可测定目标物的含量。

Description

一种红-黄-蓝三荧光发射传感器及其制备和应用
技术领域
本发明属于分析化学以及快速检测领域，具体涉及一种红-黄-蓝三荧光发射传感器及其制备和在精确可视化检测碱性磷酸酶中的应用。
背景技术
现如今，快速可视化检测在环境检测、食品安全、临床诊断等领域都发挥着重要作用。对大量待测样品的快速可视化检测，结合对可疑样品的大型仪器(如高效液相色谱)精确检测往往构成一个完整的检测流程，既节约检测的金钱和时间花费又保证检测结果的可靠性。因此，往往要求快速可视化检测方法具有高灵敏性与高选择性。
荧光传感器因具有高灵敏性，有利于痕量物质浓度的检测而被广泛研发与应用。其中，双荧光发射传感器识别一定浓度的目标物后，在单一波长激发下其两个荧光发射峰将发生不同步的变化，如一个发射峰被猝灭而另一个发射峰保持不变，这将实现基于两个发射峰强度的比值变化实现目标物浓度的自校正检测，可克服各种外部干扰。同时，两个发射峰的不同步变化将提供颜色的演变，而不仅仅是单个颜色的明暗变化，基于此将更容易得到更精确、更高分辨率的可视化检测结果。具有类氧化酶特性的过渡金属氧化物纳米材料，如二氧化锰纳米片，可用于特异性识别各种抗氧化物及其相关联物质，同时，二氧化锰纳米片具有制备过程简单、物理、化学稳定性高、价格低廉等优势。基于过渡金属氧化物纳米材料类氧化酶特性制备的双荧光发射传感器结合了二者的高灵敏性、自校正功能、荧光演变功能以及高选择性，实现了多种抗氧化物及其相关联物质的检测，如谷胱甘肽、半胱氨酸、抗坏血酸和碱性磷酸酶、双氧水和葡萄糖、硫代胆碱和乙酰/丁酰胆碱酯酶以及有机磷农药等。
然后，通过观察CIE1931色度图可知，已构建的双荧光发射传感器可提供的荧光颜色变化范围仍然有限，导致可视化检测结果缺乏一定的准确性和精确性。设法进一步扩大荧光颜色变化范围、丰富颜色变化过程，将更有利于提供更精确的可视化结果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种红-黄-蓝三荧光发射传感器及其制备和在精确可视化检测碱性磷酸酶中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种红-黄-蓝三荧光发射传感器，传感器由二氧化锰纳米片、邻苯二胺、红色荧光量子点和缓冲液构成；
或，传感器由二氧化锰纳米片、邻苯二胺、红色荧光量子点和含底物的缓冲液构成，其中底物为L-抗坏血酸-2-磷酸。
所述每1mL传感器中各物质用量为0.07–0.09mg二氧化锰纳米片，14–16μmol邻苯二胺，9–11μL红色荧光量子点，95–105μL磷酸缓冲液(0.1mol·L-1，pH 8.0)；并经水定容；当检测样品时经样品定容。
所述每1mL传感器中各物质用量为0.07–0.09mg二氧化锰纳米片，14–16μmol邻苯二胺，9–11μL红色荧光量子点，95–105μL磷酸缓冲液，其中，磷酸缓冲液为0.1mol·L-1，pH8.0，含有0.9–1.1μmol L-抗坏血酸-2-磷酸；并经水定容；当检测样品时经样品定容。
所述二氧化锰纳米片为通过2-吗啉乙磺酸超声还原高锰酸钾4–6分钟，反应后将产物用离心法沉淀，弃上清液，用超纯水洗涤沉淀5–7次，得到具有二维片状结构的二氧化锰纳米片；其中，2-吗啉乙磺酸浓度为80–120mmol·L-1，pH为5.8–6.2；高锰酸钾浓度为8–12mmol·L-1；2-吗啉乙磺酸与高锰酸钾用量体积比为5:4–7:5。
