CN109762558A - 一种用于定量检测尿液中PPi含量的比率型荧光探针的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于定量检测尿液中PPi含量的比率型荧光探针的制备方法。（1）以柠檬酸钠为碳源，谷胱甘肽为钝化剂，合成发射蓝色荧光的B‑CDs；（2）以1,2，4‑三氨基苯为碳源，甲酰胺为钝化剂，合成发射黄色荧光的Y‑CDs，并将其与合成的发射蓝色荧光的B‑CDs混合，形成在同一激发波长条件下可以同时发射蓝色荧光和黄色荧光的比率型荧光探针；（3）在探针中加入Fe³⁺，探针蓝色荧光被猝灭，黄色荧光保持不变；（4）加入PPi，结合探针中的Fe³⁺,蓝色荧光恢复，黄色荧光保持不变，通过检测蓝色荧光和黄色荧光的比值来定量检测PPi的浓度，灵敏简便，选择性好。

Description

一种用于定量检测尿液中PPi含量的比率型荧光探针的制备 方法

技术领域

本发明属纳米材料、荧光传感技术和生物分析检测领域，具体涉及基于碳点的比率荧光传感平台用于检测尿液中的PPi的方法。

背景技术

肾结石是一种当今社会的一种高发性疾病，其主要致病机制是尿道中的不溶性成分发生结晶反应，形成这种病理结晶的主要化学成分是草酸钙，磷酸钙和尿酸。焦磷酸盐（PPi, P₂O₄ ^7-）在体内是由三磷酸腺苷水解成腺苷一磷酸的过程中释放，是体内一些结晶反应例如磷酸钙的形成的抑制剂。研究表明，PPi可以作为肾结石形成的抑制剂，肾结石患者体内PPi的含量与结石的形成有关。因此，建立灵敏度高，选择性好，便于操作的用于检测尿液中PPi含量的方法具有重要的意义。

目前用于检测PPi的方法主要有色谱法和一些基于化学反应的酶催化反应的方法，但是这些方法都需要复杂的操作和昂贵的仪器，因此难以普及。近年来，一些荧光纳米材料逐渐被应用于PPi的检测，包括金纳米粒，石墨烯量子点等。但是这些已建立的方法通常都基于单个荧光信号的变化，非常容易受到外界条件的干扰。因此，建立比率型荧光探针，利用在同一激发波长下可以输出两个发射波长的特性可以克服上述缺点，改善探针的检测性能，具有重要的意义。

碳点（CDs）作为一种新型的荧光纳米材料，由于其制备前体丰富，良好的光稳定性，低细胞毒性和高生物相容性等，近在生物传感、生物成像、药物递送和光催化领域受到极大关注。近年来，CDs被广泛应用于检测金属离子，蛋白质和其他小分子。然而，这些检测方法大都完全依赖于单个荧光强度信号输出，其检测性能具有一定的局限性。据我们所知，目前还没有基于CDs的比率荧光探针用于PPi的检测。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种用于定量检测尿液中PPi含量的比率型荧光探针的制备方法，利用在同一激发波长条件下发射不同颜色荧光的两种CDs构建的比率荧光传感平台，可以大大降低来自光源、探针浓度和检测条件等因素的干扰，可以直接用于尿液中PPi的检测，灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于定量检测尿液中PPi含量的比率型荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）、合成发射蓝色荧光的B-CDs[Ma Y, Zhang Z, Xu Y, Ma M, Chen B, Wei L, etal. A bright carbon-dot-based fluorescent probe for selective and sensitivedetection of mercury ions. Talanta. 2016;161:476-81.]：将柠檬酸钠和谷胱甘肽固体用水溶解，密封在反应釜中，高温高压条件下反应，得到的产物透析纯化得到发蓝色荧光的B-CDs，其发射波长为445-465 nm；