所述红色荧光量子点为碲化镉/硫化锌(CdTe/ZnS)量子点。
一种红-黄-蓝三荧光发射传感器的应用，所述缓冲液内含L-抗坏血酸-2-磷酸的传感器，在精确可视化定性/定量检测碱性磷酸酶中的应用；
或，所述传感器在精确可视化定性/定量检测抗坏血酸中的应用。
一种可视化定性/定量检测碱性磷酸酶的方法，利用传感器内底物与待检测样品中碱性磷酸酶的催化反应，产生产物抗坏血酸使二氧化锰纳米片催化活性变化，进而影响二氧化锰纳米片与邻苯二胺的反应程度，以及邻苯二胺被还原的程度，所呈现出“黄色–橙色–红色–紫色”的不同变化，实现对目标物碱性磷酸酶的精确可视化检测。
所述待测样品中无碱性磷酸酶时，传感器内的二氧化锰纳米片催化邻苯二胺的氧化反应，生成黄色荧光邻苯二胺氧化物并猝灭量子点的红色荧光，传感器显示为黄色荧光；
所述待测样品中待碱性磷酸酶含量少时，待测物与底物的去磷酸化反应生成抗坏血酸，抗坏血酸将二氧化锰纳米片还原为二价锰离子并失去类氧化酶特性，使邻苯二胺的氧化反应减弱，生成的邻苯二胺氧化物黄色荧光逐渐减少，量子点红色荧光恢复，传感器逐步从原来的黄色荧光转变为橙色，最终转变为红色荧光；
所述待测样品中碱性磷酸酶含量高时，待测物与底物的去磷酸化反应生成抗坏血酸增多，反应产物抗坏血酸完全还原二氧化锰纳米片并逐渐还原邻苯二胺生成蓝色荧光产物，量子点红色荧光保持不变，传感器进一步从红色荧光转变为紫色荧光。
所述传感器的黄色、红色、蓝色三个荧光发射强度随待测样品中碱性磷酸酶含量的增高而降低、升高、升高，实现对目标物碱性磷酸酶的定量检测。
所述待测样品中含有碱性磷酸酶时，碱性磷酸酶在35–40℃水浴条件下催化传感器中L-抗坏血酸-2-磷酸去磷酸化生成抗坏血酸，催化反应时间55–65分钟。
所述碱性磷酸酶与底物的催化产物抗坏血酸与二氧化锰纳米片混合反应8–12分钟后，加入邻苯二胺，并38–42℃水浴条件下催化邻苯二胺的氧化反应，催化反应时间55–65分钟。
检测原理：本发明传感器可视化检测碱性磷酸酶的机理在于，当不存在目标物碱性磷酸酶时，传感器内的二氧化锰纳米片催化邻苯二胺的氧化反应，生成黄色荧光邻苯二胺氧化物并猝灭量子点的红色荧光，传感器显示为黄色荧光；
存在一定活度的碱性磷酸酶(少量)时，碱性磷酸酶催化传感器内底物L-抗坏血酸-2-磷酸的去磷酸化反应生成抗坏血酸，抗坏血酸将二氧化锰纳米片还原为二价锰离子并失去类氧化酶特性，使邻苯二胺的氧化反应减弱，生成的邻苯二胺氧化物黄色荧光逐渐减少，量子点红色荧光恢复，传感器逐步转变为红色荧光；
碱性磷酸酶活度进一步增加时，反应产物抗坏血酸完全还原二氧化锰纳米片并逐渐还原邻苯二胺生成蓝色荧光产物，量子点红色荧光保持不变，传感器进一步转变为紫色荧光，即提供“黄色–橙色–红色–紫色”丰富的、宽范围的荧光颜色变化，实现对目标物碱性磷酸酶的精确可视化、高灵敏、高选择、自校正检测。
此外，通过荧光分光光度计测定传感器溶液的荧光光谱，读取三个发射峰峰强，计算邻苯二胺氧化物黄色荧光的猝灭程度、量子点红色荧光恢复程度、邻苯二胺还原物蓝荧光的增强程度与碱性磷酸酶活度存在的计量关系，实现对碱性磷酸酶的定量检测。
本发明的有益效果为：
本发明红-黄-蓝三荧光发射传感器可在同一波长激发下，其三个不同波长的荧光针对活度逐渐增加的碱性磷酸酶表现出黄色荧光降低、红色荧光增强和蓝色荧光增强，通过测量三个不同发射波长处的荧光强度，以其强度变化为信号参量可测定目标物的含量；或更直接地，根据三处发射峰不同强度变化而产生的丰富的、宽范围的荧光颜色变化完成裸眼可视化检测。所构建的红-黄-蓝三荧光发射传感器将拓宽多荧光发射检测方法在快速可视化检测抗氧化物及其相关联物质乃至其他目标分析物中的应用；具体为：
1)本发明首次构建含过渡金属氧化物纳米材料类氧化酶特性的可发射三种荧光(红、黄、蓝)的传感器，同一波长激发下，针对活度逐渐增加的碱性磷酸酶表现出黄色荧光降低、红色荧光增强和蓝色荧光增强，进而提供丰富的、宽范围的荧光颜色变化“黄色–橙色–红色–紫色”用于碱性磷酸酶的精确可视化检测，克服了传统荧光传感器颜色演变范围窄、不利于精确可视化检测的缺点；
2)本发明传感器中的二氧化锰纳米片通过高锰酸钾还原法制备，制备过程简单，价格低廉，所制备二氧化锰纳米片具有明显类氧化酶特性，能够特异性地与碱性磷酸酶的催化产物抗坏血酸反应，并氧化邻苯二胺；氧化所得的邻苯二胺氧化物具有黄色荧光，同时具有高紫外-可见光吸收能力以猝灭红色量子点；传感器所含邻苯二胺能与碱性磷酸酶的催化产物抗坏血酸反应，生成蓝色荧光物质。多种作用相互结合，实现了复杂样品中碱性磷酸酶的特异性精确可视化检测。
附图说明
图1为本发明实施例提供的红-黄-蓝三荧光发射传感器的制备和其精确可视化检测碱性磷酸酶过程示意图。
图2为本发明实施例提供的传感器检测抗坏血酸的荧光光谱图与荧光颜色演变图；其中，A和B为红-黄-蓝三荧光发射传感器，C和D为黄-蓝双荧光发射传感器。
图3为本发明实施例提供的传感器检测碱性磷酸酶的荧光光谱图与荧光颜色演变图；其中，A为红-黄-蓝三荧光发射传感器，B为黄-蓝双荧光发射传感器。
图4为本发明实施例提供的红-黄-蓝三荧光发射传感器识别不同抗氧化物和酶后其黄色荧光和蓝色荧光强度以及荧光颜色的变化图；其中，各抗氧化性物质浓度为30μmol·L-1，各种酶活度为30mU·mL-1。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的解释说明。
本发明利用传感器中邻苯二胺进行的氧化或还原反应，产生的物质(邻苯二胺氧化物、邻苯二胺还原物)所提供的颜色与传感器中红色荧光量子点分别提供黄色、红色、蓝色荧光，发射波长依次分别为569nm、659nm、441nm，各自因碱性磷酸酶活度增加产生不同的荧光信号强度变化，即荧光猝灭、荧光增强和荧光增强，通过测量三个不同发射波长处的荧光强度，以其强度变化为信号参量可测定目标物的含量；或更直接地，根据三处发射峰不同强度变化而产生的丰富的、宽范围的荧光颜色变化(黄色–橙色–红色–紫色)完成裸眼可视化检测。在最优条件下，本发明方法制备得到的传感器能够高选择、高灵敏地检测碱性磷酸酶，且提供颜色演变与自校正功能，克服了传统荧光传感器颜色演变范围窄、不利于精确可视化检测的缺点，将拓宽多荧光发射检测法在快速可视化检测目标分析物中的应用。
实施例1
红-黄-蓝三荧光发射传感器的配制：
传感器为二氧化锰纳米片、邻苯二胺、红色荧光量子点和缓冲液构成；其中，各物质用量为：100μL二氧化锰纳米片(0.8mg·mL-1)，50μL邻苯二胺(0.3mol·L-1)，20μL红色荧光量子点；100μL磷酸缓冲液(0.1mol·L-1,pH 8.0)。并添加750μL水定容；当检测样品时添加750μL样品定容。