（2）、合成发射黄色荧光的Y-CDs[Jiang K, Sun S, Zhang L, Wang Y, Cai C, LinH. Bright-Yellow-Emissive N-Doped Carbon Dots: Preparation, Cellular Imaging,and Bifunctional Sensing. ACS Appl Mater Interfaces. 2015;7:23231-8]：将1,2,4-三氨基苯分散在甲酰胺溶液中，密封在反应釜中，在高温高压条件下反应，得到的产物离心取上清液透析纯化后得到发黄色荧光的Y-CDs，其发射波长范围为545-575 nm；

（3）、合成比率型荧光探针：将步骤（1）所得的B-CDs与步骤（2）Y-CDs混合共孵育，得到在同一激发波长条件下可以同时发射蓝色荧光和黄色荧光的比率型荧光探针；

调整B-CDs和Y-CDs的比例使得比率荧光探针的蓝色荧光和黄色荧光的强度比值为1:1~6:1；

（4）、在步骤（3）的比率荧光探针中加入Fe³⁺，使得比率荧光探针中的B-CDs的蓝色荧光被猝灭，而Y-CDs的黄色荧光保持不变，加入的Fe³⁺的浓度范围是80-300 μM；

（5）、将尿液过滤稀释，加入步骤（4）中的比率荧光探针孵育后，探针的蓝色荧光恢复，测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的比值，根据标准曲线，得到尿液中PPi的含量。

本发明定量检测尿液中PPi的含量的原理是：B-CDs的蓝色荧光在Fe³⁺存在的情况下发生电荷转移使得B-CDs的蓝色荧光被猝灭，而Y-CDs在Fe³⁺存在的情况下能够保持荧光强度不变，因此将B-CDs和Y-CDs混合孵育，得到能够在同一激发光条件下同时发射蓝色荧光和黄色荧光的比率荧光探针，在该探针中加入Fe³⁺，探针的蓝色荧光逐渐减弱，黄色荧光不变，在PPi存在的情况下，由于PPi能够和Fe³⁺结合形成稳定的复合物，使得B-CDs和Fe³⁺之间的电荷转移被抑制，探针的蓝色荧光逐渐增强，黄色荧光保持不变，因此通过建立PPi的浓度与探针的蓝色荧光和黄色荧光的比值之间的相关性可以将此探针应用于尿液中PPi的检测。

有益效果：本发明利用B-CDs和Y-CDs对Fe³⁺的响应不同构建一个比率荧光探针，其蓝色荧光和黄色荧光的比值与Fe³⁺浓度有关，Fe³⁺能够和PPi特异性结合形成复合物，因此该比率荧光探针可以用来检测PPi的含量。该探针与传统的单信号输出的荧光探针相比，能够极大程度地降低来自仪器的不稳定，测量条件以及探针浓度的变化造成的对检测结果的干扰，极大地提高了检测的准确度，整个检测环保简便，易于操作。

附图说明

图1A是实施例1制备得到的B-CDs的透射电子显微镜图；如图所示，B-CDs粒径约在3.5 nm，均匀分散（图中标尺为5 nm）。

图1B是实施例1制备得到的B-CDs的紫外吸收以及荧光发射图；如图所示，B-CDs在345 nm处有特征吸收，其荧光发射波长在445-465 nm。

图2A是实施例2制备得到的Y-CDs的透射电子显微镜图；如图所示，Y-CDs粒径约在2.5 nm，均匀分散（图中标尺为10 nm）。

图2B是实施例2制备得到的CDs的紫外吸收以及荧光发射图；如图所示，CDs在400nm处有特征吸收，其荧光发射波长在555-475 nm。

图3实施例3中B-CDs对Fe³⁺响应的示意图；如图所示，B-CDs在Fe³⁺存在的条件下荧光逐渐减弱。

图4实施例4中Y-CDs对Fe³⁺响应的示意图；如图所示，Y-CDs在Fe³⁺存在的条件下荧光保持不变。

图5是实施例5中B-CDs在不同pH条件下的荧光稳定性示意图；如图所示，B-CDs在碱性条件下荧光较强，在酸性条件下荧光较弱。

图6是实施例6中Y-CDs在不同pH条件下的荧光稳定性示意图；如图所示，Y-CDs在酸性条件下荧光较强，在碱性条件下荧光较弱。

图7是实施例7中不同pH条件下，B-CDs对Fe³⁺响应的示意图；如图所示，在pH=4的条件下，B-CDs对Fe³⁺响应最灵敏。

图8A是实施例8中Fe³⁺浓度与比率荧光探针的荧光变化相关图；如图所示，随着Fe^{3 +}浓度的增大，比率荧光探针的蓝色荧光逐渐减弱，黄色荧光保持不变。

图8B是实施例8中Fe³⁺浓度与比率荧光探针的黄色荧光与蓝色荧光比值的相关图；如图所示，随着Fe³⁺浓度的增大，比率荧光探针的蓝色荧光与黄色荧光比值逐渐增大。

图9A是实施例9中PPi浓度与比率荧光探针的荧光变化相关图；如图所示，随着PPi浓度的增大，比率荧光探针的蓝色荧光逐渐增强，黄色荧光保持不变。

图9B是实施例9中PPi浓度与比率荧光探针的蓝色荧光与黄色荧光比值的相关图；如图所示，随着PPi浓度的增大比率荧光探针的蓝色荧光与黄色荧光比值逐渐增大，在0.1-120 μM范围内，PPi的浓度与比率荧光探针的蓝色荧光与黄色荧光比值呈线性相关,线性回归方程为y=0.010x+0.384,相关系数r²=0.989。

具体实施方式

焦磷酸盐（PPi）、1,2,4-三氨基苯（阿拉丁试剂有限公司）；柠檬酸钠、五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）（国药集团化学试剂有限公司）；谷胱甘肽、Tris（2-氨基-2-（羟甲基）-1,3-丙二醇）（上海麦克林生化科技有限公司）。

实施例1 发蓝色荧光的B-CDs的合成，步骤如下：

称取300 mg的柠檬酸钠和30 mg的谷胱甘肽，加入10 ml的水，超声使其充分溶解，将溶液转移至30 ml的反应釜中密封，在200 ℃的条件下高温高压反应4h，得到的溶液冷却后用500 Da的透析袋透析12 h，得到发蓝色荧光的B-CDs。其透射电镜图如图1A所示、紫外吸收和荧光发射图如图1B所示。

实施例2 发黄色荧光的Y-CDs的合成，步骤如下：

称取100 mg的1,2,4-三氨基苯，加入10 ml甲酰胺溶液，搅拌使得1,2,4-三氨基苯在甲酰胺溶液中分散均匀，将溶液转移至30 ml的反应釜中，在120 ℃条件下反应12 h，得到的溶液离心除去未反应完全的物质，取上清用500 Da的透析袋透析纯化12 h，得到的产物用0.22 μm的微孔滤膜过滤，得到发黄色荧光的Y-CDs溶液。其透射电镜图如图2A所示、紫外吸收和荧光发射图如图2B所示。

实施例3 考察B-CDs对Fe³⁺响应，步骤如下:

取10μL的B-CDs溶液分散在180 μL的pH=4的Tris-HCl缓冲液中，然后加入10 μL不同浓度的Fe³⁺溶液，使其最终的浓度为50 μM、100 μM、200 μM，室温孵育10 min后，检测溶液的荧光强度，考察B-CDs对Fe³⁺响应，实验结果如图3所示。

实施例4 考察Y-CDs对Fe³⁺响应，步骤如下:

取10μL的Y-CDs溶液分散在180 μL的pH=4的Tris-HCl缓冲液中，然后加入10 μL不同浓度的Fe³⁺溶液，使其最终的浓度为50 μM、100 μM、200 μM，室温孵育10 min后，检测溶液的荧光强度，考察Y-CDs对Fe³⁺响应，实验结果如图4所示。