或，传感器由二氧化锰纳米片、邻苯二胺、红色荧光量子点和含底物L-抗坏血酸-2-磷酸的缓冲液构成；其中，各物质用量为：100μL二氧化锰纳米片(0.8mg·mL-1)，50μL邻苯二胺(0.3mol·L-1)，10μL红色荧光量子点；100μL磷酸缓冲液(0.1mol·L-1,pH 8.0，含10mML-抗坏血酸-2-磷酸)。并添加750μL水定容；当检测样品时添加750μL样品定容。
所述二氧化锰纳米片制备：将9mL高锰酸钾(0.01mol·L-1)和12mL 2-吗啉乙磺酸(0.1mol·L-1，pH 6.0)混合并超声反应5分钟。然后，将合成的黑棕色混合液离心，并用超纯水纯化沉淀物五次以最终获得二氧化锰纳米片，并以0.8mg·mL-1的浓度分散在水中备用。
所述红色荧光量子点为碲化镉/硫化锌(CdTe/ZnS)量子点，合成方法：Dual-emission color-controllable nanoparticle based molecular imprintingratiometric fluorescence sensor for the visual detection of Brilliant Blue,Sensors&Actuators:B.Chemical 284(2019)428–436。
实施例2
利用上述传感器用于抗坏血酸的精确可视化检测：
参见图1：首先将750μL具有不同浓度的抗坏血酸(0、0.5、1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100μmol·L-1)与100μL二氧化锰纳米片(0.8mg·mL-1)反应10分钟，再接着加入100μL磷酸缓冲液(0.1mol·L-1,pH 8.0)和50μL邻苯二胺(0.3mol·L-1)在40℃水浴锅中反应60分钟。最后加入20μL红色荧光量子点，混匀，使用荧光仪在激发波长为365nm、狭缝宽度为10/10nm条件下记录荧光发射光谱，并在365nm紫外灯下拍摄对应的荧光图像。同时，采用上述相同的方法，在制备过程中不加入红色荧光量子点，获得黄-蓝双荧光发射传感器作为对照。
由图2A可知，在365nm波长激发下，红-黄-蓝三荧光发射传感器发射三个荧光峰，分别在569nm、659nm和441nm。随着抗坏血酸浓度的增加，黄色荧光、红色荧光和蓝色荧光分别逐渐降低、增强和增强。如图2B所示，黄色荧光强度降低与蓝色荧光强度增强与抗坏血酸浓度(0.1–100μmol·L-1)线性关系，相关系数(r2)为0.989。此外，如图2A上图所示，因为同时发生的猝灭与增强作用，荧光强度的变化可造成明显而丰富的荧光颜色变化：黄色–橙色–红色–红紫色–蓝紫色，进而可实现精确、高分辨率地裸眼可视化检测抗坏血酸浓度。而如图2C所示，随着抗坏血酸浓度的增加，黄-蓝双荧光发射传感器的蓝色和蓝色荧光同样分别逐渐降低和增强，如图2D所示，蓝色荧光与黄色荧光强度比值的变化与抗坏血酸浓度也呈类似线性关系；然而，如图2C上图所示，由于缺少红色荧光的共同作用，造成的荧光颜色变化范围大大缩小：黄色–蓝色。进一步可见，红-黄-蓝三荧光发射传感器克服了双荧光发射传感器颜色演变范围窄、不利于精确可视化检测的缺点。
实施例3
利用上述传感器用于碱性磷酸酶的精确可视化检测：