实施例5 B-CDs的荧光pH稳定性考察，步骤如下：

称取24 mg的Tris七份，分别溶解于10 ml水中，用HCl调节pH，分别得到pH=3、4、5、6、7、8、9的Tris-HCl缓冲液，取10 μL B-CDs分别分散在190 μL不同pH的Tris-HCl缓冲液中，考察其在不同pH条件下的荧光稳定性，结果如图5所示。

实施例6 Y-CDs的荧光pH稳定性考察，步骤如下:

称取24 mg的Tris七份，分别溶解于10 ml水中，用HCl调节pH，分别得到pH=3、4、5、6、7、8、9的Tris-HCl缓冲液，取10 μL Y-CDs分别分散在190 μL不同pH的Tris-HCl缓冲液中，考察其在不同pH条件下的荧光稳定性，结果如图6所示。

实施例7 考察pH对B-CDs和Fe³⁺响应的影响，步骤如下:

取10μL的B-CDs溶液分别分散在180 μL的pH=3、4、5、6、7、8、9的Tris-HCl缓冲液中，然后加入10 μL不同浓度的Fe³⁺溶液，使其最终的浓度为50 μM、100 μM、200 μM，室温孵育10min后，检测溶液的荧光强度，考察在不同pH条件下B-CDs对Fe³⁺的响应，其结果如图7所示。

实施例8 比率荧光探针的合成及其对Fe³⁺的响应，步骤如下:

将合成的B-CDs与Y-CDs混合共孵育，调整B-CDs和Y-CDs的比例使得比率荧光探针的蓝色荧光和黄色荧光的强度比值为2:1，取50 μL的探针，分散在pH=4的Tris-HCl缓冲液中，分别加入10 μL不同浓度的Fe³⁺，室温孵育10 min后，检测溶液的荧光强度，考察比率荧光探针对Fe³⁺的响应，其结果如图8所示。

实施例9 对PPi的定量检测，步骤如下:

将10 μL不同浓度的PPi溶液分散pH=4的Tris-HCl缓冲液中，加入10 μL的Fe³⁺溶液，使其最终浓度为70 μM，孵育20 min后，加入50 μL上述的比率荧光探针，室温孵育10 min后，检测溶液的荧光强度，计算探针的蓝色荧光和黄色荧光的比值，所得荧光图如图9A所示，荧光强度的比值和PPi浓度的相关性如图9B所示。

Claims (5)

1.一种用于定量检测尿液中PPi含量的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）、合成发射蓝色荧光的B-CDs:

以柠檬酸钠为碳源，谷胱甘肽为钝化剂，用水热法在高温高压的作用下碳化形成发蓝色荧光的B-CDs；

（2）、合成发射黄色荧光的Y-CDs：

以1,2,4-三氨基苯为碳源，甲酰胺为钝化剂，在反应釜中，高温高压条件下反应合成发黄色荧光的Y-CDs；

（3）、合成比率型荧光探针：

将步骤（1）所得B-CDs与步骤（2）所得的Y-CDs混合共孵育，得到在同一激发波长条件下可以同时发射蓝色荧光和黄色荧光的比率型荧光探针；

（4）、在步骤（3）的比率荧光探针中加入Fe³⁺，使得比率荧光探针中的蓝色荧光被猝灭；

（5）、将尿液过滤稀释，加入步骤（4）中的比率荧光探针孵育后，探针的蓝色荧光恢复，测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的比值，根据标准曲线，得到尿液中PPi的含量。

2.权利要求1所述的用于定量检测尿液中PPi含量的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（1）中B-CDs发射波长范围在445-465 nm。

3.权利要求1所述的用于定量检测尿液中PPi含量的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（2）中的Y-CDs发射波长的范围在545-575 nm。

4.权利要求1所述的用于定量检测尿液中PPi含量的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（3）中比率荧光探针在同一激发波长条件下其蓝色荧光和黄色荧光的强度比值为1:1~6:1。

5.权利要求1所述的用于定量检测尿液中PPi含量的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（4）所用Fe³⁺浓度为80-300 μM。