参见图1：首先将750μL具有不同活度的碱性磷酸酶(0、0.1、1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100mU/mL)与100μL L-抗坏血酸-2-磷酸(10mM，溶于0.1mol·L-1,pH8.0的磷酸缓冲液)在37℃水浴锅中反应60分钟，接着加入100μL二氧化锰纳米片(0.8mg·mL-1)并反应10分钟，再接着加入50μL邻苯二胺(0.3mol·L-1)在40℃水浴锅中反应60分钟。最后加入10μL红色荧光量子点，混匀，使用荧光仪在激发波长为365nm、狭缝宽度为10/10nm条件下记录荧光发射光谱，并在365nm紫外灯下拍摄对应的荧光图像。同时，采用上述相同的方法，在制备过程中不加入红色荧光量子点，获得黄-蓝双荧光发射传感器作为对照。
由图3A可知，在365nm波长激发下，红-黄-蓝三荧光发射传感器发射三个荧光峰，分别在569nm、659nm和441nm。随着碱性磷酸酶活度的增加，黄色荧光、红色荧光和蓝色荧光分别逐渐降低、增强和增强。如图3A插图所示，蓝色荧光与黄色荧光强度比值的变化与碱性磷酸酶活度(0.1–100mU·mL-1)呈一定的计量关系：y＝101.387+(2.236-101.387)/(1+(x/37.558)^3.993)，相关系数(r2)为0.998。此外，如图3A上图所示，因为同时发生的猝灭与增强作用，荧光强度的变化可造成明显而丰富的荧光颜色变化：黄色–橙色–红色–红紫色–蓝紫色，进而可实现精确、高分辨率地裸眼可视化检测碱性磷酸酶含量。而如图3B所示，随着碱性磷酸酶活度的增加，黄-蓝双荧光发射传感器的蓝色和蓝色荧光同样分别逐渐降低和增强，蓝色荧光与黄色荧光强度比值的变化与碱性磷酸酶活度也呈类似计量关系；然而，如图3B上图所示，由于缺少红色荧光的共同作用，造成的荧光颜色变化范围大大缩小：黄色–蓝色。进一步可见，红-黄-蓝三荧光发射传感器克服了双荧光发射传感器颜色演变范围窄、不利于精确可视化检测的缺点。
实施例4
利用实施例1制备红-黄-蓝三荧光发射传感器，并采用实施例3中的方法检测各种抗氧化性物质，如谷胱甘肽、半胱氨酸、葡萄糖、草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸和抗坏血酸，以及各种酶，如脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、核苷酸酶、溶解酵素、乙酰胆碱酯酶和碱性磷酸酶；其中，各抗氧化性物质浓度为30μmol·L-1，各种酶活度为30mU·mL-1。
如图4所示，因为制备的红-黄-蓝三荧光发射传感器所具有的特异性识别能力，目标分析物碱性磷酸酶(30mU·mL-1)及其催化产物抗坏血酸(30μmol·L-1)会导致传感器明显的黄色荧光下降和明显的蓝色荧光增强，荧光颜色分别变至红色和红紫色。观察其他抗氧化物和酶的结果发现，除了谷胱甘肽和半胱氨酸，其余抗氧化物和酶并未造成黄色荧光峰或蓝色荧光峰的明显变化，所对应的荧光颜色也无明显变化，这是因为这些抗氧化物和酶的抗氧化能力不强或没有抗氧化能力；而谷胱甘肽和半胱氨酸具有比拟抗坏血酸的抗氧化能力，故还原了二氧化锰纳米片，使无黄色荧光邻苯二胺氧化物生成或生成减少，但未能还原邻苯二胺所以未使得蓝色荧光增强，造成传感器荧光颜色变至红色或橙色；在N-乙基马来酰亚胺作用下，谷胱甘肽和半胱氨酸作用被屏蔽，故未造成黄色荧光峰或蓝色荧光峰的明显变化，所对应的荧光颜色也无明显变化，证明谷胱甘肽和半胱氨酸的干扰可被消除，也进一步证明制备的红-黄-蓝三荧光发射传感器能够特异性识别目标物碱性磷酸酶，有利于其活度的准确检测。

Claims (6)

1.一种红-黄-蓝三荧光发射传感器，其特征在于：
每1 mL传感器中各物质用量为0.07–0.09 mg二氧化锰纳米片，14–16 μmol邻苯二胺，19–21 μL红色荧光量子点，95–105 μL磷酸缓冲液；
或，每1 mL传感器中各物质用量为0.07–0.09 mg二氧化锰纳米片，14–16 μmol邻苯二胺，9–11 μL红色荧光量子点，95–105μL含底物的磷酸缓冲液，其中，磷酸缓冲液为0.1mol·L-1，pH 8.0，含有0.9–1.1 μmol L-抗坏血酸-2-磷酸；
所述红色荧光量子点为碲化镉/硫化锌（CdTe/ZnS）量子点。
2.按权利要求1所述的红-黄-蓝三荧光发射传感器，其特征在于：所述二氧化锰纳米片为通过2-吗啉乙磺酸超声还原高锰酸钾4–6分钟，反应后将产物用离心法沉淀，弃上清液，用超纯水洗涤沉淀5–7次，得到具有二维片状结构的二氧化锰纳米片；其中，2-吗啉乙磺酸浓度为80–120 mmol·L-1，pH为5.8–6.2；高锰酸钾浓度为8–12 mmol·L-1；2-吗啉乙磺酸与高锰酸钾用量体积比为5:4–7:5。
3.一种权利要求1所述的红-黄-蓝三荧光发射传感器的应用，其特征在于：
所述权利要求1中缓冲液内含L-抗坏血酸-2-磷酸的传感器，在精确可视化定性/定量检测碱性磷酸酶中的应用；
或，所述权利要求1中缓冲液内不含L-抗坏血酸-2-磷酸的传感器在精确可视化定性/定量检测抗坏血酸中的应用。
4.一种可视化定性/定量检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：利用传感器内底物与待检测样品中碱性磷酸酶的催化反应，产生产物抗坏血酸使二氧化锰纳米片催化活性变化，进而影响二氧化锰纳米片与邻苯二胺的反应程度，以及邻苯二胺被还原的程度，所呈现出“黄色–橙色–红色–紫色”的不同变化，实现对目标物碱性磷酸酶的精确可视化检测；
所述待检测样品中无碱性磷酸酶时，传感器内的二氧化锰纳米片催化邻苯二胺的氧化反应，生成黄色荧光邻苯二胺氧化物并猝灭量子点的红色荧光，传感器显示为黄色荧光；
所述待检测样品中待碱性磷酸酶含量少时，待测物与底物的去磷酸化反应生成抗坏血酸，抗坏血酸将二氧化锰纳米片还原为二价锰离子并失去类氧化酶特性，使邻苯二胺的氧化反应减弱，生成的邻苯二胺氧化物黄色荧光逐渐减少，量子点红色荧光恢复，传感器逐步从原来的黄色荧光转变为橙色，最终转变为红色荧光；
所述待测样品中碱性磷酸酶含量高时，待测物与底物的去磷酸化反应生成抗坏血酸增多，反应产物抗坏血酸完全还原二氧化锰纳米片并逐渐还原邻苯二胺生成蓝色荧光产物，量子点红色荧光保持不变，传感器进一步从红色荧光转变为紫色荧光。
5.按权利要求4所述的方法，其特征在于：所述待检测样品中含有碱性磷酸酶时，碱性磷酸酶在35–40℃水浴条件下催化传感器中L-抗坏血酸-2-磷酸去磷酸化生成抗坏血酸，催化反应时间为55–65分钟。
6.按权利要求4所述的方法，其特征在于：所述碱性磷酸酶与底物的催化产物抗坏血酸与二氧化锰纳米片混合反应8–12分钟后，加入邻苯二胺，并38–42℃水浴条件下催化邻苯二胺的氧化反应，催化反应时间为55–65分钟。
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